KR20130073717A

KR20130073717A - 생물학적 시료로부터 생체세포를 배양, 분리 및 저장하는 방법

Info

Publication number: KR20130073717A
Application number: KR20110141713A
Authority: KR
Inventors: 이희영; 양현진
Original assignee: 메디칸(주)
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2013-07-03
Also published as: KR101626087B1

Abstract

본 발명은 생물학적 시료로부터 생체세포를 대량 배양, 분리 또는 저장하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따르면, 간편한 방법을 통해 조직 또는 생체 지방으로부터 신선한 생체세포를 용이하게 대량 배양, 획득 및 저장이 가능하다.

Description

생물학적 시료로부터 생체세포를 배양, 분리 및 저장하는 방법{Method for cultivating, isolating and storing biological cell from biological sample}

본 발명은 생물학적 시료로부터 생체세포를 배양, 분리 및 저장하는 방법에 관한 것이다.

조직에서 생체세포를 분리하는 과정은 통상적으로 콜라겐 분해효소 등과 같은 단백질 분해 효소를 사용하게 된다. 상기 분리된 생체세포를 인체 내에 적용하기 위해서는 생체적합성이 보장되어야 하나, 상기 효소들의 생체 내 안전성이 아직 검증되지 않아 사용에 있어서 논란이 많은 실정이다.

효소를 사용하지 않는 생체세포 분리법으로는 온도 민감성 고분자(thermosensitive polymer)에 생체세포를 부착시켜 배양한 후, 고분자만 제거하는 방법이 있다. 그러나, 이는 이미 추출된 생체세포를 증폭하는 방법으로서, 생체지방을 기존 기술로서 효소를 사용하여 분리되었거나, 이미 배양단계의 세포를 활용하므로, 신선한 세포를 이용한 배양이 아니고, 추출 및 증폭 시간이 오래 걸리며, 그 과정이 복잡하고, 효소의 불확실한 안전성에 대한 우려가 잔존한다는 단점이 있다.

따라서, 조직 또는 생체 지방으로부터 생체세포를 대량 배양하여 분리, 저장할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.

일 양상은 생물학적 시료로부터 생체세포를 대량 배양, 분리 및 저장하는 방법을 제공한다.

일 양상은,

a) 생체세포를 포함하는 생물학적 시료를 배양 지지체에 접촉시켜 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;

b) 상기 생체세포가 배양된 배양 지지체에 다른 배양 지지체를 중첩시키는 단계;

c) 상기 중첩된 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;

d) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계; 및

e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계를 포함하는 생체세포의 대량 배양 방법(단, 상기 n은 1 이상의 정수)을 제공한다.

본 발명자들은 생체세포를 배양, 분리하여 인체 내에 곧바로 적용하기 위한 연구를 수행하던 중, 배양 지지체를 중첩하여 대량 배양하는 방법을 발견하였으며, 종래에 조직으로부터 생체세포를 분리하기 위해 사용하던 콜라겐 분해효소를 사용하지 않고, 생체세포를 분리할 수 있는 방법을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 생체세포 분리 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

먼저, 상기 생체세포의 대량 배양 방법은 a) 생체세포를 포함하는 생물학적 시료를 배양 지지체에 접촉시켜 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “생체세포”는 생체로부터 분리된 세포를 의미하는 것으로, 상기 생체세포는 배양시 생존하여 성장, 증식할 수 있는 살아있는 세포를 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 생체세포는 줄기세포일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 생체세포를 포함하는 완충액, 배양액, 체액 또는 조직의 가공물일 수 있다. 상기 완충액은 예를 들어, 식염수 또는 PBS일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 생체세포를 포함하는 체액은 예를 들어, 제대혈, 혈액 또는 골수액일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기 조직은 예를 들어, 생체세포를 포함하는 지방조직일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 예를 들어, 포유 동물로부터 유래한 지방조직일 수 있다.

상기 가공물의 형태는 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 가공물의 원료가 조직인 경우, 상기 가공물은 상기 생체세포를 포함하는 조직을 초음파 분쇄, 압축 분쇄 및 파쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 기계적 분쇄를 통해 생성되는 것일 수 있다. 상기 분쇄는 조직 내에 포함되어 있는 생체세포를 조직 외부로 드러내도록 하기 위한 것이다. 상기 가공물의 원료가 체액인 경우라면, 상기 가공물은 상기 생체세포를 포함하는 체액으로부터 원심분리 등을 통해 액체 부분을 제거하고 남은 물질을 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 생체세포는 지방조직 유래 생체세포(adipose tissue-derived stem cell)일 수 있으며, 상기 생체세포는 간질 조직(interstitial tissue) 내에 존재하는 생체세포일 수 있다.

예를 들어, 상기 분쇄하는 단계에서, 지방조직을 사용하는 경우, 상기 지방조직 내에 포함되어 있는 생체세포를 분리하기 위해 지방조직을 기계적으로 분쇄함으로써, 간질 조직 내에 있는 생체세포를 조직 외부로 드러내도록 할 수 있다. 이 과정에서, 생체세포 자체도 손상을 입거나, 파괴될 수 있으나, 상기 분쇄 과정에서 살아 남은 생체세포들만 하기 배양 과정에서 증식이 되므로, 생체세포만의 분리 배양이 가능하게 된다.

일 구체예에 따르면, 지방조직을 분쇄하는 경우, 상기 분쇄된 결과물로부터 지질을 제거할 수 있다. 예를 들어. 지방조직을 기계적으로 분쇄함으로써, 간질 조직 내에 있는 생체세포는 조직 외부로 드러나게 되고, 지방조직 내에 생체세포에 비해 많은 양이 존재하는 지질은 상기 분쇄 과정을 통해 작게 분쇄가 될 수 있다. 이렇게 분쇄된 지질은 이후, 배양 지지체와의 접촉 단계에서 생체세포의 부착을 방해할 수 있으므로, 상기 분쇄 단계 이후, 제거되는 것이 바람직하다. 일 구체예에 따르면, 상기 제거하는 단계는 원심분리에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 배양 지지체에 접촉될 수 있다. 예를 들어, 상기 과정에서 지방조직을 사용한 경우, 상기 분쇄된 결과물은 분쇄된 지질 및 손상되거나, 손상되지 않은 생체세포를 포함하게 된다. 따라서, 본 접촉시키는 단계는 상기 분쇄된 결과물로부터 손상되지 않은 생체세포만을 배양 지지체에 부착시키기 위한 과정이 된다.

일 구체예에 따르면, 상기 생체세포를 부착시키기 위한 배양 지지체는 생체 적합성 하이드로 겔일 수 있으며, 예를 들어, 상기 생체 적합성 하이드로 겔은 콜라겐, 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 알지네이트(alginate), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 아가 겔(agar gel), 온도 민감성 고분자(thermosensitive polymer) 및 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소재로 구성된 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

또한, 일 구체예에 따르면, 상기 생체세포를 부착시키기 위한 배양 지지체는 생체 적합성 스폰지일 수 있으며, 상기 생체 적합성 스폰지는 예를 들어, 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 알지네이트, 폴리비닐알콜, 아가 겔, 온도 민감성 고분자, 자가조직, 무세포 동종 ECM(human acellular extracellular matrix) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 구성된 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

한편, 일 구체예에 따르면, 상기 배양 지지체는 온도 민감성 고분자 또는 효소 반응성 고분자로 이루어진 쉬트(sheet) 형태인 것일 수 있으며, 상기 고분자는 예를 들어, 콜라겐, 알지네이트, 락테이트(PLLA, PLGA, PLA), PGA, 폴리카프롤락톤(PCL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 구성된 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에 따르면, 상기 쉬트의 두께는 예를 들어, 0.01 mm 내지 100 mm, 0.05 mm 내지 50 mm 또는 0.001 mm 내지 10 mm일 수 있다,

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키게 된다.

일 구체예에 따르면, 상기 배양은 상기 배양 지지체에 배양액을 첨가하여 배양시키는 것일 수 있다. 그러나, 상기 배양 지지체 자체로서 생체세포 배양을 위한 조건이 충족되는 경우라면, 상기 배양액을 첨가할 필요가 없다.

일 구체예에 따르면, 상기 배양액은 생체세포의 성장에 필수적인 성장인자를 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 예를 들어, PDGF (platelet-derived growth factor), TGF-β (transforming growth factor), EGF(epidermal growth factor) 및 FGF(fibroblast growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

한편, 일 구체예에 따르면, 상기 배양은 예를 들어. 20℃ 내지 43℃, 23℃ 내지 40℃ 또는 25℃ 내지 38℃의 온도 조건에서 생체세포를 배양시키는 것일 수 있다. 상기 온도 조건은 배양되는 생체세포의 종류에 따라 적절하게 최적화시킬 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 배양은 상기 배양액에 진동, 수압변화 및 온도변화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 배양액의 유동성을 형성할 수 있다. 상기 배양액의 유동성 조건 역시 배양되는 생체세포의 종류에 따라 적절하게 최적화시킬 수 있다.

이후, 상기 생체세포의 대량 배양 방법은 b) 상기 생체세포가 배양된 배양 지지체에 다른 배양 지지체를 중첩시키는 단계; c) 상기 중첩된 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계; d) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계; 및 e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 배양 지지체의 중첩은 상기 배양 지지체 상에 배양된 생체세포에 다른 배양 지지체를 접촉시키는 것을 의미한다. 상기 중첩을 통해 상기 배양된 생체세포는 새로운 다른 배양 지지체로 부착되며, 상기 a)단계의 배양 조건에서 중첩된 배양 지지체 상에서 배양될 수 있다. 상기 생체세포는 e)단계에 의해 대량 배양될 수 있다. 예를 들어, 동일한 크기 및 형태의 배양 지지체를 n번 중첩, 분리 및 배양을 반복하면, 최종적으로 획득할 수 있는 생체세포는 최초 부착된 생체세포의 2ⁿ배가 될 수 있다.

상기 배양 지지체의 중첩은 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포에 직접적으로 접촉시켜 중첩시킬 수도 있지만, 상기 배양 지지체와 적절한 공간을 유지한 채로 다른 배양 지지체를 중첩시킬 수도 있다. 이때, 상기 공간은 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포가 배양 과정 중에 중첩되는 배양 지지체에 이동하여 부착될 수 있을 정도로 제공될 수 있다.

상기 b) 내지 e)단계를 거친 배양 지지체는 중첩된 각각의 배양 지지체에 충분한 양의 생체세포가 배양되어 있으므로, 상기 생체세포를 사용하기 위해서는 중첩된 배양 지지체를 분리해야 하며, 이는 중첩된 배양 지지체에 물리적인 힘을 가하여 각각의 생체세포가 부착된 배양 지지체로 분리할 수 있다.

다른 양상은,

d) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계;

e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계;

e) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계; 및

f-1) 상기 중첩된 배양 지지체에서 배양된 생체세포를 상기 배양 지지체로부터 분리시키는 단계를 포함하는 생체세포를 포함하는 생물학적 시료로부터 생체세포를 분리하는 방법(단, 상기 n은 1 이상의 정수)을 제공한다.

상기 방법은 f-1)단계를 제외하고는 상기 설명하였던, 생체세포의 대량 배양 방법과 동일하므로, 명세서의 복잡성을 피하기 위해서 중복되는 부분의 설명을 생략하도록 한다.

상기 생체세포를 포함하는 생물학적 시료로부터 생체세포를 분리하는 방법은 상기 a)단계 내지 e)단계를 거친 후, f-1) 상기 중첩된 배양 지지체에서 배양된 생체세포를 상기 배양 지지체로부터 분리시키는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 배양 지지체에 부착되어 있는 생체세포 이외의 물질을 제거하기 위해, 상기 e)단계 이후, 상기 배양 지지체를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다,

일 구체예에 따르면, 상기 f-1)단계는 원심분리, 온도변화, 여과 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리 방법에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 예를 들어, 상기 생체세포가 부착된 배양 지지체를 원심분리를 통해 배양 지지체로부터 분리하여 생체세포만 분리하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 배양 지지체를 온도 민감성 고분자를 사용한 경우에는 상기 분리하는 단계에서 온도를 변화시켜 상기 배양 지지체로부터 생체세포를 분리할 수 있다.

본 명세서에서 용어, “온도 민감성 고분자(temperature sensitive polymer)”는 일정 온도 이상에서는 겔화, 이하에서는 액화가 되거나, 일정 온도 이하에서는 겔화, 이상에서는 액화가 되는 폴리머를 의미한다. 상기 온도 감응성 고분자는 예를 들어, 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)(poly(N-isopropyl acrylamide)), 폴리(에틸렌 옥시드)(poly(ethylene oxide)), 히드록시프로필 아크릴레이트(hydroxypropyl acrylate) 등이 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

온도 민감성 고분자를 사용하는 경우, 일 구체예에 따르면, 상기 온도변화는 상기 배양시키는 단계의 배양 온도보다 1℃ 이상 높거나, 또는 1℃ 이상 낮도록 변화시켜 상기 배양 지지체로부터 생체세포를 분리할 수 있다. 즉, 상기 온도변화를 통해 상기 온도 민감성 고분자가 고체에서 액체 상태로 변형이 되고, 온도 민감성 고분자에 부착되어 있던 생체세포는 배양액 내로 포함되어, 원심분리 또는 여과를 통해 상기 배양액을 제거함으로써, 생체세포만을 분리할 수 있다.

또 다른 양상은,

e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계; 및

f-2) 상기 e)단계에서 분리된 배양 지지체를 냉동 보관하는 단계를 포함하는 생체세포 저장 방법(단, 상기 n은 1 이상의 정수)을 제공한다.

상기 방법은 f-2)단계를 제외하고는 상기 설명하였던, 생체세포의 대량 배양 방법과 동일하므로, 명세서의 복잡성을 피하기 위해서 중복되는 부분의 설명을 생략하도록 한다.

상기 생체세포를 포함하는 생물학적 시료로부터 생체세포를 분리하는 방법은 상기 e)단계에서 분리된 배양 지지체를 냉동 보관하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 냉동 보관은 질소 동결하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 한편, 상기 냉동 보관의 편의성을 위해, 상기 배양 지지체는 온도 민감성 고분자 또는 효소 반응성 고분자로 이루어진 쉬트(sheet) 형태인 것이 바람직하며, 상기 고분자의 종류 및 쉬트의 두께는 상기 생체세포의 대량 배양 방법에서 설명한 바와 같다.

일 구체예에 따르면, 간편한 방법을 통해 생물학적 시료로부터 신선한 생체세포를 용이하게 대량 배양, 획득 및 저장이 가능하다.

도 1은 일 구체예에 따른 생체세포의 대량 배양, 분리, 저장 방법의 순서도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 생체세포 분리 방법에 의해 배양 지지체 상에서 배양된 생체세포를 확인한 사진이다. 화살표는 생체세포를 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 생체세포 분리 방법에 의해 분리된 생체세포의 수를 확인한 그래프이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 일 구체예에 따른 생체세포의 대량 배양, 분리 및 저장 방법의 순서도를 나타낸다.

도 1의 순서도를 참고하여, 지방조직으로부터 생체세포를 대량 배양, 분리 및 저장하는 방법을 예를 들어 설명하면, 본 발명의 방법은 먼저, 생체세포를 포함하는 지방조직을 분쇄하게 된다. 지방조직의 분쇄는 기계적인 방법에 의하며, 초음파 분쇄 또는 파쇄에 의할 수 있다. 상기 분쇄 결과물에는 지질과 같은 불순물과 생체세포가 함께 포함되어 있게 된다. 상기 분쇄에 의해 획득한 분쇄 결과물은 그 다음 단계에 그대로 사용하거나, 또는 불순물을 제거하는 단계를 거칠 수 있다. 불순물의 제거는 당업계에 알려진 일반적인 원심분리와 같은 방법을 통해 제거될 수 있다.

이후, 상기 분쇄 결과물 또는 불순물이 제거된 분쇄 결과물은 배양 지지체에 접촉시키게 된다. 상기 접촉은 배양 지지체의 외부에 직접 접촉시키거나, 또는 배양 지지체 내부에 주입하는 방식으로 실시할 수 있다. 상기 배양 지지체는 분리, 저장의 편의성을 위해 쉬트(sheet) 형태인 것이 바람직하며, 생체세포가 적절하게 부착되어 성장할 수 있도록 생체 적합성 하이드로 겔, 생체 적합성 스폰지, 온도 민감성 고분자로 이루어진 쉬트를 사용할 수 있다.

상기 배양 지지체에 부착된 생체세포는 배양 지지체 자체에서 배양하거나, 또는 상기 배양 지지체에 배양액을 첨가하여 배양하게 된다. 상기 재양 지지체에 부착된 생체세포의 대량 배양을 위해, 상기 배양 지지체에 다른 배양 지지체를 중첩시키게 된다. 상기 중첩되는 배양 지지체는 실험자가 원하는 바에 따라 그 형상, 크기를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 원래의 배양 지지체가 사각형의 쉬트 형태라면, 중첩되는 배양 지지체는 사각형보다 크거나, 작은 원형의 쉬트 형태일 수 있다. 상기 중첩은 실험자가 원하는 횟수만큼 가능하며, 상기 배양 지지체를 수직으로 계속적으로 중첩하거나, 또는 원하는 만큼의 생체세포가 배양되어 중첩된 배양 지지체를 물리적으로 분리한 다음, 다른 배양 지지체를 중첩시키는 방법으로 대량 배양을 수행할 수 있다.

이후, 생체세포가 배양된 배양 지지체는 그 자체로 냉동 보관하여 저장하거나, 배양 지지체로부터 생체세포를 분리하여 분리된 생체세포만 별도로 저장할 수 있다.

실시예 1: 지방조직으로부터 분리된 줄기세포의 배양 지지체에서의 배양

인체로부터 얻은 지방조직을 10％ 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 지방조직을 적정량이 되도록 절단하였다. 이후, 상기 절단된 지방조직을 기계적 분쇄한 다음, 상기 분쇄된 결과물을 2200 x g의 조건으로 5분 동안 원심분리하여, 지질이 포함된 상층액을 제거하였다.

패트리 디쉬 내에 10%의 FBS가 포함된 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM)를 준비하고, 상기 배지 내에 FAT sponge(지방을 기계적 방법으로 분쇄하고 원심분리하여 지질을 제거한 뒤 동결건조를 하여 제작함, 등록특허 제0771058호 참조)를 넣어 FAT sponge를 상기 배지로 충분히 적신 다음, 상기 상층액이 제거된 나머지 부분을 상기 FAT sponge 상에 올려 놓고, 지방조직 유래 줄기세포가 FAT sponge에 정착할 수 있도록 24시간 동안 방치하였다. 이후, 상기 패트리 디쉬를 37℃, 5％ CO₂ 항온기에서 배양하였다. 이때, 이틀에 한번씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.

실시예 2: 배양 지지체로부터의 줄기세포 분리 및 확인

상기 실시예 1에서 FAT sponge 상의 지방조직 유래 줄기세포를 5일 또는 15일 동안 배양한 다음, 상기 FAT sponge 상에서 줄기세포가 제대로 배양되었는지 여부를 확인하기 위해, 상기 배양된 FAT sponge를 배양액으로부터 꺼내어, 적절한 크기로 자른 다음, 몰드에 넣고, 파라핀 처리한 다음, 5 um의 두께로 박절(sectioning)하여 H&E 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, FAT sponge를 배양 지지체로하여 5일 또는 15일 동안 배양된 줄기세포가 존재함을 확인할 수 있었으며, 최초에 상층액이 제거된 나머지 부분(pellet only)에 존재하던 줄기세포에 비해 FAT sponge로 이동하여 배양된 세포의 양이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 세포양의 증가를 좀 더 확인하기 위하여, 상기 배양된 FAT sponge로부터 원심분리를 통해 줄기세포를 분리한 다음, NucleoCounter-NC-100(chemometec)를 사용하여 줄기세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, FAT sponge로 이동하여 5일 또는 15일 동안 배양한 줄기세포의 양이 최초 상층액이 제거된 나머지 부분(pellet only)에 존재하던 줄기세포의 양에 비해 각각 30% 및 50% 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다.

이러한 결과로 볼 때, 본 발명의 줄기세포 분리 방법에 의해 콜라겐 분해 효소를 사용하지 않고도, 조직으로부터 줄기세포를 용이하게 분리하여 배양 지지체에 증식시킬 수 있으며, 증식된 줄기세포는 간단한 방법을 통해 배양 지지체로부터 분리하여 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

a) 생체세포를 포함하는 생물학적 시료를 배양 지지체에 접촉시켜 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;
b) 상기 생체세포가 배양된 배양 지지체에 다른 배양 지지체를 중첩시키는 단계;
c) 상기 중첩된 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;
d) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계; 및
e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계를 포함하는 생체세포의 대량 배양 방법(단, 상기 n은 1 이상의 정수).
제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 생체세포를 포함하는 완충액, 배양액, 체액 또는 조직의 가공물인 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 가공물은 생체세포를 포함하는 지방조직을 초음파 분쇄, 압축 분쇄 및 파쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 기계적 분쇄를 통해 생성하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 지지체는 생체 적합성 하이드로 겔인 것인 방법.
제4항에 있어서, 생체 적합성 하이드로 겔은 콜라겐, 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 알지네이트(alginate), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 아가 겔(agar gel), 온도 민감성 고분자(thermosensitive polymer) 및 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 소재로 구성된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 지지체는 생체 적합성 스폰지인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 생체 적합성 스폰지는 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 알지네이트, 폴리비닐알콜, 아가 겔, 온도 민감성 고분자, 자가조직, 무세포 동종 ECM(human acellular extracellular matrix) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 구성된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 지지체는 온도 민감성 고분자 또는 효소 반응성 고분자로 이루어진 쉬트(sheet) 형태인 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 고분자는 콜라겐, 알지네이트, 락테이트(PLLA, PLGA, PLA), PGA, 폴리카프롤락톤(PCL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 구성된 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 쉬트의 두께는 0.001 mm 내지 10 mm인 것인 방법,
제1항에 있어서, 상기 a)단계 또는 c)단계의 배양은 상기 배양 지지체에 배양액을 첨가하여 배양시키는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 배양액은 PDGF, TGF-β, EGF 및 FGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장인자를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 a)단계 또는 c)단계의 배양은 상기 배양액에 진동, 수압변화 및 온도변화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 배양액의 유동성을 형성하는 것인 방법.
a) 생체세포를 포함하는 생물학적 시료를 배양 지지체에 접촉시켜 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;
b) 상기 생체세포가 배양된 배양 지지체에 다른 배양 지지체를 중첩시키는 단계;
c) 상기 중첩된 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;
d) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계;
e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계; 및
f-1) 상기 중첩된 배양 지지체에서 배양된 생체세포를 상기 배양 지지체로부터 분리시키는 단계를 포함하는 생체세포를 포함하는 생물학적 시료로부터 생체세포를 분리하는 방법(단, 상기 n은 1 이상의 정수).
제14항에 있어서, 상기 배양 지지체는 온도 민감성 고분자 또는 효소 반응성 고분자로 이루어진 쉬트(sheet) 형태인 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 고분자는 콜라겐, 알지네이트, 락테이트(PLLA, PLGA, PLA), PGA, 폴리카프롤락톤(PCL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 구성된 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 a)단계 또는 c)단계의 배양은 20℃ 내지 43℃의 온도 조건에서 생체세포를 배양시키는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 e)단계 이후, 상기 배양 지지체를 세척하는 단계를 더 포함하는 것인 방법,
제14항에 있어서, 상기 f-1)단계는 원심분리, 온도변화, 여과 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리 방법에 의해 생체세포를 분리하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 온도변화는 상기 a)단계 또는 c)단계의 배양 온도보다 1℃ 이상 높거나, 또는 1℃ 이상 낮도록 변화시키는 것인 방법.
a) 생체세포를 포함하는 생물학적 시료를 배양 지지체에 접촉시켜 상기 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;
b) 상기 생체세포가 배양된 배양 지지체에 다른 배양 지지체를 중첩시키는 단계;
c) 상기 중첩된 배양 지지체에 부착된 생체세포를 배양시키는 단계;
d) 상기 중첩된 배양 지지체들을 물리적으로 분리시키는 단계;
e) 상기 b) 단계 내지 d) 단계를 n회 반복하는 단계; 및
f-2) 상기 e)단계에서 분리된 배양 지지체를 냉동 보관하는 단계를 포함하는 생체세포 저장 방법(단, 상기 n은 1 이상의 정수).
제21항에 있어서, 상기 냉동 보관은 질소 동결하는 것인 방법,
제21항에 있어서, 상기 배양 지지체는 온도 민감성 고분자 또는 효소 반응성 고분자로 이루어진 쉬트(sheet) 형태인 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 고분자는 콜라겐, 알지네이트, 락테이트(PLLA, PLGA, PLA), PGA, 폴리카프롤락톤(PCL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소재로 구성된 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 쉬트의 두께는 0.001 mm 내지 10 mm인 것인 방법.