KR20130065236A - 미나리 추출물을 함유하는 혈전증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

미나리 추출물을 함유하는 혈전증 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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KR20130065236A
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최준영
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안동대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 미나리 (Oenanthe javanica ( Blume ) DC) 추출물을 유효성분으로 함유하는 트롬빈 저해 혈전증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 미나리 추출물 또는 그의 에틸아세테이트 유기용매 분획물은 급성경구독성 및 만성독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장내에서도 트롬빈 저해 활성의 손실이 나타나지 않아 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 트롬빈 저해활성을 나타내어 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있으므로 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용 가능한 제형으로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

미나리 추출물을 함유하는 혈전증 예방 및 치료용 조성물{Pharmaceutical composition comprising the extract of Oenanthe javanica for prevention and control of thrombosis}
본 발명은 미나리 추출물을 함유하는 트롬빈 저해 혈전증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하여 트롬빈 저해 혈전증을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 트롬빈 저해 혈전증을 개선하기 위한 기능성 건강식품 조성물에 관한 것이다.
인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.
피브린 혈전의 생성은 수많은 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 직접 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 Factor XIII에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다.
따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있어 전세계적으로 트롬빈 직접저해제 개발을 목표로 하고 있다. 특히 사회의 발달과 인구의 고령화에 따라 혈전성 질환, 즉 과다한 혈전생성과 관련된 뇌혈관 질환이나 심장질환이 최근 급속히 증가되고 있어 안전한 항혈전제 개발이 절실한 상태이다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.
미나리(Dropwort)는 예로부터 혈압을 낮추어 주는 혈압강하작용이 있고, 혈액순환을 원활하게 하며, 장의 활동을 좋게 하여 변비, 치질, 대장 및 소장질환을 완화시켜 주고, 체내 열을 내려주고 독을 제거해주는 해열 및 해독작용이 있고, 지사작용이 있고 그리고 중금속을 해독해주는 기능이 있다고 알려져 왔다. 이러한 미나리의 주요 기능 때문에 예로부터 미나리를 섭취하여 왔는데, 주로 생식으로 섭취하거나 데쳐 섭취하였다. 미나리의 학명은 Oenanthe javanica ( Blume ) DC .로 식품공전에서 잎과 줄기를 식용으로 구분하고 있으며, 비타민 A, B1, B2, C, 베타카로틴이 풍부한 알칼리성 식품으로 단백질, 철분, 칼슘, 칼륨, 인, 당질 등이 많이 들어 있다고 알려져 있다. 특히, 다량의 칼륨을 포함하고 있어서 인체의 나트륨의 배설에 도움을 줄 수 있어서 고혈압 환자에게는 좋은 식품으로 알려져 있다.
미나리는 식물성 폴리페놀인 플라보노이드 성분을 다량 함유하는데, 이소람네틴(Isorhamnetin), 히페로사이드(Hyperoside), 페르시카린(Persicarin), 알파피넨(Alpha-pinene) 및 미르센(Myrcene)과, 그리고 색소성분인 캄페롤(Kaempferol)과 퀘르세틴(Quercetin) 등이 알려져 있다. 이소람네틴과 알파피넨은 우수한 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제하는 효과와 자유라디칼 제거효과로 항산화 효과 및 비만억제 효과를 가지는 것으로 알려져 있고, 페르시카린은 최근 연구에 의하면 간에서 알코올대사에 관여하는 효소를 활성화시켜 해독작용이 탁월하여 간보호에 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 또한, 상기 플라보노이드 성분들이 인체 발암성 물질인 아플라톡신 B1에 대해 항돌연변이 활성도 가진 것으로 최근의 연구를 통해 보고되고 있다. 한편, 폴리페놀의 일종으로서 색소성분인 캄페롤과 퀘르세틴은 혈전 생성 억제 효과가 뛰어나며 아울러 항산화 및 염증치료성질을 갖는 것으로 알려져 있다.
현재 건강을 위해 섭취하는 미나리음료는 생미나리를 착즙한 것만이 시판되고 있지만, 맛이 떨어지고, 미나리 특유의 강한 향으로 인한 거부감과 저장성의 문제 등으로 대중화되기는 곤란하다는 문제점이 있다. 한편, 현재 미나리 생산 농가에서 미나리를 재배하여 판매할 시에, 미나리 선별과정에서 많은 부분들이 폐기되어 버려진다. 그러므로, 폐기물 발생을 최소화하며, 미나리의 고유한 영양소와 고유성분 특히 폴리페놀 성분을 대부분 포함할 뿐만 아니라 특유의 맛과 향을 거부감 없이 부드럽게 살리는 미나리 추출물의 이용은 건강증진 및 환경보호의 두가지 목적을 달성할 수 있게 된다.
한편, 미나리 기능에 관련한 특허문헌으로는 대한민국 특허등록 제1003952140000호(등록일: 2003.08.06, 특허출원 제10-2000-0021271호, 출원일: 2000.04.21) '미나리 추출물을 함유하는 폐암예방 및 전이억제용식이조성물', 대한민국 특허등록 제1008133380000호 (등록일: 2008.03.06, 특허출원 제10-2006-0054683호, 출원일: 2006.06.19) '미나리를 주재료로 한 숙취해소용 음료의 제조방법', 대한민국 특허공개 제1020110016708호 (공개일: 2011.02.18, 특허출원 제10-2009-0074338호, 출원일: 2009.08.12) '미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간, 고지혈증, 고혈당 해소용 조성물 및 이를 이용한 기능성 건강식품' 등이 알려져 있다. 그러나, 미나리 추출물의 항혈전 활성 및 인간 트롬빈 효소의 저해를 통한 혈전생성저해 효과는 보고된 바 없다.
따라서 본 발명자들은 미나리 추출물 및 이의 유기용매 분획물을 이용하여 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해 및 인간 농축혈소판에 대한 혈소판 응집저해활성을 평가하였으며, 그 결과 미나리 추출물 및 유기용매 분획물에서 매우 강력한 트롬빈 저해 및 혈소판 응집저해 활성을 확인하였다.
1. 대한민국 특허등록 제1003952140000호(등록일: 2003.08.06) 2. 대한민국 특허등록 제1008133380000호 (등록일: 2008.03.06) 3. 대한민국 특허공개 제1020110016708호 (공개일: 2011.02.18)
본 발명의 목적은 미나리 추출물 및 이의 유기용매 분획물을 유효성분으로 하는 혈전증 질환 예방 및 치료용 음료 및 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 미나리 추출물 및 유기용매 분획물을 제조하고 이의 pH, 산도, 당도, 고형분 함량 및 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 추출물 및 분획물의 인간트롬빈 직접저해 및 인간 농축혈소판에 대한 혈소판 응집 저해능을 평가하여, 상업적으로 이용되고 있는 항혈전제 아스피린(상품명: 프로텍트)보다 우수한 항혈전 활성을 확인하고, 인간 적혈구 용혈활성이 나타나지 않으며, 상기 물질의 열 및 산 안정성을 조사한 다음, 상기 물질을 흰쥐에 경구투여하여 급성 및 만성독성검사를 실시함으로써 달성하였다.
본원 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 본 발명의 미나리 추출물은 에틸아세테이트로 분획하여 획득할 수 있으며, 우수한 트롬빈 저해활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 그 뿐만 아니라, 본 발명의 미나리 추출물 및 에틸아세테이트 분획물은 급성경구독성 및 만성독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장내에서도 트롬빈 저해 활성의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업 및 제약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1a는 아스피린과 미나리 추출물의 항혈전 효과를, 도 1b는 미나리 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 항혈전 효과를 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임 관점에서 비교한 그래프로, 여기서 -●-는 트롬빈 타임, -○-는 프로트롬빈 타임, -▼-는 에이피티티 타임을 나타낸다.
본 발명은 미나리 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 트롬빈 저해 혈전증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 일정 방법으로 수득한 미나리 추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 활성성분을 회수하고, 경구급성독성과 만성독성이 나타나지 않으면서 종래의 혈전생성 억제제와 달리 우수한 항혈전 활성을 나타내고, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 천연 항혈전 활성 추출물 및 분획물에 관한 것이다.
본 발명은 미나리로부터 활성 추출물을 조제하는 단계; 미나리 추출물로부터 에틸아세테이드 유기용매 분획의 조정제 단계; 상기 물질의 안정성 조사단계; 및 상기 물질의 급성 및 만성 독성검사단계로 구성된다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "미나리 추출물"은 미나리의 뿌리부분을 제거하고 세척한 후 세절기를 이용하여 0.5cm 내지 1cm 정도로 세절하는 단계, 정제수에 일정 비율을 유기산을 혼합하여 유기산용액을 만드는 단계, 유기산용액에 세절된 미나리를 침지하는 단계와, 상기 유기산용액을 25℃로 유지하면서 회전 진탕기를 사용하여 24시간 정도 교반하는 단계와, 상기 교반이 완료된 용액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하는 단계에 의해 수득될 수 있으며, 선택적으로는, 상기 여과된 용액에 당분을 첨가하는 단계까지 적용한 후에 수득된 미나리 추출물도 무방하다.
다르게, 본 발명의 조성물에 포함되는 "미나리 추출물"은 미나리 뿌리부분을 제거하고 세척한 후 세절기를 이용하여 0.5cm 내지 1cm 정도로 세절하는 단계, 정제수를 준비하여 가열한 후 85℃로 유지하면서 미나리를 투입하는 단계와, 15 내지 30분간 가열된 정제수에 미나리를 유지하면서 미나리액을 추출하는 단계와, 상기 추출단계를 거쳐 미나리액을 포함하는 추출액을 냉각시키는 단계와, 상기 냉각된 추출액에 유기산을 첨가하는 단계에 의해 수득될 수 있으며, 선택적으로는, 상기 유기산이 첨가된 추출액에 당분을 첨가하는 단계까지 적용한 후에 수득된 미나리 추출물도 무방하다.
본 발명에서 사용되는 유기산은 식용가능한 유기산 모두를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 젖산, 구연산, 초산, 사과산, 푸말산, 글루콘산 및 알파케토글루타르산으로 이루어진 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으나, 구연산(시트르산)이 가장 바람직하다.
본 발명에서 미나리 추출물 5 mg/mL 농도에서 트롬빈 타임(thrombin time), 프로트롬빈 타임(prothrombin time)과 에이피티티 타임(aPTT time)을 측정한 결과, 무첨가구보다 각각 15 배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 나타내었다. 또한 미나리 추출물 2.5 mg/mL 농도에서는 1.17배의 연장된 트롬빈 타임(thrombin time), 및 15배 연장된 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 나타내었다. 한편 정제된 아스피린 2.5 mg/ml의 농도에서의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임은 각각 8.8배, 1.6배, 1.1배 연장됨을 확인하였다. 이러한 결과는 미나리 추출물이 강력한 항혈전 활성을 나타내며, 기존의 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 미나리 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위내의 pH 에서도 활성을 유지한다.
본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "기능성 건강식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 미나리 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 미나리 추출물은 트롬빈 저해 혈전증 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 미나리 추출물이 첨가될 수 있는 식품 또는 음료로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 산수유 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미나리 추출물 및 에틸아세테이트 용매분획물의 조제
청도산 미나리를 2011년 6월 및 7월 채취하여 미나리를 준비하여 정수로 세정한 다음에 뿌리부분을 제거한 다음에 세절기를 이용하여 0.5 내지 1cm 크기로 세절하였다. 그런 다음, 정제수 100에 대해 1 내지 2.8w%의 유기산을 정제수에 혼합한 다음 유기산용액을 제조하였다. 이어서, 유기산용액에 정제수 100에 대해 28 내지 40w%의 세절된 미나리를 침지하였다. 그런 다음, 세절된 미나리가 침지된 유기산용액을 25℃의 온도로 유지하면서 24시간 동안 교반하였다. 이 때, 소량의 미나리 추출액을 추출하는 경우에는 회전 진탕기(swing shaker)를 사용할 수 있지만, 대용량의 미나리 추출액을 추출하는 경우에는 추출 탱크에 별도의 스쿠루 장치를 달아 추출용액의 흐름을 만들어 준다. 그런 다음, 교반과 추출이 완료된 유기산용액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하여 미나리 추출액을 얻었다.
상기 미나리 추출액에 5배의 에틸아세테이트 용액을 가하여 상온에서 5시간씩 3회 추출하여 에틸아세테이트 용해 물질을 분획하였다. 분획물을 감압회전 농축기를 이용하여 분말화 한 결과 21.6%의 수율을 얻었다. 미나리 추출액 및 분획물은 감압 농축하여 분말로 제조하여 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였으며, DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석한 후, 인간 혈장을 이용하여 트롬빈타임, 프로트롬빈타임, 에이피티티 타임 및 혈소판 응집저해활성의 항혈전 활성을 측정하였다.
항혈전 활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(Sohn et al., 2004. Kor . J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 측정하였다. 혈장은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4℃에서 5,000 g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같이 하였다.
트롬빈 타임( Thrombin Time )
37℃에서 0.5 U 트롬빈 (Sigma Co., USA) 50 ㎕와 20 mM CaCl2 50 ㎕, 다양한 농도의 시료 추출액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 ㎕를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)과 헤파린 (heparin; Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1 초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30 분간 열처리하고, 실온에서 1시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
프로트롬빈 타임( prothrombin time )
표준혈장(MD Pacific Co., China) 70 ㎕와 다양한 농도의 시료액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3분간 가온 후, 130 ㎕의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다.
aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )
혈장 100 ㎕와 다양한 농도의 시료 추출액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50 ㎕의 aPTT reagent (Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3 분간 배양하였다. 이후 50 ㎕ CaCl2 (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )
혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9 비율로 혼합한 후, 1,100 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP (platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 0.49 mM MgCl2, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재 현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x109/ml 되도록 조정하였다. 이후 1 ml 현탁액에 2.5 ul collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer (Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.
미나리 추출물 및 에틸아세테이트 분획물은 각각 1.25 mg/mL 농도에서 각각 1.17배 및 3.2배 증가된 트롬빈 타임을 나타내었으며, 15배 이상 증가된 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 나타내었다(도 1a, 도 1b 참조). 반면 아스피린은 1.25 mg/mL 농도에서 2.1배의 증가된 트롬빈 타임 및 1.2배 및 1.1배의 증가된 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 나타내어, 미나리 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 높은 항혈전 활성을 확인하였다.
실시예 2: 본 발명의 미나리 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 pH , 색차 , 당도 및 유용성분 조사
조제된 미나리 추출물의 물리적 특성 및 유용성분 함량을 조사하였다. 수분함량은 시료 10 g을 80℃에서 항량 건조하여 수분함량을 평가, 또는 적외선 수분측정기(HG53 Halogen Moisture Analyzer, Mettler-Toledo International Inc., Zurich, Switzerland)로 측정하였으며, 3회 이상 반복 평가하였다. 한편 pH, 당도(brix) 및 산도의 경우, 시료 10 g을 50 ml 멸균 tube에 넣고, 1분간 교반 후, 용액의 pH와 brix를 측정하였으며, pH 측정은 320 pH meter (Mettler Toledo InLabR 413, UK)로 측정하였으며, brix 측정은 refractometer (Atago N-1E, Japan)을 이용하였다. 산도의 경우 시료 10 mL에 0.1 N NaOH 용액을 가하여 pH 8.3이 될 때까지 적정하여 소비된 양을 초산(acetic acid)의 함량(%)으로 환산하여 나타내었다. 색도는 추출물 그대로를 Hunter Color Difference meter (Super color SP-80 Colormeter, Tokyo Denshoku Co., Japan)를 이용하여 측정하였으며, 명도(lightness, L), 적색도(redness, a), 황색도(yellowness, b)를 측정하였다. 이때 표준백판의 색도는 L값이 92.44, a값이 -0.06, b값이 1.35로 기준을 정하였으며, 시료당 3회 측정하여 평균값을 구하여 나타내었고 색차(△E)는 다음의 식을 이용하여 계산하였다:
Figure pat00001
한편, 미나리 추출물의 총 플라보노이드 (total flavonoid)의 함량 측정은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출 검액 400 ㎕에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 ㎕를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 (total polyphenol) 함량은 추출 검액 400 ㎕에 50 ㎕의 Folin-ciocalteau, 100 ㎕의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.
그 결과는 표 1 및 표 2에 나타내었으며, 비교를 위해 시판되고 있는 H회사 및 N회사의 100% 사과주스, 포도주스, 오렌지 주스, 50% 오미자 주스, 및 65% 토마토 주스를 E 대형매장에서 구입하여 대조구로 사용하였다.
미나리 추출물의 물리적 특성
주스 pH 당도 (brix,%) 산도(%) 고형분 함량 (%) 명도 적색도 황색도 색차
사과주스 3.80 12.2 0.397 13.72 22.40 -11.16 -6.25 71.25
오미자주스 3.05 17.6 0.759 21.16 20.92 -9.33 -4.04 72.24
포도주스 3.27 13.4 0.440 16.15 11.22 -0.87 -1.86 81.21
오렌지주스 3.98 11.2 0.761 12.87 28.61 -6.91 5.17 64.23
토마토주스 3.97 11.6 0.391 18.29 21.30 3.76 7.42 71.41
미나리추출물 2.76 1.2 0.363 1.44 50.24 1.36 0.82 42.15
명도(degree of lightness): 흰색 ＋100～0 검정
적색도 (degree of redness) : 적색 ＋100～－80 녹색, 황색도(degree of yellowness) 황색 ＋70～－80 검정
표 1에 나타낸 바와 같이 미나리 추출물은 다른 과일주스에 비해 상대적으로 낮은 pH를 나타내며, 고형분 함량에서도 1.44%로 낮은 수치를 나타내었다. 그러나 사과주스 및 토마토 주스와 유사한 산도를 나타내며, 오미자 주스, 오렌지 주스보다는 낮은 산도를 나타내었다. 따라서 미나리 추출물은 유기산을 다량 가지고 있으며, 당류도 일부 포함하고 있음을 확인하였다. 색차분석의 경우 기존 시판되는 과일 및 야채주스에 비해 상대적으로 명도와 적색도가 높으며, 황색도가 낮아 옅은 분홍색을 띠는 것으로 확인되었다. 이러한 색상은 관능적으로 우수한 색상이다.
주스 총 폴리페놀 총 플라보노이드 총당 환원당
사과주스 0.26±0.01 0.01±0.01 104.42±0.06 32.90±0.37
오미자주스 0.19±0.01 비검출 87.18±03.51 62.26±0.19
포도주스 1.21±0.07 0.06±0.01 120.62±0.29 48.19±0.13
오렌지주스 0.45±0.01 0.01±0.01 73.89±0.11 16.51±0.19
토마토주스 0.29±0.01 비검출 77.42±0.29 32.29±0.08
미나리추출물 0.31±0.01 0.01±0.00 0.99±0.04 0.10±0.00
미나리 추출물의 유용성분 분석 (단위: mg/g)
표 2의 결과에서처럼 미나리 추출물은 시판 사과, 오미자 및 토마토 주스보다 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량 역시 사과 및 오렌지 주스와 유사하였다. 미나리 추출물은 포도주스 및 오렌지 주스보다 총 폴리페놀 함량이 낮았으나, 시판 포도 및 오렌지 주스가 100% 과즙 음료임을 고려할 때, 미나리 추출물(40 w% 미나리)의 경우 총 폴리페놀 유용성분은 매우 높은 편임을 알 수 있다. 따라서, 미나리 음료는 우수한 항산화 및 항혈전 활성을 나타내리라 예측된다. 한편 미나리 음료의 총당 및 환원당 함량은 다른 과일 및 야채주스보다 매우 낮은 0.1 mg/g 수준을 나타내었다.
실시예 3: 본 발명의 미나리 추출물의 농도별 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티티 타임 및 혈소판 응집저해 활성 측정
조제된 미나리 추출물을 DMSO에 적당한 농도로 녹인 후, 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임을 측정하였으며, 그 결과는 표 3 및 도 1에 나타내었다. 대조구로는 항응고제인 아스피린을 사용하였다.
미나리 추출물과 아스피린의 항혈전 활성
최종 농도
(/mL)		 트롬빈 타임(초) 프로트롬빈 타임(초) 에이피티티 타임 (초)
미나리 아스피린 미나리 아스피린 미나리 아스피린
0 32.1 32.1 18.1 18.1 55.1 55.1
625 37.5 37.2 ND ND 108.5 ND
1000 37.5 ND 21.5 ND > 482 ND
1500 39.1 79.9 23.5 22.6 > 482 55.0
2500 ND 282.4 > 482 28.3 > 482 55.4
3.6 > 482 ND > 482 ND > 482 ND
5000 > 482 > 482 > 482 > 482 > 482 > 482
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 미나리 추출물은 1,500 ㎍/mL의 농도에서 39.1초의 트롬빈 타임을, 아스피린은 1,500 ㎍/mL의 농도에서 99.5초의 트롬빈 타임을 나타내어, 아스피린이 미나리 추출물보다 강력한 트롬빈 저해활성을 나타내었다. 그러나 5,000 mg/mL 농도에서는 모두 15배 이상 연장된 트롬빈 타임을 나타내었다. 한편 외인성 및 내인성 혈전 생성과 관계된, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 타임에서는 모두 미나리 추출물이 2.5 mg/mL 농도 이상에서부터는 정제된 아스피린보다 오히려 강력한 항혈전 효과를 나타내었다.
또 다른 혈전 생성의 주요원인은 혈소판 응집에 의해 나타나므로, 미나리 추출물의 혈소판 응집 저해 활성을 평가하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었으며, 미나리 추출물은 매우 강력한 혈소판 응집 저해능을 가지고 있음을 확인하였다.
미나리 추출물과 아스피린의 혈소판 응집 저해 활성
시료/대조구 강도
(Amplitude:ohm)		 기울기
(Slope)		 연장시간
(Lag time:초)		 하강면적
(Area under)
DMSO-1 19 9 4 177.8
DMSO-2 18 6 4 164.8
아스피린 0.25 mg/ml 9 1 15 68.7
미나리 추출물 0.25 mg/ml 3 0 72 18.3
실시예 4: 본 발명의 미나리 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 농도별 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티티 측정
상기 실시예 1에서 얻어진 미나리 추출액 1 Kg에 5리터의 에틸아세테이트를 가하고 상온에서 유기용매 분획을 실시하였으며, 감압회전 농축기를 이용하여 분획물을 분말화 한 결과 216 g을 회수하였다. 에틸아세테이트 분획물을 다시 DMSO에 녹인 후 항혈전 활성을 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다. 즉 미나리 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 미나리 추출물보다 더욱 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하였다.
미나리 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 항혈전 활성
최종 농도
(/mL)		 에틸아세테이트 분획
트롬빈 타임 (초) 프로트롬빈 타임(초) 에이피티티 타임 (초)
0 32.1 18.1 55.1
500 31.0 25.4 66.2
1000 31.1 > 482 > 482
1250 102.3 > 482 > 482
2500 > 482 > 482 > 482
5000 > 482 > 482 > 482
실시예 5: 본 발명의 미나리 추출물의 활성물질의 화학적 특성 및 안정성
상기 실시예 4에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 갑압건조하여 분말 조제한 후, 회수된 활성물질을 대상으로 인간 적혈구 용혈활성, 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 조정제된 활성물질은 100℃에서 2시간 처리, pH 2 (0.01 M HCl)에서의 2시간 처리, 혈장에서 2시간 처리시에도 활성의 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다. 또한 2,500 ug/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈활성은 나타나지 않았다.
실시예 6: 실시예 4의 에틸아세테이트 분획물의 단회경구독성 시험
4주령의 흰쥐를 한국화학연구소 안전성 연구센터 실험동물육종실에서 Sprague-Dawley계 흰쥐를 공급받아 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 150~300 Lux의 조도로 12시간 간격 (오전 8시~오후 8시)으로 조절되는 동물실험실에서 14일간 순화시킨 후, 10마리씩 구분하여 각각 실시예 4의 에틸아세테이트 분획물의 단회경구독성을 평가하였다. 먼저 각각의 시료를 DMSO에 녹인 후, 10마리에게 1,000 mg/kg의 농도로 각각 경구투여 후, 일주일간 생존여부와 병적 이상증후를 관찰하였으며, 이후 부검하여 각종 장기의 출혈 및 혈청 생화학적 검사를 실시하였다. 대조구로는 DMSO만을 경구투여하였다. 그 결과 생존율은 100%였으며, 병적 이상 징후나 장기 출혈이 관찰되지 않았으며, GPT, GOT의 혈청 생화학적 검사 역시 대조구와 비교하여 유의점은 확인되지 않았다. 따라서 미나리 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물의 낮은 농도의 사용은 부가적인 문제점을 야기하지 않으리라 판단되었다.

Claims (4)

  1. 미나리 추출물 또는 그의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    미나리 추출물이, 유기산 용액에 세절된 미나리를 침지하는 단계, 상기 유기산용액을 회전 진탕기를 사용하여 교반하는 단계, 및 상기 교반이 완료된 용액을 여과망을 사용하여 여과하는 단계를 포함하는 수득된 미나리 추출물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    미나리 추출물이, 열수에 미나리를 투입하는 단계, 15 내지 30분간 열수에 미나리를 유지하여 미나리액을 추출하는 단계, 및 추출된 미나리액을 냉각시키고 여기에 유기산을 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 미나리 추출물 또는 그의 에틸아세테이트 분획물을 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전증 개선용 기능성 건강식품 조성물.
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