KR20130040523A - Ｌ―형 젖산 생성 변이 균주 및 이를 이용한 젖산 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생성 재조합 미생물 및 이를 이용하여 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산하는 미생물에서 D-형 젖산 탈수소화효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃시킨 변이 균주 및 상기 균주를 이용하여 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 산업 바이오 분야 및 바이오폴리머 분야에서 열 안정성이 높은 PLA를 제조하는데 사용되는 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 대량 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 균주로부터 D-형 젖산 탈수소화효소(D-lactate dehydrogenase gene; D-LDH) 유전자를 녹아웃시킨 변이 균주, 및 상기 변이 균주를 이용한 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
합성 섬유, 플라스틱의 제조 등 다양한 분야에서 합성 고분자들이 사용되고 있는데, 이들은 대부분은 석유를 원료로 사용하여 만들어지며, 자연환경에서 잘 분해되지 않고, 제조과정에서도 여러 유해 물질이 배출된다. 따라서, 최근에는 합성 고분자 대신 재생 가능한 원료를 사용하고, 제조과정에서 해로운 유기용매를 사용하지 않으며, 재활용이 가능한 물질을 사용하려는 '녹색환경 기술'이 각광받고 있다. 상기 녹색환경 기술에서는 생물에서 합성되는 여러 가지 고분자인 바이오폴리머(biopolymer)를 사용한다. 바이오폴리머의 합성은 모두 생체 촉매를 담당하는 효소의 작용으로 이루어지기 때문에, 이를 이용하여 생명계에서 일어나는 화학을 흉내 내어 원하는 성능의 화학물질을 얻는다.
바이오폴리머의 대표적인 물질 중 하나인 폴리젖산(Polylactic acid; PLA)은 생체분해가능 플라스틱(biodegradable plastic)으로 이미 다양한 분야에서 널리 사용되고 있다. PLA는 지방족 폴리에스테르(aliphatic polyester)로서, 일부 유통 업체에서는 식품 포장, 전자렌지용 그릇 제조 등에서 사용될 뿐만 아니라, 의학분야에서도 봉합실(suture), 약물 전달 장치(drug delivery device)로서 다양하게 사용되고 있다. PLA는 L-형 또는 D-형의 두 가지 이성질체를 갖는데, 현재 산업적으로는 L-형 락티드(lactide) PLA 및 L-형/D-형 락티드 PLA가 널리 사용된다. L-형은 분자량이 매우 크며, 용융 변이 온도(melting transition tempature)는 분자량이 낮아짐에 따라 감소하고, L-형/D-형 락티드의 고분자는 상당히 무정형이고, 이에 상당하는 낮은 용융점을 갖는다. 저분자량의 PLA는 락티드(lactide)의 축합 중합에 의해 합성되며, 이 PLA는 커플링제(coupling agent)에 의해 연결되어 고분자량의 PLA로 합성되는데, 상기 고분자 PLA의 특성은 좋은 기계적 물성을 갖는데 필수적인 요소가 된다. 또한, PLA는 수많은 생분해성 플라스틱 중에서도 강도와 강성 같은 기계적 성질, 광택과 투명성 같은 물리적 성질, 내수와 내유성 같은 화학적 성질 및 안전과 위생성 같은 생물학적 성질이 뛰어나다는 것이 알려졌다. 하지만, PLA는 결정성 고분자임에도 불구하고 열 안정성은 현저히 낮기 때문에, 실제 산업이용성에 한계를 보여왔다.
최근 L-형의 단량체로 이루어진 PLA와 D-형의 단량체로 이루어진 PLA를 블렌딩하여 구조 복합체(stereo complex)라는 라세믹 크리스탈(racemic crystal)이 보고되었는데, 이 고분자는 기존의 PLA에 비해 50% 높은 녹는점(melting temperature)을 보여 기존의 PLA 한계로 알려진 열에 대한 안정성을 극복하려는데 새로운 대안을 제시하였다(Ishida et al, 2006, J Biosci Bioeng, 101, 172-177; Ikada et al, 1987, Macromolecules 20,904-906; Tsuji et al, 1991, Macromolecules, 24,5651-5656). 따라서, L-형 또는 D-형의 단량체로 이루어진 PLA를 제조하기 위해 광학 순도가 높은 젖산의 생산이 요구되고 있다.
젖산은 폴리젖산(polylactic acid; PLA)의 단량체로서, 자연계에서 흔히 볼 수 있는 하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acid)이다. 젖산의 종래 생산방법으로는 화학적으로 합성하는 화학적 합성법 및 생물을 이용하여 생산하는 생물학적 합성법이 있다. 화학적 합성법은 락토니트릴(lactonitrile)을 강산으로 가수분해(hydrolysis)하는 방법이 주로 사용되나, 이를 이용하여 생산된 젖산은 혼합된 L-형/D-형 젖산의 라세믹 형태로 생산된다(Datta et al, 1995, FEMS Microbiol Rev 16,221-231). 반면, 생물학적 합성법은 다양한 생물체를 이용하여 젖산을 생산하는 방법으로, 특히 미생물을 이용하여 발효를 통해 젖산을 생산하는 방법이 각광을 받고 있다. 상기 생물학적 합성법에서는, 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하기 위해 다양한 연구들이 진행되었는데, 특히 최근에는 비교적 유전자 조작이 쉬운 대장균을 이용하여 순수한 젖산을 생산하는 다양한 방법들이 발표되었다. 하지만 대장균은 원래 L-형 젖산 생산 능력이 없을 뿐만 아니라, 낮은 내산성 및 높은 당 농도에서 당을 완벽하게 대사하지 못한다는 단점이 있기 때문에(Volker et al, 2006, Curr Opin Microbiol, 9,268-274), 다른 대안적 순수 젖산을 얻기 위한 다른 방법이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하는 방법을 연구 노력한 결과, L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물로부터 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 D-형 젖산 탈수소화효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자의 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 이용하여 상동성 재조합(homologous recombination)을 통한 D-형 젖산 탈수소화효소 유전자를 녹아웃시킨 변이 균주를 제조하였다. 또한, 상기 D-형 젖산 탈수소화효소 유전자를 녹아웃시킨 변이 균주를 효모 추출물 농도 0 내지 12g/L을 포함한 균주 배양액을 사용하여 혐기성 및 약호기성(microaerobic) 및 pH 6 내지 pH 7의 조건에서 배양할 때, 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되는 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 높은 광학 순도를 가진 L-형 젖산을 이용하여 합성된 PLA는 기존의 PLA의 약점인 열에 대한 불안정성을 극복하고 본 발명의 광학 순도가 높은 L-형 젖산의 대량 생산 방법을 이용하여 PLA의 생산 단가를 절감시킴으로써, 본 기술이 젖산 및 PLA 상업화 기술에 유용하게 이용될 수 있음을 제시하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명의 시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 광학적으로 순수한 L-형 젖산을 생산하기 위해, L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 유전적으로 조작하여 D-형 젖산 탈수소화효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃시킴으로써 광학 순도가 높은 L-형을 생산하는 균주를 제공하고, 상기 균주를 사용하여 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-형 및 D-형 젖산을 생산하는 미생물로부터 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase gene; D-LDH) 유전자 제거를 통해 제조된 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 번호: 1을 포함하는 D-LDH 유전자를 녹아웃시켜, 수탁번호 KCTC12027BP로 기탁되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 번호: 2을 포함하는 D-LDH 유전자를 녹아웃시켜, 수탁번호 KCTC12028BP로 기탁되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계; 및
2) 단계 1)의 미생물에 대해 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 종배양하는 단계;
2) 단계 1)에서 종배양된 종배양액을 본배양에 접종시키는 단계;
3) 단계 2)에서 접종된 접종액을 혐기성 또는 약호기조건(microaerobic condition)에서 본배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 본배양된 본배양액에서 L-형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 L-형 젖산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 광학적으로 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 사용하여 합성한 PLA는 기존 PLA의 약점인 열에 대한 불안정성을 극복할 뿐만 아니라 PLA의 생산 단가를 절감시킴으로써, 젖산 및 PLA 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169가 실시예 2에 따라 제조된 재조합 벡터에 의해 형질전환(transformation)된 것임을 확인하는 결과는 나타내는 그림이다. 도 1의 A은 서열 번호: 1을 포함하는 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH)가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이 KCTC 3510를 확인한 것으로, 명시된 번호 1 및 2는 은 서열 번호: 4의 Erm(R) 및 서열번호: 5의 D-LDH(F)의 프라이머를 사용한 결과이고 명시된 번호 3은 마커이다. 도 1의 B는 서열 번호: 2를 포함하는 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH)가 녹아웃된 락토바실러스 파라카세이 KCTC 13169를 확인한 것으로, 명시된 번호 1은 마커이고 명시된 번호 3는 서열 번호: 3의 Erm(F) 및 서열번호: 5의 D-LDH(F)의 프라이머를 사용한 결과이며 명시된 번호 3은 서열 번호: 4의 Erm(R) 및 서열번호: 6의 D-LDH(R)의 프라이머를 사용한 결과이다.
도 2는 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510를 포도당 150g/L 및 250g/L를 포함하는 한천배지(agar medium)에서 배양할 때, D-형 젖산의 합성능력이 현저히 감소하는 것을 나타내는 그림이다.
도 3은 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 통기가 없는 혐기성 조건(non-aeration), 초기 8시간에만 질소 유입(1vvm)이 된 약호기성 조건과 지속적 질소 유입 또는 자연적 통기(natural aeration)의 호기성 조건에서 배양할 때, 혐기성 또는 약호기성 조건에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되는 것을 나타내는 그림이다. 도 3의 A는 OD610의 값 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타낸 그림이고, 도 3의 B는 도 3의 A에 상응하는 L-형 젖산 생산률을 나타낸 그림이다.
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0의 조건에서 배양할 때, 약산성 및 중성 pH에서 비교적 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되고, pH 6.0 내지 6.5에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 보다 효과적으로 생산되는 것을 나타내는 그림이다. 도 4의 A는 OD610의 값 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타낸 그림이고, 도 4의 B는 도 4의 A에 상응하는 L-형 젖산 생산률을 나타낸 그림이다.
도 5는 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 0%(w/v. 0g/L), 0.4%(w/v. 4g/L), 0.8%(w/v. 8g/L) 및 1.2%(w/v. 12g/L)의 효모추출물을 포함하는 배지에서 배양할 때, 0g/L 내지 12g/L의 효모추출물이 포함된 배지에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되는 것을 나타내는 그림이다. 도 5의 A는 OD610의 값 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타낸 그림이고, 도 5의 B는 도 5의 A에 상응하는 L-형 젖산 생산률을 나타낸 그림이다.
도 2는 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510를 포도당 150g/L 및 250g/L를 포함하는 한천배지(agar medium)에서 배양할 때, D-형 젖산의 합성능력이 현저히 감소하는 것을 나타내는 그림이다.
도 3은 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 통기가 없는 혐기성 조건(non-aeration), 초기 8시간에만 질소 유입(1vvm)이 된 약호기성 조건과 지속적 질소 유입 또는 자연적 통기(natural aeration)의 호기성 조건에서 배양할 때, 혐기성 또는 약호기성 조건에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되는 것을 나타내는 그림이다. 도 3의 A는 OD610의 값 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타낸 그림이고, 도 3의 B는 도 3의 A에 상응하는 L-형 젖산 생산률을 나타낸 그림이다.
도 4는 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0의 조건에서 배양할 때, 약산성 및 중성 pH에서 비교적 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되고, pH 6.0 내지 6.5에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 보다 효과적으로 생산되는 것을 나타내는 그림이다. 도 4의 A는 OD610의 값 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타낸 그림이고, 도 4의 B는 도 4의 A에 상응하는 L-형 젖산 생산률을 나타낸 그림이다.
도 5는 실시예 2에 따라 제조된 D-LDH가 녹아웃(knock-out)된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 0%(w/v. 0g/L), 0.4%(w/v. 4g/L), 0.8%(w/v. 8g/L) 및 1.2%(w/v. 12g/L)의 효모추출물을 포함하는 배지에서 배양할 때, 0g/L 내지 12g/L의 효모추출물이 포함된 배지에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되는 것을 나타내는 그림이다. 도 5의 A는 OD610의 값 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타낸 그림이고, 도 5의 B는 도 5의 A에 상응하는 L-형 젖산 생산률을 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물에서 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃시킴으로써 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 번호: 1을 포함하는 D-LDH 유전자를 녹아웃시켜, 수탁번호 KCTC12027BP로 기탁되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 번호: 2을 포함하는 D-LDH 유전자를 녹아웃시켜, 수탁번호 KCTC12028BP로 기탁되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주일 수 있고, 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei) KCTC 3510(ATCC 25302) 및 KCTC 13169 일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 바람직하게는 조건 혐기성 균주(facultative anaerobic organisms)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 일반적으로 많은 균주 및 동물세포에서는 산소 있을 때 발효 대신에 세포 호흡을 거치고, 산소가 없거나 부족할 때만 발효과정이 일어난다. 반면, 조건 혐기성 균주는 산소가 있을 때조차도 발효 및 호흡 과정을 모두 거치게 된다.
본 발명에서 사용되는 상기 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 젖산 발효, 바람직하게는 동종젖산 발효를 하는 미생물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 여기서 상기 젖산 발효(lactic acid fermentation)는 포도당(glucose), 과당(fructose), 및 자당(sucrose)와 같은 당류(sugars)가 세포 에너지 및 대사 부산물인 젖산을 만들어내는 생물학적 과정을 의미한다. 상기 젖산 탈수소화 효소(lactate dehydrogenase)는 NADH 및 NAD+의 상호전환(interconversion)을 매개하여, 이와 동시에 피루브산(pyruvate) 및 젖산(lactate)의 상호전환을 촉매하는 것이다. 상기 젖산 발효는 동종젖산 발효 및 이종젖산 발효의 두 가지 종류가 있다. 동종젖산 발효(homolactic fermentation)는 피루브산의 두 분자 모두를 젖산으로 전환하여, 결국 두 개의 젖산을 생성하는 반면, 이종젖산 발효(heterolactic fermentation)는 피루브산의 한 분자는 젖산으로 전환시키고 다른 피루브산의 한 분자는 에탄올 및 이산화탄소로 전환시켜 결국 한 개의 젖산이 생성된다. 따라서, 동종젖산 발효는 부산물(byproduct)로서 가스가 생성되지 않는 유일한 호흡 과정 중 하나로 매우 특별한 것이다.
본 발명에서 녹아웃시키기 위한 D-형 젖산 탈수소화 효소는 D-형 젖산의 생산에 필수적인 효소로서, 구체적으로는 D-형 젖산 탈수소화 효소 2, 보다 더 구체적으로는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2로 기재되는 것을 포함하는 D-형 젖산 탈수소화 효소 2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-LDH) 유전자가 녹아웃 락토바실러스 균주를 제공한다. 보다 구체적으로, 서열 번호: 1을 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510는 2011년 10월 4일, 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC12027BP로 기탁되었고, 서열 번호: 2를 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169는 2011년 10월 4일, 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC12028BP로 기탁되었다.
또한, 본 발명은 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 하기의 방법과 같은 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계; 및
2) 단계 1)의 미생물에 대해 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 단계.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 L-형 젖산 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 구체적으로 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주일 수 있고, 보다 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei) KCTC 3510(ATCC 25302) 및 KCTC 13169 일 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 D-형 젖산 탈수소화 효소는 D-형 젖산의 생산에 필수적인 효소로서, 구체적으로는 D-형 젖산 탈수소화 효소 2, 보다 더 구체적으로는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2로 기재되는 것을 포함하는 D-형 젖산 탈수소화 효소 2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 젖산 탈수소화 효소는 M 및 H 아단위 단백질(subunit protein)의 4분자체(tetramer)로 구성되어 있으며, 그것을 구성하고 있는 4개의 아단위(subunit)에 따라 5가지로 아형(isoform)이 나뉜다. 인간에서, LDH(lactate dehydrogenase) 1은 심장 및 적혈구(red blood cell; RBC)에 주로 있으며, LDH 2는 세망내피계(reticuloendothelial system)에, LDH 3은 폐에, LDH 4는 신장, 태반, 및 췌장에, 및 LDH 5는 간 및 가로무늬근(striated muscle)에 주로 분포한다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)는 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키기 위해, 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 미생물로 도입한 후 상동성 재조합(homologous recombination)에 의하여 유전자를 녹아웃시킬 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactate dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키기 위한 녹아웃 벡터는 유산균(lactic acid bacteria), 보다 구체적으로는 락토바실러스(lactobacillus), 보다 더 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)에서 작동 가능해야 하지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 D-LDH 유전자를 녹아웃(knock-out)시키기 위한 녹아웃 벡터는 pTOPOdelAP인 것을 특징으로 하는 녹아웃 벡터를 이용하는 것이 바람직 하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 D-LDH 유전자를 녹아웃(knock-out)시키기 위한 녹아웃 벡터는 형질전환된 미생물 또는 재조합된 벡터(vector)의 선별을 위한 마커로서 항생제 내성 유전자, 보다 구체적으로는 각각 에리트로마이신(erythromycin resistance gene) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol)을 사용할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 광학적으로 순수한 L-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물, 보다 구체적으로는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-LDH) 유전자가 녹아웃 락토바실러스 균주을 제조하였다. 보다 구체적으로, 서열 번호: 1을 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510는 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC12027BP로 기탁되었고, 서열 번호: 2를 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169는 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC12028BP로 기탁되었다. 그 중에서, 서열 번호 1을 포함하는 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510를 포도당 150g/L 및 250g/L를 포함하는 한천배지(agar medium)에서 를 배양할 때, 두 농도조건 모두에서 D-형 젖산 합성 능력이 현저히 감소하는 것을 보였다(도 2). 보다 구체적으로, 포도당 150g/L를 포함한 배지에서 상기 유전적으로 조작된 재조합 미생물을 배양할 경우 0.05% 이하의 D-형 젖산 생산을 보였으며, 보다 많은 양의 포도당(250g/L)을 포함한 배지에서 상기 유전적으로 조작된 재조합 미생물을 배양할 경우에도 0.1% 이하의 D-형 젖산 생산 능력을 보였다. 따라서 상기 유전적으로 변형된 재조합 미생물로부터 생산된 젖산은 99.9% 이상의 광학적으로 순수한 L-형 젖산임을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 광학적으로 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 이용하여 광학 순도 높은 L-형 젖산을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기의 광학적으로 순도가 높은 L-형 젖산 대량 생산 방법은 하기의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
1) 종배양하는 단계;
2) 단계 1)의 종배양을 본배양에 접종시키는 단계;
3) 단계 2)의 접종액을 혐기성 또는 약호기조건(microaerobic condition)에서 본배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 본 배양액에서 L-형 젖산을 회수하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 미생물을 종배양 및 본배양하기 위한 배지는 미생물, 보다 구체적으로는 락토바실러스 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 배지이나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 종배양액 접종은 종배양액이 610nm에서의 흡광도가 0.5 내지 10, 구체적으로는 1 내지 7, 보다 더 구체적으로는 2 내지 5에 도달할 때 접종할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 단계 2)에 있어서, 접종되는 종배양액은 본배양액의 1% 내지 30%, 구체적으로 5% 내지 20%, 보다 더 구체적으로 10% 내지 15%(v/v)를 본배양액에 접종시킬 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 종배양 또는 본배양시 사용되는 배지는 pH 5.0 내지 8.5, 구체적으로 pH 6.0 내지 7.0, 보다 더 구체적으로 pH 6.5일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 배양은 48 내지 96 시간 동안 실시될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 배양 온도는 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 37℃일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 배지에 포함되는 효모 추출물(Yeast Extract)은 0g/L 내지 12g/L, 보다 구체적으로는 8g/L 내지 12g/L일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 배양 조건은 혐기성 또는 약호기조건(microaerobic condition), 구체적으로는 질소유입은 0 내지 0.1vvm일 때 효과적으로 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하고, 보다 구체적으로는 혐기성 조건에서 가장 효과적으로 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예 2에 의해 제조된 서열 번호: 2의 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 이용하여 광학 순도가 높은 L-형 젖산 대량 생산 조건을 확립하고자, 통기가 되지 않는(non aeration) 혐기성 조건과 초기 8시간 동안만 질소유입(1vvm의 질소)이 있는 약호기 조건(microaerobic condition)과 자연적 통기(natural aeration) 또는 지속적 질소 유입이 있는 호기성 조건, 다양한 효모추출물의 농도 조건, 및 다양한 pH 조건을 확인한 결과, 혐기성 또는 약 호기성 조건에서, 효모 추추물이 0 내지 12g/L(1.2%)를 포함하는 배지를 이용하여, pH가 6 내지 7일 때 비교적 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 효과적으로 생산되는 것을 확인하였다(도 3 내지 5). 보다 구체적으로, 혐기성 조건에서, 효모추출물 농도가 8g/L(0.8%) 내지 12g/L(1.2%), pH가 6.5로 조절되었을 때 광학 순도가 높은 L-형 젖산이 가장 효과적으로 생산되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 이용하여 광학적으로 순수한 L-형 젖산 대량 생산 방법을 제공하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.
배양조건 및 사용된 균주
균주를 배양하여 젖산(lactic acid)을 생산하기 위해 사용된 기본 배지는 데 만-로고사-샤프(de Man-Rogosa-Sharpe; MRS) 액체 배지를 사용하였고, 37℃에서 정치배양(standing culture)을 하였다. 상기 배지의 조성은 효모 추출물(Yeast extract) 15g/L, Na-아세테이트(acetate) 1g/L, K2HPO4 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, MgSO4·H2O 0.2g/L, MgSO4·7H2O 0.356g/L, MnSO4·H2O 0.03g/L, FeSO4·7H2O 0.03g/L를 포함한다. 기질로는 포도당(glucose) 150g/L 또는 250g/L를 사용하였다. 또한, 플라스미드를 포함한 균주들을 배양하기 위해서 두 가지 항생제, 에리토마이신(erythomycin; Erm) 및 클로람페니콜(chloramphenicol; Cm)을 각각 5μg/ml, 10μg/ml을 사용하였다.
L-형 젖산을 생산하는 균주 중에서 가장 높은 젖산 농도와 균주 생장 속도를 보인 균주를 이용하기 위해, MRS 배지를 이용하여 37℃에서 정치배양을 한 결과 하기 표 1과 같은 결과의 다양한 균주(KCTC에서 분양받음)의 생장 속도를 확인하였다.
| 균주명(KCTC) | 젖산(LA) 농도 | D-형 젖산(%) | L-형 젖산(%) |
| 3959 | 10.706 | 0 | 100 |
| 3635 | 16.391 | 100 | 0 |
| 3034 | 15.022 | 100 | 0 |
| 3141 | 19.644 | 59.4 | 40.6 |
| 13415 | 9.229 | 0 | 100 |
| 13169 | 19.905 | 0.5 | 99.5 |
| 3801 | 20.085 | 57.6 | 42.4 |
| 13412 | 16.504 | 100 | 0 |
| 3926 | 10.622 | 0 | 100 |
| 5187 | 2.076 | 0 | 100 |
| 3733 | 10.456 | 100 | 0 |
| 3718 | 10.357 | 100 | 0 |
| 13302 | 10.157 | 100 | 0 |
| 3526 | 10.683 | 100 | 0 |
| 3899 | 10.67 | 0 | 100 |
| 5085 | 16.487 | 55.0 | 45.0 |
| 3652 | 10.328 | 100 | 0 |
| 3527 | 11.303 | 100 | 0 |
| 3722 | 8.421 | 100 | 0 |
| 3529 | 11.109 | 93.2 | 6.8 |
| 3528 | 11.503 | 92.1 | 7.9 |
| 3721 | 11.276 | 90.3 | 9.7 |
| 3524 | 11.359 | 91.5 | 8.5 |
그 결과, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3801 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3141은 생산되는 D-형 젖산 및 L-형 젖산의 비율이 좋지 않기 때문에 이들을 제외하고, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169가 가장 좋은 생장 속도를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 이를 바탕으로 L-형저저산을 생산하기 위한 기본 균주로 사용하였으며, 상기 사용된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510은 ATCC 25302와 동일한 균주로서 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169 균주와 아종까지 동일하며, 전 유전체 서열(whole genome sequence)가 되어있으므로, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510 균주의 서열을 바탕으로 녹아웃(knock-out)을 진행하였다.
D-형 젖산 탈수소화효소 2 유전자가 녹아웃(
knock
-
out
)된 재조합 균주의 제조
균주가 갖고 있는 D-형 젖산 탈수소화효소 2 (D-lactate dehydrogenase 2; D-LDH2) 유전자를 녹아웃시키기 위하여 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 이용하여 균주를 형질전환시켰다.
녹아웃 벡터를 제작하기 위하여, pCR 2.1 TOPO(Invitrogen, USA)을 제한효소인 DraI으로 절단한 후, 3.2kb의 절편을 자가 결합(self-ligation)하여, pTOPOdelAP 벡터를 수득하였다. 형질도입된 균주를 선별하기 위한 마커로서, 에리트로마이신 내성 유전자(Erythromycin resistance gene)를 pAMbeta 1(gene bank accession number GU128949)로부터 정방향 프라이머(forward primer): 5'-AAGCTTGCAAACTTAAGAGTGTGTT-3'(서열 번호: 3) 및 역방향 프라이머(reverse primer): 5'-AAGCTTCCACCAATACCCAAAA-3'(서열 번호: 4)를 이용하여 1.3kb의 절편을 수득한 후, Taq 중합효소가 포함된 ExPrime Taq Premix(Genet Bio, Korea), 20pmol의 프라이머, 100ng의 플라스미드 DNA를 포함한, 최종 부피를 20μl로 반응액을 PCR을 통하여 상기 플라스미드 DNA를 증폭시켰다. 94℃, 5분 - [94℃, 30초(변성; denaturation) - 54℃, 30초(어닐링; annealing) - 72℃, 60초(신장; elongation)] x 30 사이클(cycle) - 72℃,10분(확장)의 조건으로 PCR으로 수행하였고, 그 후 제한효소인 HindIII로 절단하였다. HindIII로 절단한 단편을 pTOPOdelAP에 삽입하여, pTOPOdelAPErm 벡터를 수득하였다. D-LDH의 녹아웃을 위하여, 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) KCTC 13169와 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) KCTC 3510(ATCC25302) 균주의 D-LDH 유전자 절편을 획득하기 위하여, 정방향 프라이머(Forward Primer): 5'-GAATTCATGCACATAAGAAAGGATGATATC-3'(서열 번호: 5)와 역방향 프라이머(Reverse Primer): 5'-GGTACCTTACTGACGAGTTTCGATGTCATTC-3'(서열 번호: 6)를 이용하여 95℃, 5분 - [95℃, 30초(변성; denaturation) - 54℃, 30초(어닐링; annealing) - 72℃, 60초(신장; elongation)] x 30 사이클(cycle) - 72℃,7분(확장)의 조건으로 PCR으로 수행한 후 pCR2.1TOPO(Invitrogen)에 클로닝(cloning)한다. 상기 벡터를 EcoRV/XmnI의 제한효소로 절단하여, 600bp의 단편을 얻은 후, EcoRV로 절단한 pTOPOdelAPErm에 삽입하여 재조합 플라스미드를 만들었다.
상기 재조합 플라스미드를 모 균주에 도입하여 단일 교차 상동 재조합(single cross-over homologous recombination)에 의한 녹아웃 돌연변이(knock-out mutant)를 만들었다. 그 후, 상기 수득한 플라스미드를 균주에 도입시키기 위해, 테레사(Teresa) 방법을 사용하여(M. Teresa Alegre, M. Carmen Rodriguez, Juan M. Mesas. 2004. Transformation of Lactobacillus plantarum by electroporation with in vitro modified plasmid DNA. FEMS Microbiology.241:73-77) 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하였다. 형질전환(transformation)은 전기침공(electroporation)으로 Gene PulserII(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)장치를 사용하여, 2.0kV, 200Ω, 25μF의 전기 충격을 주었다. 그 후 500ul의 MRS를 첨가하여 3시간 배양한 후, 항생제인 Erm 및 Cm을 첨가한 MRS 한천배지에 도말하였다. 37℃에서 3일간 배양 후 분리된 균을 얻어서 MRS 액체 배지에 접종, 배양한 후 플라스미드를 추출하고, 도면의 간단한 설명에 기재되어 있는 프라이머를 사용하여 상기와 같은 조건으로 PCR을 한 후 전기영동으로 그 크기를 확인하여, 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510 및 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169에서 해당 플라스미드의 형질도입을 확인하였다(도 1). 서열 번호: 1을 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510는 2011년 10월 4일, 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC12027BP로 기탁되었고, 서열 번호: 2를 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169는 2011년 10월 4일, 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC12028BP로 기탁되었다.
D-형 젖산 탈수소화효소 2(D-
LDH2
) 유전자 녹아웃된 형질전환 균주에서 광학 순도가 높은 L-형 젖산의 확인
KCTC12027BP의 기탁번호를 갖는, 상기 실시예 2에서 만들어진 서열 번호: 1을 포함하는 D-LDH를 녹아웃시킨 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510가 D-형 젖산 생산능력이 감소하고 광학적으로 순수한 L-형 젖산의 생산이 가능한지 알아보고자 본 실험을 수행하였다.
상기 균주를 실시예 1에 기재된 것과 같이 포도당을 탄소원으로 하는 한천배지를 사용하여 배양한였다. 녹아웃 돌연변이(Knock-out mutant) 및 젖산(lactic acid)의 광학 순도(optical purity)를 측정하기 위해, 메가자임(K-LATE, K-DATE; Megazyme, Ireland) 효소 키트(kit) 및 HPLC(high performance chromatography)를 사용하였다. 포도당과 젖산의 농도는 HPLC로 측정하였고, 이때 HPLC조건은 UV 210nm, CHIRALPAK(Daicel, Japan) MA+ 컬럼(column): 0.002M CuSO4, 1.0ml/min, 25 ℃ 및 RI 탐지기(detector), Aminex HPX-87H 컬럼(column): 0.008N H2SO4, 0.6ml/min, 50 ℃였다.
그 결과, 포도당 150g/L 및 250g/L를 포함하는 한천배지(agar medium)에서 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 균주를 배양할 때, 두 농도조건 모두에서 D-형 젖산의 합성능력이 현저히 감소하였다(도 2).
약호기
,
pH
6-7 및 5g/L 내지 20g/L의 효모 추출물 농도에서 D-형 젖산 탈수소화효소 2(D-
LDH2
) 유전자가 녹아웃된
락토바실러스
배양시 효과적인 L-형 젖산 생산의 확인
실시예 2 및 3을 통하여, L-형 및 D-형 젖산 모두 합성할 수 있는 능력을 가진 락토바실러스 파라카세이 균주에서 D-LDH를 녹아웃시켰을 때 D-형 젖산을 생산할 수 있는 능력이 현저히 저하됨과 동시에 광학적으로 순수한 L-형 젖산을 생산한다는 것을 알 수 있었다. 따라서, L-형 젖산의 대량 생산을 통해 이를 산업화시키기 위해, L-형 젖산의 생산능력이 최대가 되는 조건을 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다.
<
실시예
4-1>
약호기조건에서
D-형 젖산 탈수소화효소 2(D-
LDH2
) 유전자가 녹아웃된
락토바실러스의
효과적 L-형 젖산 생산능력의 확인
광학 순도가 높은 L-형의 대량 생산이 수월한 조건을 알아보기 위해, 실시예 2에서 제조된 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 균주를 통기가 없는 혐기성 조건(non-aeration), 초기 8시간에만 질소 유입(1vvm)이 된 약호기성 조건과 지속적 질소 유입 또는 자연적 통기(natural aeration)의 호기성 조건에서 배양하여 L-형 젖산이 효과적으로 생산이 가능한 조건을 알아보았다.
효모 추출물(Yeast extract) 10g/L, Na-아세테이트(acetate) 1g/L, K2HPO4 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, MgSO4 7H2O 0.2g/L, MnSO4 0.03g/L, FeSO4 0.03g/L 및 포도당(glucose) 200g/L를 포함한 배지에서 수탁번호 KCTC12028BP를 갖는, 상기 실시예 2에서 제조된 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 배양한 후, 610nm에서 OD값을 측정함으로써 생산된 L-형 젖산 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타내었다. 상기 균주의 배양은 37℃에서 56시간까지 수행되었으며, 매 8시간마다 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 상기 균주는 약호기 및 혐기성 조건에서 비교적 효과적인 L-형 젖산의 생산을 보였고, 가장 효과적으로는 혐기성 조건에서 높은 L-형 젖산의 생산을 나타내었다(도 3).
<
실시예
4-2>
pH
6-7에서 D-형 젖산 탈수소화효소 2(D-
LDH2
) 유전자가 녹아웃된
락토바실러스의
효과적 L-형 젖산 생산능력의 확인
광학 순도가 높은 L-형의 대량 생산이 수월한 pH 조건을 알아보기 위해, 실시예 2에서 만들어진 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 균주를 다양한 pH, 즉 pH 6.0, pH 6.5 및 pH 7.0의 조건에서 배양하였다.
효모 추출물(Yeast extract) 10g/L, Na-아세테이트(acetate) 1g/L, K2HPO4 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, MgSO4 7H2O 0.2g/L, MnSO4 0.03g/L, FeSO4 0.03g/L 및 포도당(glucose) 160g/L를 포함하는 배지에서 수탁번호 KCTC12028BP를 갖는, 상기 실시예 2에서 제조된, D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 배양한 후, 610nm에서 OD값을 측정함으로써 생산된 L-형 젖산 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타내었다. 상기 균주의 배양은 37℃, 200prm에서 40시간까지 수행되었으며, 매 8시간마다 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 상기 형질전환된 균주는 약 산성 및 중성 조건 모두에서 비교적 높은 L-형 젖산 생산능력을 나타내었고, 특히 pH 6.5 조건에서 가장 높은 L-형 젖산 생산능력을 보였다(도 4).
<
실시예
4-3> 효모추출물 15g/L에서 D-형 젖산 탈수소화효소 2(D-
LDH2
) 유전자가 녹아웃된
락토바실러스의
효과적 L-형 젖산 생산능력의 확인
광학 순도가 높은 L-형의 대량 생산이 수월한 조건을 알아보기 위해, 실시예 2에서 만들어진 D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 균주를 다양한 농도, 즉 0%(w/v. 0g/L), 0.4%(w/v. 4g/L), 0.8%(w/v. 8g/L) 및 1.2%(w/v. 12g/L)의 효모추출물을 포함한 배지의 조건에서 배양하였다.
Na-아세테이트(acetate) 1g/L, K2HPO4 0.5g/L, KH2PO4 0.5g/L, MgSO4 7H2O 0.2g/L, MnSO4 0.03g/L, FeSO4 0.03g/L, 포도당(glucose) 180 g/L 및 상기 명시된 것과 같이 다양한 농도의 효모 추출물(Yeast extract)을 포함한 배지에서 수탁번호 KCTC12028BP를 갖는, 상기 실시예 2에서 제조된, D-LDH가 녹아웃된 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169를 배양한 후, 610nm에서 OD값을 측정함으로써 생산된 L-형 젖산 및 남아있는 글루코오즈(glucose)의 양을 나타내었다. 상기 균주의 배양은 37℃, 200prm에서 56시간까지 수행되었으며, 매 8시간마다 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 효모 추출물이 0g/L 내지 12g/L(0% 내지 1.2%)일 때 비교적 높은 L-형 젖산 생산 능력을 보였고, 보다 구체적으로 8g/L 내지 12g/L(0.8% 내지 1.2%)에서 보다 효과적인, 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산 능력을 보였다(도 5).
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology
<120> L-lactic acid producing genetically modified microorganisms and
the method for preparing L-lactic acid using the same
<130> 11p-08-14
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 1
aatatttcaa gcaatgggcc aaggatacag gcaacacact tgaataccat acagaatttc 60
tcgatgaaaa caccgttgaa tgggctaaag ggtttgatgg catcaattca ttgcagacaa 120
cgccatatgc agccggcgtt tttgaaaaaa tgcacgcgta tggtatcaag ttcttgacga 180
ttcggaatgt gggtacggat aacattgata tgactgccat gaagcaatac ggcattcgtt 240
tgagcaatgt accggcttat tcgccagcag cgattgctga atttgctttg accgatactt 300
tgtacttgct acgtaatatg ggtaaagtac aggcgcaact acaggcgggc gattatgaaa 360
aagcgggcac cttcatcggt aatgaactcg gtcagcaaac cgttggcgtg atgggcaccg 420
gtcatattgg gcaggttgct atcaaactgt tcaaagggtt tggcgccaaa gtgattgctt 480
acgatcctta tccaatgaag ggcgatcacc cagattttga ctatgtcagc cttgaagacc 540
tctttaagca aagtgatatc 560
<210> 2
<211> 560
<212> DNA
<213> Lactobacillus paracasei
<400> 2
aatatttcaa gcaatgggcc aaggatacag gcaacacact tgaataccat acagaatttc 60
tcgatgaaaa caccgttgaa tgggctaaag ggtttgatgg catcaattca ttgcagacaa 120
cgccatatgc agccggcgtt tttgaaaaaa tgcacgcgta tggtatcaag ttcctgacga 180
ttcggaatgt gggtacggat aacattgata tgactgccat gaagcaatac ggcattcgtt 240
tgagcaatgt accggcttat tcgccagcag cgattgctga atttgctttg accgatactt 300
tgtacttgct acgtaatatg ggtaaagtac aggcgcaact acaggcgggc gattatgaaa 360
aagcgggcac cttcatcggt aaggaactcg gtcaacaaac cgttggcgtg atgggcaccg 420
gtcatattgg gcaggttgct atcaaactgt tcaaaggctt tggcgccaaa gtgattgctt 480
acgatcctta tccaatgaag ggcgatcacc cagattttga ctatgtcagc cttgaagacc 540
tctttaagca aagtgatatc 560
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
aagcttgcaa acttaagagt gtgtt 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
aagcttccac caatacccaa aa 22
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
gaattcatgc acataagaaa ggatgatatc 30
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
ggtaccttac tgacgagttt cgatgtcatt c 31
Claims (10)
1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계; 및
2) 단계 1)의 미생물에 대해 D-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(D lactic acid dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.
2) 단계 1)의 미생물에 대해 D-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(D lactic acid dehydrogenase; D-LDH) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 미생물은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)인 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 D-형 젖산 탈수소화 효소 유전자는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 녹아웃(knock-out) 시키는 방법은 pTOPOdelAP 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.
제 1항의 제조 방법에 의해서 제조된, 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물.
수탁번호 KCTC12027BP로 기탁되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물.
수탁번호 KCTC12028BP로 기탁되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물.
1) 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 광학 순도가 높은 L-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 종배양하는 단계;
2) 단계 1)에서 종배양된 종배양액을 본배양에 접종시키는 단계;
3) 단계 2)에서 접종된 접종액을 본배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 본배양된 본배양액에서 L-형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 L-형 젖산 생산 방법.
2) 단계 1)에서 종배양된 종배양액을 본배양에 접종시키는 단계;
3) 단계 2)에서 접종된 접종액을 본배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 본배양된 본배양액에서 L-형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 L-형 젖산 생산 방법.
제 8항에 있어서, 종배양액 또는 본배양액은 pH가 6 내지 7이고, 효모 추출물 농도는 0g/L 내지 12g/L인 것을 특징으로 하는 L-형 젖산 생산 방법.
제 8항에 있어서, 종배양 또는 본배양은 질소가 0 내지 0.1vvm으로 유입된 혐기성 또는 약호기조건(microaerobic condition)에서 배양되는 것을 특징으로 하는 L-형 젖산 생산 방법.
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-
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