KR20130034326A - 전기장을 이용한 ｄｎａ 증착 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 고분자 표면에 DNA를 증착하기 위하여 사용하는 원료 DNA 용액에 전기장을 형성한 상태에서 고분자 표면에 DNA를 증착한다. 즉, 본 발명에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법은, 실리콘 웨이퍼에 스핀 캐스팅으로 PMMA 막을 형성하는 단계와, 상기 PMMA 막에 증착할 DNA를 포함하는 DNA 용액을 준비하는 단계와, 상기 DNA 용액에 상기 PMMA 막이 형성된 상기 실리콘 웨이퍼를 담근 상태에서 상기 DNA 용액에 전기장을 인가하여 상기 PMMA 막 상에 DNA를 증착하는 단계를 포함하여 이루어진다.

Description

전기장을 이용한 ＤＮＡ 증착 방법{Electric-field assisted Deposition of DNA on polymer surfaces}
본 발명은 DNA를 고분자 표면에 증착하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 전기장을 이용하여 고분자 표면에 DNA를 증착시켜 증착 속도와 증착 밀도를 높일 수 있는 DNA의 효율적인 증착 방법에 관한 것이다.
DNA의 표면 상호작용에 대한 연구는 DNA의 매핑, DNA 염기서열 결정(sequencing), DNA 분석 등과 같은 다양한 응용분야에 적용되고 있다. 이러한 응용분야와 관련하여 DNA 분자를 매우 효율적으로 증착하는 것이 중요하다.
DNA 코밍(combing)은 균일하게 연장된 DNA 배열을 얻기 위한 방법으로, 용액 속의 DNA를 기체상(air phase)으로 만들어 고분자 표면에 형성된 DNA에 부착되어 연장되도록 한다. 종래 기술에 따르면 DNA 코밍은 PMMA (polymethylmetacrylate) 표면에서 가장 좋은 수율을 나타내며, DNA 용액의 산도(pH)에 크게 좌우되고, 0.1M NaOH와 20mM MES의 6:50 체적비의 혼합물 (6:50 용액)에서 가장 좋은 결과를 나타낸다.
본 발명은 상술한 바와 같은 기술적 배경에서 안출된 것으로서, 고분자 표면에 DNA를 증착함에 있어서 빠른 속도와 높은 밀도의 DNA 증착 결과를 얻을 수 있는 DNA 증착 방법을 제공하는 것을 그 과제로 한다.
이와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 고분자 표면에 DNA를 증착하기 위하여 사용하는 원료 DNA 용액에 전기장을 인가하여 고분자 표면에 DNA를 증착한다.
즉, 본 발명에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법은, 실리콘 웨이퍼에 스핀 캐스팅으로 PMMA 막을 형성하는 단계와, 상기 PMMA 막에 증착할 DNA를 포함하는 DNA 용액을 준비하는 단계와, 상기 DNA 용액에 상기 PMMA 막이 형성된 상기 실리콘 웨이퍼를 담근 상태에서 상기 DNA 용액에 전기장을 인가하여 상기 PMMA 막 상에 DNA를 증착하는 단계를 포함하여 이루어진다.
여기에서, 상기 전기장은 백금 와이어로 이루어진 양 전극과 금도금된 실리콘 웨이퍼로 이루어진 음 전극 사이에 형성될 수 있다.
상기 전기장은 교류 전원에 의하여 생성될 수 있으며, 이 경우 전극과 고분자 표면의 이온 형성을 막을 수 있다.
또한, DNA를 증착하는 단계에서는 상기 실리콘 웨이퍼의 상기 PMMA 막이 형성된 면이 상기 전기장을 발생시키는 전극 중 음의 전극과 마주보도록 배치하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 고분자 표면에 DNA를 증착하는 과정에서 DNA 용액에 전기장을 인가하여 증착함으로써, DNA 증착 수율을 획기적으로 높일 수 있다. 실험결과에 따르면 125ng/ml DNA 용액을 10.64V/cm의 전기장을 일으켜 증착한 경우의 증착 수율이 전기장이 없는 경우의 2.5mg/ml DNA 용액을 사용한 것과 같아 DNA 증착의 효율이 20배 증가하였다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 장치의 구성을 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 장치에서 DNA가 움직이는 방향을 나타낸 것이다.
도 4a와 도 4b는 증착된 DNA를 촬영한 사진으로서, 각각 종래기술과 본 발명의 실시예에 따른 방법에 따라 증착된 DNA를 촬영한 것이다.
도 5a 내지 도 5d는 DNA 용액의 농도와 전기장을 변화시키며 증착한 DNA 밀도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 DNA 용액의 농도와 전기장의 변화에 따른 DNA 증착 밀도를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 한편, 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
이하에서, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법에서는, 도 1에 나타난 바와 같이, 먼저 스핀 캐스팅으로 PMMA 막을 형성한 고분자 표면을 준비하고(S110), 고분자 표면에 DNA를 증착하기 위해 사용되는 DNA 용액을 준비한다(S120).
다음, 전기장을 이용하여 DNA를 증착하기 위하여 전기장을 형성하기 위한 준비를 행한다(S130). 전기장 형성을 위한 전극 등이 준비되면, 전기장을 인가한 상태에서 고분자 표면에 DNA를 증착한다(S140).
이하에서는, 도 1에 도시된 각 단계에 대하여 좀 더 자세히 설명하기로 한다.
(1) 고분자 표면의 준비
DNA를 증착하기 위한 고분자 표면을 형성하기 위하여, 먼저 실리콘 웨이퍼를 다이아몬드 커터로 약 10*10 mm 크기로 잘라 준비한다. 다음, 절단에 따라 발생한 실리콘 먼지를 질소 기체를 이용하여 제거한다. 유기 오염을 제거하기 위하여 웨이퍼를 메탄올 또는 에탄올에 담근 후 15분간 초음파 처리하고, 3:1 0.1M 황산: 0.1M 과산화수소 용액에서 적어도 15분간 초음파 처리한다. 다음 웨이퍼를 중성수(deionized water: DI water)로 세 번 세척한다.
세척 후, 스핀 캐스팅(spin casting)으로 실리콘 웨이퍼에 PMMA (polymethylacrylate) 박막을 형성한다. 각 웨이퍼는 2.38*102 RPM, 7.2V에서 1분 동안 세 번 스핀되는데, 실리콘 웨이퍼 위의 중성수를 건조하기 위하여 아무런 물질 없이 한 번 스핀되고, 웨이퍼의 표면에 존재하는 불순물을 용해하기 위하여 순수 톨루엔으로 한 번 스핀되며, 마지막으로 PMMA가 15mg/ml로 톨루엔에 용해된 용액으로 한 번 스핀된다. PMMA의 두께는 타원계(ellipsometer)(Rudolf Auto EL)로 측정할 수 있으며, 600-800Å으로 한다. 다음, 최대 1*107 torr의 압력을 갖는 이온펌프 진공오븐(Perkin Elmer) 내에서 105℃로 적어도 60분간 웨이퍼를 연결(anneal)한다.
(2) DNA 용액의 준비
10% 원료 DNA 용액, 10% YoYo-1(invitrogen), 80% 완충 용액을 45℃ 오븐에서 120분간 배양하여 λ-DNA를 YoYo-1으로 염색한다. DNA 용액의 완충 용액은 0.1M 수산화나트륨(NaOH)과 20mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)를 6:50 NaOH:MES 체적 비(volume ratio)로 혼합하여 사용한다. 10% DNA 용액을 6:50 MaOH:MES 용액에 희석하여 다양한 농도의 DNA를 사용해 실험하였으며, 혼합 및 희석할 때마다 용액을 섞었(vortex)다.
(3) 전기장의 준비
전기화학적 실험을 위하여 두 개의 전극과 테프론 웰로 구성된 셀을 형성한다. 전극으로는 백금 와이어와 금도금된 실리콘 웨이퍼를 사용한다. 금도금된 실리콘 웨이퍼는 scribe and break 장치를 이용하여 6mm*25mm로 절단한다.
전극은 에탄올 또는 메탄올로 철저히 세척하며, 매 실험 전에 세 번씩 용액에 담그고 중성수로 세척한다. 또한 전극 표면에 산화막이 형성되는 것을 방지하기 위하여 유리병 내에 보관하거나 금속박(foil)을 덮어 보관한다.
DNA 용액을 넣기 위하여 36*11*10mm 테프론 웰을 제작하여 메탄올 또는 에탄올에서 15분간 초음파 처리하고, 다시 중성수에서 15분간 초음파 처리하여 세정한다. 다음, 전극은 테프론 웰의 긴쪽 끝으로부터 27.94mm(1.1in) 떨어지도록 배치하여 나사로 고정한다. 또한, 전극이 웰의 정확히 한가운데에 위치하도록 웰의 긴 방향의 양쪽 끝으로부터 5.5mm 떨어지도록 배치한다.
다양한 목적의 실험을 위하여 다양한 전극을 사용할 수 있다. 셀의 가운데에서 더욱 균일한 전기장을 형성하기 위해서는 더 넓은 금도금 실리콘 웨이퍼를 음극에 사용한다. 양극에는 금 도금판이 버퍼 용액과 전기화학적 반응을 나타내므로 양전극으로는 버퍼 용액과의 반응이 적은 금속인 백금 와이어를 사용한다.
교류 전기장에 대해서는 두 개의 백금 와이어를 셀의 양쪽 가장자리에 설치하고, 전극은 1.5초 동안 전압을 가하고 0.5초 동안 반대 방향의 전압을 가하는 전원에 연결되었다. 0-30V의 직류 전기장을 위해서는 Hewlett Packard의 6216A 전원을 사용하고, 더 높은 전압과 AC 전기장을 위하여 프로그래머블 전원(Keithly, 228V Voltage/Current Source)를 사용하였다.
교류 전원을 사용할 경우, 전극과 고분자 표면에 이온이 생성되는 효과(ion buildup)를 줄일 수 있다.
(4) 고분자 표면의 DNA 증착
(3) 단계에서 준비한 셀을 이용하여 전기장을 이용한 DNA 증착을 수행한다. DNA는 PMMA 코팅된 실리콘 웨이퍼에 디핑 앤 리트랙팅(dipping and retracting)법을 이용하여 증착한다.
도 2에 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 장치의 구성이 나타나 있다. DNA를 증착하기 위한 고분자 표면을 갖는 실리콘 웨이퍼를 DNA 용액에 디핑하기 위한 디핑 장치는 테프론 집게(tweezers)와 집게를 제어하기 위한 컴퓨터 제어 스테퍼 모터(Arrick, MD-2 Dual Stepper Motor System)으로 구성된다. 디핑 장치는 가속도, 속도, 디핑 시간, 이동거리를 포함하는 다양한 매개변수들을 제어할 수 있다. 집게의 끝부분이 셀의 한가운데, 즉 양 전극으로부터 13.97mm(5.55in)의 거리에 위치하도록 집게 아래에 셀이 장착된다.
PMMA 코팅된 실리콘 웨이퍼는 PMMA 막이 음의 전극과 마주보도록 디핑 장치에 고정되어 음으로 대전된 DNA 입자가 PMMA 표면으로 움직이도록 한다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 전기장을 이용한 DNA 증착 방법에서 DNA가 움직이는 방향을 나타낸 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이, DNA 입자가 음 전극에서 양 전극 방향으로 이동하므로 DNA를 증착하고자 하는 고분자 표면인 PMMA 막이 음의 전극과 마주하도록 실리콘 웨이퍼를 배치한다.
3000μl의 희석된 DNA 용액을 피펫으로 테프론 웰 내에 주입하고, 웨이퍼의 대부분이 용액 내에 잠기도록 웨이퍼를 내린다. 다음 전기장을 인가하고 일정시간이 경과한 후에 웨이퍼를 용액으로부터 꺼낸다.
반대로, 고분자 표면으로부터 DNA를 떼어내기 위해서는, DNA가 없는 6:50 NaOH:MES 버퍼 용액 내에서 웨이퍼가 반대 방향을 가리키도록 배치하면 된다.
이와 같이 증착한 고분자 표면의 DNA를 관찰하기 위하여, 수은 램프와 형광 현미경(TCS, SP2)을 사용하여 CCD 카메라(Leica, DC350F)로 촬영하였다.
도 4a와 도 4b는 증착된 DNA를 촬영한 사진으로서, 이미지의 노출시간은 58.4초이다. ImageJ 소프트웨어(NIH)와 DNA 가닥의 길이를 세고 측정하기 위하여 Max/Msp (cycling 74)를 이용하여 자체 제작한 프로그램을 이용하여 이미지를 분석하였다. 도 4a와 도 4b는 각각 2.5mg/ml의 DNA 농도를 갖는 DNA 용액을 사용하여 전기장이 없는 상태(0V/m)와 8.87V/m의 전기장을 인가한 상태에서 고분자 표면에 DNA를 증착한 결과를 촬영한 것이다.
도 5a 내지 도 5d는 DNA 용액의 농도와 전기장을 변화시키며 증착한 DNA 밀도를 나타내는 막대 그래프이고, 도 6은 DNA 용액의 농도와 전기장의 변화에 따른 DNA 증착 밀도를 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 전기장의 세기가 증가할수록 증착된 DNA의 밀도가 높은 것을 알 수 있으며, DNA 용액의 농도가 높을수록 증착된 DNA 밀도가 높아진다.
실험결과에 따르면 125ng/ml DNA 용액을 10.64V/cm의 전기장을 인가하여 증착한 경우의 증착 수율이 전기장이 없는 경우의 2.5mg/ml DNA 용액을 사용한 것과 동일한 것으로 나타났다. 즉, DNA 증착의 효율을 20배 증가시킨 것을 알 수 있다.
이상에서 바람직한 실시예를 기준으로 본 발명을 설명하였지만, 본 발명의 장치 및 방법은 반드시 상술된 실시예에 제한되는 것은 아니며 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 따라서, 첨부된 특허청구의 범위는 본 발명의 요지에 속하는 한 이러한 수정이나 변형을 포함할 것이다.

Claims (4)

  1. 실리콘 웨이퍼에 스핀 캐스팅으로 PMMA 막을 형성하는 단계와,
    상기 PMMA 막에 증착할 DNA를 포함하는 DNA 용액을 준비하는 단계와,
    상기 DNA 용액에 상기 PMMA 막이 형성된 상기 실리콘 웨이퍼를 담근 상태에서 상기 DNA 용액에 전기장을 인가하여 상기 PMMA 막 상에 DNA를 증착하는 단계를 포함하는 전기장을 이용한 DNA 증착 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전기장은,
    백금 와이어로 이루어진 양 전극과 금도금된 실리콘 웨이퍼로 이루어진 음 전극 사이에 형성되는 것인 전기장을 이용한 DNA 증착 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전기장은,
    교류 전원에 의하여 생성되는 것인 전기장을 이용한 DNA 증착 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA를 증착하는 단계에서는,
    상기 실리콘 웨이퍼의 상기 PMMA 막이 형성된 면이 상기 전기장을 발생시키는 전극 중 음의 전극과 마주보도록 배치하는 것인 전기장을 이용한 DNA 증착 방법.
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