KR20120119105A - 층꽃풀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 층꽃풀 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 층꽃풀(Caryopteris incana) 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물은 제3급-부틸히드로퍼옥시드(t-BHP, tertiary-butyl hydroperoxide)와 같은 독성 물질에 의하여 간 독성이 유발되었을 때 간세포 보호 효과가 우수하므로 간 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

Description

층꽃풀 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물{HEPATOPROTECTIVE PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT FROM CARYOPTERIS INCANA AND COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

본 발명은 층꽃풀 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 인간의 신체 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하면서 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그 만큼 손상될 확률도 매우 높다. 그러나 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상 간으로의 회복이 어려운 상태가 된다. 또한 우리의 몸은 산업화에 따른 공해물질, 유독물질에 항상 노출되어 있어 우리의 간은 끊임없이 해독작용에 시달리고 있는데 간독성을 유발하는 제3급-부틸히드로퍼옥시드(t-BHP, tertiary-butyl hydroperoxide), 사염화탄소, D-갈락토사민(D-galactosamine), 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide) 및 브로모벤젠(bromobenzene) 등과 같은 독성 유발물질 외에도 정신적 스트레스, 과음, 흡연 등은 간 손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다. 간질환은 병이 생기는 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물독성 간질환, 지방간, 자가 면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타 간질환으로 구분된다. 간 질환은 초기에 자각증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에, 우리나라뿐만 아니라 세계적으로도 사망원인의 수위를 차지하고 있으나, 효과적인 치료제 및 진단방법이 없는 실정이다. 종래 간질환 치료제로서 간 기능 보조제, 항바이러스제, 간세포 촉진제, 면역억제제, 섬유화억제제. 인터페론 등이 사용되고 있지만, 위와 같은 치료제들은 간질환에 효과적이지 못하고 부작용 및 재발의 위험이 높기 때문에 최근에는 천연물로부터 간 질환에 대해 유효하거나 간 보호활성을 가진 물질 탐색이 이루어지고 있다.

현재까지 천연식물에서 추출되어 실제 임상에서 응용되고 있는 간 기능 보호제로서는 실리범 마리아넘(Silybum marianum)이라는 식물에서 추출된 실리빈(silybin), 실리디아민(silydiamine), 실리크리스틴(silycristine)등의 이성체로 구성된 실리마린(silymarin) 제제 정도가 있으나 이조차 효능의 증대가 필요하며, 실제로 치료제로서 현재 사용 중이거나 임상시험 중인 예는 소수에 불과하다. 이에 본 발명자들은 간 보호 효과를 가지는 물질을 탐색하여 식품 및 의약품에 활용하기 위한 목적으로 층꽃풀 추출물을 이용한 간 보호 활성을 조사하였다.

층꽃풀(Caryopteris incana (Thunb.) Miq.)은 마편초과에 속하는 다년초로 주로 대한민국을 비롯하여 일본, 대만, 중국에서 자라며, 우리나라에서는 남부지방 산야에서 자란다(Ahn et al., 1998). 생약명은 '난향초'라 하여 지상부와 뿌리부분을 말하는데. 호흡기 감염증으로 인한 백일해, 기관지염에 유효하고, 풍습성으로 인한 관절염, 타박상에도 효력을 얻고, 산후의 어혈로 인한 하복부 동통을 치료하며 뱀에 물린데, 습진, 가려움증 등에 외용한다(Song et al., 1989).

층꽃풀의 정유성분인 타우카디놀(taucadinol), 미르테닐 아세테이트(myrtenyl acetate), 피노카르본(pinocarvone), δ-3-카렌(δ-3-carene) 등이 세포독성이 있다고 보고되어 있으며, 다이터펜(diterpenoid)인 인카논(incanone)은 백혈병 세포(human leukemia cell)에서 세포독성이 있는 것으로 보고되어 있다(Kim et al., 2008).

그러나, 층꽃풀 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들의 간 보호 활성에 관한 보고는 전혀 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 한국의 자생 식물을 대상으로 간 효과를 연구한 결과, 층꽃풀 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리ㅇ동정하여 얻은 화합물이 우수한 간 보호 효과를 나타내어 간염, 지방간, 간경화 및 간장 독성과 같은 간 질환 등의 예방 및 치료제로 사용될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 목적은 층꽃풀 추출물 또는 분획물로부터 분리된 특정 화합물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 목적은 층꽃풀 추출물 또는 분획물로부터 분리된 신규의 화합물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 층꽃풀 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 층꽃풀 추출물 또는 분획물로부터 분리된 신규의 화합물을 제공한다.

본 발명의 층꽃풀(Caryopteris incana) 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물은 제3급-부틸히드로퍼옥시드(t-BHP, tertiary-butyl hydroperoxide)와 같은 독성 물질에 의하여 간 독성이 유발되었을 때 간세포 보호 효과가 우수하므로 간 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 신규 화합물 카욥테로사이드 A(Caryopteroside A)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 신규 화합물 카욥테로사이드 A(Caryopteroside A)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 신규 화합물 카욥테로사이드 B(Caryopteroside B)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 신규 화합물 카욥테로사이드 B(Caryopteroside B)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 신규 화합물 인카노이드 A(Incanoid A)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 신규 화합물 인카노이드 A(Incanoid A)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7는 신규 화합물 인카노이드 B(Incanoid B)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 신규 화합물 인카노이드 B(Incanoid B)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 층꽃풀(Caryopteris incana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 층꽃풀 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다;

1) 건조한 층꽃풀에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축하여 추출물을 제조하는 단계.

상기 층꽃풀은 식물 전체를 이용할 수 있고, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 등의 1 내지 2개 이상의 부위로 나누어 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 잎, 줄기, 꽃과 같은 지상부를 사용하는 것이 좋다.

상기 추출 용매는 물, C₁ ~ C₄의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으며, 메탄올 또는 에탄올 수용액으로 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 층꽃풀 건조 중량의 1 내지 30 배로 함이 바람직하고, 10 내지 20 배로 하는 것이 더 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출시 온도는 10 내지 150℃ 인 것이 바람직하며, 20 내지 80℃ 인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1 내지 10일인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 추출물을 제조하는 방법은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 추출 회수는 1회 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

한편 층꽃풀 추출물의 분획물은 추가적으로 유기용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 이때 유기용매는 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트, 부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 층꽃풀 추출물을 물에 현탁시킨 후 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 층꽃풀 추출물로부터 분획 과정을 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한 본 발명은 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 하기 화학식 1 내지 10 으로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식 4에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소 또는 메틸기를 의미하며, 화학식 6에서 R은 하기 화학식 11의 카페오일기 또는 하기 화학식 12의 6,7-디히드로포리아멘토일기를 의미한다.

[화학식 11]

[화학식 12]

상기 화합물은 층꽃풀 추출물 또는 분획물을 세파덱스, 실리카겔 및 역상 칼럼크로마토그래피(RP-18) 등을 사용하여 화합물을 분리할 수 있다. 특히 이를 통하여 4종의 신규 화합물을 얻을 수 있었으며, 이를 각각 카욥테로사이드 A(Caryopteroside A, 화학식 1), 카욥테로사이드 B(Caryopteroside B, 화학식 2), 인카노이드 A(Incanoid A, 화학식 6, R은 카페오일기)및 인카노이드 B(Incanoid B, 화학식 6, R은 6,7-디히드로포리아멘토일기)이라 명명하였다. 상기 신규 화합물 이외에도, 5종의 페닐프로파노이드 배당체로서 6-O-카페오일플리노사이드 A(6-O-caffeoylphlinoside A, 화학식 3), 악테오사이드(acteoside, 화학식 4, R₁ 및 R₂는 수소), 루코스셉터사이드 A(leucosceptoside A, 화학식 4, R₁은 메틸기 및 R₂는 수소), 지오노사이드 D(jionoside D, 화학식 4, R₁은 수소 및 R₂는 메틸기), 마티노사이드(Martynoside, 화학식 4, R₁ 및 R₂는 메틸기), 6-카페오일-D-글루코즈(6-O-caffeoyl-D-glucose, 화학식 5), 1종의 이리도이드로서 8-O-아세틸-6′-O-카페오일하르파지드(8-O-acetyl-6'-O-caffeoylharpagide, 화학식 7), 3종의 플라보노이드로서 에리오딕티올-7-O-β-D-글루코피라노사이드(eriodictyol-7-O-β-D-glucopyranoside, 화학식 8), 루테올린 4′-O-β-D-글루코피라노사이드(luteolin 4'-O-β-D-glucopyranoside, 화학식 9), 로이폴린)(rhoifolin, 화학식 10)과 같은 화합물을 분리하였다.

상기 층꽃풀 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물은 HepG2 세포에서의 세포독성 보호 효과로 인하여 간독성 질환, 구체적으로는 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암, 간성혼수 등에 대한 예방 및 치료효과를 나타낸다.

상기 본 발명의 층꽃풀 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 층꽃풀 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질환의 중증도, 약물형태, 투여시간, 투여방법, 투여경로 및 투여기간 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1일 투여량은 본 발명에 따른 추출물, 분획물 또는 화합물을 동결건조하였을 때의 양으로 0.0001㎎/㎏ 내지 500㎎/㎏, 바람직하게는 0.001㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏ 이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 개선용 건강 식품을 제공한다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되지 않는다.

제조예 1 : 층꽃풀 지상부 추출물 및 이의 분획물의 제조

음건한 층꽃풀의 지상부(꽃을 포함한 잎과 줄기) 6.13 kg을 세절한 후 25.5 L의 메탄올에 침적시키고 4일 동안 실온에서 추출한 후 추출액을 여과하였다. 추출액을 여과한 후 남은 잔사에 다시 25.5 L의 메탄올을 가하고 4일 동안 실온에서 추출하는 방법을 추가로 2회 반복한 뒤, 이를 35 ℃에서 감압 농축하여 메탄올 추출물 760.1 g을 수득하였다. 상기 메탄올 추출물을 증류수 7.5 L에 현탁시키고, 분별깔때기를 이용하여 디클로로메탄(70.5 L × 3), 에틸아세테이트(7.5 L × 3) 및 부탄올(7.5 L × 3)로 분획하였으며, 그 결과 디클로로메탄 분획물(90.2 g), 에틸아세테이트 분획물(42.6 g), 부탄올 분획물(248.5 g) 및 물 분획물을 얻을 수 있었다.

제조예 2 : 층꽃풀 추출물의 분획물로부터 유효성분의 분리

상기 층꽃풀의 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물 20 g을 메탄올을 전개용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 각각의 분획들은 TLC로 확인하여 유사한 분획들을 모아 7개의 소분획(980E1 ~ 980E7)으로 나누었다.

이후, 소분획 E3(13.5 g)은 세파덱스 LH-20을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매로는 70% 메탄올을 사용하였으며, 마지막은 100% 메탄올을 사용하여 11개의 소분획(980E3-1 ~ 980E3-11)을 얻을 수 있었다.

소분획 980E3-2(382.6 mg)을 취하여, 실리카겔을 이동상으로 한 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 용매 조건은 CH₂Cl₂:MeOH:H₂O(부피비 7:1:0.1 → 4:1:0.1)의 혼합용매를 사용하여 전개시켰으며 10 개의 소분획(980E3-2a ~ 980E3-2j)으로 나누었다.

소분획 980E3-2i(84.1 mg)는 Licroprep RP-18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 다시 소분획 9 개(980E3-2i1 ~ 980E3-2i9)를 얻었으며, 그 중 5 와 7 분획에서 각각 화합물 1(17.9 ㎎)과 2(15.1 ㎎)를 얻었다.

소분획 980E3-4(5.2 g)는 CH₂Cl₂:MeOH:H₂O(부피비 7:1:0.1→4:1:0.1)의 혼합용매를 사용하여 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 15개의 소분획(980E3-4-1 ~ 980E3-4-15)으로 분리하였다. 이 중 분획 980E3-4-11(3 g)은 35% 메탄올에서 70% 메탄올까지 전개용매로서 사용하여 Lichroprep RP-18 컬럼 크로마토그래피를 수행하였으며, 이로부터 순수한 화합물 4(1.93 g)와 12(83.5 ㎎)를 얻었다.

한편, 소분획 980E3-4-14(126.7 ㎎)는 Lichroprep RP-18 column chromatography로 30% 메탄올에서 40% 메탄올까지 극성을 올리면서 전개시켜 10개의 소분획(980E3-4-14a ~ 980E3-4-14j)으로 나누었다. 그 중 소분획 980E3-4-14c(20 ㎎)는 50% 메탄올을 전개용매로 사용한 preparative RP-18 TLC를 실시하여 순수한 화합물 8(15.6 ㎎)을 얻었으며, 소분획 980E3-4-14h(11.3 ㎎)는 50% 메탄올을 전개용매로 이용한 preparative RP-8 TLC를 수행하여, 순수한 화합물 3(7.7 ㎎)을 얻었다.

한편 소분획 980E3-4-10(903.2 ㎎)은 Lichroprep RP-18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 10개의 소분획(980E3-4-10.1 ~ 980E3-4-10.10)으로 나누었다. 사용한 전개용매는 30% 메탄올에서 50% 메탄올까지 사용하였으며, 그 중 4번째 소분획 980E3-4-10.4로부터 세파덱스 LH-20을 이용하여 화합물 5(326.5 ㎎)를 얻었다. 또한 첫 번째 소분획 980E3-4-10.1로부터 전개용매를 30% 메탄올에서 50% 메탄올까지 극성을 높이면서 Lichroprep RP-18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물 7(20.6 ㎎)을 얻었다. 그리고 다섯 번째 소분획 980E3-4-10.5(89.1 ㎎)로부터 50% 메탄올를 전개용매로 이용한 preparative RP-18 TLC를 실시한 결과 화합물 6(9.4 ㎎)과 9(28 ㎎)를 얻었다.

한편, 소분획 980E3-2e(49 ㎎)는 HPLC를 이용한 RP-18(7 ㎛, 250-10, Merck) preparative HPLC를 실시하였다. 36% 메탄올에서 60% 메탄올까지의 혼합 용매를 사용하였으며, 이를 통하여 화합물 10(5.1 ㎎)과 11(10.5 ㎎)을 얻었다.

한편, 소분획 980E3-1(1.51 g)을 실리카겔을 이동상으로 한 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 용매 조건은 CH₂Cl₂:MeOH:H₂O(부피비 7:1:0.1 → 5:1:0.1)의 혼합용매를 사용하여 전개시켰으며, 16 개의 소분획(980E3-1a ~ 980E3-1p)로 나누었고, 11번째 분획인 소분획 980E3-1k(478.7 ㎎)는 Lichroprep RP-18 컬럼 크로마토그래피로 30% 메탄올에서 60% 메탄올까지 극성을 올리면서 전개용매를 사용하여 순수한 화합물 13 (109.1 ㎎)을 얻었다.

또한, 소분획 980E3-3(2.2 g)은 세파덱스 LH-20을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매로 100% 메탄올을 사용하여 6개의 소분획(980E3-3a ~ 980E3-3f)으로 나누었다. 소분획 980E3-3b(176 mg)은 CH₂Cl₂:MeOH:H₂O(부피비 7:1:0.1)의 혼합용매를 사용하여 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피와 분취용 RP-18 TLC(50% MeOH)를 실시하여 순수한 화합물 14(17.3 ㎎)를 얻었다.

제조예 3 : 분리된 화합물의 구조 결정

상기 제조예 2에서 얻은 각 성분들에 대한 물리적 특성 및 ¹H-NMR(400 MHz)과 ¹³C-NMR(100 MHz) 스펙트럼을 측정하였다. 각 피크의 화학 이동값(chemical shift)을 측정용매인 메탄올의 화학이동값(3.3 ppm, 49.8 ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다.

제조예 3-1 : 화합물 1의 구조분석

[α]²⁰ _D -44.1° (c 0.44, MeOH)

HRESMS(positive-ion mode):m/z = 787.2462(Calcd. for C₃₈H₄₃O₁₈: 787.2449)

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.09(3H, d, J=6.2 Hz, H-r6), 2.79(2H, brt, J=6.9 Hz, H-7), 2.29(1H, t, J=9.7 Hz, H-r4), 3.42(1H, t, J=8.7 Hz, H-g2), 3.54(1H, m, H-r5), 3.58(1H, dd, J=3.7, 9.9 Hz, H-r3), 3.73(1H, q, J=8.0 Hz, H-8a), 3.79(1H, m, H-g5), 3.84(1H, t, J=9.0 Hz, H-g3), 3.93(1H, br, H-r2), 3.97(1H, q, J=8.0 Hz, H-8b), 4.24(1H, brd, J=4.0 Hz, H-g6), 4.41(1H, d, J=7.9 Hz, H-g1), 5.04(1H, t, J=9.6 Hz, H-g4), 5.19(1H, d, J=1.0 Hz, H-r1), 6.22(1H, d, J=15.9 Hz, H-8″), 6.27(1H, d, J=15.9 Hz, H-8′), 6.65(1H, dd, J=1.8, 8.1 Hz, H-6), 6.54(1H, d, J=8.0 Hz, H-5), 6.68(1H, d, J=1.9 Hz, H-2), 6.71(1H, d, J=8.2 Hz, H-5″), 6.75(1H, d, J=8.2 Hz, H-5′), 6.81(1H, dd, J=1.8, 8.3 Hz, H-6″), 6.93(1H, dd, J=1.8, 8.2 Hz, H-6′), 6.98(1H, d, J=1.8 Hz, H-2″), 7.04(1H, d, J=1.8 Hz, H-2′), 7.53(1H, d, J=15.9 Hz, H-7″), 7.59(1H, d, J=15.9 Hz, H-7′).

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 18.5(C-r6), 36.6(C-7), 64.1(C-g6), 70.5(C-r4), 70.9(C-g4), 72.0(C-r3), 72.3(C-r2), 72.5(C-8), 73.1(C-g5), 73.7(C-r4), 76.1(C-g2), 81.5(C-g3), 103.1(C-r1), 104.4(C-g1), 114.6(C-8′,8″), 115.3(C-2′,2″), 116.4(C-5), 116.5(C-5′,5″), 117.1(C-2), 121.3(C-6), 123.0(C-6″), 123.3(C-6′), 127.6(C-1′,1″), 131.4(C-1), 144.6(C-4), 146.1(C-3), 146.7(C-3″), 146.8(C-3′), 147.4(C-7″), 148.1(C-7′), 149.6(C-4″), 149.8(C-4′), 168.1(C-9″), 168.8(C-9′).

무정형의 분말인 상기 화합물은 ¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 7.53(1H, d, J=15.9 Hz, H-7″), 7.59(1H, d, J=15.9 Hz, H-7′)와 6.22(1H, d, J=15.9 Hz, H-8″), 6.27(1H, d, J=15.9 Hz, H-8′)에서의 피크는 서로 커플링 하고 있으며, 커플링 상수로(coupling constant)로 trans 비닐(vinyl)기가 2개 존재하는 것을 알 수 있었다. δ 6.65(1H, dd, J=1.8, 8.1 Hz, H-6)에서의 doublet of doublet 피크는 6.54(1H, d, J=8.0 Hz, H-5) 피크와 ortho 커플링을 하고 6.68(1H, d, J=1.9 Hz, H-2) 피크와 meta 커플링을 하고 있어, 방향족 고리가 ABX system으로 치환된 화합물임을 알 수 있었다. δ 6.71(1H, d, J=8.2 Hz, H-5″) 피크가 6.81(1H, dd, J=1.8, 8.3 Hz, H-6″) 피크와 ortho 커플링을 하고 6.98(1H, d, J=1.8 Hz, H-2″) 피크와는 meta 커플링을 하고 있어, 다른 방향족 고리가 ABX system으로 치환된 화합물임을 알 수 있었다. δ 6.93(1H, dd, J=1.8, 8.2 Hz, H-6′)에서의 doublet of doublet 피크는 6.75(1H, d, J=8.2 Hz, H-5′) peak와 ortho 커플링을 하고 7.04(1H, d, J=1.8 Hz, H-2′) 피크와는 meta 커플링을 하고 있어 ABX system으로 치환된 방향족 고리가 3개 존재하는 화합물임을 알 수 있었다. δ 5.19에서의 넓은 doublet 피크(J=1.0 Hz)와 1.09(3H, d, J=6.2 Hz, H-r6)에서의 doublet 피크는 람노오스(rhamnose)에서 기인하는 전형적인 피크로 각각 아노머 수소(anomeric proton)과 람노오스의 6번 수소에서 기인하는 피크임을 알 수 있었다. 또한 δ 5.04 에서의 triplet 피크는 당에서 기인하는 피크로 치환기가 결합하고 있음을 예상할 수 있고, δ 4.41(1H, d, J=7.9 Hz)에서의 doublet 피크는 당의 아노머 수소에서 기인한 것으로 그 커플링 상수로서 β-form임을 알 수 있었다. 따라서 이 화합물은 3개의 방향족 고리, 2개의 trans 비닐기 및 2개의 당이 존재하며 그 중 하나는 람노오스임을 확인할 수 있었다.

¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ 168.1(C-9″)과 168.8(C-9′)에서의 피크로 2개의 카보닐기를 나타내는 것이며, 이는 2개의 카페오일(caffeoyl)기에서 기인한 것임을 알 수 있었다. δ 60-80사이의 피크들은 2개의 당에서 기인한 피크로 그 화학 이동 값을 통하여 각각 글루코오스와 람노오스임을 확인할 수 있었다(Steaven et al., 1990, Leroy et al., 1972). Dept(135ㅀ) 스펙트럼에서 δ 72.3(C-8)과 36.7(C-7) 피크는 CH₂기 임을 알 수 있었으며 지방족기(aliphatic group)에서 기인한 것임을 알 수 있었다.

¹H-¹HCOSY에서 2개의 당 들의 정확한 위치를 알 수 있었으며, 비닐기와 방향족 고리의 연결관계, 결합 위치를 확인하였다. 또한, 이들의 결합위치를 정확하게 확인하기 위하여 HMBC와 HMQC 실험을 수행하였으며, HMQC에서는 탄소와 수소간의 정확한 피크들을 동정할 수 있으며, HMBC에서는 치환기들의 정확한 위치를 알 수 있었다. 즉, 글루코오스의 6번에서 기인하는 δ 4.24 에서의 피크는 δ 168.8에서의 카보닐기와 상관관계가 나타나고, δ 5.04 에서의 triplet 피크는(C-g4)는 δ 168.1(C-9″)에서의 다른 카보닐기와 상관관계가 나타나며, 두 개의 카페오일기는 글루코오스의 4번과 6번에 각각 결합하고 있음을 알 수 있었다. 또한 글루코오스의 1번 수소에서 기인하는 δ 4.41(1H, d, J=7.9 Hz)에서의 doublet 피크는 δ 72.5에서의 8번 탄소와 상관관계가 나타나고, 람노오스의 1번 수소에서 기인하는 δ 5.19에서의 넓은 doublet 피크가 δ 81.5에서의 글루코오스 3번 탄소와 상관관계가 나타나고 있어, 글루코오스 1번에 펜에틸(phenethyl)기가, 3번 위치에 람노오스가 결합하고 있음을 확인할 수 있었다.

상기 분석 결과를 종합하여 이 화합물은 하기 화학식 1과 같은 구조의 화합물임을 확인할 수 있었고, 이는 자연계에서 처음으로 분리된 화합물로서 카욥테로사이드 A(Caryopteroside A)로 명명하였다.

[화학식 1]

제조예 3-2 : 화합물 2의 구조분석

[α]¹⁹ _D -244°(c 0.60, MeOH)

HRESMS(positive-ion mode):m/z = 945.2660(Calcd. for C₄₄H₄₉O₂₃: 949.2665)

¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD): δ 1.06(3H, d, J=6.1 Hz, H-r6), 3.08(2H, t, J=9.4 Hz, H-g′4), 3.16(1H, t, J=8.5 Hz, H-g2), 3.23(1H, t, J=8.2 Hz, H-g′2), 3.32(1H, m, overlapped with solvent, H-g′4), 3.35(1H, m, H-g5), 3.38(1H, m, H-g′5), 3.51(1H, dd, J=6.6, 11.8 Hz, H-g6a), 3.55(1H, m, H-r5), 3.58-3.62(3H, m, H-r3, r4, g6b), 3.73(1H, brt, J=11.2 Hz, H-g′6a), 3.79(1H, t, J=9.3 Hz, H-g3), 3.96(1H, t, J=2.1 Hz, H-r2), 4.47(1H, d, J=7.8 Hz, H-g′1), 4.82(1H, t, J=9.6 Hz, H-g4), 4.89(1H, overlapped with solvent, H-g1), 5.04(1H, d, J=1.6 Hz, H-r1), 5.16(1H, dd, J=1.9, 11.6 Hz, H-g′6b), 5.24(1H, s, H-7), 5.64(1H, s, H-8), 6.28(1H, d, J=15.9 Hz, H-8′), 6.35(1H, d, J=15.8 Hz, H-8″), 6.73(1H, dd, J=1.3, 8.4 Hz, H-6), 6.76(1H, d, J=8.9 Hz, H-5), 6.78(1H, d, J=8.3 Hz, H-5′), 6.86(1H, d, J=1.3 Hz, H-2), 6.91(1H, d, J=8.3 Hz, H-5″), 6.95(1H, dd, J=1.9, 8.3 Hz, H-6′), 7.07(1H, d, J=1.3 Hz, H-2′), 7.06(1H, dd, J=1.7, 8.3 Hz, H-6″), 7.40(1H, d, J=1.9 Hz, H-2″), 7.59(1H, d, J=15.9 Hz, H-7′), 7.61(1H, d, J=15.8 Hz, H-7″).

¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD): δ 18.9(C-r6), 62.6(C-g6), 64.8(C-g′6), 70.8(C-r5), 70.9(C-g4), 72.6(C-g′4), 72.7(C-r3), 74.7(C-g2), 74.8(C-g5), 76.2(C-g′5), 76.3(C-g′2), 76.9(C-r4), 78.1(C-g′3), 79.6(C-7), 83.1(C-r2), 84.9(C-g3), 97.2(C-8), 101.4(C-g1), 103.6(C-r1), 106.4(C-g′1), 114.6(C-2), 114.9(C-8′), 115.3(C-2′), 116.5(C-5), 116.7(C-5′), 116.9(C-5″), 119.1(C-8″), 119.3(C-6), 119.9(C-2″), 123.4(C-6′), 126.5(C-6″), 127.1(C-1′), 129.9(C-1″), 130.9(C-1), 141.7(C-3″), 146.2(C-7″), 146.7(C-3), 146.9(C-4), 147.0(C-3′), 148.3(C-7′), 148.5(C-4″), 150.0(C-4′), 168.2(C-9″), 168.6(C-9′).

무정형의 분말인 상기 화합물은 ¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 7.59(1H, d, J=15.9 Hz, H-7′)에서의 피크와 δ 6.28(1H, d, J=15.9 Hz, H-8′)에서의 피크, 그리고 δ 7.61(1H, d, J=15.8 Hz, H-7″)의 피크와 6.35(1H, d, J=15.8 Hz, H-8″) 피크가 각각 doublet으로 나타나며, 그들의 커플링 상수로서 trans 비닐(vinyl)기가 2개 존재하는 것을 알 수 있었다.

δ 7.06(1H, dd, J=1.7, 8.3 Hz, H-6″)에서의 doublet of doublet 피크는 6.91(1H, d, J=8.3 Hz, H-5″) 피크와 ortho 커플링을 하고, δ 7.40(1H, d, J=1.9 Hz, H-2″) 피크와 meta 커플링을 하고 있어, 방향족 고리가 ABX system으로 치환되었음을 알 수 있었으며, δ 6.95(1H, dd, J=1.9, 8.3 Hz, H-6′)피크가 δ 6.78 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5′) 피크와 ortho 커플링을 하고, δ 7.07(1H, d, J=1.3 Hz, H-2′) peak와 meta 커플링을 하고 있어 이 방향적 고리 역시 ABX system으로 치환된 화합물임을 알 수 있었다. 한편, δ 6.73(1H, dd, J=1.3, 8.4 Hz, H-6) 피크가 δ 6.76(1H, d, J=8.9 Hz, H-5) 피크와 ortho 커플링을, 6.86(1H, d, J=1.3 Hz, H-2) 피크와 meta 커플링을 하고 있어, 이 방향족 고리 역시 ABX system으로 치환되어 있음을 알 수 있었다. δ 5.24(1H, s, H-7)와 5.64(1H, s, H-8)에서의 피크는 각각 하나의 수소에 해당하는 피크이며, 화학적 이동을 통하여 산소와 결합하고 있는 형태임을 예상하였다. δ 5.16(1H, dd, J=1.9, 11.6 Hz, H-g′6b)에서의 피크는 당의 6번에서 기인한 것으로 작용기가 존재함을 알 수 있었으며, δ 5.04(1H, d, J=1.6 Hz, H-r1)에서의 넓은 doublet 피크와 δ 1.06(3H, d, J=6.1 Hz, H-r6)에서의 3개의 수소에 해당하는 단일 피크는 람노오스(rhamnose)의 전형적인 피크로 각각 아노머 수소와 6번 수소에서 기인한 피크임을 알 수 있었다. δ 3-4 사이의 복잡한 피크로 당의 존재를 추정하였고, δ 4.47(1H, d, J=7.8 Hz, H-g′1)에서의 doublet 피크는 당의 아노머 수소에 기인한 것으로 그 커플링 상수로서 β-form임을 알 수 있었다. 따라서 이 화합물은 3개의 방향족 고리. 2개의 trans 비닐기 및 3개의 당이 존재하며 하나의 당은 람노오스임을 알 수 있었다.

¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ 168.2(C-9″)와 168.6(C-9′)에서의 피크로부터 카보닐기를 예상할 수 있었으며, δ 60-80사이의 피크들은 3개의 당에서 기인한 피크이며, 그 화학 이동으로부터 2개의 글루코오스와 1개의 람노오스임을 알 수 있었다(Steaven et al., 1990, Leroy et al., 1972). DEPT(135ㅀ) 스펙트럼에서는 두 개의 글루코오스에서 기인하는 6번 탄소 피크 이외에는 어떠한 피크도 나타나지 않아 전형적인 페닐프로파노이드(phenylpropanoid)와는 조금 다른 형태임을 예상할 수 있었다.

¹H-¹HCOSY에서 3개의 sugar들의 정확한 위치를 알 수 있었으며, vinyl기와 aromatic ring의 연결 관계도 확실히 알 수 있었다. 또한, 이 화합물에 결합하고 있는 치환기들의 정확한 결합 위치를 파악하기 위하여 HMBC와 HMQC 실험을 하였다. HMQC에서는 탄소와 수소 간의 정확한 피크들을 동정할 수 있었으며, 용매의 물 피크에 중첩되어 있던 글루코오스의 아노머 수소인 δ 4.89에서의 피크와 δ 101.4에서의 아노머 탄소의 상관관계가 나타나 글루코오스의 정확한 위치도 파악할 수 있었다. HMBC에서는 4차 탄소의 정확한 위치를 알 수 있었다. 즉, δ 5.64(1H, s)에서의 펜에틸(phenethyl)의 8번에 해당하는 메틴 수소(methine proton)는 δ 101.4에서의 글루코오스 1번 탄소와 δ 79.6에서의 7번 메틴 탄소와 각각 상관관계가 나타나고, 7번 탄소는 δ 6.73(1H, dd, J=1.3, 8.4 Hz)에서의 6번 수소, 6.86(1H, d, J=1.3 Hz)에서의 2번 수소와 상관관계가 나타나 펜에틸기가 글루코오스 1번에 위치하고 있음을 알 수 있었다. δ 5.04(1H, d, J=1.6 Hz)에서의 람노오스 아노머 수소는 δ 84.9에서의 글루코오스 3번 탄소와 상관관계가 나타나고, 또 다른 글루코오tm의 아노머 수소인 δ 4.47(1H, d, J=7.8 Hz)에서의 피크는 δ 83.1에서의 람노오스 2번 탄소와 상관관계가 나타나 이 화합물은 글루코오스의 3번에 람노오스가 위치하고, 람노오스 2번에 다른 글루코오스가 결합한 형태임을 알 수 있었다. 한편, 글루코오스 4번 수소에서 기인하는 δ 4.82(1H, t, J=9.6 Hz)에서의 피크는 δ 168.6(C-9′)에서의 카페오일기에서 기인한 카보닐 탄소와 상관관계를 보이고, 다른 글루코오스의 6번에서 기인하는 δ 3.73(1H, brt, J=11.2 Hz, H-g′6a)의 피크와 5.16(1H, dd, J=1.9, 11.6 Hz, H-g′6b)에서의 피크는 δ 168.2(C-9″)에서의 피크와 상관관계가 나타나므로 2개의 카페오일기는 각각 글루코오스 4번과 다른 글루코오스의 6번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 또한, δ 5.64(1H, s)에서의 펜에틸기의 8번 수소는 δ 130.9에서의 1번 탄소와 δ 141.7에서의 3″번 탄소와 상관관계가 나타나고, δ 5.24에서의 7번 수소는 δ 130.9에서의 1번 탄소, δ 148.5에서의 4″번 탄소와 상관관계가 나타나 글루코오스의 6″에 결합된 카페오일기 3번과 4번, 펜에틸기의 7번과 8번 위치에서 고리를 형성하고 있음을 알 수 있었다.

상기 분석 결과를 종합하여 이 화합물은 하기 화학식 2과 같은 구조의 화합물임을 확인할 수 있었고, 이는 자연계에서 처음으로 분리된 화합물로서 카욥테로사이드 B(Caryopteroside B)로 명명하였다.

[화학식 2]

제조예 3-3 : 화합물 8의 구조분석

[α]¹⁸ _D -46.5°(c 0.65, MeOH)

HRESMS(positive-ion mode):m/z = 653.2077(Calcd. for C₃₀H₃₇O₁₆: 653.2082)

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 1.81(3H, s, H-10), 1.97(1H, m, H-6a), 2.45(1H, t, J=7.5 Hz, H-9), 2.65(1H, m, H-6b), 2.97(1H, q, J=78 Hz, H-5), 3.25(2H, m, H-3′, 4′), 3.45(1H, dd, J=7.7, 9.2 Hz, H-2′), 3.51(1H, m, H-5′), 3.61(1H, dd, J=5.5, 11.8 Hz, H-6′a), 3.79(1H, d, J=9.6 Hz, H-4″a), 3.81(1H, d, J=11.5 Hz, H-6′b), 3.86(1H, s, H-2″), 4.28(2H, d, J=1.2 Hz, H-5″), 4.30(1H, d, J=10.8 Hz, H-4″b), 4.76(1H, d, J=7.6 Hz, H-1′), 5.10(1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 5.43(1H, s, H-1″), 5.44(1H, br s, H-7), 6.22(1H, d, J=15.9 Hz, H-8′″), 6.75(1H, d, J=8.2 Hz, H-5′″), 6.90(1H, dd, J=1.9, 8.2 Hz, H-6′″), 7.01(1H, d, J=1.9 Hz, H-2′″), 7.43(1H, s, H-3), 7.52(1H, d, J=15.9 Hz, H-7′″)

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 16.6(C-10), 36.7(C-5), 39.8(C-6), 50.2(C-9), 62.7(C-6′), 69.2(C-5″), 71.7(C-4′), 75.7(C-4″), 77.1(C-2′), 78.3(C-3′, 2″), 78.9(C-5′), 79.3(C-3″), 97.8(C-1), 98.2(C-1′), 109.7(C-1″), 112.8(C-4), 114.7(C-8′″), 115.1(C-2′″), 116.5(C-5′″), 123.1(C-6′″), 127.7(C-1′″), 128.0(C-7), 140.4(C-8), 146.7(C-3′″), 147.3(C-7′″), 149.6(C-4′″), 153.5(C-3), 169.0(C-9′″), 171.0(C-11)

무정형의 분말인 상기 화합물은 ¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 6.22(1H, d, J=15.9 Hz, H-8′″)에서의 피크와 δ 7.52(1H, d, J=15.9 Hz, H-7′″)에서의 피크로부터 한 그룹의 trans 비닐기를 알 수 있었으며, δ 6.75(1H, d, J=8.2 Hz, H-5′″), 6.90(1H, dd, J=1.9, 8.2 Hz, H-6′″), 7.01(1H, d, J=1.9 Hz, H-2′″)의 피크 형태는 방향족 고리가 ABX system으로 치환되어 있어 카페오일 기가 있음을 알 수 있었다. δ 1.5-5.5에서의 피크 형태로 이 화합물은 이리도이드(iridoid) 화합물임을 예상하였고, δ 3-4 사이의 복잡한 피크로 2개의 당을 추정하였으며, δ 4.76(1H, d, J=7.6㎐, H-1')의 커플링 상수로부터 이 화합물에 존재하는 당은 β-form임을 알 수 있었다(Steaven et al., 1990). 또한, δ 1.81에서의 3개의 수소에 해당하는 단일피크로 메틸기가 존재함을 알 수 있었다.

¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ 171.0에서의 피크는 카르복실산의 카보닐기를, δ 169.0 피크는 카페오일기에서 기인한 카보닐기임을 예상할 수 있었다. δ 112-153에서의 피크들은 카페오일기에서 기인한 피크 이외에 4개의 피크가 더 나타나 두 개의 이중결합이 더 있음을 알 수 있었다. 당에서 기인한 피크가 δ 60-80 사이에서 나타나고 있으며 그 화학 이동과 피크 수로 미루어 글루코오스와 5탄당에 해당하는 아피오스(apiose)가 존재함을 알 수 있었다(Steaven et al., 1990, Leroy et al., 1972).

HMQC에서는 탄소와 수소 간의 정확한 피크들을 동정할 수 있었으며, HMBC에서는 이 화합물에 결합하고 있는 치환기의 위치를 정확하게 알 수 있었다. 즉, δ 4.76(1H, d, J=7.6 Hz)에서 글루코오스 1번 수소는 δ 97.8에서의 1번 탄소와 상관관계가 나타나 글루코오스는 1번에 치환되어 있음을 알 수 있었으며, δ 3.45(1H, dd, J=7.7, 9.2 Hz)에서의 글루코오스의 2번 수소와 δ 109.7에서의 아피오스의 1번 탄소와 상관관계가 나타나 아피오스는 글루코오스의 2번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 또한, δ 4.28(2H, d, J=1.2 Hz)의 아피오스의 5번 수소에서 기인한 피크는 δ 169.0에서의 카페오일기의 카보닐기와 상관관계가 나타나 카페오일기는 아피오스 5번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. δ 1.81에서의 메틸 피크는 δ 140.4에서의 C-8과 상관관계가 나타나 8번 탄소에 메틸기가 치환되어 있음을 알 수 있었다.

상기 분석 결과를 종합하여 이 화합물은 하기 화학식 6a와 같은 구조의 화합물임을 확인할 수 있었고, 이는 자연계에서 처음으로 분리된 화합물로서 인카노이드 A(Incanoid A)로 명명하였다.

[화학식 6a]

제조예 3-3 : 화합물 14의 구조분석

[α]²⁵ _D -25.2°(c 0.52, MeOH)

HRFABMS(negative-ion mode):m/z = 657.2757(Calcd. for C₃₁H₄₅O₁₅: 657.2758)

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 0.83(3H, s, H-10′″), 1.27(1H, m, H-7′″), 1.36(1H, m, H-5′″), 1.51(2H, m, H-6′″,7′″), 1.70(3H, s, H-9′″), 1.74(3H, s, H-10), 1.92(1H, m, H-6a), 2.11(1H, m, H-4), 2.28(1H, t, J=7.8 Hz, H-9), 2.63(1H, m, H-6b), 3.16(2H, m, H-3′, 4′), 3.37(1H, dd, J=7.7, 9.2 Hz, H-2′), 3.42(1H, m, H-5′), 3.50(2H, m, H-8′″), 3.52(1H, m, H-6′a), 3.69 (1H, d, J=9.6 Hz, H-4″a), 3.71(1H, s, H-2″), 3.74(1H, d, J=11.6 Hz, H-6′b), 4.13 4.18(2H, d, J=11.3 Hz, H-5″), 4.26(1H, d, J=9.6 Hz, H-4″b), 4.66(1H, d, J=7.6 Hz, H-1′), 4.97(1H, d, J=7.8 Hz, H-1), 5.34(1H, s, H-1″), 5.39(1H, br s, H-7), 6.69(1H, t, J=7.6 Hz, H-3′″), 7.28(1H, s, H-3)

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 12.5(C-9′″), 16.9(C-10), 19.7(C-10′″), 36.7(C-5), 27.4(C-4′″), 30.8(C-6′″), 37.1(C-5′″), 37.3(C-5), 40.1(C-6), 40.7(C-7′″), 50.4(C-9), 61.1(C-8′″), 62.9(C-6′), 72.0(C-5″), 75.9(C-4′), 77.1(C-4″), 78.5(C-2′), 78.6(C-3′, 2″), 79.2(C-5′), 79.5(C-3″), 98.2(C-1), 98.4(C-1′), 109.8(C-1″), 113.3(C-4), 128.3(C-7), 128.6(C-2′″), 140.7(C-8), 144.8(C-3′″), 153.3(C-3), 169.5(C-1′″), 171.5(C-11)

무정형의 분말인 상기 화합물은 ¹H-NMR 스펙트럼에서 인카노이드 A(Incanoid A)와 유사한 피크형태를 보이고 있지만 카페오일기에 해당하는 피크는 보이지 않았다. 고자장 영역에서 10번에서 기인하는 메틸기 이외에 δ 0.83(3H, s, H-10′″)와 1.70(3H, s, H-9′″)에서의 두 개의 메틸에 해당하는 단일피크를 포함하여 aliphatic 피크가 나타나 다른 치환기가 있음을 알 수 있었다. 나머지 피크는 위에서 분리한 10-데옥시제니포닉산(10-deoxygeniposidic acid)과 일치하며 글루코스와 5탄당이 더 결합하고 있음을 예상하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ 171.5에서의 피크는 카르복실산의 카보닐기임을 알 수 있었으며, δ 169.5 피크는 이 화합물에 결합하고 있는 acyl기에서 기인한 에스테르(ester) 카보닐기임을 예상할 수 있었고 그 화학적 이동값으로부터 8-히드록시-2,6-디메틸-2(E)-옥테노일기(8-hydroxy-2,6-dimethyl-2(E)-octenoyl)인 6,7-디히드로포리아멘틱산(6,7-

dihydrofoliamenthic acid)임을 알 수 있었다. 또한 이들 피크 이외에 당에서 기인한 피크가 δ 60-80 사이에서 나타나고 있으며 그 화학 이동과 피크 수로 미루어 글루코오스와 5탄당에 해당하는 아피오스(apiose)가 존재함을 알 수 있었다(Steaven et al., 1990, Leroy et al., 1972).

HMQC에서는 탄소와 수소 간의 정확한 피크들을 동정할 수 있었으며, HMBC에서는 이 화합물에 결합하고 있는 치환기의 위치를 정확하게 알 수 있었다. 즉, δ 4.66(1H, d, J=7.6 Hz)에서 글루코오스 1번 수소는 δ 98.2에서의 1번 탄소와 상관관계가 나타나 글루코오스는 1번에 치환되어 있음을 알 수 있었으며, δ 3.37(1H, dd, J=7.7, 9.2 Hz)에서의 글루코오스의 2번 수소와 δ 109.8에서의 아피오스의 1번 탄소와 상관관계가 나타나 아피오스는 글루코오스의 2번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 또한, δ 4.13 4.18(2H, d, J=11.3 Hz)의 아피오스의 5번 수소에서 기인한 피크는 δ 169.5에서의 카보닐기와 상관관계가 나타나 6,7-디히드로포리아멘틱산기는 아피오스 5번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 상기 분석 결과를 종합하여 이 화합물은 하기 화학식 6과 같은 구조의 화합물임을 확인할 수 있었고, 이는 자연계에서 처음으로 분리된 화합물로서 인카노이드 B(Incanoid B)로 명명하였다.

[화학식 6b]

이상의 분석결과, 본 발명에서 층꽃풀 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 4종의 신규 화합물 1, 2, 8, 14를 포함하고 있음을 확인하였다.

또한, 상기 분리된 화합물의 분석 결과, 6종의 페닐프로파노이드 배당체(phenylpropanoid glycoside)로서 6-O-카페오일필리노사이드 A(3)(Zhao D. P. et. al., J. Nat. Med., 2009, 63, 241), 악테오사이드(4), 루코스셉터사이드 A(5)(Miyase T. et. al., Chem. Pharm. Bull., 1982, 30, 2732), 지오노사이드 D(6)(Sasaki H. et. al., Phytochemistry 1989, 28, 875) 및 6-카페오일-D-글루코즈(7)(Shimomura H. et. al., Phytochemistry 1987, 28, 249), 마티노사이드(13)(Miyase T. et. al., Chem. Pharm. Bull., 1982, 30, 2732)임을 확인하였으며, 1종의 이리도이드 화합물로서 8-O-아세틸-6′-O-카페오일하르파지드(9)(Zhao D. P. et. al., J. Nat. Med., 2009, 63, 241), 3종의 플라보노이드 화합물로서 에리오딕티올-7-O-β-D-글루코피라노사이드(10)(Cui C.-B. et. al., Chem. Pharm. Bull., 1990, 38, 3218) 루테올린 4′-O-β-D-글루코피라노사이드(11)(Yoshizaki M. et. al., Phytochemistry 1987, 26, 2557, Markham K. R. et. al., Terahedron 1978, 34, 1389), 로이폴린(12)(Kaneko T. et. al., Phytochemistry 1995, 39, 115)로 분석되었으며, 알려진 문헌의 내용과 일치함을 확인할 수 있었다.

실시예 1 : t -BHP에 의한 간세포 손상 회복 효과

층꽃풀로부터 추출한 메탄올 추출물, 이의 분획물 및 상기 제조예 2에서 분리된 화합물들을 각각 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 100 ㎍/㎖과 100 mM로 저장 용액(stock solution)을 만들었으며, 이를 배지로 희석시켜 알맞은 농도로 사용하였다. 사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 2ㅧ 10⁴ cell/well로 분주하여 24시간동안 배양하여 안정화하였다. 배양된 세포에 층꽃풀 메탄올 추출물, 분획물 및 이로부터 분리된 화합물들을 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양하고, 200 μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 독성을 유발하였다. 이와 같이 처리된 세포를 세포독성 및 세포 생존 정도를 알아보기 위하여 MTT 분석법(Hansen M.B. et. al., 1989, J. Immunol. Methods 119:119)을 사용하였다.

MTT가 첨가된 세포를 4시간 동안 배양한 후 시약을 제거하고 각 웰에 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. t-BHP 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 독성 처리군 및 시료 처리군의 세포생존율을 대조군에 대한 상대적인 백분율로 나타내었으며 3회 반복 실험한 결과를 표 1과 표 2에 각각 나타내었다.

HepG2 세포에서의 t-BHP 유도 독성에 대한 층꽃풀 추출물 및 이의 분획물의 세포독성 보호 효과

상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 사람 간암 세포주 유래 HepG2 세포에서 200 μM t-BHP에 의한 세포독성은 층꽃풀 추출물 및 이들의 분획물에 의하여 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 특히 에틸아세테이트 분획에서의 세포보호 효능은 다른 용매 분획에서의 보호효능보다 탁월한 효능을 보이고 있음을 알 수 있었으며, 5 ㎍/㎖에서의 저농도에서도 61.2ㅁ 1.6%의 우수한 세포보호 효능을 나타내고 있음을 알 수 있었다.

상기 결과로부터 층꽃풀로부터 추출한 추출물 및 이들의 분획물들이 독성물질에 의한 간세포 손상 보호 효과가 우수함을 알 수 있었다.

HepG2 세포에서의 t-BHP 유도 독성에 대한 화합물 1 - 14와 대조 약물의 세포독성 보호효과

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에서 200 μM t-BHP에 의한 세포독성은 상기 제조예 2에서 분리 정제한 화합물 1 ~ 14에 의하여 농도 의존적으로 감소하였다. 특히 화합물 1의 보호 효과는 대조약물로 사용한 실리빈에 비하여 매우 우수하고, 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 보호 효과와 유사한 정도에 해당하며, 1 μM에서의 저농도에서는 오히려 콰르세틴의 보호 효능 보다도 우수한 것을 알 수 있었다. 따라서 층꽃풀의 메탄올 추출물로부터 분획한 에틸 아세테이트 분획으로부터 분리한 이들 화합물들은 독성에 의한 간세포 보호제로 유용함을 알 수 있었다.

하기에 본 발명의 간독성 질환 예방 또는 치료제를 위한 제제예를 예시한다.

제조예 1 : 정제의 제조

유효성분(층꽃풀 추출물) 10 g

락토스 70 g

결정성 셀룰로오스 15 g

마그네슘 스테아레이트 5 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.

제조예 2 : 캡슐제의 제조

유효성분(층꽃풀의 추출물) 10 g

옥수수 전분 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 6 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

Claims (11)

1. 층꽃풀(Caryopteris incana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 층꽃풀을 물, C₁ ~ C₄의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기의 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 분획물은 층꽃풀 추출물을 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트 및 부탄올 중에서 선택된 용매로 분획하여 얻은 분획물인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물 또는 분획물은 하기 화학식 1 내지 10으로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
   [화학식 1]
   

   

   
   
   [화학식 2]
   

   

   
   
   
   [화학식 3]
   

   

   
   
   [화학식 4]
   

   

   
   
   [화학식 5]
   

   

   
   
   [화학식 6]
   

   

   
   
   [화학식 7]
   

   

   
   
   [화학식 8]
   

   

   
   
   [화학식 9]
   

   

   
   
   [화학식 10]
   

   

   
   
   상기 화학식 4에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소 또는 메틸기를 의미하며, 화학식 6에서 R은 하기 화학식 11의 카페오일기 또는 하기 화학식 12의 6,7-디히드로포리아멘토일기를 의미한다.
   [화학식 11]
   

   

   
   [화학식 12]
   

   

   
   
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
7. 하기 화학식 1 내지 10으로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
   [화학식 1]
   

   

   
   
   [화학식 2]
   

   

   
   
   [화학식 3]
   

   

   
   
   [화학식 4]
   

   

   
   
   [화학식 5]
   

   

   
   
   [화학식 6]
   

   

   
   
   [화학식 7]
   

   

   
   
   [화학식 8]
   

   

   
   
   [화학식 9]
   

   

   
   
   [화학식 10]
   

   

   
   
   상기 화학식 4에서, R₁ 및 R₂는 각각 수소 또는 메틸기를 의미하며, 화학식 6에서 R은 하기 화학식 11의 카페오일기 또는 하기 화학식 12의 6,7-디히드로포리아멘토일기를 의미한다.
   [화학식 11]
   

   

   
   [화학식 12]
   

   

   
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수인 것을 특징으로 하는 간독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
9. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 6으로 표시되는 화합물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
   [화학식 2]
   

   

   
   
   [화학식 6]
   

   

   
   상기 화학식 6에서 R은 하기 화학식 11의 카페오일기 또는 하기 화학식 12의 6,7-디히드로포리아멘토일기를 의미한다.
   [화학식 11]
   

   

   
   [화학식 12]
   

   

   
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 화합물은 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    
11. 층꽃풀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 개선용 건강 식품.
    
    

Images