KR20120089846A - 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체, 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체, 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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행크 에프. 컹
크레이그 비. 톰슨
웬차오 쿠
카를 플뢰슬
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체에 관한 것이다. 또한, 단일 부분입체이성질체의 제조 방법이 기재되어 있을 뿐만 아니라, 영상화제로서의 방사성표지된 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체의 사용 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체, 및 그의 제조 및 사용 방법{SINGLE DIASTEREOMERS OF 4-FLUOROGLUTAMINE AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 8월 14일에 출원된 미국 가출원 제61/233,875호의 이점을 주장하며, 이의 전문은 본원에 포함된다.
기술분야
본 출원은 4-플루오로-글루타민의 개선된 제조 방법에 관한 것이다.
플루오린-치환된 아미노산은 펩티드-기반 약물 디자인 및 단백질 공학에서 이용되며, 또한 암 진단을 위한 PET 영상화에서도 용도가 입증된다. 2-[18F]플루오로-2-데옥시-D-글루코스 (FDG)가 양전자 방출 단층촬영 (positron emission tomography; PET) 추적자로서 성공적으로 개발되어 일상적인 암 영상화에 사용된 이래로, 다양한 질환의 진단을 위한 플루오린-18 방사성표지된 작용제의 설계 및 개발이 매우 활발한 연구 영역으로서 출현하였다. 예를 들어, 문헌 [Mercer, J. R., Molecular imaging agents for clinical positron emission tomography in oncology other than fluorodeoxyglucose (FDG): applications, limitations and potential. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 2007, 10, (2), 180-202]; [Couturier, O.; Luxen, A.; Chatal, J.-F.; Vuillez, J.-P.; Rigo, P.; Hustinx, R., Fluorinated tracers for imaging cancer with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2004, 31, (8), 1182-1206.]; 및 [Miller, P. W.; Long, N. J.; Vilar, R.; Gee, A. D., Synthesis of 11C, 18F, 15O, and 13N radiolabels for positron emission tomography. Angewandte Chemie, International Edition 2008, 47, (47), 8998-9033]을 참고할 수 있다.
FDG에 의한 암 영상화의 메카니즘은 에너지원 - 글루코스에 대한 종양 세포의 갈망, 즉, 종양 세포에서의 증가된 해당작용을 기반으로 한다. 최근의 보고는 글루타민 (NH2C(O)CH2CH2CHNH2C(O)OH), Gln)도 또한 스트레스 하에서 세포를 위한 대사성 에너지원이 될 수 있다는 것을 제안하는데, 바로 글루타민분해 (glutaminolysis)이다. 문헌 [Wise, D. R.; Deberardinis, R. J.; Mancuso, A.; Sayed, N.; Zhang, X. Y.; Pfeiffer, H. K.; Nissim, I.; Daikhin, E.; Yudkoff, M.; McMahon, S. B.; Thompson, C. B., Myc regulates a transcriptional program that stimulates mitochondrial glutaminolysis and leads to glutamine addiction. Proc Natl Acad Sci USA 2008]. 따라서, 증가된 종양 대사를 연구하기 위한 대사성 추적자로서 Gln 및 그의 유사체에 대한 개발의 필요성이 존재한다.
18F-방사성표지된 4-플루오로-L-글루타민 (4-FGln)의 4가지 부분입체이성질체 ([18F]1, 2, 3 및 4)의 합성 및 다양한 유형의 종양 세포에서의 이들의 생물학적 특성에 대한 추가적 평가가 관심을 받고 있다.
Figure pct00001
그러나, [18F]1-4의 제조를 입증하기 위해서는, 비방사성 분자, 소위 "비방사성 (cold) 표준물"의 실제적인 합성이 먼저 이루어져야 할 필요가 있다. 다양한 입체특이적 플루오린화 α-아미노산 (F-α-AA)을 합성하고자 한 시도들이 최근 보고된 바 있다. 문헌 [Dave, R.; Badet, B.; Meffre, P., gamma-Fluorinated analogs of glutamic acid and glutamine. Amino Acids 2003, 24, (3), 245-261]; [Tolman, V.; Sedmera, P., Chemistry of 4-fluoroglutamic acid. Part 3. Preparation of the diastereomers of 4-fluoroglutamine and 4-fluoroisoglutamine. An enzymatic access to the antipodes of 4-amino-2-fluorobutyric acid. Journal of Fluorine Chemistry 2000, 101, (1), 5-10]. 이들 합성은 이하의 반응식 1 및 2에 요약되어 있다.
<반응식 1>
Figure pct00002
<반응식 2>
Figure pct00003
반응식 1에 개시된 일련의 반응은 4-플루오로글루탐산의 혼합물로부터 출발하여 4가지 부분입체이성질체의 혼합물로서의 4-플루오로글루타민만을 제공한다. 4-플루오로글루탐산의 부분입체이성질체의 제조를 위해서는 11 단계까지가 필요할 수 있다. 반응식 2에 개시된 일련의 반응은 에리트로 (erythro) 또는 트레오 (threo) 4-플루오로글루탐산의 라세미 혼합물로 출발한다. 이들 라세미체는 그 후 라세미 에리트로 또는 라세미 트레오 4-FGln으로 전환된다. 단일 이성질체는 반응식 2의 방법에 따라 제조될 수 없다. 흥미롭게도, 문헌 [Dave, et al.]에는 "4-플루오로글루탐산의 모든 4가지 입체이성질체의 제조를 위한 이용가능한 절차가 있음에도 불구하고 [반응식 2와] 동일한 변형이 거울상이성질체상으로 순수한 4-플루오로글루타민의 합성에는 아직 적용되지 못했다는 것을 주목할 만하다"라고 기재되어 있다.
WO2008/052788에는, 글리신-함유 시프 염기 (Schiff's base) 및 (S)-2-[N-(N-벤질프로필)아미노]벤조페논 (BPB)의 니켈 착체 및 3-브로모부트-3-엔산 메틸 에스테르를 이용한 금속-촉매된 합성에 의해 제조된 4-플루오로-L-글루타민의 부분입체이성질체 혼합물의 제조가 기재되어 있다.
<반응식 3>
Figure pct00004
WO2008/-62799, 실시예 1 및 2.
그럼에도 불구하고, 4-플루오로글루타민의 4가지 부분입체이성질체 각각의 단일 이성질체의 합성은 아직까지 보고된 바 없다. 게다가, 그의 궁극적인 목표가 방사성 화합물을 합성하는 것이라는 점을 고려하면, 반응식 1 및 2에 개시된 일련의 반응과 대조적으로 후기 단계에서 플루오린 원자를 도입하는 합성은, 18F 원자의 짧은 반감기 (t1 /2 = 109.7분)로 인해 유리하다.
<발명의 개요>
본 발명은 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체, 및 또한 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체의 전구체에 관한 것이다.
Figure pct00005
또한, 본 발명은
80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체를, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체를 형성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 플루오린화제와 반응시키는 단계; 및
화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체를, 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체를 생성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 산과 반응시키는 단계
를 포함하는, 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체의 제조 방법에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure pct00006
<화학식 II>
Figure pct00007
식 중,
R1은 산-불안정 질소 보호기이고;
R2는 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
OR4는 이탈기이고;
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
암을 영상화하는 데 있어서 방사성표지된 4-플루오로글루타민의 단일 이성질체의 사용 방법도 또한 기재된다.
도 1은 9L 세포에서의 화합물 1, 2, 3 및 4의 흡수를 나타낸다.
도 2는 화합물 1의 ％흡수/100 μg 단백질을 나타낸다. x축이 ％흡수/100 μg 단백질이다.
도 3은 화합물 1이 주사된 마우스의 소동물 PET 동화상을 나타낸다.
도 4는 마우스에서의 화합물 1의 흡수를 나타낸다.
본 발명은 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민 부분입체이성질체의 단일 부분입체이성질체에 관한 것이다. 단일 부분입체이성질체 각각은 먼저 제조된 부분입체이성질체의 혼합물과 상이한 재흡수 프로파일을 갖는다는 것이 밝혀진 바 있다. 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체는 하기 화합물 1 내지 4로 나타나 있다. 본 발명은 또한 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 18F-표지된 A-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체에 관한 것이다. 당업자는, 4-플루오로-글루타민에 대한 언급이 비-표지된 플루오로-글루타민 및 표지된, 즉, 18F-표지된 플루오로글루타민을 모두 포함한다는 것을 알 것이다.
Figure pct00008
4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체가 100％ 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 범주 내에서, 4-플루오로글루타민의 다른 부분입체이성질체 1, 2 또는 3가지가 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체와 함께 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 단일 부분입체이성질체는 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단일 부분입체이성질체는 90％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단일 부분입체이성질체는 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다.
본원에서 사용된 "부분입체이성질체 과잉률"은 조성물 내 나머지 부분입체이성질체와 비교하여 목적하는 단일 부분입체이성질체의 몰분율 간의 차이를 지칭한다. 부분입체이성질체 과잉률은 다음과 같이 계산된다:
(단일 부분입체이성질체의 양)-(다른 부분입체이성질체의 양)/l.
예를 들어, 90％의 1과 10％의 2, 3, 4 또는 이들의 혼합물을 함유한 조성물은 80％ [(90-10)/l]의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 95％의 1과 5％의 2, 3, 4 또는 이들의 혼합물을 함유한 조성물은 90％ [(95-5)/l]의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 99％의 1과 1％의 2, 3, 4 또는 이들의 혼합물을 함유한 조성물은 98％ [(99-l)/l]의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 부분입체이성질체 과잉률은 1, 2, 3 또는 4 중 임의의 하나에 대해 유사하게 계산될 수 있다.
4-플루오로글루타민의 부분입체이성질체 각각의 양을 정량화하는 방법도 또한 당업계에 공지되어 있다. 가장 바람직한 방법으로는 바람직하게는 키랄 컬럼을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 들 수 있으며, 여기서 각각의 부분입체이성질체에 대한 피크 각각의 곡선하 면적이 샘플에 존재하는 각각의 부분입체이성질체의 양과 관련이 있다.
특히, 4-플루오로-L-글루타민의 단일 부분입체이성질체 1 및 2, 및 또한 상응하는 18F-표지된 화합물 [18F]1 및 [18F]2의 제조 방법이 중요하다.
본 발명의 방법은, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체를, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체를 형성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 플루오린화제와 반응시키는 단계; 및
화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체를, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체를 생성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 산과 반응시키는 단계를 포함한다.
<화학식 I>
Figure pct00009
<화학식 II>
Figure pct00010
식 중, R1은 산-불안정 질소 보호기이고; R2는 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고; R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고; OR4는 이탈기이고; n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
하나의 예시적인 산은 트리플루오로아세트산이다.
바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 다른 3가지의 부분입체이성질체가 존재하지 않는 단일 부분입체이성질체로서 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 바람직하게는, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 90％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 가장 바람직하게는, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 Ia의 화합물이다.
<화학식 Ia>
Figure pct00011
본 발명의 범주 내에서, "본질적으로"는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 단 하나의 부분입체이성질체가 존재하는 것을 지칭한다.
다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 Ib의 화합물이다.
<화학식 Ib>
다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 Ic의 화합물이다.
<화학식 Ic>
Figure pct00013
다른 실시양태에서, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 Id의 화합물이다.
<화학식 Id>
Figure pct00014
80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체, 특히 화합물 Ia, Ib, Ic 및 Id도 또한 본 발명의 범주에 속한다.
바람직하게는, -OR4는 -O토실레이트 (-OSO2C6H4-pCH3)이다.
바람직하게는, 화학식 II의 화합물은 다른 3가지의 부분입체이성질체가 존재하지 않는 단일 부분입체이성질체로서 제공된다. 부분입체이성질체 순도가 화학식 II의 화합물의 형성에서 유지되지 않는다면, 부분입체이성질체를 HPLC를 비롯한 당업계에 공지된 방법에 따라 분리하여 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체를 수득할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 바람직하게는, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 90％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다. 가장 바람직하게는, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 IIa의 화합물이다.
<화학식 IIa>
Figure pct00015
다른 실시양태에서, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 IIb의 화합물이다.
<화학식 IIb>
Figure pct00016
또다른 실시양태에서, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 IIc의 화합물이다.
<화학식 IIc>
Figure pct00017
또다른 실시양태에서, 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 본질적으로 하기 화학식 IId의 화합물이다.
<화학식 IId>
Figure pct00018
플루오린화제는 그 자체가 당업계에 공지되어 있으며, 적합한 플루오린화 시약은 당업자에 의해 식별가능하다. 특히 바람직한 플루오린화제의 예로는 초원자가 (hypervalent) 실리케이트 플루오린화제, 예를 들어, 테트라부틸암모늄 디플루오로트리페닐실리케이트 (TBAT), [Bu4N][Ph3SnF2], 퍼플루오로-1-부탄술포닐 플루오라이드 (PBSF), 트리(디메틸아미노)술포늄 디플루오로트리메틸실리케이트 (TASF)가 있다.
플루오린화 동안, C(2) 위치에서의 에피머화가 가능하며, 이는 부분입체이성질체 과잉의 소실을 초래한다. 그러한 상황에서, 부분입체이성질체는 통상의 방법, 예를 들어, HPLC를 이용하면 용이하게 분리될 수 있다. 플루오린화 시약의 염기도를 완화시키면 에피머화의 양을 감소 또는 제거할 수 있다는 것이 발견되었다. 플루오린화제의 염기도를 완화시키는데 사용될 수 있는 시약의 예로는 2-메시틸렌술폰산 및 Et3N-(HF)3이 있다. 바람직하게는, 플루오린화제는 pH를 약 7-8로 조정하도록 적정된다. 플루오린화를 위한 특히 바람직한 시약은 TASF이며, 여기서 pH는 Et3N(HF)3으로 조정된다.
플루오린화 반응을 위한 바람직한 용매로는 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 이들의 혼합물이 있다.
18F-표지된 플루오린화 시약의 사용은 화학식 IIa, IIb, IIc 및 IId의 상응하는 18F-표지된 화합물의 형성을 가져올 것이다.
특정 플루오린화 반응 조건의 사용은 플루오린의 혼입을 성공적으로 일으키는 한편, 부분입체이성질체 과잉의 소실을 가져올 수 있다. 그러한 상황에서, 부분입체이성질체는 통상의 방법, 예를 들어, HPLC를 사용하면 용이하게 분리될 수 있다.
본원에서 사용된 "산-불안정 질소 보호기"는 산에 의해 제거되어 -NH-를 제공할 수 있는, 질소 원자 상의 보호기를 지칭한다. 그러한 보호기는 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Greene, T.W., Wuts, P. G. M. Greene's Protective Group in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., 2007]을 참고할 수 있다. 특히 바람직한 산-불안정 질소 보호기로는, 카르복실-기반 보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐 (Boc)이 있다.
본원에서 사용된 "알킬"은 1 내지 30개의 탄소, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소를 갖는, 분지 또는 비분지 포화 탄화수소를 지칭한다. 바람직한 알킬 기로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸 및 헥실이 있다.
본원에서 사용된 "시클로알킬"은 3 내지 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 6개의 탄소를 갖는 시클릭 포화 탄화수소를 지칭한다. 바람직한 시클로알킬 기로서는, 예를 들어, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 등이 있다.
본원에서 사용된 OR4는 이탈기이며, 플루오라이드 이온에 의해 친핵성 치환되는 기를 지칭한다. 특히 바람직한 것은 OR4가 -O토실레이트 (-OTos, -OSO2-C6H4-CH3)인 실시양태이다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 화학식 IIIa 또는 IIIb의 화합물을 클로로아세트산의 존재 하에서 화학식 IV의 화합물과 접촉시켜, 화학식 V의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물을 형성시켜 제조한다.
<화학식 IIIa>
Figure pct00019
<화학식 IIIb>
Figure pct00020
<화학식 IV>
Figure pct00021
<화학식 V>
Figure pct00022
당업자는, 출발 물질이 화학식 IIIa의 화합물인 경우, 화학식 V의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물이 바람직하게는 화학식 Va 및 Vb의 화합물을 포함할 것이라는 것을 용이하게 이해할 것이다.
<화학식 Va>
Figure pct00023
<화학식 Vb>
Figure pct00024
유사하게, 출발 물질이 화학식 IIIb의 화합물인 경우, 화학식 V의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물은 바람직하게는 화학식 Vc 및 Vd의 화합물을 포함할 것이다.
<화학식 Vc>
Figure pct00025
<화학식 Vd>
Figure pct00026
화학식 V의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물은 화학식 VI의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물을 형성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 반응된다.
<화학식 VI>
Figure pct00027
당업자는, 화학식 V의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물이 화학식 Va 및 Vb의 화합물을 포함하는 경우, 화학식 VI의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물이 바람직하게는 화학식 VIa 및 VIb의 화합물을 포함할 것이라는 것을 용이하게 이해할 것이다.
<화학식 VIa>
Figure pct00028
<화학식 VIb>
Figure pct00029
유사하게, 화학식 V의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물이 화학식 Vc 및 Vd의 화합물을 포함하는 경우, 화학식 VI의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물은 바람직하게는 화학식 VIc 및 VId의 화합물을 포함할 것이다.
<화학식 VIc>
Figure pct00030
<화학식 VId>
Figure pct00031
바람직한 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물은 화학식 VIa 및 VIb의 화합물의 혼합물이다.
<화학식 VIa>
Figure pct00032
<화학식 VIb>
Figure pct00033
그 후, 화학식 VI의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물은 바람직하게는 물리적 분리에 의해 분리된다. 부분입체이성질체에 대한 물리적 분리 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피가 있다. 본 발명에 따르면, 화학식 VI의 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물은 분리되어, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는, 바람직하게는 90％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는, 가장 바람직하게는 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 화학식 VI의 화합물의 단일 부분입체이성질체를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, R1은 -C(O)O-C1 - 6알킬 또는 -C(O)O-C1 - 6시클로알킬이다. 다른 실시양태에서, R1은 -C(O)O-C1 - 6알킬이다. 바람직하게는, R1은 -C(O)O-t-부틸이다.
다른 실시양태에서, R2는 t-부틸이다. 또다른 실시양태에서 R3은 -OCH3이다. 다른 실시양태에서, n은 3이다.
방사성표지된, 바람직하게는 18F로 표지된 본 발명의 화합물의 단일 부분입체이성질체는 환자에서 질환, 특히, 암을 진단하는 데 유용한 조성물로 제제화될 수 있다. 방사성표지된 화합물 1, 2, 3 또는 4가 본 발명의 진단학적 조성물에서 사용될 수 있지만, 진단학적 조성물에서 화합물 1 또는 2를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이들 진단학적 조성물은, 조성물을 당업계에 공지된 담체 및/또는 희석제와 함께 제제화함으로써 (예를 들어, 주사에 의한 비경구 투여에 의한) 환자에 대한 투여용으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 진단학적 조성물을 환자에게 투여한 후, 환자에서 암을 영상화하는 수단으로서 단일 부분입체이성질체로부터의 감마선을 검출할 수 있다. 그러한 검출에 대한 한가지 예시적인 방법은 양전자 방출 단층촬영 (PET)이다.
이하의 기재는 본 청구된 발명에 대한 예시로서 개시되는 것이며, 제한하는 것으로 의도된 것이 아니다.
2,4,6-트리메톡시벤질아민으로부터 2,4,6-트리메톡시벤질이소시아나이드 (Tmob-IC)를 제조하였다. 반응식 4를 참고하면 된다. 상응하는 포름아미드로의 전환 후, 트리포스겐으로 처리하여 목적하는 이소시아나이드를 70％ 전체 수율로 수득하였다.
<반응식 4>
Figure pct00034
알데히드 8의 제조는 반응식 5에 도시되어 있다. BF3 촉매 작용 하에서 tert-부틸 트리클로로아세트이미데이트를 사용하여 부분적으로 보호된 L-아스파르트산 유도체 A를 에스테르화하여 97％ 완전히 보호된 L-아스파르트산 5를 얻는다. 촉매 수소화에 의해 벤질 기를 제거한 후, 2-단계 조합된 환원 반응으로 전체 수율 87％로 호모세린 6을 제공한다. 이후, 데스-마틴 페리오디난 시약으로 산화시켜 알데히드 8을 86％ 수율로 제공한다.
<반응식 5>
Figure pct00035
중간체 Tmob-IC 및 8이 모두 제조되면, 파서리니 (Passerini) 반응을 실시하여 글루타민 골격을 모아 탁월한 수율로 4-아실옥시 치환된 Gln 유도체 9를 제공한다.
티오우레아를 사용하여 클로로아세틸 기를 제거하여 화합물 10을 생산한다 (반응식 6). 2개의 부분입체이성질체인 알콜 10' 및 10" (HPLC 분석에 기초하여 1:1 비율)은 분명한 극성 차이를 보이며, 플래쉬 크로마토그래피로 분리할 수 있다 (반응식 7). 이러한 두 알콜의 절대 배열은 모셔 (Mosher) 에스테르 분석에 의해 결정된다. 할당된 배열은 두 알콜의 물리적 특성과 비교할만 하다. (2S,4R) 배열의 알콜 (10')은 더 높은 mp (143-145℃)를 나타내는 반면, (2S,4S) 배열의 알콜 (10")은 더 낮은 mp (58-61℃)를 나타낸다. 히드록실을 토실화하여 토실레이트 11을 96％의 수율로 얻는다. 초원자가 실리케이트 플루오린화제인 트리스(디메틸아미노)술포늄 디플루오로트리메틸실리케이트 (TASF)로 플루오린화하여 화합물 12 (12' 및 12")를 60-70％의 수율로 얻는다. TFA로 처리하여 목적하는 4-플루오로글루타민 (1 및 2)을 생산한다.
<반응식 6>
Figure pct00036
<반응식 7>
Figure pct00037
알데히드 8의 거울상이성질체인 화합물 8a는 구입가능한 D-아스파르트산 유도체 B로부터 출발하여 반응식 8에 설명된 순서에 따라 제조할 수 있다.
<반응식 8>
Figure pct00038
이후, 알데히드 8a를 파서리니 반응 조건 하에서 이소시아나이드 및 클로로아세트산과 반응시켰다. 수득되는 중간체 9a를 티오우레아 및 NaHCO3의 배합 조건을 사용하여 탈아세틸화시킨 후, 조심스럽게 플래쉬 크로마토그래피 분리하여 2종의 입체특이적 4-히드록시 기 치환된 D-글루타민 유도체 10a' 및 10a"를 얻는다 (반응식 9). 토실화, 플루오린화 및 산성 탈보호 반응을 포함하는 추가 변환을 통해 또다른 2종의 4-FGln 부분입체이성질체인 플루오린화 D-글루타민 유사체 3 및 4를 비슷한 수율로 얻는다. 또한, 천천히 증발시켜 중간체 10a', 12a' 및 최종 생성물 3 모두에 대한 고품질의 결정 샘플을 제공한다. X-선 결정 분석으로 추가로 이들 화합물의 절대 배열을 식별한다.
<반응식 9>
Figure pct00039
또한, 효과적인 시간 및 조건 하에서 하기 화학식 I의 화합물을 플루오린화제와 반응시켜 하기 화학식 II의 화합물을 형성하고,
효과적인 시간 및 조건 하에서 화학식 II의 화합물을 반응시켜 4-플루오로글루타민을 생산하는 것을 포함하는, 4-플루오로글루타민
Figure pct00040
의 제조 방법이 본 발명의 범주 내에 포함된다.
<화학식 I>
Figure pct00041
<화학식 II>
Figure pct00042
식 중,
R1은 산-불안정 질소 보호기이고;
R2는 C1 - 6알킬이고;
R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬이고;
OR4는 이탈기이고;
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
바람직한 방법에서, 화학식 I의 화합물은 클로로아세트산의 존재 하에 하기 화학식 III의 화합물을 하기 화학식 IV의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 V의 화합물을 형성하고, 효과적인 시간 및 조건 하에서 화학식 V의 화합물을 반응시켜 화학식 VI의 화합물을 형성함으로써 제조된다.
<화학식 III>
Figure pct00043
<화학식 IV>
Figure pct00044
<화학식 V>
Figure pct00045
<화학식 VI>
Figure pct00046
특정 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 화학식 VIy의 화합물 및 화학식 VIz의 화합물의 혼합물이다.
<화학식 VIy>
Figure pct00047
<화학식 VIz>
Figure pct00048
바람직하게는, 화학식 VIy의 화합물 및 화학식 VIz의 화합물을 물리적으로 분리하였다. 바람직한 물리적 분리 방법은 크로마토그래피를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, R1은 -C(O)O-C1 - 6알킬이다. 보다 바람직하게는, R1은 -C(O)O-t-부틸이다. 또한, R2가 t-부틸인 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, R3은 -OCH3이다. 또다른 실시양태에서, OR4는 O토실레이트이다. 또다른 실시양태에서, n은 3이다.
본 발명에 사용하기에 바람직한 플루오린화제는 트리스(디메틸아미노)술포늄 디플루오로트리메틸실리케이트이다. 바람직하게는, 플루오린화제는 18F를 포함한다.
바람직하게는, 화학식 III의 화합물은
Figure pct00049
이다.
바람직하게는, 4-플루오로글루타민은
Figure pct00050
이다.
또한, 4-플루오로글루타민이
Figure pct00051
인 것이 바람직하다.
또한, 하기 화학식 I의 화합물이 본 발명의 범주에 포함된다.
<화학식 I>
Figure pct00052
상기 식에서,
R1은 산-불안정 질소 보호기이고;
R2는 C1 - 6알킬이고;
R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬이고;
OR4는 이탈기이고;
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
바람직하게는, 화학식 I의 화합물은
Figure pct00053
및
Figure pct00054
이다.
< 실시예 >
당업자는 하기 절차들이 단지 설명을 위한 것이지 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 또한, 하나의 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 또는 부분입체이성질체의 쌍에 대한 절차가 설명되면, 유사한 절차를 사용하여 다른 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 또는 부분입체이성질체의 쌍을 제조할 수 있다.
일반적인 정보
사용된 모든 시약은 시판 제품이고, 달리 언급하지 않는 한 추가 정제없이 사용하였다. 실리카겔 60 (230-400 메쉬, 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피 (FC)를 실시하였다. 각각의 절차의 대해, "표준 후처리"는 다음 단계들을 가리킨다: 동일 부피의 물을 함유하는 분별 깔대기로 반응 혼합물을 붓는 단계, 상기 혼합물을 동일 부피의 표시된 유기 용매로 3회 추출하고 및 유기상을 함께 배합하는 단계, 상기 유기층을 염수로 세척하는 단계, 황산나트륨 또는 황산마그네슘으로 건조시키는 단계, 고체를 여과하는 단계 및 감압하에 여과물을 농축시키는 단계. 융점 (mp)을 MEL-TEMP 상에서 점검하였다 (미보정). 200 MHz에서 1H NMR 스펙트럼을 얻었고, 50 MHz에서 13C NMR 스펙트럼을 기록하였으며, 282 MHz에서 19F NMR 스펙트럼을 기록하였다 (브루커 (Bruker) DPX 200 및 DMX 300 분광계). 중수소화 용매 중 잔류 양성자에 대해 δ 값 (백만분의 일)으로 화학적 이동을 기록하였다. 커플링 상수를 헤르츠로 기록하였다. 다중도는 s (단일선), d (이중선), t (삼중선), q (사중선), p (오중선), br (넓은 선) 또는 m (다중선)으로 정의하였다. 애질런트 (Aglient) LC 1100 시리즈에서 HPLC 분석을 실시하였다. 펜실바니아 대학 방사선 학과 방사성제약 화학 부서에서 애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies) LC/MSD TOF 질량 분광계를 사용하여 고해상도 MS 실험을 실시하였다. 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 모델 243B 편광계 상에서 광학 회전 값을 측정하였다.
2-( 이소시아노메틸 )-1,3,5- 트리메톡시벤젠 Tmob - IC
N-(2,4,6- 트리메톡시벤질 ) 포름아미드
Figure pct00055
에틸 포르메이트 (7.5 mL, 93 mmol)를 2,4,6-트리메톡시벤질아민 (0.985 g, 5.0 mmol)을 함유하는 25 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3일 동안 실온에서 교반하고, 여과하였다. 여과된 백색 고체를 수집하고 진공하에 건조시켜 조 생성물 (1.09 g, 97％)제공하였다:
Figure pct00056
참고 문헌 [F. Christopher Pigge, John J. Coniglio, Shiyue Fang. Organometallics 2002, 21, 4504-4512].
2-( 이소시아노메틸 )-1,3,5- 트리메톡시벤젠
Figure pct00057
빙조에서 냉각시킨 5 mL CH2Cl2 중 앞서 제조한 포름아미드 (0.675 g, 3.0 mmol) 및 트리에틸 아민 (1 mL)의 교반 용액에 트리포스겐 용액 (0.356 g, 1.2 mmol, 5 mL CH2Cl2에 용해됨)을 적가하였다. 적가 후 발열 현상이 사라지면, 반응 혼합물을 실온에 두고, TLC용 샘플을 수집하였다. 반응물인 포름아미드가 소비되면, 반응 혼합물을 CH2Cl2로 표준 후처리하였다. 조 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (FC) (용매로서 헥산 중 EtOAC 20％-25％)로 정제하여 연한 황색의 결정성 고체 생성물 (0.435 g, 70％, mp 107-109℃)을 제공하였다;
Figure pct00058
참고 문헌 [Susana P. G. Costa, Hernani L. S. Maia, Silvia M. M. A. Pereira-Lima. Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 1475-1479].
중간체 (S)-4- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4- 옥소부타노에이트 (8)
(S)-4-벤질 1- tert -부틸 2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 ) 숙시네이트 (5)
Figure pct00059
화합물 A (0.969 g, 3.0 mmol)를 50 mL 둥근 바닥 플라스크에서 10 mL CH2Cl2에 용해시켰다. 이 용액에 tert-부틸 2,2,2-트리클로로아세트아미데이트 (1.31 g, 6 mmol) 및 BF3?Et2O (37 ㎕, 0.3 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 고체 NaHCO3 (0.84 g, 10 mmol)를 한 번에 첨가하였다. 이 혼합물을 10분 동안 교반하고 실리카 플러그로 여과하였다. 여과물을 진공하에 증발시키고 잔류물을 FC (EtOAc/헥산, 15/85, 부피/부피)로 정제하여 백색 고체 5 (1.10 g, 97％, mp 63-64℃)를 제공하였다; (lit.1 64-65℃; lit.2 61-63℃); [α]24 D = + 20.0 (c = 1.0, CHCl3) 및 [α]24 D = -8.1 (c = 2.0, MeOH) [lit2 [α]22 D = + 19.6 (c = 1.0, CHCl3); lit3 [α]25 D = -7.4 (c = 2.0, MeOH)];
Figure pct00060
tert-부틸 에스테르화에 대한 참고 문헌 [A. Armstrong, I. Brackenridge, R. F. W. Jackson, J. M. Kirk. Tetrahedron Lett. 1988, 29, 2483-2486].
생성물 식별에 대한 참고 문헌 (융점 및 광학 회전):
문헌 1. [Stephen C. Bergmeir, Agustin A. Cobas, Henry Rapoport. The Journal of Organic Chemistry 1993, 58, 2369-2376]
문헌 2. [Robert M. Adlington, Jack E. Baldwin, David Catterick, Gareth J. Pareth J. Pritchard. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1999, 855-866]
문헌 3. [Madhup K. Dhaon, Richard K. Olsen, K. Ramasamy. The Journal of Organic Chemistry 1982, 47, 1962-1965].
(S)-4- tert - 부톡시 -3-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4- 옥소부탄산 (6)
Figure pct00061
무수 EtOH (20 mL) 중 에스테르 5 (1.04 g, 2.74 mmol) 및 10％ Pd/C (0.2 g)의 혼합물을 50 psi에서 수소로 3시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 이 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공하에 농축시켜 백색 결정성 고체 6 (0.79 g, 100％)을 수득하였다:
Figure pct00062
(S)-4- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4- 히드록시부타노에이트 (7)
Figure pct00063
50 mL 둥근 바닥 플라스크 내에서 산 6 (0.733 g, 2.54 mmol)을 5 mL THF에 용해시키고, 용액을 -10℃로 냉각시켰다. 이 용액에 Et3N (0.39 mL, 2.79 mmol) 및 에틸 클로로포르메이트 (0.27 mL, 2.79 mmol)를 적가하였다. -10 내지 -5℃에서 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하였다. 빙조로 냉각시킨 100 mL 2-목 플라스크 내에서 2 mL H2O와 NaBH4 (0.203 g, 5.33 mmol)의 혼합물에 상기 여과물을 서서히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 추가 4시간 동안 교반하고, 이어서 빙조로 냉각시키면서 pH = 2 - 3이 될 때까지 1 M HCl로 산성화시켰다. 유기상을 수집하고, 수상을 EtOAc (20 mL x 3)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 NaHCO3 (20 mL) 및 염수 (20 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 여과물을 진공하에 증발시키고, 잔류물을 FC (EtOAc/헥산, 35/65 → 45/55, vol/vol)에 의해 정제하여 7 (0.618 g, 87％)을 수득하였다:
Figure pct00064
(S)-4- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4- 옥소부타노에이트 (8)
Figure pct00065
CH2Cl2 (5 mL) 중 알콜 7 (0.284 g, 1.03 mmol)의 용액에 고체 NaHCO3 (0.861 g, 10.25 mmol) 및 데스-마틴 페리오디난 시약 (5.1 mL 0.3 M CH2Cl2 용액, 1.53 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 나트륨 티오술페이트 용액 (1.0 M, 5 mL)을 첨가하고, 생성된 2상 혼합물을 5분 동안 격렬하게 교반하고, 이어서 포화 NaHCO3 (5 mL)를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 CH2Cl2 (15 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켜 조 생성물을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피 (EtOAc/헥산, 20/80, V/V)로 알데히드 8 (0.243 g, 86％)을 백색 결정성 고체로서 제공하였다:
Figure pct00066
(2S)- tert -부틸 2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4-(2- 클로로아세톡시 )-5-옥소-5-(2,4,6- 트리메톡시벤질아미노 ) 펜타노에이트 (9)
Figure pct00067
CH2Cl2 (10 mL) 중 8 (0.366 g, 1.33 mmol)의 교반 용액에 2-(이소시아노메틸)-1,3,5-트리메톡시벤젠 (0.303 g, 1.46 mmol) 및 클로로아세트산 (0.138 g, 1.46 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피 (EtOAc/헥산, 30/70 → 40/60, V/V)하여 9를 왁스성 백색 고체 (0.727 g, 95％)로서 수득하였다:
Figure pct00068
(2S)- tert -부틸 2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4-히드록시-5-옥소-5-(2,4,6-트 리메톡시벤질 아미노) 펜타노에이트 (10)
Figure pct00069
EtOH/THF (5/5 mL) 중 9 (0.678 g, 1.18 mmol)의 교반 용액에 티오우레아 (0.269 g, 3.54 mmol) 및 NaHCO3 (0.297 g, 3.54 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 50℃로 1.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 실리카겔 상 FC (EtOAc/헥산, 45/55 → 60/40, V/V)에 가하여 10을 왁스성 백색 고체로서의 C(4) 부분입체이성질체의 혼합물 (0.543 g, 91％)로서 수득하였다:
Figure pct00070
(2S,4S)- tert -부틸 2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4-히드록시-5-옥소-5-(2,4,6-트 리메톡시벤질 아미노) 펜타노에이트 (10') 및 (2S,4R)- tert -부틸 2-( tert -부톡시카르보닐아미노)-4-히드록시-5-옥소-5-(2,4,6- 트리메톡시벤질아미노 ) 펜타노에이트 (10")
Figure pct00071
앞서 수득한 2개의 부분입체이성질체의 혼합물 10을 FC (실리카겔 60, EtOAc/헥산, 30/70 → 60/40, V/V)에 가하여 2개의 부분입체이성질체 - 알콜 10' 및 10"를 제공하였다.
알콜 10': 백색 고체: mp 143 - 145℃; [α]26 D = -28.7 (c = 1.06, MeOH); 10'의 HPLC: >99％ [Rt = 9.45분; 컬럼: 키랄셀 OD (250 x 4.6 mm)와 직렬 연결된 럭스 3u 셀룰로스-1 (150 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 15％ 2-프로판올; 유속: 1.0 mL/분].
Figure pct00072
알콜 10": 백색 고체: mp 58 - 61℃; [α]26 D = +10.5 (c = 1.0, MeOH); 10"의 HPLC: >99％ [Rt = 9.36분; 컬럼: 키랄셀 OD (250 x 4.6 mm)와 직렬 연결된 럭스 3u 셀룰로스-1 (150 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 15％ 2-프로판올; 유속: 1.0 mL/분].
Figure pct00073
(2S)- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-5-옥소-4-( 토실옥시 )-5-(2,4,6-트 리메톡시벤질 아미노) 펜타노에이트 (11)
Figure pct00074
빙조 (0℃)로 냉각시킨 CH2Cl2 (10 mL) 중 10 (0.546 g, 1.09 mmol)의 교반 용액에 Et3N (0.76 mL, 5.45 mmol), p-톨루엔술포닐 클로라이드 (TsCl, 0.416 g, 2.18 mmol) 및 촉매량의 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 0.11 mmol, 0.013 g)을 첨가하였다. 0℃에서 15분 동안 유지시킨 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 하룻밤 동안 유지시키고, 이어서 CH2Cl2로 표준 후처리하였다. 조 생성물을 FC (EtOAc/헥산, 40/60 → 50/50, V/V)에 의해 정제하여 옅은 백색 고체 11 (0.68 g, 96％)을 수득하였다. 11의 HPLC: 이성질체 1: 50％, Rt = 12.53분; 이성질체 2: 50％, Rt = 18.72분; [컬럼: 럭스 3u 셀룰로스-1 (150 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 5％ 2-프로판올; 유속: 1.0 ml/분].
Figure pct00075
(2S,4R)- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-5-옥소-4-( 토실옥시 )-5-(2,4,6-트 리메톡시벤질 아미노) 펜타노에이트 (11')
Figure pct00076
11의 제조 절차에 따라, 화합물 11'를 알콜 10' (2.010 g, 4.04 mmol)로부터 옅은 백색의 발포성 고체 (2.599 g, 99％ 수율)로서 제조하였다: [α]26 D = -30.5 (c = 1.04, MeOH); 순도에 대한 11'의 HPLC: 98.0％, [주 피크: Rt = 15.9분; 부 피크: 19.0분 및 24.6분; 컬럼: 키랄셀 ODH (250 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 5％ 2-프로판올; 유속: 1.0 mL/분].
Figure pct00077
(2S,4S)- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-5-옥소-4-( 토실옥시 )-5-(2,4,6-트 리메톡시벤질 아미노) 펜타노에이트 (11")
Figure pct00078
11의 제조 절차에 따라, 화합물 11"를 알콜 10" (1.69 g, 3.40 mmol)로부터 옅은 백색의 발포성 고체 (2.12 g, 96％ 수율)로서 제조하였다: [α]26 D = +14.1 (c = 1.01, MeOH); 순도에 대한 11"의 HPLC: 97.7％, [주 피크: Rt = 23.7분; 부 피크: 16.2분; 컬럼: 키랄셀 ODH (250 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 5％ 2-프로판올; 유속: 1.0 mL/분].
Figure pct00079
TASF 에 의한 플루오린화 절차: tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4-플루오로-5-옥소-5-(2,4,6- 트리메톡시벤질아미노 ) 펜타노에이트 (12)의 합성
Figure pct00080
빙조 (0℃) 내에서 냉각시킨 CH2Cl2 (7 mL) 중 11 (0.340 g, 0.52 mmol)의 교반 용액에, CH2Cl2 (3 mL)에 용해시킨 트리스(디메틸아미노)술포늄 디플루오로트리메틸실리케이트 (TASF, 0.287 g, 1.04 mmol)를 적가하였다. 0℃에서 1시간 동안 유지시킨 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 12시간 동안 유지시켰다. TASF 시약의 제2 부분 (1 mL의 CH2Cl2에 용해시킨 0.287 g, 1.04 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 추가 12시간 동안 유지시켰다. 반응물을 빙냉수 (5 mL)의 첨가에 의해 켄칭시키고, 이어서 CH2Cl2로 표준 후처리하였다. 조 생성물을 FC (EtOAc/헥산, 35/65 → 45/55, V/V)에 의해 정제하여 담황색 고체 12 (0.158 g, 61％)를 수득하였다.
Figure pct00081
"중성화된" TASF 에 의한 플루오린화 절차: (2S,4R)- tert -부틸 2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4- 플루오로 -5-옥소-5-(2,4,6- 트리메톡시벤질아미노 ) 펜타노에이트 (12')의 합성
Figure pct00082
CH2Cl2/THF (1.5 mL/1.5 mL) 중 트리스(디메틸아미노)술포늄 디플루오로트리메틸실리케이트 (TASF, 1.38 g, 5.0 mmol)의 교반 용액에 Et3N(HF)3 (0.25 mL)를 적가하였다. 그 후, 토실레이트 11' (0.391 g, 0.6 mmol), THF (1 mL) 및 상기 "중성화된" TASF (2.7 mL, 3.0 mmol)를 환류 응축기가 장착된 25 mL 2-목 플라스크에 차례로 첨가하였다. 혼합물을 오일조에 의해 50℃로 10시간 동안 가열하고, 오일조를 제거하고, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석한 후, 반-포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. EtOAc 상을 수집하고, MgSO4에 의해 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 남아있는 잔류물을 FC (EtOAc/헥산, 25/75 → 40/60, V/V)에 의해 정제하여 옅은 백색의 발포성 고체 12' (0.232 g, 77％)를 수득하였다; [α]24 D = +1.70 (c = 1.14, MeOH); 12'의 HPLC: [99％, 주 피크: Rt = 22.8분; 1％, 부 피크: Rt = 25.2분; 컬럼: 키랄셀 OD (250 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 1.5％ EtOH; 유속: 1.2 mL/분].
Figure pct00083
12'의 CH2Cl2/헥산 용액을 서서히 용매 증발시켜, X-선 결정 구조 분석에 적합한 12'의 결정을 수득하였다.
중간체 12'의 결정 구조:
Figure pct00084
(2S,4S)- tert -부틸-2-( tert - 부톡시카르보닐아미노 )-4- 플루오로 -5-옥소-5-(2,4,6-트 리메톡시벤질 아미노) 펜타노에이트 (12")
Figure pct00085
CH2Cl2/THF (1.5 mL/1.5 mL) 중 트리스(디메틸아미노)술포늄 디플루오로트리메틸실리케이트 (TASF, 1.43 g, 5.2 mmol)의 교반 용액에 Et3N(HF)3 (0.26 mL)를 적가하였다. 그 후, 토실레이트 11" (0.434 g, 0.66 mmol), THF (1 mL) 및 상기 "중성화된" TASF (4.4 mL, 5.2 mmol)를 환류 응축기가 장착된 25 mL 2-목 플라스크에 차례로 첨가하였다. 혼합물을 오일조에 의해 45℃로 24시간 동안 가열하고, 오일조를 제거하고, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석한 후, 반-포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. EtOAc 상을 수집하고, MgSO4에 의해 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 남아있는 잔류물을 FC (EtOAc/헥산, 25/75 → 40/60, V/V)에 의해 정제하여 옅은 백색의 발포성 고체 12" (0.101 g, 30％)를 수득하였다; [α]22 D = -18.4 (c = 1.10, MeOH); 12"의 HPLC: [96.6％, 주 피크: Rt = 20.5분; 3.4％, 부 피크: Rt = 19.0분; 컬럼: 키랄셀 OD (250 x 4.6 mm), UV 검출기, 210 nm, 헥산 중 1.5％ EtOH; 유속: 1.2 mL/분].
Figure pct00086
(2S,4R)-2,5- 디아미노 -4- 플루오로 -5- 옥소펜탄산 (1)
Figure pct00087
빙조 (0℃)로 냉각시킨 디메틸술파이드 (0.1 mL)와 12' (0.192 g, 0.384 mmol)의 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA, 5 mL)을 적가하였다. 첨가 후, 빙조를 제거하고, 반응물을 실온에서 2.5시간 동안 유지시켰다. 용액을 진공하에 증발시켜 대부분의 TFA를 제거하였다. 잔류물을 H2O (5 mL)에 용해시키고, CH2Cl2 (3 mL x 2)로 세척하였다. 수성 부분을 빙조 내에서 냉각시키고, 빙냉시킨 5％ 수성 암모니아를 서서히 첨가하여 pH = 7로 중성화시켰다. 중성화된 용액을 다우엑스 50WX8-200의 소형 컬럼 (H+ 형태, 10 g)에 가하고, 물로 세척하고, 5％ 수성 암모니아로 추가 용리시켰다. 생성물을 함유한 분획을 모아서 진공하에 농축시키고, 고진공 조건하에서 하룻밤 동안 건조시켜 조 생성물을 백색 고체로서 얻었다. 이것을 EtOH/H2O로부터의 재결정화에 의해 추가 정제하여 백색 고체 (0.045 g, 71％ 수율)를 수득하였다: mp 175℃ (dec); [α]25 D = +46.2 (c = 0.16, H2O); 1의 HPLC: [98.8％, 주 피크: Rt = 11.98분; 1.22％, 부 피크: Rt = 9.29분; 컬럼: 키렉스 3126 (D)-페니실라민 (150 x 4.6 mm), UV 검출기, 254 nm, 1.0 mM CuSO4 용액; 유속: 1.0 mL/분, 컬럼 온도 10℃];
Figure pct00088
1의 H2O 용액을 서서히 용매 증발시켜, X-선 결정 구조 분석에 적합한 4-FGln 1의 결정을 수득하였다.
최종 4-FGln (2S,4R) 1의 결정 구조:
Figure pct00089
(2S,4S)-2,5- 디아미노 -4- 플루오로 -5- 옥소펜탄산 (2)
Figure pct00090
1의 제조 절차에 따라, 화합물 2를 플루오라이드 12" (0.090 g, 0.18 mmol)로부터 백색 고체 (0.019 g, 67％ 수율)로서 제조하였다: mp 160℃ (dec); [α]25 D = -14.6 (c = 0.15, H2O); 2의 HPLC: [94.9％, 주 피크: Rt = 10.8분; 5.1％, 부 피크 1 : Rt = 8.42분; 컬럼: 키렉스 3126 (D)-페니실라민 (150 x 4.6 mm), UV 검출기, 254 nm, 1.0 mM CuSO4 용액; 유속: 1.0 mL/분, 컬럼 온도 10℃];
Figure pct00091
방사성플루오린화 방법. 18F 표지화 반응 동안의 라세미화를 방지하기 위해, 온화한 염기성 작용제인 중탄산칼륨 (KHCO3)과 중성 상 전이 촉매인 18-크라운-6의 조합물을 "고온" 플루오린화 반응에 대해 시험하였다. 토실레이트 전구체를 사용하여, 적은 부의 탄소-2 위치 에피머화 (2R,4R) 부분입체이성질체 [ 18 F]12a"를 수반한 주요 생성물로서, 목적하는 (2S,4R) 이성질체 [ 18 F]12'를 성공적으로 형성시켰다.
이어서, 중간체 [ 18 F]12'를 TFA/아니솔로 60℃에서 5분 동안 처리함으로써, 목적하는 탈보호화된 생성물인 [ 18 F]1을 최종적으로 제조하였다. 4-FGln이 실질적 UV/가시광선 흡광도를 나타내지 않기 때문에, HPLC 상에서의 공동-용리에 의한 [ 18 F]1의 직접 확인에는 어려움이 있었다. 생성물을 (9-플루오레닐메틸) 카르바메이트 클로라이드 (Fmoc-Cl)로 처리하여 아미노-Fmoc 보호화를 수행하였다. 이 추가로 유도체화된 방사성 화합물 Fmoc -[ 18 F]1을 "비방사성" Fmoc-4-FGln 표준물과의 공동-주입에 의해 HPLC 프로파일 상에서 확인하였다.
궁극적으로는, 수성 1 mM CuSO4 용액을 용리액 (1 mL/분, 10℃ 컬럼 온도)으로 한 키랄 컬럼 페노메넥스® 키랄 키렉스3126 (D-페니실라민) (150 X 4.6 mm)을 사용함으로써, 4개의 모든 방사성표지된 및 비방사성 4F-Gln 1, 2, 3 및 4를 추가 유도체화의 필요 없이 분리 및 확인할 수 있었다 (Cu-4-FGln 착체는 UV 흡수성임). [ 18 F]1은 실제로 소량의 부분입체이성질체 [ 18 F]4 (< 5％)를 수반한 주요 생성물이었다.
4개의 모든 방사성표지된 4F-Gln 및 "비방사성" 표준물의 HPLC 프로파일을 키랄 키렉스3126 (D-페니실라민) (150 X 4.6 mm) (1 mM의 CuSO4, 1 mL/분, 10℃)를 이용하여 확인할 수 있었다. 이러한 조건을 이용하여, 화합물 2를 초기에 용리시키고, 이어서 화합물 1, 3 및 4를 용리시켰다.
Figure pct00092
출발 물질로서 11'를 이용한 [ 18 F]1 ((2S,4R)-4- FGln )의 방사성합성
Figure pct00093
활성화된 셉팍® 라이트 QMA 카르브 (SepPak® Light QMA Carb)에 F18 (20 내지 40 mCi)을 로딩하고, 1 mL의 18-c-6/KHCO3 (ACN 18.6 mL 중의 18-c-6 160 mg/물 3.4 mL 중의 KHCO3 29 mg)로 용리시켰다. 이 용액을 아르곤으로 블로우 건조 (blown to dryness)시키고, 아르곤 흐름 하에 80℃에서 아세토니트릴 1 mL로 2회 공비 건조시켰다. 건조시킨 F18을 빙조에서 냉각시키고, 11' 5 mg을 아세토니트릴 0.5 mL에 용해시키고, 건조시킨 F18에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 70℃의 유조에서 가열하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 아세토니트릴 0.5 mL 및 물 8 mL를 첨가하였다. 혼합물을 활성화된 오아시스® (Oasis®) HLB 3 cc 상에 로딩하고, 통과시키고, 물 3 mL로 2회 세척하였다. 목적하는 방사성표지된 화합물을 0.5 mL의 에탄올로 용리시켰다 (총 약 20％의 방사능). 방사화학적 순도를 역상 HPLC에 의해 측정하고 (제미니 (Cemini) C18 (250 X 4.6 mm), MeOH/포름산 0.1％ 8/2. 1 mL/분, 체류 시간 약 6분, >95％), 입체화학적 순도를 키랄 HPLC에 의해 측정하였다 (키랄팩 (Chiralpak) OD 컬럼 (250 X 4.6 mm), 헥산/EtOH 98.5/1.5, 1.2 mL/분, 체류 시간 약 22분, >95％).
상기 에탄올성 용액을 블로우 건조시키고, 빙조에서 냉각시키고, TFA 595 ㎕/아니솔 5 ㎕의 혼합물을 첨가하였다. 이 용액을 5분 동안 60℃에서 가열하였다. 아르곤 증기 하에 가온되는 동안 TFA 및 아니솔을 제거하고, 잔류물을 1 mL의 물로 연화처리하고, 수용액을 0.45 μ 필터를 통해 여과하여 붕괴 보정이 되지 않은 약 10％의 단리된 수율로 목적하는 방사성 물질 [ 18 F]1 ((2S,4R)-4- FGln )을 수득하였고, RCP는 99％이었고, dr은 96％이었다. 방사화학적 순도 및 입체화학적 순도를 키랄 HPLC에 의해 측정하였다 (키렉스 3126 (d)-페니실라민, 1 mL의 CuSO4 용액, 1 mL/분, 2S,4R 이성질체에 대한 체류 시간 약 11분, 2R,4R 이성질체에 대한 체류 시간 약 18분).
Figure pct00094
역상 HPLC 상에서의 중간체 12'의 HPLC 프로파일 (제미니 C18 (250 X 4.6 mm), MeOH/포름산 0.1％ 8/2. 1 mL/분, 체류 시간 약 6분, >95％).
Figure pct00095
키랄팩 OD 컬럼 (250 X 4.6 mm) 상에서의 중간체 12'의 HPLC 프로파일 (헥산/EtOH 98.5/1.5, 1.2 mL/분, 체류 시간 약 22분, 약 96％의 dr).
Figure pct00096
키랄 컬럼 상에서의 [ 18 F]1 ((2S,4R)-4- FGln )의 HPLC 프로파일 (키렉스 3126 (d)-페니실라민, 1 mM의 CuSO4 용액, 1 mL/분, 2S,4R 이성질체에 대한 체류 시간 약 11분, 2R,4R 이성질체에 대한 체류 시간 약 18분).
출발 물질로서 11 a' 를 이용한 [ 18 F]3 ((2R,4S)-4- FGln )의 방사성합성
Figure pct00097
활성화된 셉팍® 라이트 QMA 카르브에 F18 (39.8 mCi)을 로딩하고, 1 mL의 18-c-6/KHCO3 (ACN 18.6 mL 중의 18-c-6 160 mg/물 3.4 mL 중의 KHCO3 29 mg)로 용리시켰다. 이 용액을 아르곤으로 블로우 건조시키고, 아르곤 흐름 하에 80℃에서 아세토니트릴 1 mL로 2회 공비 건조시켰다. 건조시킨 F18을 빙조에서 냉각시키고, 11 a' 5 mg을 아세토니트릴 0.5 mL에 용해시키고, 건조시킨 F18에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 70℃의 유조에서 가열하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 아세토니트릴 0.5 mL 및 물 8 mL를 첨가하였다. 혼합물을 활성화된 오아시스® HLB 3 cc 상에 로딩하고, 통과시키고, 물 3 mL로 2회 세척하였다. 목적하는 방사성표지된 화합물을 0.5 mL의 에탄올로 용리시켰다 (총 약 20％의 방사능). 방사화학적 순도를 역상 HPLC에 의해 측정하고 (제미니 C18 (250 X 4.6 mm), MeOH/포름산 0.1％ 8/2. 1 mL/분, 체류 시간 약 6분, RCP>95％), 입체화학적 순도를 키랄 HPLC에 의해 측정하였다 (키랄팩 OD 컬럼 (250 X 4.6 mm), 헥산/EtOH 98.5/1.5, 1.2 mL/분, 체류 시간 약 20분, dr>90％).
상기 에탄올성 용액을 블로우 건조시키고, 빙조에서 냉각시키고, TFA 595 ㎕/아니솔 5 ㎕의 혼합물을 첨가하였다. 이 용액을 5분 동안 60℃에서 가열하였다. 아르곤 증기 하에 가온되는 동안 TFA 및 아니솔을 제거하고, 잔류물을 1 mL의 물로 연화처리하고, 수용액을 0.45 μ 필터를 통해 여과하여 붕괴 보정이 되지 않은 약 10％의 단리된 수율로 목적하는 방사성 물질 [ 18 F]3 ((2R,4S)-4- FGln )을 수득하였고, RCP는 97％이었고, dr은 90％이었다. 방사화학적 순도 및 입체화학적 순도를 키랄 HPLC에 의해 측정하였다 (키렉스 3126 (d)-페니실라민, 1 mL의 CuSO4 용액, 1 mL/분, 2R,4S 이성질체에 대한 체류 시간 약 15분, 2S,4S 이성질체에 대한 체류 시간 약 10분).
Figure pct00098
역상 HPLC 상에서의 중간체 12 a'의 HPLC 프로파일 (제미니 C18 (250 X 4.6 mm), MeOH/포름산 0.1％ 8/2. 1 mL/분, 체류 시간 약 6분, >95％).
Figure pct00099
키랄팩 OD 컬럼 (250 X 4.6 mm) 상에서의 중간체 12 a'의 HPLC 프로파일 (헥산/EtOH 98.5/1.5, 1.2 mL/분, 체류 시간 약 22 분, 약 96％의 dr).
Figure pct00100
키랄 컬럼 상에서의 [ 18 F]3 ((2R,4S)-4- FGln )의 HPLC 프로파일 (키렉스 3126 (d)-페니실라민, 1 mM의 CuSO4 용액, 1 mL/분, 2R,4S 이성질체에 대한 체류 시간 약 15분, 2S,4S 이성질체에 대한 체류 시간 약 10분).
[ 18 F]2 ((2S,4S)-4- FGln )의 방사성합성
Figure pct00101
활성화된 셉팍® QMA에 F18 (46.9 mCi)을 로딩하고, 1 mL의 K222/K2CO3 (아세토니트릴 18.6 mL 중의 K222 220 mg/물 3.4 mL 중의 K2CO3 40 mg) (45.5 mCi)로 용리시켰다. 이 용액을 아르곤으로 블로우 건조시키고, 아르곤 흐름 하에 80℃에서 아세토니트릴 1 mL로 2회 공비 건조시켰다. 건조시킨 F18을 빙조에서 냉각시키고, 11" 5.31 mg을 아세토니트릴 1 mL에 용해시키고, 건조시킨 F18에 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 70℃의 유조에서 가열하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 물 8 mL를 첨가하였다. 혼합물을 활성화된 오아시스® HLB 3 cc 상에 로딩하고, 통과시키고, 물 3 mL로 2회 세척하였다. 목적하는 방사성표지된 화합물을 0.5 mL의 에탄올로 용리시켰다 (총 약 14％의 방사능).
상기 에탄올성 용액을 약 200 ㎕의 부피로 농축시키고, 5 ㎕를 키랄 HPLC로 주입하고 (OD-컬럼, 헥산/EtOH 98.5/1.5, 1.2 mL/분), 두번째 피크 (약 20분)를 단리시켰다. 2S,4S 이성질체에 상응하는 두번째 피크를 단리시켰다 (56 μCi) (수집된 분획물은 체류 시간이 약 20분이었고, 각각 45/4/56 μCi이었음).
Figure pct00102
키랄 OD 컬럼 (헥산/EtOH 98.5/1.5, 유속 1.2 mL/분) 상에서의 에탄올성 용액 ([ 18 F]12" 및 [ 18 F]12 a'의 혼합물)의 방사성 HPLC 추적.
목적하는 분획물의 헥산/에탄올 용액을 블로우 건조시키고, TFA 219 ㎕/아니솔 1 ㎕를 첨가하고, 5분 동안 60℃에서 가열하였다. 가온되는 동안 아르곤 하에 휘발물을 제거하였다. 잔류물을 0.5 mL의 물로 처리하고, 새로운 바이알로 이동시켜 46 μCi의 용량을 수득하였다 (RCP >99％, E >98％).
방사화학적 순도, 정체성 및 부분입체이성질체의 순도를 HPLC에 의해 측정하였다.
Figure pct00103
키랄 컬럼 (키렉스 3126 (d)-페니실라민, 1 mM의 CuSO4 용액, 1 mL/분) 상의 정제된 [ 18 F]2 ((2S,4S)-4- FGln )의 HPLC. 비방사성 표준물과 함께 공동-주입함으로써 정체성을 확립하였다.
[ 18 F]4 ((2R,4R)-4- FGln )의 방사성합성
Figure pct00104
활성화된 셉팍® QMA에 F18 (82.8 mCi)을 로딩하고, 1 mL의 K222/K2CO3 (아세토니트릴 18.6 mL 중의 K222 220 mg/물 3.4 mL 중의 K2CO3 40 mg) (78.9 mCi)로 용리시켰다. 이 용액을 아르곤으로 블로우 건조시키고, 아르곤 흐름 하에 80℃에서 아세토니트릴 1 mL로 2회 공비 건조시켰다. 건조시킨 F18을 빙조에서 냉각시키고, 11a" 8.28 mg을 아세토니트릴 1 mL에 용해시키고, 건조시킨 F18에 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 70℃의 유조에서 가열하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 물 8 mL를 첨가하였다. 혼합물을 활성화된 오아시스® HLB 3 cc 상에 로딩하고, 통과시키고, 물 3 mL로 2회 세척하였다. 목적하는 방사성표지된 화합물을 0.5 mL의 에탄올로 용리시켰다 (총 약 14％의 방사능).
상기 에탄올성 용액을 약 200 ㎕의 부피로 농축시키고, 5 ㎕를 키랄 HPLC (OD-컬럼, 헥산/EtOH 98.5/1.5, 1.2 mL/분)로 주입하고, 두번째 피크 (약 24분)를 단리시켰다. 2R,4R 이성질체에 상응하는 두번째 피크를 단리시켰다 (106 μCi).
Figure pct00105
키랄 OD 컬럼 (헥산/EtOH 98.5/1.5, 유속 1.2 mL/분) 상에서의 에탄올성 용액 ([ 18 F]12' 및 [ 18 F]12a"의 혼합물)의 방사성 HPLC 추적.
목적하는 분획물의 헥산/에탄올 용액을 블로우 건조시키고, TFA 219 ㎕/아니솔 1 ㎕를 첨가하고, 5분 동안 60℃에서 가열하였다. 가온되는 동안 아르곤 하에 휘발물을 제거하였다. 잔류물을 0.5 mL의 물로 처리하고, 새로운 바이알로 이동시켜 103 μCi의 용량을 수득하였다 (RCP>99％, dr>99％).
방사화학적 순도, 정체성 및 거울상이성질체의 순도를 HPLC에 의해 측정하였다.
Figure pct00106
키랄 컬럼 (키렉스 3126 (d)-페니실라민, 1 mM의 CuSO4 용액, 1 mL/분) 상의 정제된 [ 18 F]4 ((2R,4R)-4- FGln )의 HPLC. 비방사성 표준물과 함께 공동-주입함으로써 정체성을 확립하였다.
생물학적 연구 절차:
시험관내 세포 흡수 연구
4 개의 가능한 이성질체의 세포 흡수율을 9L 종양 세포주를 사용하여 평가하였다. 세포 흡수 결과 (％용량/100 μg 단백질)를 [3H] 글루타민의 것과 비교하였다. 4-플루오로-글루타민 이성질체의 흡수율은 이성질체들 간에 뚜렷한 차이를 나타냈다 (도 4). 2S 이성질체인 천연 L-글루타민 유도체가 최고의 흡수율을 나타냈다. 4-FGln (2S,4R)은 9L 세포에서 높은 흡수율을 나타냈으며, 이 흡수율은 2시간 동안 연속적으로 지속되었고, 최대 시점을 연구하였다. 4-FGln (2S,4S) 이성질체는 또한 (2S,4R) 이성질체의 것과 유사한 탁월한 흡수율을 나타냈으나, 흡수율 값은 2시간에서 급격하게 떨어지는 것으로 나타났다. 비-천연 D-글루타민 이성질체인 (2R,4R) 및 (2R,4S) 4-FGln은 모두 (2S,4R) 및 (2S,4S) 4-FGln 및 [3H]-L-글루타민에 비해 낮은 세포 흡수율을 보여주며, 이는 C-2 위치에서의 배위가 종양 세포 흡수에 대해 매우 중요하고, 글루타민의 2S 배위 (보통 L-이성질체로 알려져 있음)는 세포막을 가로지르는 수송에 필수적임을 시사한다. 도 1을 참조한다.
[18F]4-FGln의 종양 세포 흡수는 고도로 선택적인 과정이고, 2 개의 천연 4-플루오로-L-글루타민 유도체는 비-천연 4-플루오로-D-글루타민 유도체의 것보다 높은 흡수율을 보여준다.
[18F]4-FGln (2S,4R) 1 이성질체는 다른 [18F]4-FGln 이성질체들 중에서 9L 종양 세포로의 최고의 흡수율을 보여준다. 이러한 관찰 때문에, 본 발명자들은 단지 [18F]4-FGln의 (2S,4R) 이성질체 1을 추가로 연구하기로 결정하였다. 시험관내 세포 흡수 억제 연구를 9L 세포에서 수행하여 [18F]4-FGln의 (2S,4R) 1의 특이성을 시험하였다. 비-방사성 L-글루타민 및 L-세린은 글루타민 수송자에 대한 양성 대조군 억제제로서 작용하였다. L-글루타민은 시스템 N 수송자를 억제하고, L-세린은 ASC 수송자를 억제한다. 3 개의 상이한 농도를 0.5 mM 내지 5 mM 범위의 각각의 억제제에 대해 시험하였다. L-글루타민 및 [18F] (2S,4R)-4-FGln 1의 공동-인큐베이션 30 분 후, 시스템 N 수송자는 명백하게 억제되었다. 결과는 거의 90％ 억제 (0.49％ 용량/100 μg 억제된 단백질 대. 대조군 3.56％ 용량/100 μg 단백질)를 나타내었다. L-세린은 또한 ASC 수송자의 상당한 억제 (1.41％ 억제율 대. 대조군 3.56％ 용량/100 μg 단백질)를 나타냈다. 시스템 A 수송자를 억제하는 비-방사성 MeAIB는 음성 대조군으로서 작용하였다. 5 mM의 농도에서, 시스템 A 수송 시스템에 대한 효과는 거의 없었다 (3.69％ 억제율 대. 대조군 3.56％ 용량/100 μg 단백질). 결과는 L-글루타민 및 L-세린에 대한 용량 의존적 반응을 명백히 입증하며, MeAIB는 시스템 A 수송 시스템에 대한 억제를 전혀 보이지 않는다. 도 2를 참조한다.
4 개의 4-[18F]F-글루타민 이성질체 (2S,4R), (2S,4S), (2R,4S) 및 (2R,4R) 각각의 세포 흡수율을 (9L) 래트 뇌 신경교육종 세포에서 연구하였다. L-[3,4-3H(N)]-글루타민 (>97％, 250 μCi (9.25 MBq)을 퍼킨 엘머사로부터 입수하였고, 이를 수행되는 모든 세포 흡수 실험에 대해 대조군으로서 사용하였다. L-[3,4-3H(N)]-글루타민의 순도를 TLC 방법 (TLC 실리카겔 60 F254; 용매 CH2Cl2:MeOH:NH3:H2O (20:20:5))에 의해 측정하였다. L-[3,4-3H(N)]-글루타민은 0.3 내지 0.4의 Rf 값을 나타냈다. 설치류 (9L) 세포를 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM), 소태아 혈청 및 100 유닛/페니실린 mL, 100 μg/스트렙토마이신 mL에서 배양하였다. 종양 세포를 리간드 인큐베이션 전에 배지에서 24 시간 플레이팅하였다 (2.0 x 105 개 세포/웰). 실험날에, 배지를 흡입시키고, 세포를 따뜻한 인산염 완충 염수 (PBS, 0.90 mM Ca2 + 및 1.05 mM Mg2 + 함유) 1 mL로 3회 헹구었다. 모든 4 개의 4-[18F]F-글루타민 이성질체 및 L-[3,4-3H(N)]-글루타민을 PBS 용액 중에 용해시키고, 각 웰에 첨가하고 (대략 500,000 cpm/mL/웰), 37℃에서 5분, 30분, 60분, 120분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 종료시, 웰을 흡입시킨 다음, 잔류 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하지 않는 빙냉 PBS 1 mL로 3회 헹구었다. 냉각시킨 PBS로 헹군 후, 1 M NaOH 350 μL를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 필터 페이퍼 상에 수집하였다. 필터 페이퍼를 섬광 바이알 안에 넣고, 계수용 유체를 첨가한 다음 (7 mL, 에코라이트 (ecolite) +) 18 내지 24시간 후에 베타 계수기를 사용하여 바이알을 계수하였다. 4-[18F]F-글루타민 이성질체 및 L-[3,4-3H(N)]-글루타민을 사용하는 이중-동위원소 연구에 대해, 바이알을 먼저 감마 계수기를 사용하여 계수하여 18F 계수를 획득하였다. 이어서, 베타 계수를 18F가 완전히 붕괴된지 1일 후에 획득하였다. 세포 용해물 100 μL를 로리 (Lowry) 방법에 의한 단백질 농도의 측정에 대해 사용하였다.
시험관내 억제 연구
4-[18F]F-글루타민 (2S,4R) 이성질체의 특이성을 시험하기 위해, 억제 연구를 9L 세포를 사용하여 수행하였다. 트레이서를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 상기 기재된 바와 같이 처리하였다. 비-방사성 L-글루타민 및 L-세린은 글루타민 수송자에 대해 양성 대조군 억제제로서 작용하였다. L-글루타민은 시스템 N 수송자를 억제하고, L-세린은 ASC 수송자를 억제한다. 시스템 A 수송자를 억제하는 비-방사성 MeAIB는 음성 대조군으로서 작용하였다. 3 개의 상이한 농도를 0.5 mM 내지 5 mM 범위의 각각의 억제제에 대해 시험하였다. 데이터는 각 억제제에 대한 용량 의존적 반응을 보여주며, L-글루타민이 최고의 억제를 나타냈다 ([5 mM]에서 대략 90％).
microPET 로의 소동물 영상화
활발한 소동물 PET (A-PET) 영상 연구를 4-[18F]F-글루타민 (2S,4R) 이성질체를 사용하여 수행하였다. 모든 스캔을 동물 PET 전용 스캐너 (모자이크 바이 필립스 (Mosaic by Phillips)) (수르티, 2005) 상에서 수행하였다. M/tomND 자발적 인간 유방 종양을 보유한 트랜스제닉 마우스를 이 연구에서 사용하였다. 상기 트랜스제닉 마우스 모델의 사용은 다수의 이점이 있다. 독시사이클린 감수성 프로모터는 상기 마우스를 유전학적으로 조작하여 myc 유전자를 발현한다. 이 종양은 통상적인 제노그래피 종양에 대해 자발적으로 유발된다. 마우스에 음료수를 통해 독시사이클린을 투여하는 경우 (2 mg/kg), myc 유전자의 발현은 상향-조절된다. 독시사이클린을 제거한 경우, myc 유전자는 하향-조절된다. 이들 화합물이 해당 글루타민 흡수율과 myc 유전자 발현 수준 사이에 직접적인 상관관계를 제공하기 때문에 상기 모델이 선택된다.
대략 300 μCi의 [18F]-4F-글루타민 (2S,4R) 이성질체를 측면 꼬리 정맥을 통해 주입하여 M/tomND 종양 내 글루타민 흡수율을 조사하였다. 영상은 트레이서의 주입 직후에 나타났고, 120분의 기간 동안 계속되었다. 영상 및 종양 흡수의 속도론은 [18F]-4F-글루타민 (2S,4R) (1)이 myc 유전자가 상향-조절되는 경우 종양 부위에서 흡수된다는 것을 명백하게 입증하였다. 도 3 및 4를 참조한다.
마우스에서의 생체내 생체분포 연구
신규한 종양 PET 영상화제로서의 [18F]-4F-글루타민 이성질체를 시험하기 위해, 본 발명자들은 20-25 g 체중의 정상적인 ICR 마우스에서 [18F]-4F-글루타민 (2S,4R) (1)을 시험하였다. 그룹 당 5 마리의 마우스를 생체분포 연구에 대해 사용하였다. 마우스를 이소플루란의 사용으로 마취시키고, 25 μCi의 각각의 이성질체를 함유하는 염수 용액 0.15 mL를 측면 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 마우스를 이소플루란 마취 하에 두면서 심장 적출에 의해 주입후 2분, 30분, 60분, 120분 및 240분에서 희생시켰다. 관심 기관을 제거하고, 칭량하고, 방사성을 감마 계수기 (팩커드 코브라 (Packard Cobra))를 사용하여 계수하였다. 그램 당 용량(％)을 1.0％의 초기 용량 계수에 대한 조직 활성 계수의 비교에 의해 계산하였다. 초기 용량은 동일한 속도로 측정되는 주입 물질의 100배 희석된 분취액으로 이루어진다.
정상 마우스에서의 생체분포 (2분, 30분, 60분, 120분 및 240분); (2S,4R)-4-F-Gln, 1.
Figure pct00107
빠른 흡수가 모든 주요 기관에서 관찰되었고, 이는 트레이서가 정맥 주사에 따라 쉽게 세포막을 침투한다는 것을 제시한다. 유의한 심장 흡수 및 심장 조직으로부터의 비교적 느린 유실이 존재한다. 높은 초기 신장 흡수 및 빠른 유실이 명백하였고, 소변 배설이 빠르고, 췌장이 가장 현저한 흡수 및 체류를 나타내며, 췌장:간의 비는 30분 후 4:1에 이를 것이며, 이는 췌장에서 선택적인 흡수 및 체류를 제시한다. 췌장 세포의 외분비 세포는 글루타민에 대해 보다 높은 턴-오버 (turn-over)를 가질 수 있고, 뇌 흡수는 중간 정도이나, 뇌 흡수 값은 주입 후 최대 4시간 일정하게 유지되는 것이 가능할 수 있다. 이후 시점에서 골 흡수의 유의한 증가가 있었다. 순환 혈액 내에서 유리 플루오라이드 이온의 형성을 야기하는 생체내 탈플루오린화가 존재할 것이다. 따라서, 골 흡수의 증가는 상기 트레이서의 생체내 탈플루오린화를 반영하는 것일 수 있다.

Claims (58)

  1. 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체.
    <화학식 I>
    Figure pct00108

    식 중,
    R1은 산-불안정 질소 보호기이고;
    R2는 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
    R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
    OR4는 이탈기이고;
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
  2. 제1항에 있어서, 90％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 단일 부분입체이성질체.
  3. 제1항에 있어서, 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 단일 부분입체이성질체.
  4. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00109

    인 단일 부분입체이성질체.
  5. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00110

    인 단일 부분입체이성질체.
  6. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00111

    인 단일 부분입체이성질체.
  7. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00112

    인 단일 부분입체이성질체.
  8. 제1항에 있어서, R1이 Boc인 단일 부분입체이성질체.
  9. 제1항에 있어서, R2가 t-부틸인 단일 부분입체이성질체.
  10. 제1항에 있어서, R3이 각각 -OCH3인 단일 부분입체이성질체.
  11. 제1항에 있어서, n이 3인 단일 부분입체이성질체.
  12. 제1항에 있어서, OR4가 -O토실레이트인 단일 부분입체이성질체.
  13. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00113

    인 단일 부분입체이성질체.
  14. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00114

    인 단일 부분입체이성질체.
  15. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00115

    인 단일 부분입체이성질체.
  16. 제1항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00116

    인 단일 부분입체이성질체.
  17. 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체.
    <화학식 II>
    Figure pct00117

    식 중,
    R1은 산-불안정 질소 보호기이고;
    R2는 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
    R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
  18. 제17항에 있어서, R1이 Boc인 단일 부분입체이성질체.
  19. 제17항에 있어서, R2가 t-부틸인 단일 부분입체이성질체.
  20. 제17항에 있어서, R3이 각각 -OCH3인 단일 부분입체이성질체.
  21. 제17항에 있어서, n이 3인 단일 부분입체이성질체.
  22. 제17항에 있어서, F가 18F인 단일 부분입체이성질체.
  23. 제17항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00118

    인 단일 부분입체이성질체.
  24. 제17항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00119

    인 단일 부분입체이성질체.
  25. 제17항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00120

    인 단일 부분입체이성질체.
  26. 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 암을 영상화하기 위한 진단학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00121

    인 진단학적 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00122

    인 진단학적 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00123

    인 진단학적 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00124

    인 진단학적 조성물.
  31. 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 I의 화합물의 단일 부분입체이성질체를, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 하기 화학식 II의 화합물의 단일 부분입체이성질체를 형성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 플루오린화제와 반응시키는 단계; 및
    화학식 II의 화합물을, 4-플루오로-글루타민의 단일 부분입체이성질체를 생성하기에 효과적인 시간 동안 및 그러한 조건 하에 산과 반응시키는 단계
    를 포함하는, 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체의 제조 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00125

    <화학식 II>
    Figure pct00126

    식 중,
    R1은 산-불안정 질소 보호기이고;
    R2는 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
    R3은 각각 독립적으로 -OC1 - 6알킬 또는 C1 - 6시클로알킬이고;
    OR4는 이탈기이고;
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
  32. 제31항에 있어서, 산이 트리플루오로아세트산인 방법.
  33. 제31항에 있어서, R1이 Boc인 방법.
  34. 제31항에 있어서, R2가 t-부틸인 방법.
  35. 제31항에 있어서, R3이 각각 -OCH3인 방법.
  36. 제31항에 있어서, n이 3인 방법.
  37. 제31항에 있어서, OR4가 -O토실레이트인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00127

    인 방법.
  39. 제31항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00128

    인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00129

    인 방법.
  41. 제31항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00130

    인 방법.
  42. 제31항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00131

    인 방법.
  43. 제31항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00132

    인 방법.
  44. 제31항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00133

    인 방법.
  45. 제31항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 본질적으로
    Figure pct00134

    인 방법.
  46. 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체를 환자에게 투여하는 단계; 및
    4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체에 의해 방출되는 감마선을 검출하는 단계
    를 포함하는, 환자에서 암을 영상화하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00135

    인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00136

    인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00137

    인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 4-[18F]플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체가 본질적으로
    Figure pct00138

    인 방법.
  51. 80％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  52. 제51항에 있어서, 90％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  53. 제51항에 있어서, 98％ 이상의 부분입체이성질체 과잉률을 갖는 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  54. 제51항에 있어서, 본질적으로 4-[18F]플루오로글루타민인 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  55. 제51항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00139

    인 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  56. 제51항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00140

    인 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  57. 제51항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00141

    인 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
  58. 제51항에 있어서, 본질적으로
    Figure pct00142

    인 4-플루오로글루타민의 단일 부분입체이성질체.
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