KR20120052894A

KR20120052894A - 한련초 추출물, 이의 분획물, 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 탈모방지 및 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20120052894A
Application number: KR1020110119848A
Authority: KR
Inventors: 김승호; 김재화
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-05-24
Also published as: KR101322926B1

Abstract

본 발명은 한련초 추출물, 이의 분획물, 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 조성물은 TGF-β의 발현을 현저히 억제시킴으로써, 탈모방지, 육모, 양모, 발모 촉진에 유용히 사용될 수 있으며, 탈모방지용 용액, 크림, 로션, 샴푸, 스프레이, 겔 및 로션 등의 형태로 사용될 수 있다.

Description

한련초 추출물, 이의 분획물, 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 탈모방지 및 발모촉진용 조성물{A Composition for prevention of hair loss and promotion of hair growth comprising extracts of Eclipta prostrata, fractions thereof, terthienyl derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof}

본 발명은 한련초 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 터트티에닐 유도체를 포함하는 탈모방지용 또는 발모촉진용 약학적 조성물에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만 내지 15만개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen) 및 휴지기(telogen)를 반복한다. 성장기는 모발이 성장하여 케라틴이 만들어지고, 퇴행기는 성장기가 끝나고 모발의 형태를 유지하면서 대사과정이 느려지는 시기로써 천천히 성장한다. 퇴행기에는 케라틴은 만들어지지 않고 모낭의 세포 분열이 정지되어 급격히 위축되는 시기이다. 다음의 휴지기 시기가 되면 모낭은 활동을 완전히 멈추고 탈모를 준비하게 되어 휴지기 모발의 기저부에서 새롭게 자라는 성장기 모발에 의해 밀려나 저절로 빠지며, 빗질이나 머리를 감는 등의 물리적 작용에 의해 빠지는 주기를 반복한다. 이러한 주기는 3~6년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 일일 평균 100개 전후의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다.

상기와 같이 사람의 모발은 모주기를 가지고 있기 때문에 털갈이 없이 항상 일정한 모발의 수를 유지하게 된다. 그러나 대머리가 진행되면 모근에 존재하는 유두가 작아지고, 모유두가 작아지면 머리털의 굵기도 가늘어지고 동시에 모주기도 짧아지며, 새로 자라나온 털은 더욱 가늘어지게 된다. 따라서 대머리가 진행되면 머리털은 솜털로 변하며 모주기는 더욱 짧아져 조금 자란 후 빠지게 된다.

대머리가 진행되면 두피에 기름이 많아져서 지루성 피부염이 잘 생기고, 모근에 부착되어 있는 피지선은 점차로 커지면서 피지를 많이 만들어 내는데, 이는 대머리의 원인이 아니고 대머리의 이차적인 현상이나 이러한 현상이 다시 탈모를 촉진시키는 원인이 된다.

탈모의 원인은 유전적인 원인이 크게 자리하고 있으며, 비단 남성들만의 문제가 아니라 여성들의 탈모현상도 늘어나고 있는 상황으로 최근 심각한 문제로 대두되고 있다. 유전적 요인 외에 호르몬의 불균형적인 분비, 사회생활의 정신적 스트레스, 대기오염 노출, 가공 식품의 섭취, 고열로 인한 중병, 영양의 불균형, 항암제 및 항갑상선제의 복용, 경구 피임약의 투여, 샴푸, 강한 자외선이나 운동 중 흘리는 땀, 식습관, 심리적 압박감 등의 다양한 습관과 환경이 주범으로 알려져 있다. 이러한 원인에 따라 다양한 탈모 방지 및 발모용 제제가 개발되고 있으나, 대부분의 탈모관련 기술은 남성호르몬을 제어하여 탈모를 막고, 나아가 발모를 촉진시키려 하고 있다. 그러나, 효과를 볼 수 있는 물질이 실제적으로 포함되어 있지 않거나 미비하여 과학적으로 아직까지 탈모문제를 완벽히 정복하지 못하고 있으며, 확실한 효능이 밝혀진 제제가 개발되지 못하고 있는 실정이다.

한편, TGF-β는 동종이형질체로 여러 종류의 세포와 조직에서 초기 발생의 조절, 세포주기의 조절, 세포 증식 및 분화, 이동, 생존, 세포외 기질의 생산, 면역 체계, 혈관 생성과 혈구세포 생산, 세포사 유도, 골격 형성, 상처 치유 등을 조절하는 다기능성 사이토카인으로 알려져 있다. 또한, 혈관 상피성장인자(VEGF)는 동종 이형질의 당단백질로 상처 부위에서 혈관 신생을 자극하며, 상피세포에 특이적인 마이토젠(mitogen)으로 상피세포의 이동과 증식을 유도하고, 혈관의 투과성을 증가시키는 역할을 한다고 알려져 있다.

퇴행기에서는 실제적으로 세포 사멸 과정(apoptosis)이 일어나면서 형태학적으로 TGF-β가 분비되고, 이러한 물질로 인하여 탈모의 현상이 급격히 이루어지는 것으로 알려져 있다. 따라서 TGF-β의 억제를 유도함으로 정상 모발이 탈모로 진행되는 과정을 줄여 결과적으로 탈모 현상을 늦춰주는 것이 필요하다.

또한 탈모가 나타나는 원인은 유전자 요인 외에도 강한 자외선이나 운동 중 흘리는 땀, 식습관, 심리적 압박감 등을 꼽을 수 있는데, 특히 여름철에 강하게 내리쬐는 자외선은 두피에 직접적인 자극을 주어 모근을 건조하게 만들고, 염증을 증가시켜 탈모를 촉진시킨다. 또한 자외선 때문에 모발의 단백질 층인 케라틴이 파괴되어 손상을 입게 되며, 이는 머리카락을 가늘어 지게 함으로써 결국 탈모를 불러오게 된다. 따라서 외부로부터 상처받은 머리 피부 부위는 새로운 조직이 형성되고 세포외 기질의 합성과 재구성이 일어나 상처 입은 조직이 본래 기능을 할 수 있도록 치유될 수 있어야 한다. 복잡한 상처 치유 반응과 함께 수반되는 중요한 현상이 세포 재생 능력이다. 세포 재생은 상처 치유 과정 중에 새로운 조직이 형성되면서 이러한 조직에 적당한 산소와 영양분을 공급해주어 그 조직이 정상적인 신체의 일부로서 재생되고 기능이 수행되도록 해준다. 일단 모세혈관이 기존에 있던 혈관에서부터 뻗어 나오게 되면 강(lumen)이 형성되고 혈액이 흐를 수 있게 된다. 계속적인 혈관 내피세포의 분열로 모세혈관의 확장이 이루어진다. 새로 형성된 모세혈관에 의한 영양분의 공급과 여러 인자에 의해 상처조직은 정상조직으로 회복된다. 따라서 외부 요인에 따른 피부 부위 특히, 두피의 손상을 치유함으로써 탈모를 방지할 수 있는 물질의 확보가 필요하다.

이에 본 발명자들은, 부작용 없이 탈모를 방지하고 발모를 촉진시킬 수 있는 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 한련초 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 터트티에닐 유도체가 TGF-β의 발현을 억제하고, VEGF의 발현을 촉진함으로서, 세포의 재생 능력을 향상시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 탈보방지 작용 또는 발모 촉진 작용을 가지는 한련초 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 터트티에닐 유도체를 포함하는 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 한련초 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "한련초"는 우리나라의 중부와 남부지방의 논두렁, 개울가의 습기가 있는 곳에서 자생하는 다년초 식물로써 애장초, 목한련, 묵두초, 하련초 등으로도 불린다. 한련초에는 사포닌과 탄닌, 고미질, 에크립틴(한련초소), 비타민 A류 물질, 니코틴과 쿠마린 화합물인 웨델로락톤(wedelolactone)과 데메시웨델로락톤(demethylwedelolactone-7-glucosid)이 함유되어 있다. 한련초의 줄기를 자르면 즙이 나와 시간이 지나면 산화되어 까맣게 변색하게 되는데 이는 웨델로락틴이 공기에 산화되어 변색되는 것으로, 옷이나 머리칼, 수염 등의 염색제로도 사용되어 왔다.

본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은, 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 예를 들어 (a) 물, (b) C₁ _-4 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 또는 (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매를 사용하여 얻을 수 있다. 바람직하게 본 발명의 한련초 추출물은 메탄올 추출물일 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함한다.

또한, 상기 추출은 상온 추출 추출은 상온 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 및 증기 추출로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "분획물"은 특정 용매를 이용하여 상기 한련초 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 가지는 물질을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다.

한련초 분획물을 얻기 위하여 사용되는 용매는 당업계에서 통상적으로 이용될 수 있는 용매, 예를 들어 (a) 물, (b) C₁ _-4 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), (c) 헥산, (d) 클로로포름, (e) 에틸아세테이트 또는 (f) 상기 (a)-(e)의 혼합용매를 사용할 수 있다. 바람직하게 상기 분획물은 한련초의 클로로포름 분획물일 수 있다.

본 발명의 한련초 추출물 또는 이의 분획물은 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함될 수 있다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등으로 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 한련초 추출물 또는 용매 분획물에 포함된다.

또한 본 발명의 한련초 추출물 또는 이의 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 열풍 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 한련초 추출물 또는 이의 분획물은 TGF-β 발현을 억제하거나, VEGF의 발현을 촉진시킬 수 있으므로, 탈모의 방지 또는 발모의 촉진용으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "TGF-β"는 여러 종류의 세포와 조직에서 초기 발생의 조절, 세포주기의 조절, 세포 증식 및 분화, 이동, 생존, 세포외 기질의 생산, 면역 체계, 혈관 생성과 혈구세포 생산, 세포사 유도, 골격 형성, 상처 치유 등을 조절하는 다기능성 사이토카인을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "VEGF"는 vascular endothelial growth factor의 약자로서, 국문으로는 혈관내피세포 성장인자를 의미한다. 상기 VEGF는 혈관내피세포에 대한 생장 활성을 지표로 하여 분리되는 폴리펩티드로서, 상기 VEGF의 생산은 허혈 등의 환경인자로 유도될 수 있으며, 생리적 또는 종양조직에서의 혈관신생 촉진인자로서도 중요한 역할을 하고 있다.

구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명의 한련초 추출물 또는 이의 분획물을 처리한 섬유아세포에서 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 실시한 결과, TGF-β의 발현을 억제하고, VEGF의 발현을 촉진하는 것을 확인하였다(도 1 및 2). 구체적인 다른 일실시예에 따르면, 한련초 추출물 또는 이의 분획물을 처리한 경우, TNF-α로 유도한 TGF-β 발현 증가를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이로서, 본 발명에 따른 한련초 추출물 또는 이의 분획물이 탈모 방지 또는 발모 촉진 작용을 가짐을 확인하였다(도 3).

다른 양태로서, 본 발명은 한련초 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물, 의약외품 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물은 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용되는 모발이란, 머리의 모근 및 모낭, 머리카락 및 속눈썹과 겉눈썹, 수염, 겨드랑이, 음모, 신체 전반에 모근 및 모낭이 있는 모든 부위를 포함한다.

다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 식에서

R은 CHO 또는 CH₂OH이다.

상기 터트티에닐 유도체는 천연 공급원(한련초 등의 식물)으로부터 분리되거나, 천연 공급원으로부터 수득하여 화학적 개질에 의해 제조하거나, 또는 화학적으로 합성하여 제조하거나, 상업적으로 제조된 상품일 수 있다.

구체적인 일실시예에서, 한련초의 메탄올 추출물을 클로로포름으로 분획하고, 상기 한련초 클로로포름 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 8개의 소분획으로 분리하였고, 이를 다시 HPLC 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 본 발명의 터트티에닐 유도체 화합물을 얻었다.

본 발명의 터트티에닐 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합하거나 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 하기 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 또는 칼륨, 알칼리 토금속, 예를 들어, 마그네슘을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 TGF-β의 발현을 억제할 수 있으므로 탈모방지 또는 발모촉진용으로 유용하게 사용될 수 있다.

구체적인 일실시예에서, 본 발명의 터트티에닐 유도체(터트티에닐 알데하이드 및 터트티에닐 메탄올) 각각을 처리한 섬유아세포를 배양하여 그 상청액에 루시퍼라아제를 가하고 루시퍼라아제의 활성을 측정한 결과, 상기 터트티에닐 유도체가 TGF-β의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 7 및 8).

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 인산 칼슘, 규산 칼슘, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 모발생장 촉진용 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 등을 포함한 여러 경로를 통하여 투여될 수 있으나, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다를 수 있고, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 한련초 추출물 및 분획물의 투여량은 성인기준으로 0.001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg으로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 일반적으로 0.001 내지 500 mg/kg의 양 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg의 양을 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 잘 알려진 담체 및/또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 이때 제형은 정제, 알약, 과립, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 한련초 추출물, 이의 분획물, 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 뿐만아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친지성 겔화제, 친수성 또는 친지성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료를 함유할 수 있다.

본 발명의 탈모방지 및 발모촉진용 조성물은 화장품 또는 의약외품의 제형으로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 제형은 한련초 추출물, 분획물, 터트티에닐 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 배합할 수 있는 어느 형태의 제형도 가능하다, 바람직하게, 상기 탈모방지 및 발모촉진용 화장품 또는 의약외품의 제형으로 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹 발모제, 속눈썹 영양제, 또는 애완동물용 샴푸 및 애완동물용 린스 등과 같이 용액, 솔젤, 에멀젼, 오일, 왁스, 에어졸 등 다양한 형태로 제조될 수 있고, 가발 또는 모자 등의 두피 또는 모발용 기구의 제조나 가공에 사용될 수 도 있으며, 이들로 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 탈모방지용 조성물에는 상술한 각종 제형에 따라 또는 최종목적에 적합하게 통상의 탈모방지용 조성물에 배합되는 각종 성분들을 함유할 수 있다. 예를 들면, 샴푸의 제형을 갖는 경우에는 세정 성분인 합성 계면활성제와 방부제, 점증제, 점도 조절제, pH 조절제, 향료, 염료, 모발 컨디셔닝제 및 물 중 어느 하나 이상을 함유할 수 있다. 상기 합성 계면활성제 중 합성 음이온 계면활성제는 알킬 및 알킬 에테르 설페이트로서, 대표적인 예로 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황 산암모늄, 라우릴 황산 트리에탄올아민, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산나트륨, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산암모늄 등이 있다. 또한 상기 합성 계면활성제 중 합성 양쪽성 계면활성제는 알킬 베타민 및 알킬 아미도프로필 베타인으로서, 대표적인 예로는 코코디메틸 카복시메틸 베타인, 라우릴디메틸 카복시메틸 베타인, 라우릴 디메틸 알파-카복시에틸 베타인, 세틸 디메틸 카복시메틸 베타인, 코카미도 프로필 베타인 등이 있다. 상기 비이온 계면활성제는 알카놀 아미드 및 아민 옥사이드로서, 라우릴 디에틸 아민옥사이드, 야자유 알킬디메틸 아민옥사이드, 라우린산 디에탄올아미드, 야자유 지방산 디 에탄올아미드, 야자유 지방산 모노에탄올아미드 등이 있다.

본 발명에서 사용되는 임의 성분으로서는 샴푸로서의 기본적 물성 및 품질을 유지하기 위한 통상적인 임의 성분으로서 당해 분야의 전문가에게 널리 공지되어 있다. 이러한 임의 성분에는 진주박 보조제, 방부제, 점중제 및 점도 조절제, pH 조절제, 향료, 염료, 모발 컨디셔닝제가 포함된다. 예를 들면 에틸렌글리콜 모노스테아레이트, 에틸렌글리콜 디스테아레이트와 같은 진주박 보조제; 파라 옥시안식향산메틸, 메틸클로로 이소치아졸리논과 메틸 이소치아졸 리논의 혼합물과 같은 방부제; 염화나트륨, 염화암모늄, 프로필렌 글리콜과 같은 점증제 및 점도 조절제; 구연산, 인산, 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 pH 조절제; 폴리쿼터늄-10, 폴리쿼터늄-7, 메틸폴리실록산, 디메티콘코폴리 올, 가수분해 동물단백질과 같은 모발 컨디셔닝제, 수용성 타르와 같은 염료가 사용되며, 또한 향료가 사용될 수 있다.

추가로, 본 발명의 탈모방지용 조성물은 그 제형에 달리하여 애완동물용으로 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물을 함유하는 샴푸 형태로 제조될 수 있으며, 애완동물의 피부에 자극이 적고 보습력이 탁월한 중성의 세제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 본 발명의 성물에 의해 강력한 살충, 항균능력과 탈모 방지 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 한련초 추출물, 이의 분획물 및 터트티에닐 유도체 화합물은 TGF-β 발현을 효과적으로 억제함으로써, 탈모방지 및 발모촉진용 조성물로 약학적으로 이용가능할 뿐만 아니라, 화장료 조성물로서도 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은, 본 발명의 일실시예에 따른, 한련초 추출물의 TGF-β 발현 억제 효과에 대한 시험 결과이다.
도 2는, 본 발명의 일실시예에 따른, 한련초 클로로포름 분획물의 세 번째 소분획물의 VEGF 활성 촉진 효과에 대한 시험 결과이다.
도 3은, 본 발명의 일실시예에 따른, 한련초 추출물의 TNF-α로 유도한 TGF-β 발현 억제 효과에 대한 시험 결과이다.
도 4는, 본 발명의 일실시예에 따른, TGF-β 발현억제 효능을 나타내는 한련초 추출물의 최소 농도를 나타낸 시험 결과이다.
도 5는, 본 발명의 일실시예에 따른, 한련초 추출물이 TGF-β 억제 효능을 나타내는데 소요되는 시간을 측정한 시험 결과이다.
도 6은, 본 발명의 일실시예에 따른, 한련초 추출물의 세포 재생능력을 확인한 시험 결과이다(A: 정상배지에서 자란 CRL2076 세포, B: 2 ㎍/㎖의 한련초 추출물이 처리된 CRL2076 세포).
도 7은, 본 발명의 일실시예에 따른, 터트티에닐 알데하이드의 TGF-β 억제효과에 대한 시험 결과이다.
도 8은, 본 발명의 일실시예에 따른, 터트티에닐 메탄올의 TGF-β 억제 효과에 대한 시험 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 한련초 추출물의 제조

건조된 국산 한련초를 구입하여 실험에 사용하였다. 한련초 건조 분말 3.5 kg을 메탄올(MeOH) 25ℓ에 침적시켜 7일 동안 실온에서 24시간 교반하여 추출하였고, 이를 2번 반복하였다. 침출물을 여과기로 여과하고, 감압농축하였다. 메탄올을 제거함으로써 한련초 메탄올 추출물 560 g을 수득하였다.

실시예 2. 한련초 헥산 및 클로로포름 분획물의 제조

실시예 1에서 수득한 한련초 메탄올 추출물 560 g을 증류수 1000 ㎖에 현탁시킨 후, 다시 n-헥산 1000 ㎖로 2회 추출하였다. 그 후 클로로포름 1000 ㎖로 2회 추출하여, 53 g의 헥산 분획물 및 7 g의 클로로포름 분획물을 얻었다.

실시예 3. 활성 화합물의 분리 및 구조 규명

실시예 2로 수득한 한련초 클로로포름 분획물 7 g을 클로로포름과 메탄올의 농도 구배(100:0 내지 0:100 부피비)를 이용한 추출액 용배를 이용하여 실리카겔(80g, Merck silica 70 내지 230 mesh) 크로마토그래피를 시행하여 8개의 소분획물을 얻었다(Fr. 1(80.6mg), Fr. 2(76.2mg), Fr. 3(706.3mg), Fr. 4(188.8mg), Fr. 5(641mg), Fr. 6(1.18g), Fr. 7(3.14g), Fr. 8(796.6mg)).

상기 소분획물 중 첫 번째 분획물을 HPLC(high-performance liquid chromatography; YMC Pack Pro C18 column, 250, 20mm, 70% acetonitrile in H₂O)를 실시하여 알파-터트티에닐-2-알데하이드를 얻었으며, 세 번째 분획물을 헥산과 에틸아세테이트(10:1 내지 0:10)를 이용한 추출액 용배를 이용하여 실리카겔((7g, Merck silica 230-400 mesh) 크로마토그래피를 시행하여 알파-터트티에닐메탄올을 얻었다. 상기 알파-터트티에닐-2-알데하이드 및 알파-터트티에닐메탄올의 성상, 분자량, 분자식, 질량분석, ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 보고된 문헌(Indian journal of Chemistry., 30B:1052-1053, 1991)의 데이터와 일치하였으며, 상기 화합물의 구체적인 이화학적 특징과 화학구조는 하기 표 1과 같다.

알파-터트티에닐-2-알데하이드		성상: 노랑 무정형 고체 분자량: 275 mw 분자식: C₁₃H₈S₃O ESI-질량분석: m/z - [M+Na]⁺, 299 ¹H-NMR(400 MHz, CDCL₃, δ(ppm)): 9.88 (s, CHO), 7.68 (d, J=4 Hz, 3-H), 7.32-7.00 (m, six thiophene) ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃, δ(ppm)): 182.2, 146.7, 141.6, 139.1, 137.2, 136.4, 134.4, 128.0, 126.8, 125.3, 124.6, 124.4, 124.0
알파-터트티에닐메탄올		성상: 노랑 무정형 고체 분자량: 277 mw 분자식: C₁₃H₆S₃O ESI-질량분석:m/z - [M+Na]⁺, 301 ¹H-NMR(400MHz, CDCL₃, δ(ppm)): 7.72-6.88 (m, seven thiophene), 5.53 (t, J=5 Hz, CH₂OH), 4.62 (d, J=5 Hz, CH₂OH) ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃, δ(ppm)): 146.3, 135.9, 135.6, 134.9, 134.7, 128.4, 125.6, 124.9, 124.8, 124.4, 124.4, 124.1, 123.6, 123.6, 58.3

실시예 4. 한련초 추출물의 TGF -β 발현 억제효과

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 CRL2076 세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 5x10⁵개/ml가 되도록 조정하여, 12시간 동안 한련초 추출물을 5 ug/ml 농도로 유지하였다. 이후, mRNA 추출 키트를 사용하여 상기 섬유아세포에서 mRNA를 추출하고, 추출된 RNA를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.

RT-PCR의 실시조건은 30 사이클(cycles)을 기본으로 하였다. 1 사이클은 55℃에서 30초 동안 어닐링(annealing) 단계, 72℃에서 30초 동안 연장(Elongation) 단계, 94℃에서 30초 동안 변성(denaturing) 단계로 구성하여 실시하였고, 그 결과를 전기영동으로 확인하여 도 1에 나타내었다.

TGF-β발현의 분석을 위하여 사용한 프라이머는 하기와 같다.

정방향(Forward): 5'-CGTGTTGCTCTCCCGGGCAG-3' (서열번호 1)

역방향(Reverse): 5'-GCAGTGGGCGCTAAGGCGAA-3' (서열번호 2)

또한 대조군으로 사용한 GAPDH의 발현을 분석한 프라이머는 하기와 같다.

정방향(Forward): 5'-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3' (서열번호 3)

역방향(Reverse): 5'-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT-3' (서열번호 4)

그 결과, 도 1에 나타나듯이 본 발명의 한련초 추출물은 미처리한 대조군(Control)과 양성 대조군(용매)와 비교하여 TGF-β 발현량을 현저히 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 한련초 분획물의 VEGF 발현 촉진 효과

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 HEK293세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 2x10⁵개/ml가 되도록 조정하여, VEGF 프로모터 PGL4 벡터로 형질전환한 후, 12시간 동안 실시예 3으로 수득한 한련초 클로로포름 분획물 중 세 번째 소분획을 각 100 ng/ml, 500 ng/ml, 1 ug/ml, 3 ug/ml 및 5 ug/ml 농도로 유지하여 6시간 동안 배양하였다. mRNA 추출 키트를 사용하여 mRNA를 추출하고, 추출된 RNA를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.

RT-PCR의 실시조건은 30 사이클(cycles)을 기본으로 하였다. 1 사이클은 55℃에서 30초 동안 어닐링(annealing) 단계, 72℃에서 30초 동안 연장(Elongation) 단계, 94℃에서 30초 동안 변성(denaturing) 단계로 구성하여 실시하였다.

VEGF의 발현의 분석을 위하여 사용한 프라이머는 하기와 같다.

정방향(Forward): 5'-GTACGTTGGTGCCCGCTGCT-3' (서열번호 5)

역방향(Reverse): 5'-TCCTTCCTCCTGCCCGGCTC-3' (서열번호 6)

정방향(Forward): 5'-CCATCTTCCAGGAG-3' (서열번호 7)

역방향(Reverse): 5'-TCTGGGTGGCAGT-3' (서열번호 8)

이어서, 용해 버퍼 100 ul를 첨가하고 4℃에서 30분동안 쉐이킹하였다. 상청액 10 ul를 취하여 이를 루시퍼라아제 제제 50 ul와 혼합하고 루시퍼라아제의 활성을 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에 나타나듯이, 본 발명에 따른 한련초 분획물의 세 번째 소분획이 VEGF의 발현량을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 2 ).

실시예 6: 한련초 추출물의 TNF -α로 유도한 TGF -β의 발현 억제 효과

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 CRL2076세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 5x10⁵개/ml가 되도록 조정하여 5ml씩을 분주하고 한련초 추출물을 각 1 ug 및 2 ug 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 여기에 TNF-α 10 ug을 처리하고, 2시간 후 RT-PCR을 수행하였고 그 결과를 전기영동으로 확인하여 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에 나타나듯이, TNF-α만을 처리한 군에서는 TGF-β의 발현이 증가되었으나, TNF-α와 한련초 추출물을 모두 처리한 군에서는 TGF-β 발현이 억제되었다. 이로서, 세포 내에서 TNF-α에 의해 TGF-β의 발현이 유도되더라도, 본 발명에 따른 한련초 추출물을 처리한 경우 TNF-α 처리에 의한 영향을 받지 않고 TGF-β 발현을 억제함을 확인하였다.

실시예 7: 한련초 추출물의 농도별 TGF -β 발현 억제 효과

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 CRL2076세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 5x10⁵개/ml 가 되도록 조정하여 5 ml씩을 분주하고, 한련초 추출물을 각 0.2 ug, 0.5 ug, 1ug 및 2 ug 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 그 후 TGF-β 발현 정도를 관찰하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타나듯이 한련초 추출물 2 ug의 농도에서 TGF-β 발현이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 8: 한련초 추출물의 TGF -β 발현 억제 효능시간

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 CRL2076세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 5x10⁵개/ml 가 되도록 조정하여 5 ml씩을 분주하고, 한련초 추출물을 첨가하여 10분, 1시간, 2시간 배양하였고 RT-PCR을 수행하였고 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에서 나타나듯이 TGF-β 발현이 시간이 경과함에 따라 억제되고, 2시간 후에는 TGF-β 발현이 완전하게 억제되는 것을 확인하였다..

실시예 9: 한련초 추출물의 세포 이상 효과 확인시험

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 CRL2076세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 5x10⁵개/ml가 되도록 조정하여 5 ml씩을 분주하고, 한련초 추출물 2 ug 을 첨가하여 세포의 형태학적 변화와 세포의 손상 정도를 24시간 동안 관찰하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 6에 나타나듯이 한련초 추출물을 처리한 농도의 섬유아세포는 한련초 추출물을 처리하지 않은 정상세포와 동일한 형태를 나타내어, 세포의 이상 현상이 없음을 확인하였다.

실시예 10: 터트티에닐 유도체의 TGF -β억제 효과

사람 섬유아세포(fibroblast) 세포주인 CRL2076세포를 10% FBS가 함유된 DMSO 배양액에 세포수가 5x10⁵개/ml 가 되도록 조정하여 5 ml씩을 분주하였다. 터트티에닐 알데하이드 각 20 ng/ml, 200 ng/ml 및 2 ug/ml 및 터트티에닐 메탄올을 각 2 ng/ml, 20 ng/ml, 200 ng/ml 및 2 ug/ml 씩 첨가하여 각각 6시간 동안 배양한 후, 용해 버퍼 100 ul를 첨가하고 4℃에서 30분동안 쉐이킹하였다. 상청액 10 ul를 취하여 이를 루시퍼라아제 제제 50 ul와 혼합하고 루시퍼라아제의 활성을 측정하고 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.

그 결과, 도 7 및 8에 나타나듯이, 터트티에닐 알데하이드 및 터트티에닐 메탄올의 농도의존적으로 TGF-β의 활성을 감소시키는 것을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A Composition for prevention of hair loss and promotion of hair growth comprising extracts of Eclipta prostrata, fractions thereof, terthienyl derivatives or pharmaceutically acceptable salts thereof <130> PA110823KR <150> KR10-2010-0114108 <151> 2010-11-16 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TGF-beta <400> 1 cgtgttgctc tcccgggcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TGF-beta <400> 2 gcagtgggcg ctaaggcgaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 3 ccatcaccat cttccaggag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 4 acagtcttct gggtggcagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for VEGF <400> 5 gtacgttggt gcccgctgct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for VEGF <400> 6 tccttcctcc tgcccggctc 20 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 7 ccatcttcca ggag 14 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 8 tctgggtggc agt 13

Claims

한련초 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 한련초 추출물은 물, C₁ _-4 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 한련초 메탄올 추출물을 물, C₁ _-4 저급 알코올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합용매로 분획한 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 한련초 추출물 또는 이의 분획물은 TGF-β 발현 억제 또는 VEGF 발현 촉진 작용이 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
한련초 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서
R은 CHO 또는 CH₂OH이다.
제6항에 있어서, 상기 탈모방지 또는 발모촉진 작용은 TGF-β의 발현 억제작용이 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 터트티에닐 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
[화학식 1]

상기 식에서
R은 CHO 또는 CH₂OH이다.
제5항 또는 제8항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제 제형으로서 헤어토닉, 헤어크림, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 헤어스프레이, 헤어에어졸, 포마드, 분말, 젤, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹 발모제, 속눈썹 영양제의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.