KR20120029367A - 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화합물의 용도 - Google Patents

중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화합물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화학식 1의 화합물의 용도 및 화학식 1의 화합물에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물을 제공한다. 화학식 1의 화합물로 처리된 중간엽 줄기세포는 연골 세포로 특이적으로 분화 유도되므로 이를 이용하면 관절염, 연골 손상, 연골 결손 등의 연골 질환을 효과적으로 치료할 수 있게 된다.

Description

중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화합물의 용도{USE OF COMPOUNDS FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS TO CHONDROCYTES}
본 발명은 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화학식 1의 화합물의 용도 및 화학식 1의 화합물에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
현재 관절염과 같은 연골질환의 치료를 위해서는 진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등과 같은 약물이나 히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등과 같은 연골을 보호할 수 있는 보조적인 물질을 이용하는 것이 일반적이다. 그러나, 위와 같은 약물의 경우 통증이나 염증 반응을 비특이적으로 완화할 뿐 연골 세포의 재생이나 증식을 유도하지는 못한다. 또한, 히알루론산과 같은 연골 보호제 또한 연골의 조직의 유지를 위해 도움을 줄 뿐 마찬가지로 연골 세포의 재생이나 증식에는 효과가 없다.
따라서, 최근에는 퇴행성관절염 등과 같은 손상된 연골조직의 재생을 위해 최근에는 세포공학(cell therapy) 및 조직공학(tissue engineering) 기술을 이용하여 손상된 연골조직을 대체하고자 하는 방법이 시도되고 있으나 세포 및 조직공학에는 대량의 연골 세포가 필요하지만 연골 세포를 생체외에서 증식시키는 과정에서 연골 세포의 특성을 소실하는 탈분화(de-differentiation) 현상이 일어나기 때문에 연골 세포의 대량획득에 어려움이 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 연골질환에 대한 세포치료제로서의 활용을 위해 중간엽 줄기세포로부터 연골 세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하고자 한다.
이식된 세포와 조직 간의 이종성을 줄인다면 이식된 세포의 생착율을 증가시킬 수 있을 것이다. 이러한 점에 착안하여 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 유도할 수 있는 방법에 대해 지속적으로 연구하였다. 그 결과, 하기 화학식 1의 화합물이 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화 유도할 수 있음을 밝혔다.
하기 실시예에서는 화학식 1의 화합물에 의해 엑스 비보(ex vivo) 상에서 변형된 인간 지방조직 유래의 중간엽 줄기세포가 연골 세포로 분화되며 연골 세포화에 따른 마커를 발현함을 보여준다.
따라서, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화학식 1의 화합물의 용도, 화학식 1의 화합물을 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법 및 화학식 1의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서,
R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, C6 - 12아릴, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 탄소수 5 내지 12의 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고,
R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이고,
R6는 C6 - 12아릴, C3 - 12사이클로알킬, 또는 C6 - 12아릴로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환된다.
여기에서, "치환된" 기는 하나 이상의 수소 원자가 하나 이상의 비-수소원자기로 대체된 것이나, 단 원자가(valence) 요구조건이 만족되어야 하고 화학적으로 안정한 화합물이 치환으로부터 발생되어야 한다. 본 명세서 내에서, 명시적으로 "비치환된"이라고 기재되지 않은 한, 모든 치환기는 치환 또는 비치환될 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, R1 내지 R6의 치환기는 각각 상기 정의된 치환기 중 하나 이상으로 다시 치환될 수 있다.
"알킬"은 일반적으로 명시된 수의 탄소원자 (예컨대, 1 내지 12개의 탄소원자)를 갖는 직쇄 및 분지형 포화 탄화수소 기를 의미한다. 알킬기의 예는 제한없이 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸 등을 포함한다.
"알콕시"는 알킬-O-를 말하며, 여기에서 알킬은 상기 정의되어 있다. 알콕시 기의 예는 제한없이 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시 등을 포함한다. 알콕시는 부착이 원자가 필요조건을 위반하지 않는다면 임의의 고리 원자에서 부모 기(parent group) 또는 기재(substrate)에 부착될 수 있다. 마찬가지로, 알콕시기는 부착이 원자가 요구조건을 위반하지 않는다면 하나 이상의 비수소 치환기를 포함할 수 있다.
"카르복시"는 2가 라디칼인 -C(O)OH를 나타내며, "니트로"는 N(O)2를 나타낸다. 본 명세서에서 (O)는 탄소, 질소 또는 황과 같은 원자에 산소가 이중결합을 통해 결합되어 있음을 의미한다.
"아릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 5- 및 6-원 일환 방향족 기를 포함한 각각 일가 및 이가 방향족 기를 말한다. 아릴이 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 경우 "헤테로아릴"이라고도 언급한다. 일환 아릴기의 예는 제한없이 페닐, 피롤릴, 퓨란일, 티오펜에일, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 피리딘일, 피라진일, 피리다진일, 피리미딘일 등을 포함한다. 아릴기는 또한 상기 정의된 융합된 5- 및 6-원 고리를 포함한 이환 기, 삼환 기 등을 포함한다. 다환 아릴기의 예는 제한없이 나프틸, 바이펜일, 안트라센일, 피렌일, 카바졸릴, 벤족사졸릴, 벤조다이옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이미다졸릴, 벤조티오펜에일, 퀸올린일, 이소퀸올린일, 인돌릴, 벤조퓨란일, 푸린일, 인돌리진일 등을 포함한다. 상기 아릴기는 부착이 원자가 요구조건을 위반하지 않는다면 임의의 고리 원자에서 부모 기 또는 기재에 부착될 수 있다. 마찬가지로, 아릴기는 치환이 원자가 요구조건을 위반하지 않는다면 하나 이상의 비-수소 치환기를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, 페닐, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 피리딘 또는 벤젠 고리를 형성하고,
R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이고,
R6는 페닐, 나프탈릴, C3 - 12사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소이거나, 서로 연결되어 피리딘 고리를 형성하고,
R3는 수소, 페닐, 또는 C1 - 4알킬이거나, R2와 함께 서로 연결되어 벤젠 고리를 형성하며,
R4 및 R5는 수소이고,
R6는 페닐, 나프탈릴, C5 - 10사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은
상기 화학식 1의 화합물은
1) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (4-히드록시-페닐)-아미드;
2) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (7-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
3) 2-히드록시-5-(퀴놀린-8-술포닐아미노)-벤조익 에시드;
4) 5-(4-터트-부틸-벤젠술포닐아미노)-2-히드록시-벤조익 에시드;
5) 비페닐-4-술포닉 에시드 (5-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
6) N-(4-히드록시-나프탈릴-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
7) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (4-하이드록시-페닐)-아미드;
8) N-(5-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
9) N-(7-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
10) 4-tert-부틸-N-(3-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
11) 4-tert-부틸-N-(2-클로로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
12) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
13) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
14) 4-tert-부틸-N-(2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
15) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
16) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
17) 4-tert-부틸-N-(3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
18) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
19) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
20) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-니트로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
21) 4-tert-부틸-N-[2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-벤젠술폰아미드;
22) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
23) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
24) 4-tert-부틸-N-에틸-N-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-벤젠술폰아미드;
25) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 에틸-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-아미드;
26) 4-tert-부틸-N-[4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-벤젠술폰아미드;
27) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드; 또는
28) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 연골 세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 중간엽 줄기세포의 종류 또한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 중배엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 골수, 조직 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 연골 세포로의 분화가 유도된 중배엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 중간엽 줄기세포에 대해 화학식 1의 화합물을 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일정 시간 동안 화학식 1의 화합물과 중간엽 줄기세포를 접촉시켜 중간엽 줄기세포가 연골 세포로 분화 유도될 수 있기만 하면 된다. 한 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 처리는 중간엽 줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다.
중간엽 줄기세포에 처리되는 화학식 1의 화합물의 농도는 구체적인 화학식 1의 화합물의 종류나 중간엽 줄기세포에 처리되는 기간, 또는 연골 세포로의 분화 요구 정도 등에 따라 달라질 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 농도는 0.01 내지 100 μM의 범위에서 사용될 수 있다.
중간엽 줄기세포의 분화 유도에 일반적으로 요구되는 시간을 고려할 때, 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서의 배양은 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 중간엽 줄기세포에 대한 화학식 1의 화합물의 처리의 기간은 처리되는 화학식 1의 화합물의 종류 또는 농도에 따라 달라질 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서 "연골 세포"는 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포 또는 연골 세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 발명에 있어서, 화학식 1의 화합물의 처리에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포는 연골화(chondrogenesis)와 관련된 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 연골 세포는 이러한 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, 파이브로넥틴, β1 인테그린, α5 인테그린 및 N-카데린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. 화학식 1의 화합물의 구체예는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 조성물은 중배엽 줄기세포의 배양시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 이러한 배지로는 예컨대, MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등이 포함될 수 있다. 다르게는, 화학식 1의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물은 중간엽 줄기세포와는 별도로로 체내에 도입될 수도 있을 것이다. 즉, 중간엽 줄기세포의 투여 전이나 후, 또는 중간엽 줄기세포의 투여와 동시에 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물이 별도로 투여될 수도 있다. 이 경우 상기 조성물은 화학식 1의 화합물의 투여에 적합한 공지의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물을 제공한다. 이러한 연골질환 치료용 의약 조성물은 이제 제한되는 것은 아니나, 관절염, 연골 손상 또는 연골 결손 등의 연골 질환의 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 상기 의약 조성물은 줄기세포의 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 연골 세포의 유효량은 1×104 내지 1×108 세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병변의 정도에 따라 적의 증감될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물 및 이의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 식에서,
R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, C6 - 12아릴, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 탄소수 5 내지 12의 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고,
R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이고,
R6는 C6 - 12아릴, C3 - 12사이클로알킬, 또는 C6 - 12아릴로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환된다.
화학식 1의 화합물의 구체예는 앞서 설명한 바와 같다.
화학식 1의 화합물은 한 구체예에서 하기 반응식 1과 같이 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure pat00003
상기 반응식에서 R1 내지 R7은 앞서 정의한 바와 같다.
따라서, 본 발명은 상기 화학식 2의 화합물을 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법의 일례를 설명하면, 화학식 2의 화합물의 테트라하이드로퓨란 0.2M 용액에 화학식 3의 화합물과 트리에틸아민을 교반상태에서 주입한 후 12시간 반응시키고, 생성 혼합물을 에틸아세테이트로 여과한 다음 감압 농축한 후, 얻어진 일차 화합물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 방법으로 정제하여 화학식 1의 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 1의 화합물로 처리된 중간엽 줄기세포는 연골 세포로 특이적으로 분화 유도되므로 이를 이용하면 관절염, 연골 손상, 연골 결손 등의 연골 질환을 효과적으로 치료할 수 있게 된다.
도 1은 화학식 1의 화합물이 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화유도함을 보여주는 알시안 블루 염색 결과를 보여준다.
도 2는 화학식 1의 화합물이 투여량 의존적으로 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화유도함을 보여주는 샌드위치 ELISA결과를 보여준다.
도 3은 화학식1 의 화합물이 ERK를 인산화시킴을 보여주는 웨스턴블롯 결과를 보여준다.
도 4는 화학식 1의 화합물이 세포와 세포외 기질(ECM) 간의 상호작용과 세포-세포간 상호작용(cell-cell interation)이 연골 세포화의 조절과 관련된, 파이브로넥틴, 인테그린 α5β1 및 N-카데린에 대해 미치는 효과를 보여주는 Semi-quantitative RT-PCR 결과를 보여준다.
도 5는 A1943, A1944, A1948, A1949 및 A1950 화합물이 A1942와 유사한 수준으로 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 유도함을 보여주는 샌드위치 ELISA 결과를 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
실시예 : 화학식 1의 화합물의 합성
실시예 1 : (퀴놀린-8- 술포닉 에시드 (4-히드록시- 페닐 )-아미드 ( Quinoline -8-sulfonic acid (4-hydroxy-phenyl)-amide)의 제조
Figure pat00004

화학식 2의 화합물(300mg, 1.32mmol)의 테트라하이드로퓨란 0.2M 용액에 화학식 3의 화합물(216mg, 1.98mmol)와 트리에틸아민(550ml, 3.96mmol)를 교반상태에서 주입한 후 12시간 교반하였다. 생성 혼합물을 에틸아세테이트로 여과한 다음 감압 농축하였다. 얻어진 일차 화합물을 실리카겔 컬럼크러마토그래피 방법(용출제: 에틸아세테이트:메틸렌클로라이드:헥산 = 2:1:3)으로 정제하여 목적 화합물을 49%의 수율(194mg)로 얻었다.
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.46 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 9.15 (dd, J = 4.2, 1.8 Hz, 1H), 8.53 (dd, J = 8.4, 1.7 Hz, 1H), 8.25 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H), 8.21 (dd, J = 7.3, 1.4 Hz, 1H), 7.74 (dd, J = 8.3, 4.2 Hz, 1H), 7.68 - 7.63 (m, 1H), 6.75 - 6.70 (m, 2H), 6.53 - 6.41 (m, 2H)
실시예 2 내지 28:
상기 실시예 1에 기재된 제조방법과 유사한 제조방법으로, 실시예 2 내지 28의 화합물을 제조하였다. 제조된 화합물들의 화학구조 및 물성치는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009

[표 2]
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014

실험예 : 화학식 1의 화합물에 의한 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 확인
인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
무균의 조건에서 60 cc의 팽창 용액(정상 주사용수 1 L 안에 30 mL 1% lidocaine, 30 mL 0.5% bupivacaine, 10 mL 4.2% sodium bicarbonate, 1 mg epinephrine를 첨가)을 배꼽 주변 부분에 넣는다. Mercedes 3 mm x 9 cm Aspiration Luer Lock Cannula (Byron Medical, Tucson, AZ)를 이용하여 지방을 흡입시킨 후 바로 얼음에 방치하여 준다. 250 mm 가는 체를 통해 걸러진 지방 흡입물은 마취제와 혈액에 의한 오염물질이 포함되어 있으므로 이를 제거해 주기 위해 PBS로 씻어준다. 얻어진 지방 조직은 collagenase I (1 mg/mL; Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)에 넣고 흔들어주며 1시간 동안 37˚C에서 방치한다. 현탁된 지방조직을 1500 x g, 10 분간 원심분리 해 주고 성숙된 지방세포를 포함한 상등액은 버린다. 얻어진 stroma vascular (SV)들은 0.1% BSA로 씻어주며 M-199 (12.8% 우혈청, heparin, 10,000 U/mL penicillin G, 25 mg/mL amphotericin B, 10,000 mg/mL streptomycin 포함)로 풀어준 후 gelatin 이 코팅된 tissue culture flask에 깔아주어 배양한다. 24시간 후 씻어주어 붙지 않은 세포들을 제거하여 주고 계속 배양 한다.
화합물 처리에 의한 중간엽 줄기세포의 엑스 비보 변형
2계대에서, 중간엽 줄기세포를 60 mm 플레이트에 2 x 105 cells/ml로 위와 동일한 배지를 이용하여 분주하고, 화학식 1의 화합물(실시예 1 내지 28의 화합물)을 최종 농도 10nM, 100nM, 1μM 또는 10μM로 처리하고 매 3일에 한번씩 화학식 1의 화합물을 신선한 배지로 교체하여 11일간 배양하였다.
알시안 블루 염색
세포들을 우선 PBS(Gibco)로 3회 세척한 다음 100% 메탄올(Sigma)로 -20℃에서 10분 동안 고정하였다. 염색은 1% 알시안 블루 8GX(Bio Basis, Ontario, Canada)를 포함하는 0.1M HCl(pH 1.0) 용액을 세포에 2시간 동안 실온에서 처리함으로써 수행하였다. 염색의 강도를 정량하기 위해, 염색된 배양 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 각각의 웰을 1ml의 6M 구아니딘-HCl(Sigma)으로 밤새 실온에서 추출하였다. 추출된 염료의 광학 밀도를 650nm에서 측정하였다.
샌드위치 ELISA
포획항체(capture antibody)를 각 웰의 바닥에 결합시킨 다음, 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS(Gibco)로 2회 세척하고, 100㎕의 3% BSA를 함유한 PBS로 실온에서 2 내지 3시간 동안 처리하였다. PBS로 플레이트를 2회 세척한 후, 세포분해물을 각 웰에 가하고, 플레이트를 2시간 이상 습윤 대기하 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.02% tween-20(Sigma)을 함유한 PBS로 4회 세척하였다. 탐지 항체(detector antibody)를 가한 후, 플레이트를 습윤 대기하 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 퍼옥시다아제가 컨쥬게이션되어 있는 2차 항체와 함께 다시 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 100 ㎕의 테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Sigma)을 기질(substrate)로서 처리하고, 25 ㎕의 0.1 M H2SO4을 종결 완충액으로서 가하여 반응을 중지시킨 후, 즉시 ELISA 플레이트 리더기(Bio-Rad)로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
웨스턴 블롯
세포들을 PBS로 1회 세척하고, 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2-EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM Na3VO4, 1 mg/ml 류펩틴 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 용해 버퍼(Cell Signaling Technology)로 약 20분 동안 용해시켰다. 세포용해물을 12,000 g로 10분 동안 원심분리시키고, 상층액을 얻었다. 단백질 농도는 Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 정량적인 단백질은 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔로 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Millipore)으로 이동시켰다. 5% 무지방 분유를 함유한 Tris-buffered saline-Tween 20 (TBS-T, 0.1% Tween 20)으로 멤브레인을 블로킹 한 후, 멤브레인을 TBS-T로 2회 세척하고, 1차 항체 (ERK and p-ERK; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 멤브레인을 TBS-T로 10분 동안 3회 세척한 다음, 호오스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후, 밴드를 향상된 화학발광 시약(GE Healthcare Life Sciences)으로 탐지하였다. 밴드 강도는 Image J 1.40g software (NIH)를 이용하여 정량하였다.
RT - PCR
다양한 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 분석하였다. 전체 RNA를 UltraspectTM-II RNA system(Biotecx Laboratories, Inc., USA) 및 easy-BLUETM(Intron Biotechnology, Seoul, South Korea)에 의해 제조하였다. 분리된 전체 RNA로부터 Avian Myeloblastosis virus (AMV) 역전사효소(Powver cDNA Synthesis Kit, Intron Biotechnology)에 의해 단일가닥 cDNA를 합성하였다. 1 ㎕의 전체 RNA, 1X 역전사 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1 mM 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs), 0.5 유닛의 RNase 저해제, 0.5㎍의 oligo(dT)15, 및 15 유닛의 AMV 역전사효소를 함유하는 20 ㎕의 역전사 반응 혼합물을 42℃에서 15분간 인큐베이션하고, 99℃에서 5분 동안 가열한 다음, 0 내지 5℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. PCR은 Tap 폴리머라아제(i-MaxTM DNA polymerase, Intron Biotechnology)로 표준 절차를 이용하여 수행하였다. 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃ 내지 65℃에서 30초 동안 어닐링, 그리고 72℃에서 30초 동안 연장하는 것으로 하여 사이클 수는 25 내지 45 사이클로 변동되었다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.
파이브로넥틴(Fibronectin): 5'-CCTTAAGCCTTCTGCTCTGG-3', 5'-CGGCAAAAGAAAGCAGAACT-3' (300 bp); β1 인테그린(β1 integrin): 5'-GCCAGTGTCACCTGGAAAAT-3', 5'-TCGTCCATTTTCTCCTGTCC-3' (344 bp); α5 인테그린(α5-integrin): 5'-CTTCGGTTCACTGTTCCTC-3', 5'-TGGCTTCAGGGCATTT-3' (283 bp); N-카데린(N-cadherin): 5'-GCCACCATATGACTCCCTTTTAGT-3', 5'-CAGAAAACTAATTCcAATCTGAAA-3'(454 bp)
GAPDH 프라이머(5'-CTCCCAACGTGTCTGTTGTG-3', 5'-TGAGCTTGACAAAGTGGTCG-3' (450bp) 및 5'-ACCACAGTCcATGCCATCA -3', 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(450bp))를 내부 표준(internal standard)으로 사용하였다. 증폭 산물들의 신호 강도는 각각의 GAPDH 신호 강도에 대한 그들의 상대적인 강도로 정상화되었다(normalized).
통계학적 분석
결과들은 평균 ± S.E.M.로 나타내었다. Student's t-test를 이용하여 비교하였다. p-value가 0.05 미만일 때 상관관계가 통계학적으로 유의한 것으로 고려하였다.
결과
화학식 1의 화합물이 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화유도할 수 있는지 시험하고자, 우리는 설페이트화 프로테오글리칸에 대한 알시안 블루 염색을 통해 연골화를 정량하였다. 그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 중간엽 줄기세포에 A1942 화합물(1 μM)을 11일 동안 처리한 군이 대조군에 비해 상대적 흡광도가 약 3배 이상 높은 것으로 나타났다((*p<0.05 vs. 대조군).
또한, 우리는 다양한 농도의 A1942 화합물로 처리된 중간엽 줄기세포가 투여량 의존적인 방식으로 연골 세포로 분화되는지 확인하기 위해, 연골 세포 마커인 어그레칸(aggrecan)의 상향조절된 발현 여부를 조사하고자 하였다. 중간엽 줄기세포를 다양한 농도의 A1942 화합물(0.1, 0.5, 1 μM)로 11일 동안 처리하였다. 화학식 1의 화합물에 의한 연골화의 유도가 (ERK) MAP 키나아제 신호전달 경로에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 따라서, MEK의 선택적 저해제인 U0126이 어그레칸의 발현에 미치는 영향에 대해서도 함께 조사하였다. 중간엽 줄기세포의 연골화 과정 중의 어그레칸의 발현 수준의 변화는 샌드위치 ELISA에 의해 조사되었다. 그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 어그레칸은 A1942 화합물의 처리 농도에 따라 투여량 의존적인 방식으로 발현량이 증가하며, MEK의 선택적 저해제인 U0126의 처리는 A1942 화합물의 처리에도 불구하고 어그레칸의 발현량을 감소시키는 것으로 나타났다 (*p<0.05 vs. 대조군, †p<0.01 vs. 1 μM A1942+U0126).
우리는 또한 ERK의 인산화에 대한 A1942의 효과에 대해 조사하고자 하였다. 11일 동안 1 μM 의 A1942를 처리한 중간엽 줄기세포의 연골화 과정에서 ERK의 인산화된 수준의 변화를 웨스턴블롯을 통해 조사하였다. 그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, A1942 처리군에서는 시간이 지남에 따라 p-ERK의 수준이 증가한 반면, A1942와 함께 U0126을 처리한 군에서는 시간의 변화에도 불구하고 p-ERK의 수준이 증가하지 않았다.
세포와 세포외 기질(ECM) 간의 상호작용과 세포-세포간 상호작용(cell-cell interation)이 연골 세포화의 조절과 관련되어 있다. 따라서, 11일 동안 1 μM 의 A1942를 처리한 중간엽 줄기세포의 연골화 과정에서, 세포와 세포외 기질(ECM) 간의 상호작용을 매개하는 인테그린 α5β1과 그의 리간드인 파이브로넥틴, 그리고 세포-세포간 상호작용(cell-cell interation)을 매개하는 N-카데린에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 Semi-quantitative RT-PCR을 통해 조사하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 시간의 흐름에 따라, 파이브로넥틴, β1 인테그린, α5 인테그린 및 N-카데린의 발현이 모두 감소함을 확인할 수 있었다.
우리는 A1942 외의 다른 화학식 1의 화합물의 연골 분화 유도 효과에 대해 조사하였다. 상기 기술한 것과 동일한 방식으로 중간엽 줄기세포의 연골화 과정 중의 어그레칸의 발현 수준의 변화는 샌드위치 ELISA에 의해 조사되었다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, A1943, A1944, A1948, A1949 및 A1950 화합물(실시예 2 내지 6의 화합물) 또한 A1942와 유사한 수준으로 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 유도함을 확인할 수 있었다(One-way analysis of variance, Bonferroni's Multiple Comparison Test (*p<0.001 vs. Control)).
우리는 추가적으로 합성한 실시예 7 내지 28의 화합물의 연골 분화 유도 효과에 대해 샌드위치 ELISA에 의해 동일한 방식으로 조사하였다. 그 결과, 하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 7 내지 28의 화합물 또한 A1942와 유사한 수준으로 중간엽 줄기세포의 연골 분화를 유도함을 확인할 수 있었다. 표 3에서, 연골분화 유도 활성은 대조군에 대해 노말라이즈한 것이다.
[표 3]
Figure pat00015

Claims (19)

  1. 화학식 1의 화합물을 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00016

    상기 식에서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, C6 - 12아릴, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 탄소수 5 내지 12의 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 C6 - 12아릴, C3 - 12사이클로알킬, 또는 C6 - 12아릴로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환된다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, 페닐, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 피리딘 또는 벤젠 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 페닐, 나프탈릴, C3 - 12사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것인
    중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소이거나, 서로 연결되어 피리딘 고리를 형성하고,
    R3는 수소, 페닐, 또는 C1 - 4알킬이거나, R2와 함께 서로 연결되어 벤젠 고리를 형성하며,
    R4 및 R5는 수소이고,
    R6는 페닐, 나프탈릴, C5 - 10사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것인
    중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은
    1) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (4-히드록시-페닐)-아미드;
    2) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (7-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
    3) 2-히드록시-5-(퀴놀린-8-술포닐아미노)-벤조익 에시드;
    4) 5-(4-터트-부틸-벤젠술포닐아미노)-2-히드록시-벤조익 에시드;
    5) 비페닐-4-술포닉 에시드 (5-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
    6) N-(4-히드록시-나프탈릴-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    7) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (4-하이드록시-페닐)-아미드;
    8) N-(5-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    9) N-(7-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    10) 4-tert-부틸-N-(3-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    11) 4-tert-부틸-N-(2-클로로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    12) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    13) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    14) 4-tert-부틸-N-(2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    15) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    16) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    17) 4-tert-부틸-N-(3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    18) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    19) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    20) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-니트로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    21) 4-tert-부틸-N-[2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-벤젠술폰아미드;
    22) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
    23) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
    24) 4-tert-부틸-N-에틸-N-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-벤젠술폰아미드;
    25) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 에틸-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-아미드;
    26) 4-tert-부틸-N-[4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-벤젠술폰아미드;
    27) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드; 또는
    28) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인
    중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것인 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    화학식 1의 화합물의 처리는 중간엽 줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행되는 것인 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    배양은 5일 내지 15일 동안 수행되는 것인 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    연골 세포는 파이브로넥틴, β1 인테그린, α5인테그린 또는 N-카데린의 발현이 줄기세포에 비해 감소되어 있는 것인 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도 방법.
  9. 화학식 1의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00017

    상기 식에서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, C6 - 12아릴, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 탄소수 5 내지 12의 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 C6 - 12아릴, C3 - 12사이클로알킬, 또는 C6 - 12아릴로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환된다.
  10. 제9항에 있어서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, 페닐, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 피리딘 또는 벤젠 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 페닐, 나프탈릴, C3 - 12사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것인
    중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물.
  11. 제9항에 있어서
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H이거나, 서로 연결되어 피리딘 고리를 형성하고,
    R3는 수소, 페닐, 또는 C1 - 4알킬이거나, R2와 함께 서로 연결되어 벤젠 고리를 형성하며,
    R4 및 R5는 수소이고,
    R6는 페닐, 나프탈릴, C5 - 10사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것인
    중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은
    1) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (4-히드록시-페닐)-아미드;
    2) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (7-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
    3) 2-히드록시-5-(퀴놀린-8-술포닐아미노)-벤조익 에시드;
    4) 5-(4-터트-부틸-벤젠술포닐아미노)-2-히드록시-벤조익 에시드;
    5) 비페닐-4-술포닉 에시드 (5-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
    6) N-(4-히드록시-나프탈릴-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    7) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (4-하이드록시-페닐)-아미드;
    8) N-(5-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    9) N-(7-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    10) 4-tert-부틸-N-(3-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    11) 4-tert-부틸-N-(2-클로로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    12) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    13) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    14) 4-tert-부틸-N-(2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    15) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    16) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    17) 4-tert-부틸-N-(3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    18) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    19) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    20) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-니트로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    21) 4-tert-부틸-N-[2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-벤젠술폰아미드;
    22) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
    23) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
    24) 4-tert-부틸-N-에틸-N-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-벤젠술폰아미드;
    25) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 에틸-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-아미드;
    26) 4-tert-부틸-N-[4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-벤젠술폰아미드;
    27) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드; 또는
    28) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드
    로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인
    중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도용 조성물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골 세포를 포함하는 연골질환 치료용 의약 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 연골질환은 관절염, 연골 손상 또는 연골 결손인 연골질환 치료용 의약 조성물.
  15. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00018

    상기 식에서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, C6 - 12아릴, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 탄소수 5 내지 12의 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 C6 - 12아릴, C3 - 12사이클로알킬, 또는 C6 - 12아릴로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환된다.
  16. 제15항에 있어서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, 페닐, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 피리딘 또는 벤젠 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 4알킬 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 페닐, 나프탈릴, C3 - 12사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것인 화합물.
  17. 제15항에 있어서
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H이거나, 서로 연결되어 피리딘 고리를 형성하고,
    R3는 수소, 페닐, 또는 C1 - 4알킬이거나, R2와 함께 서로 연결되어 벤젠 고리를 형성하며,
    R4 및 R5는 수소이고,
    R6는 페닐, 나프탈릴, C5 - 10사이클로알킬 또는 페닐로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환되는 것인 화합물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은
    1) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (4-히드록시-페닐)-아미드;
    2) 퀴놀린-8-술포닉 에시드 (7-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
    3) 2-히드록시-5-(퀴놀린-8-술포닐아미노)-벤조익 에시드;
    4) 5-(4-터트-부틸-벤젠술포닐아미노)-2-히드록시-벤조익 에시드;
    5) 비페닐-4-술포닉 에시드 (5-히드록시-나프탈릴-1-일)-아미드;
    6) N-(4-히드록시-나프탈릴-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    7) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (4-하이드록시-페닐)-아미드;
    8) N-(5-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    9) N-(7-하이드록시-나프탈렌-1-일)-4-메틸-벤젠술폰아미드;
    10) 4-tert-부틸-N-(3-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    11) 4-tert-부틸-N-(2-클로로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    12) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    13) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-클로로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    14) 4-tert-부틸-N-(2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    15) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    16) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (2-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    17) 4-tert-부틸-N-(3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-벤젠술폰아미드;
    18) 바이페닐-4-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    19) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-플루오로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    20) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 (3-니트로-4-하이드록시-페닐)-아미드;
    21) 4-tert-부틸-N-[2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-벤젠술폰아미드;
    22) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
    23) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸]-아미드;
    24) 4-tert-부틸-N-에틸-N-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-벤젠술폰아미드;
    25) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 에틸-(5-하이드록시-2-메틸-페닐)-아미드;
    26) 4-tert-부틸-N-[4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-벤젠술폰아미드;
    27) 바이페닐-4-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드; 또는
    28) 나프탈렌-2-술포닉 에시드 [4-(2-하이드록시-에틸)-사이클로헥실]-아미드로부터 선택되는 화합물.
  19. 하기 화학식 2의 화합물을 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00019

    [화학식 3]
    Figure pat00020

    [화학식 1]
    Figure pat00021

    상기 식에서,
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소, C6 - 12아릴, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이거나, R1와 R2 또는 R2와 R3 가 서로 연결되어 탄소수 5 내지 12의 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고,
    R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 - 12알킬, C1 - 12알콕시, 하이드록시, 카르복시 또는 할로겐 원자이고,
    R6는 C6 - 12아릴, C3 - 12사이클로알킬, 또는 C6 - 12아릴로 치환된 C1 - 4알킬 이며,
    R7은 수소 또는 C1 - 4알킬이고,
    상기 R1 내지 R6는 각각 독립적으로 C1 - 4알킬, 하이드록시, 하이드록시C1 - 4알킬, 니트로, 카르복시 및 할로겐 원자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 추가로 치환되거나 비치환된다.
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