KR100517385B1 - 파골세포 분화 및 골흡수를 억제하는 탄시논 ⅱα - Google Patents

Abstract

본 발명은 파골세포의 분화 및 골흡수를 억제하는 화합물인 하기 화학식 1로 표현되는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 탄시논 ⅡA는 칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3를 포함하는 파골세포와 관련된 유전자의 발현을 억제하고, 파골세포 전구체에서 RANKL의 발현을 억제함으로써, RANKL에 의해 유도되는 Akt, ERK 및 NF-κB의 활성을 차단한다.

Description

파골세포 분화 및 골흡수를 억제하는 탄시논 ⅡΑ{Tanshinone ⅡΑ inhibiting osteoclast differentiation and bone resorption}

본 발명은 파골세포의 분화 및 골흡수를 억제하는 화합물인 하기 화학식 1로 표현되는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)에 관한 것이다.

[화학식 1]

성인의 뼈는 골 흡수 및 합성의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정을 끊임없이 겪는 동적 상태이다(G. Mundy, Bone remodeling, in: M.J. Favus (Ed.), Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 1999, pp.30-38). 이러한 리모델링에서의 불균형은 골다공증(osteoporosis), 파젯병(Paget's disease; 변형성 골염), 치주질환 및 다발성 골수종(multiple myeloma)과 관련된 골용해(osteolysis) 등을 포함하는 성인 골격 기형을 유도한다. 이러한 질병들은 주로 골 흡수를 초래하는 세포인 파골세포(osteoclast)의 과도한 활성에 의해 나타난다. 파골세포는 식균세포 계통의 조혈 전구세포에서 기원하고 단핵의 전구체들의 융합으로 인해 다핵 세포로 분화한다(T. Suda et al., Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families, Endocr. Rev. 20 (1999) 345-357).

최근들어, 파골세포/기질세포로부터 유도된 파골세포 분화 인자인 RANKL(Receptor Activator of Nuclear factor κB(RANK) ligand)을 발견하고, 파골세포 분화의 이해에서 비약적인 진보가 생겼다. 상기 RANKL은 그것의 동종 수용체, RANK, 파골세포 전구세포에 직접적으로 결합하는 주요 파골 분자이다(D.M. Anderson et al., Homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function, Nature 390 (1997) 175-195; H. Yasuda et al., Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and identical to TRANCE-RANKL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 3579-3602; Z.H. Lee and H.H. Kim, Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts, Biochem. Biophys. Res. Commun. 305 (2003) 211-214). RANKL은 분화된 파골세포로 대표되는 칼시토닌 수용체, c-src, 인테그린 β3를 포함하는 유전자들의 발현을 유도하는데 필요하다(S. Takeshita et al., Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 1477-1488; D.L. Lacey et al., Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in vitro and in vivo, Am. J. Pathol. 157 (2000) 435-448; T. Miyamoto et al., An adherent condition is required for formation of multinuclear osteoclasts in the presence of macrophage colony-stimulating factor and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, Blood 96 (2000) 4335-4343).

RANKL 결합에 의하여, 파골세포 전구체에서 발현되는 RANK는 어뎁터 신호전달 물질인 TRAFs(tumor necrosis factor receptor(TNFR)-associated factors)를 증가시킨다(L. Galibert et al., The involvement of multiple tumor necrosis factor receptor(TNFR)-associated factors in the signaling mechanisms of receptor activator of NF-kappaB, a member of the TNFR superfamily, J. Biol. Chem. 273 (1998) 34120-34127; B.G. Darnay et al., Activation of NF-kappaB by RANK requires tumor necrosis factor receptor-associated factor(TRAF) 6 and NF-kappaB-inducing kinase. Identification of a novel TRAF6 interaction motif, J. Biol. Chem. 274 (1999) 7724-7731; H.-H. Kim et al., Receptor activator of NF-kappaB recruits multiple TRAF family adaptors and activates c-Jun N-terminal kinase, FEBS Lett. 443 (1999) 297-302; B.R. Wong et al., M. Vologodskaia, H. Hanafusa, Y. Choi, TRANCE, a TNF family member, activates Akt/PKB through a signaling complex involving TRAF6 and c-Src, Mol. Cell 4 (1999) 1041-1049). TRAFs는 NF-κB의 강한 활성을 유발한다. 또한 PI 3-kinase/Akt, p38 및 ERK 신호 경로도 RANKL 신호전달에 관여하는 파골세포 분화 과정에 포함된다(H. Hotokezaka et al., U0126 and PD98059, specific inhibitors of MEK, accelerate differentiation of RAW264.7 cells into osteoclast-like cells, J. Biol. Chem. 277 (2002) 47366-47372; S.E. Lee et al., The phosphatidylinositol 3-kinase, p38, and extracellular signal-regulated kinase pathways are involved in osteoclast differentiation, Bone 30 (2002) 71-77). 이러한 파골세포 분화와 관련된 신호전달 경로의 차단은 성인골격 질병의 치료를 위한 치료적 접근으로 생각되어진다.

균의 대사산물인 워트마닌(wortmannin)은 PK 3-키나아제의 잠재적 및 선택적 억제제이며, 시험관내 나노몰 농도(nanomolar concentration)에서 파골세포의 골흡수를 억제하는 것으로 알려져 있다(T.J. Hall et al., a potent inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, inhibits osteoclastic bone resorption in vitro, Calcif. Tissue Int. 56 (1995) 336-338).

또한 제니스테인(genistein) 및 헤르비마이신(hervimycin)과 같은 타이로신 키나아제 억제제들은 파골세포의 활성 및 난소절제된 쥐(ovariectomized rats)에서의 골 손실을 억제하는 효능을 가지며(H.C. Blair et al., Variable effects of tyrosine kinase inhibitors on avian osteoclastic activity and reduction of bone loss in ovariectomized rats, J. Cell Biochem. 61 (1996) 629-637), Src 집단 키나아제 억제제인 CGP77675는 시험관내에서 칼슘과잉혈증(hypercalcemia) 및 골다공증의 동물 모델에서 골흡수를 억제한다고 보고되었다(M. Missbach, et al., A novel inhibitor of the tyrosine kinase Src suppresses phosphorylation of its major cellular substrates and reduces bone resorption in vitro and in rodent models in vivo, Bone 24 (1999) 437-449).

대핵 세포인 파골세포는 조혈세포의 단핵구/대식세포 계통으로부터 분화되어 골흡수를 위해 특수화된다. 파골세포 분화에서의 중재는 파골세포를 포함하는 골질환의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근으로 생각되어지고 있다.

이에 본 발명자들은 파골 반응을 억제하는 천연 화합물을 찾기 위하여, 파골세포/골수세포를 함께 배양하는 시스템을 사용하여 생약 추출물을 검색하였다. 이러한 스크린 과정에서 본 발명자들은 Salvia miltiorrhiza 분게(Bunge)에서 기원하고 파골세포 분화 및 골 흡수를 억제하는 물질인 탄시논 ⅡA를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 파골세포 분화 및 골 흡수를 억제하는 신규물질인 탄시논 ⅡA를 제공하는 것이다.

성인의 골 질량은 골 생성율과 그 재흡수율 사이의 불균형으로 인해 나이에 따라 감소하게 된다. 파골세포는 무기질 골(resorbing mineralized bone)을 흡수할 수 있는 세포 타입이다. 골 흡수는 파골세포 수 및 활성을 결정하는 여러 가지 인자들에 의해 영향을 받는다. 본 발명자들은 파골세포의 생성 또는 활성을 감소시키는 화합물을 무작위 스크리닝을 하였고, 이를 골다공증, 파제트병(Paget's disease) 및 치주질환(periodontal disease)과 같은 골-흡수 질환을 치료하는데 이용하였다.

조혈세포와 같은 기원인 전구세포로부터 파골세포의 분화 과정은 아직 정확히 밝혀지지 않았다. 그러나, 일반적으로 파골 반응에서 발생하는 두 개의 결정적인 단계; 파골세포와 전구세포의 관련 및 다핵화된 파골세포를 생성하기 위한 TRAP-양성 단핵 세포의 융합(W.J. Boyle, et al., Osteoclast differentiation and activation, Nature 423 (2003) 337-342) 단계를 인정하고 있다. 분화과정 동안에 여러 가지 유전자의 발현은 한정되어 자극을 받으며, 이러한 유전자로는 TRAP, V-ATPase, 탈탄산효소Ⅱ(carbonic anhydrase Ⅱ), c-Src, 칼시토닌 수용체 및 인테그린 β3 등을 들 수 있다.

상기 연구과정에서 발견하게 된 탄시논 ⅡA가 TRAP-양성 다핵 파골세포에서 전구체의 분화 및 분화된 파골세포의 골 흡수 활성을 모두 억제하는 물질임을 확인하게 되었다. 그 결과, 본 발명은 파골세포의 분화 및 골흡수를 억제하는 화합물인 하기 화학식 1로 표현되는 탄시논 ⅡA(tanshinone ⅡA)를 제공한다.

본 발명에 의한 탄시논 ⅡA는 꿀풀과에 속하는 Salvia miltiorrhiza 분게(Bunge)에서 기원한다. 이 식물은 전통적으로 한방 약초로 사용되어 왔고, 관상동맥의 심장질환에 효과가 있는 것으로 보고되었다(W. Tang, G. Eisenbrand, Chinese Drugs of Plant Origine, Springer-Verlag, Berlin, 1992). 심장혈관 시스템에서 방어 효과 이외에도 카스파아제(caspase) 경로의 활성을 통한 여러 가지 종양 세포계에서 세포의 자가사멸(apoptosis)을 유발하는 것으로 알려져 있다(H.J. Sung et al., Tanshinone IIA, an ingredient of Salvia miltiorrhiza BUNGE, induces apoptosis in human leukemia cell lines through the activation of caspase-3, Exp. Mol. Med. 31 (1999) 174-178; Y. Yoon et al., Tanshinone IIA isolated from Salvia miltiorrhiza BUNGE induced apoptosis in HL60 human premyelocytic leukemia cell line, J. Ethnopharmacol. 68 (1999) 121-127).

일반적으로, 칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3와 같이 파골세포가 분화하는 동안에 그 발현량이 증가하는 유전자들은 탄시논 ⅡA에 의해 보다 두드러지게 억제되며, 단핵의 파골세포가 다핵의 기능성 파골세포로 융합되는 것을 억제하기도 한다. 탄시논 ⅡA에 의한 유전자 발현 유도 및 세포 융합의 억제작용은 골수 전구세포에서 파골세포로의 분화에 그들의 부정적 효능에 대해 설명할 수 있게 해준다.

골 흡수를 위해 성숙한 파골세포는 골-흡수 파골세포에서 clear zone과 정확하게 일치하는 "액틴 고리"라 불리는 액틴 필라멘트의 고리화 구조를 생성한다(H.K. Vaananen, M. Horton, The osteoclast clear zone is a specialized cell-extracellular matrix adhesion structure, J. Cell Sci. 108 (1995) 2729-2732). 이 독특한 세포골격 조직은 활성화된 파골세포의 기능적 마커가 되는 것으로 생각된다(T. Suda et al., Regulation of osteoclast function, J. Bone Miner. Res. 12 (1997) 869-879; T.L. Burgess et al., The ligand for osteoprotegerin(OPGL) directly activates mature osteoclasts, J. Cell Biol. 145 (1999) 527-538). 따라서, 액틴 고리의 본질을 교란시키는 방법은 항-흡수성 약제 개발에 실질적으로 적용할 수도 있다.

탄시논 ⅡA는 RANKL에 의해 유도되는 액틴고리 생성을 붕괴한다. 액틴 고리 붕괴는 파골세포의 불활성을 유도한다. 실제로 탄시논 ⅡA는 시험관내에서 성숙한 파골세포에 의한 골 흡수를 현저하게 감소시킨다. 탄시논 ⅡA는 분화 및 파골세포 전구세포의 융합을 억제하고, 다핵의 성숙한 파골세포의 세포골격 구조를 붕괴함으로써 생체내에서 골격 손실을 감소시킨다.

파골세포 전구배양에서 RANKL(Receptor Activator of Nuclear Factor kappaB ligand)에 의존하는 파골세포 분화 동안에 일반적으로 상향조절되는 칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3 mRNA의 수준에서 상당한 질병을 유발한다. RANKL은 파골세포의 전구 세포에서 ERK, Akt 및 NF-κB 신호 전달 경로를 활성화하고, 탄시논 ⅡA는 이 활성을 억제한다. 또한, 탄시논 ⅡA는 액틴 고리를 파괴하여 분화된 파골세포의 골흡수 활성을 억제한다. 따라서, 탄시논 ⅡA는 파골세포의 수와 활성을 모두 감소하여 생체내에서 골흡수 질병을 개선하는 잠재력을 가진다.

또한, 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor; TNFR)의 하나이면서 상과(superfamily)에 속하는 RANK는 TNFR 및 다른 관련된 수용체들과 많은 신호전달 경로로 나뉜다. RANK의 촉진은 PI 3-키나아제/Akt, NF-kB 및 MAPK 신호전달 경로를 활성화한다. 골수 전구세포에서 파골세포로의 RANKL-driven 분화에서 PI 3-키나아제 및 Akt는 Src 계통의 키나아제들을 통해 활성화된다(B.R. Wong et al., TRANCE, a TNF family member, activates Akt/PKB through a signaling complex involving TRAF6 and c-Src, Mol. Cell 4 (1999) 1041-1049). 또한 ERK 경로는 파골세포 분화에서 중요한 역할을 한다(S.E. Lee et al., The phosphatidylinositol 3-kinase, p38, and extracellular signal-regulated kinase pathways are involved in osteoclast differentiation, Bone 30 (2002) 71-77). 탄시논 ⅡA는 RANKL 반응에서 Akt 및 ERK의 활성을 억제한다. RANKL 촉진은 JNK 활성 경로를 통한 AP-1 전사인자의 활성을 유도한다(H.-H. Kim et al., Receptor activator of NF-kappaB recruits multiple TRAF family adaptors and activates c-Jun N-terminal kinase, FEBS Lett. 443 (1999) 297-302; Z.H. Lee et al., Activation of c-Jun N-terminal kinase and activator protein 1 by receptor activator of nuclear factor kappaB, Mol. Pharmacol. 58 (2000) 1536-1545).

최근에, JNK 활성은 파골세포가 분화하는 동안에 RANKL에서 유도된 자가사멸로부터 골수세포를 방어하기 위해 골수 단핵세포로부터 효과적인 파골세포 분화를 위해 요구된다(J.P. David et al., JNK1 modulates osteoclastogenesis through both c-Jun phosphorylation-dependent and -independent mechanisms, J. Cell Sci. 115 (2002) 4317-4325). 그러나, 탄시논 ⅡA는 RANKL-촉진된 JNK 활성에 영향을 주지 않았다. 흥미롭게도, 탄시논 ⅡA는 RANKL 반응에서 p38의 활성을 증가시켰다. p38 MAPK는 내피세포에서 신규한 TNF-α-like cytokine 및 lysophosphatidylcholine에 의해 유도되는 자가사멸과 관련 있다는 사실이 보고되었다(T.L. Yue et al., TL1, a novel tumor necrosis factor-like cytokine, induces apoptosis in endothelial cells. Involvement of activation of stress protein kinases (stress-activated protein kinase and p38 mitogen-activated protein kinase) and caspase-3-like protease, J. Biol. Chem. 274 (1999) 1479-1486; M. Takahashi et al., Lysophosphatidylcholine induces apoptosis in human endothelial cells through a p38-mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism, Atherosclerosis 161 (2002) 387-394). 탄시논 ⅡA에 의한 p38의 활성화는 파골 전구세포의 자가사멸을 촉진하고, 그로 인해 파골세포의 분화를 억제하는 것이 가능하다(G. Franzoso et al., Requirement for NF-kappaB in osteoclast and B-cell development, Genes Dev. 11 (1997) 3482-3496; V. Iotsova et al., Osteopetrosis in mice lacking NF-kappaB1 and NF-kappaB2, Nat. Med. 3 (1997) 1285-1289). 탄시논 ⅡA 처리는 I-κB의 저하를 차단하고 RANKL에 의해 유도되는 NF-κB의 활성을 감소시킨다.

탄시논 ⅡA의 여러 가지 효능에 관한 분자 메카니즘은 아직 정의하기 어려우나, 본 발명에 의한 탄시논 ⅡA는 파골세포 분화, 융합, 액틴 고리 형성 및 골흡수를 억제한다. 또한, 탄시논 ⅡA는 칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3를 포함하는 파골세포와 관련된 유전자의 발현을 억제하고, 파골세포 전구체에서 RANKL의 발현을 억제함으로써, RANKL에 의해 유도되는 Akt, ERK 및 NF-κB의 활성을 차단한다.

이하, 실시예 및 시험예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1] 탄시논 ⅡA의 분리

Salvia miltiorrhiza(꿀풀과)의 뿌리인 Tanshen은 광주광역시 소재 진원당 제약에서 구입하였고 조선대학교 약학과 생약학 교실에서 엄밀한 감정을 거쳐 실험재료로 사용하였다. Tanshen(600g)을 상온에서 메탄올 1.8 L로 추출한 다음 감압농축하여 용매를 날리고 얻어진 메탄올 추출물을 물에 현탁한 후 CH₂Cl₂, EtOAc 및 n -BuOH로 차례로 분획하였다. 메틸렌 클로라이드 분획(5.7g)을 Hex-EtOAc = 10:1→8:1→5:1→2:1→1:1→1:2, MeOH only)의 혼합용매의 극성을 점진적으로 높여가면서 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 실시하였다. 컬럼크로마토그라피 결과 TLC 패턴을 기점으로 소분획 D1-D11로 나누었다. 각 소분획에 대한 활성을 검색한 결과 활성은 소분획 D2로 모아져 이 분획을 다시 Hex-EtOAc = 10:1의 용매를 사용하여 실리카젤 컬럼크로마토그라피를 실시하고, 얻어진 소분획 D2-1을 MeOH-H₂O = 7:1의 혼합용매와 LiChroprep RP-18을 이용하여 컬럼크로마토그라피를 실시하여 정제된 탄시논 ⅡA 0.1g을 얻었다. 탄시논 ⅡA의 UV, IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, MS를 포함하는 물리화학적 데이터는 문헌에 보고된 수치와 일치하여 분리한 화합물을 탄시논 IIA로 규명하였다.

C₁₉H₁₈O₄ (M.W. 294) orange needles in EtOAc; m.p. 206 ℃

¹H-NMR (CDCl₃, 125MHz) δ3.19 (m, H-1), 1.80 (m, H-2), 1.66 (m, H-3), 7.62 (d, J=8.0, H-6), 7.54 (d, J=8.0, H-7), 7.22 (d, J=1.0 Hz, H-15), 2.26 (s, H-17), 1.31 (s, H-18), 1.31 (s, H-19)

¹³C-NMR (CDCl₃, 125MHz) δ 29.8(C-1, t), 19.1(C-2, t), 37.9(C-3, t), 34.7(C-4, s), 150.1(C-5, s), 133.5(C-6, d), 119.9(C-7, d), 127.5(C-8, s), 126.5(C-9, s), 144.5(C-10, s), 183.7(C-11, s), 175.8(C-1, s), 121.2(C-13, s), 161.7(C-14, s), 141.3(C-15, d), 120.2(C-16, s), 8.8(C-17, q), 31.8(C-18, q), 31.8(C-19, q).

[시험예 1] 탄시논 ⅡA에 의한 파골세포 분화억제효과

본 발명에 의한 탄시논 ⅡA가 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보았다.

파골세포의 분화를 연구하는데 있어서 가장 큰 어려운 점은 현재까지 파골세포의 기능을 유지하고 있는 세포주가 확립되어 있지 않다는 것이다. 파골세포는 골수기원의 조혈모세포에서 기원하고 이들이 분화를 할 때 조골세포/기저세포의 도움을 받기 때문에 파골세포의 분화모델 시스템으로 골수세포와 조골세포의 상호배양 시스템이 많이 이용되고 있다. 본 시험예에서는 골수세포와 조골세포를 상호배양하여 골수세포가 파골세포로 분화되는 시스템을 조성하고 이 시스템에서 화합물 탄시논 ⅡA가 파골세포의 분화를 억제하는지를 실험하였다.

1) 조골세포의 분리

생후 1일인 ICR 마우스를 70% 에탄올에 넣어 소독한 후 가위와 핀셋을 이용하여 두개골을 분리하여 몇 조각으로 자른 후 3X HBSS가 들어있는 6cm 배양접시에 모은다. 여기에 0.1% 콜라겐분해효소(collagenase, Gibco BRL)와 0.2% 디스파제 (dispase; Boehringer Mannheim)를 넣고 37℃에서 15분간 5회 처리하였다. 2회 처리 시부터 얻은 세포를 수집하여 원심분리(1600rpm, 5분)하여 조골세포를 얻었다. 조골세포의 갯수가 약 1-2x10⁶이 되게 조절하여 10cm 배양접시에 옮겨 10% FBS가 함유된 α-MEM(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 15㎖에서 3일간 배양하였다. 배양 후 냉동 바이알에 분주하여 질소탱크에 냉동 보관하였다가 상호배양(co-culture) 실험에 사용하였다.

2) 골수세포의 분리

6주내지 7주령인 ICR 암컷 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후 70% 에탄올로 뒷다리 부위를 소독한 다음 경골(tibia)을 무균적으로 분리하였다. 분리한 경골을 3X HBSS(Gibco BRL)에 넣고 연조직을 깨끗하게 제거하였다. 상기 경골의 양쪽 끝을 자르고 1cc 주사기를 이용하여 1X α-MEM으로 골수에 주입하여 골수세포를 얻은 후에 수회 파이펫팅하여 골수세포를 충분히 풀어주었다. 그 후 원심분리(1600rpm, 5min)하여 상청액은 버리고 침전된 세포 성분(골수세포와 적혈구)을 획득하였다. 침전된 세포에 ACK 완충액(155 mM NH₄Cl, 11 mM KHCO₃, 0.01 mM EDTA) 약 15-20 ㎖을 2분간 처리하고, 인산완충용액을 첨가하여 골수세포의 손상을 최소한으로 줄이고 적혈구를 용해시켰다. 그 후 원심분리(1600rpm, 5분)하고 10%(v/v) 우태아 혈청(FBS ; Gibco BRL), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10ng/㎖ 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF; Peprotech EC, London, England)를 함유하는 α-MEM으로 세포를 현탁하였다.

3) 상호배양(Co-culture)

상기 분리 및 배양한 골수세포와 조골세포를 상호배양하였다. 각각 웰 (well)당 골수세포 1×10⁷개 및 조골세포 1×10⁶개가 되도록 조절하고 48웰 세포배양접시에서 10% FBS가 함유된 α-MEM에서 10^-8M VtD₃ 및 10^-6M PGE₂ 의 존재하에 5일간 배양하였다. 이때 탄시논 ⅡA를 2.5, 5, 10, 20㎍/㎖의 농도가 되도록 처리하였고, 탄시논 ⅡA를 처리하지 않은 경우를 대조군으로 하였다.

배양 후 분화가 끝난 파골세포가 있는 배양접시에서 배양액을 제거하고 세포를 고정하기 위하여 10% 포르말린으로 5분 동안 처리하였다. 포르말린을 제거하고 0.1% 트립톤 X-100(Triton X-100)을 10초 동안 처리하였다. 트립톤 X-100 용액을 제거하고, 백혈구 산 포스파타제 키트(leukocyte acid phosphatase kit; Sigma, cat. No. 387-A)를 사용하여 5분간 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)염색하였다. TRAP 염색용액을 제거하고 증류수로 2번 수세하고 건조시킨 다음 3 이상의 핵을 가지는 TRAP-양성 다핵 세포를 파골세포로 카운팅하여 TRAP-양성 다핵 세포의 수를 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

본 발명에 의한 탄시논 ⅡA가 파골세포 분화를 각각 64.67%, 89.11% 및 100% 억제하였고, 탄시논 ⅡA의 농도가 높아질수록 파골세포의 분화가 더욱 강하게 억제됨을 알 수 있었다(도 1B).

[시험예 2] 탄시논 ⅡA에 의한 파골세포 융합 억제 효과

골수세포는 37℃, 습도가 조절된 챔버(chamber)에서 24시간 동안 배양하였고, 비유착성(非癒着性) 세포는 비중액(Histopaque; Sigma) 구배에서 수집하고 분리하였다. 계면에서 세포를 채취하고, α-MEM/10% FBS에 1×10⁶ cells/㎖로 재현탁한 후 30ng/㎖ M-CSF 및 50ng/㎖ RANKL(Peprotech EC) 존재하에서 3일간 배양하였다. 이들 세포를 1시간동안 5, 10, 15, 20㎍/㎖ 농도의 탄시논 ⅡA로 전처리한 다음 30ng/㎖ M-CSF 및 100ng/㎖ RANKL(Peprotech EC)과 함께 12시간 동안 배양하였다. 세포들을 TRAP로 염색하고 TRAP-염색된 세포를 Giemsa 용액과 함께 5분간 배양한 후 1% 소듐 카보네이트(sodium carbonate)로 세척하여 핵을 염색하였다. 융합지수(fusion index)는 모든 RTAP-양성 세포에서 함유되는 핵 중에서 다핵(핵 수≥5) TRAP-양성 세포에서 함유되는 핵의 퍼센트로 산출하였다.

골흡수를 수행하기 위하여, 단일핵의 전융합 파골세포(pOCs)를 성숙한 다핵의 파골세포를 생성하는 각각 다른 것과 융합한 후(T. Suda, N. Takahashi, N. Udagawa, E. Jimi, M.T. Gillespie, T.J. Martin, Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families, Endocr. Rev. 20 (1999) 345-357), 탄시논 ⅡA가 파골세포의 융합에 미치는 영향을 조사하였다. 전융합 단일핵 TRAP-양성 pOCs를 30ng/㎖ M-CSF 및 50ng/㎖ RANKL의 존재하에 3일간 골수세포를 배양하여 얻었다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 탄시논 ⅡA가 복용량에 의존하여 OCLs에서 pOCs의 융합을 억제하는 것을 알 수 있었다. 실제로 세포 융합량을 산출할 때, 탄시논 ⅡA의 농도 20㎍/㎖에서 2.86배로 융합지수가 감소하였다(도 2B). 이러한 결과는 탄시논 ⅡA가 세포 융합을 감소시킴으로써 RANKL-의존 파골세포의 성숙을 조절할 수 있음을 알려준다.

[시험예 3] 파골세포에서 탄시논 ⅡA에 의한 액틴 고리 생성의 차단

1) 성숙한 파골세포의 배양

각각 웰 (well)당 골수세포 1×10⁷개 및 조골세포 1×10⁶개가 되도록 조절하고, 90-mm 48웰 세포배양접시에서 10% FBS가 함유된 α-MEM에서 10^-8M VtD₃ 및 10^-6 M PGE₂의 존재하에 6일간 배양하였다. 세포는 0.2% 콜라게나아제(collagenase; Wako Chemicals, Osaka, Japan)를 처리하여 37℃에서 10분간 분리하고, 60-mm 접시에 다시 도포한 후 또 하루동안 배양하였다. 37℃에서 15분간 이 접시들에 0.1% 콜라게나아제를 처리한 다음 수회 파이펫팅하여 조골세포를 제거하였다. 잔여 세포를 성숙한 파골세포로 간주하였다. 정제된 파골세포는 0.5% FBS를 함유하는 α-MEM으로 기아상태로 만들고 5, 10, 15, 20㎍/㎖ 농도의 탄시논 ⅡA를 전처리하고, 탄시논 ⅡA를 처리하지 않은 것을 대조군으로 한 다음 100ng/㎖ RANKL을 30분간 처리하였다. 세포 고정후 로다민 팔로이딘(rhodamine phalloidin)으로 염색하였다.

2) 액틴 고리 생성

파골세포는 F-액틴의 고리구조를 생성하여 밀봉구역을 생성해야만 한다. 따라서, 탄시논 ⅡA가 액틴 고리 생성에 어떠한 영향을 주는지 알아보았다. 성숙한 파골세포에서 고리구조를 보이는 F-액틴을 rhodamine-phalloidin으로 염색하여 상호배양에서 분리하였다(도 3A). 파골세포가 RANKL로 처리되었을 때, 액틴 고리간의 간격이 밀집되고 투명하게 보이는 가장자리가 매끄러워졌다(도 3B). 그러나, 탄시논 ⅡA를 처리하면 탄시논 ⅡA의 농도에 비례하여 고리 구조에서 RANKL의 효과를 폐지하였다(도 3C-F). 액틴 고리는 탄시논 ⅡA의 존재하에서 풀리고 흐릿해졌다.

[시험예 4] 탄시논 ⅡA에 의한 파골세포의 골 흡수 활성 억제

골흡수 함요 분석(Resorption pit assay)을 이용하여 탄시논 ⅡA가 파골세포의 골 흡수 활성에 미치는 영향을 조사하였다.

성숙한 파골세포는 골수 세포 및 두개관 세포를 함께 6일간 배양하여 얻었다. 조(crude) 파골세포를 96-well 배양기에 넣고 탄시논 ⅡA를 20시간동안 처리한 상아 절편 위에서 다시 배양하였다. 배양 기간 후 부착된 세포를 면 함요로 문질러 배양기에서 완전히 제거하였고, 재흡수 함유는 헤마톡실린 용액(Hematoxylin solution; Sigma)으로 염색하여 시각화하였다. 40X 배율에서 광학현미경으로 사진을 찍었으며, 재흡수 함요의 총 면적은 Image Pro-Plus 프로그램 버전 4.0(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)으로 분석하였다.

분화된 다핵의 파골세포는 형태적 및 기능적 분극화를 일으키고 무기질 골 표면에서 재흡수되기 시작한다. 탄시논 ⅡA가 성숙한 파골세포의 골흡수 활성에 미치는 영향을 알아보았다.

정제된 성숙한 파골세포를 상아 절편 위에 놓고, 탄시논 ⅡA의 농도를 0, 5, 10, 15, 20㎍/㎖으로 조절하여 24시간 동안 배양한 후 골흡수 량을 조사하였다. 탄시논 ⅡA의 존재하에서 골흡수는 탄시논 ⅡA의 복용량에 비례하여 억제되었으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이상의 결과로, 탄시논 ⅡA는 파골세포의 분화 및 성숙뿐만이 아니라 성숙한 파골세포의 골흡수 활성도 억제함을 알 수 있었다.

[시험예 5] 파골세포 분화와 관련된 유전자에서 탄시논 ⅡA의 영향

파골세포의 분화에서 탄시논 ⅡA의 효능에 대한 메카니즘으로 통찰해 보기 위해, 파골 반응동안에 유도되는 유전자의 발현 레벨을 연구하였다. 골수 대식세포로부터 분리한 파골세포의 전구체를 20㎍/㎖ 탄시논 ⅡA의 존재하에 또는 부재하에 M-CSF 및 RANKL과 함께 배양한 후 전체 RNA는 1, 3, 6일에 걸쳐 얻었고, 유전자 발현량의 변화는 RT-PCR로 평가하였다.

1) RT-PCR 분석

TRI 시약을 사용하여 준비한 총 RNA의 2㎍을 SuperScriptⅡ 역전사효소(Gibco BRL)로 역전사하였다. 역전사된 c-DNA의 10%를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다: integrin β3, 5'-TGACTCGGACTGGACTGGCTA-3'(서열번호 1) 및 5'-CACTCAGGCTCTTCCACCACA-3'(서열번호 2); TRAF6, 5' gctcaaacggaccattcgga 3'(서열번호 3) 및 5' GGGATTGTGGGTCGCTGAAA 3'(서열번호 4); carbonic anhydrase II, 5' CTCTCAGGACAATGCAGTGCTGA 3'(서열번호 5) 및 5' atccaggtcacacattccagca 3'(서열번호 6); calcitonin receptor, 5' ACCGACGAGCAACGCCTACGC 3'(서열번호 7) 및 5' GCCTTCACAGCCTTCAGGTAC 3'(서열번호 8); c-Src, 5' ccaggctgaggagtggtact 3'(서열번호 9) 및 5' cagcttgcggatcttgtagt 3'(서열번호 10); RANK; 5' CACAGACAAATGCAAACCTTG 3'(서열번호 11) 및 5' GTGTTCTGGAACCTATCTTCCTCC 3'(서열번호 12); GAPDH, 5'-ACTTTGTCAAGCTCATTTCC-3'(서열번호 13) 및 5'-TGCAGCGAACTTTATTGATG-3'(서열번호 14). PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 30초간 확장하는 사이클을 22-25회 반복하였다. PCR 생성물은 1.2-2.0% 아가로오스 겔로 분리하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다.

2) 결과

칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3 유전자의 큰 유도는 모든 분화 기간내에 관찰되었다(도 5; 2, 4, 5 패널). 배양시 탄시논 ⅡA를 첨가한 경우에는 칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3의 발현이 강하게 저해되었다(도 5; 2, 4, 5 패널 및 lanes 4, 5 및 6). 분화하는 동안에 탈탄산효소(carbonic anhydrase Ⅱ)의 발현만이 적당히 증가하였고, TRAF6 및 RANK의 mRNA 레벨은 거의 변화를 보이지 않았다. 탄시논 ⅡA는 이들 유전자의 발현을 약하게 억제하는 결과를 보였다(도 5; 1, 3, 6 패널). 따라서, 탄시논 ⅡA는 파골세포가 분화하는 동안에 유도되는 유전자들을 조절하는 탁월한 효능을 가짐을 알 수 있었다.

[시험예 6] 탄시논 ⅡA가 처리된 파골세포 전구체 내에서 RANK에서 Akt, ERK 및 NF-kB로의 신호전달 억제

먼저, 파골세포의 분화에서 PI 3-kinase/Akt, ERK, p38 및 JNK의 관련에 대한 증거를 제공하였다(S.E. Lee, K.M. Woo, S.Y. Kim, H.M. Kim, K. Kwack, Z.H. Lee, H.-H. Kim, The phosphatidylinositol 3-kinase, p38, and extracellular signal-regulated kinase pathways are involved in osteoclast differentiation, Bone 30 (2002) 71-77; Z.H. Lee, K. Kwack, K.K. Kim, S.H. Lee, H.H. Kim, Activation of c-Jun N-terminal kinase and activator protein 1 by receptor activator of nuclear factor kappaB, Mol. Pharmacol. 58 (2000) 1536-1545). 따라서, Akt, ERK, p38 및 JNK 신호전달 경로는 골-재흡수 질병의 여러 가지에서 치료적 타겟으로 나타났다. 본 발명에서는 탄시논 ⅡA가 이들 키나아제를 포함하는 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에서는 0.1% FBS를 함유하는 배지에서 5시간동안 혈청에서 골수 대식세포를 제거하고, 30분간 탄시논 ⅡA 20㎍/㎖로 전처리한 후 0, 5, 15, 30 분간 100ng/m. RANKL로 자극하였다. 세포 용균액을 다음과 같이 Western blotting 하였다: 세포는 20mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 및 프로테아제(protease) 및 포스파테아제 억제제(phosphatase inhibitors)를 함유하는 완충액에서 용균하였다. 세포 단백질의 용균액(30-40㎍)을 10% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드막(polyvinylidene difluoride membrane; Millipore, Bedford, MA)으로 전달하였다. 5% 탈지유로 차단한 후, 막을 anti-phospho Akt, ERK, JNK, and p38 및 anti-I-kB(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)로 정밀조사하였다. 같은 막을 제거하고 anti-Akt, ERK, JNK, p38 및 액틴(Cell Signaling Technology)으로 재조사하였다.

파골세포가 RANKL에 의해 자극받을 경우, Akt, ERK, JNK 및 p38의 인산화반응이 증가하였다. 탄시논 ⅡA의 처리는 RANKL에 의해 유도되는 Akt 및 ERK의 인산화반응을 차단하였다(도 6; 1, 3 패널). 한편으로는 탄시논 ⅡA가 JNK의 인산화반응에 영향을 미치지 못하였고, p38의 인산화반응은 급격히 감소하였다(도 6; 5, 7 패널).

NF-κB 경로의 활성은 파골세포 분화에 필수적이다(G. Franzoso, L. Carlson, L. Xing, L. Poljak, E.W. Shores, K.D. Brown, A. Leonardi, T. Tran, B.F. Boyce, U. Siebenlist, Requirement for NF-kappaB in osteoclast and B-cell development, Genes Dev. 11 (1997) 3482-3496). NF-κB을 활성화하기 위해, I-κB가 인산화반응을 통해 감소시켜야 한다. 파골세포 전구체가 RANKL에 의해 자극을 받을 경우, 처리후 5-15분 사이에 I-κB의 저하가 발생하였다(도 7A; lanes 2-3). 정제된 파골세포 전구체에 탄시논 ⅡA를 첨가하면 RANKL에 의해 유도되는 I-κB 저하를 막는다(도 7A; lanes 6-7).

또한 파골세포 전구체에서 관찰되는 NF-κB의 활성을 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)로 평가하였다. EMSA는 종래의 통상적인 방법으로 수행하였다(S.E. Lee, W.J. Chung, H.B. Kwak, C.H. Chung, K.B. Kwack, Z.H. Lee, H.H. Kim, Tumor necrosis factor-alpha supports the survival of osteoclasts through the activation of Akt and ERK, J. Biol. Chem. 276 (2001) 49343-49349). 세포는 0.6% NP-40를 함유하는 저장성 완충액(hypotonic buffer; 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF)에서 용균하고 4000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이 펠렛은 고염도 완충액(high salt buffer; 20 mM HEPES, pH 7.9, 420 mM NaCl, 25% glycerol, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM DTT) 15㎕에서 20분간 냉각하여 용균하였다. 저장 완충액(20 mM HEPES, pH 7.9, 100 mM NaCl, 20% glycerol, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM DTT) 75㎕를 첨가한 후, 샘플을 볼텍싱(vortexing)으로 10초간 교반한 다음, 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 핵 추출물(10㎍)을 ³²P로 라벨된 NF-B 결합 부위 올리고머 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 대략 20,000 cpm으로 20℃에서 30분간 배양하였다. DNA가 결합된 NF-B 단백질은 4-5% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 거쳐 방사선사진으로 확인하였다.

그 결과, 파골세포 전구체에서 관찰되는 NF-κB의 활성은 15분동안 RANKL에 의해 자극을 받았다(도 7B; lane 3과 lane 7 대비). 상기 결과에서 살펴본 바와 같이, 탄시논 IIA는 파골세포 분화와 관련된 다수의 신호전달 경로를 차단하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 파골세포 분화의 억제 과정에서 탄시논 ⅡA의 효능은 Akt, NF-κB 및 MAPKs을 활성화하기 위한 RANK에 의한 신호전달에서의 장애로부터 초래되는 결과이다.

요약에서, 약초인 Salvia miltiorrhiza에서 정제한 화합물인 탄시논 ⅡA는 파골세포의 분화 및 골 흡수를 억제하였다. 또한 탄시논 ⅡA는 분화하는 동안에 파골세포의 전구세포의 융합을 억제하였다. 따라서, 탄시논 ⅡA는 골다공증, 골 부식성 류마티스 관절염 및 치주질환 등의 골흡수 질병의 치료를 위한 약제 개발용 물질이 될 것이다.

도 1은 파골세포 분화에서 탄시논 ⅡA의 효능을 보여주는 광학현미경 사진 및 그래프이다.

도 2는 탄시논 ⅡA에 의해 파골세포의 세포융합이 억제되는 것을 보여주는 광학현미경 사진 및 그래프이다(* p<0.05, 대조군과 현저한 차이를 보인다).

도 3은 탄시논 ⅡA에 의해 액틴고리 생성이 억제되는 것을 보여주는 광학현미경 사진이다(* p<0.05, 대조군과 현저한 차이를 보인다).

도 4는 탄시논 ⅡA에 의해 파골세포의 골흡수 활성이 억제되는 것을 보여주는 광학현미경 사진 및 그래프이다.

도 5는 파골세포의 전구세포로부터 파골세포가 형성되는 동안에 RANKL-유도된 유전자 발현에 탄시논 ⅡA가 미치는 영향을 보여준다(* p<0.05, 대조군과 현저한 차이를 보인다).

도 6은 파골세포의 전구세포에서 RANKL에 의해 유도되는 Akt 및 ERK 활성에 탄시논 ⅡA가 미치는 영향을 보여준다.

도 7은 파골세포의 전구세포에서 RANKL에 의해 유도되는 NF-κB 활성에 탄시논 ⅡA가 미치는 영향을 보여준다.

<110> Chunsun University Co., Ltd. <120> Tanshinone IIA inhibiting osteoclast differentiation and bone resorption <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 1 tgactcggac tggactggct a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 2 cactcaggct cttccaccac a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 3 gctcaaacgg accattcgga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 4 gggattgtgg gtcgctgaaa 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 5 ctctcaggac aatgcagtgc tga 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 6 atccaggtca cacattccag ca 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 7 accgacgagc aacgcctacg c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 8 gccttcacag ccttcaggta c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 9 ccaggctgag gagtggtact 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 10 cagcttgcgg atcttgtagt 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 11 cacagacaaa tgcaaacctt g 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 12 gtgttctgga acctatcttc ctcc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 13 actttgtcaa gctcatttcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplification primer for amplifying the gene of strains of ICR mouse <400> 14 tgcagcgaac tttattgatg 20

Claims (5)

1. 삭제
2. 꿀풀과에 속하는 Salvia miltiorrhiza 분게(Bunge)에서 기원하고 파골세포의 분화 및 골흡수를 억제하는 하기 화학식 1로 표시되는 탄시논 ⅡA를 유효성분으로 함유하며,

   골다공증, 파제트병(Paget's disease) 및 치주질환(periodontal disease)으로 이루어진 군에서 선택된 골-흡수 질환을 치료하기 위한 조성물:

   [화학식 1]
3. 제 2항에 있어서, 상기 탄시논 ⅡA는 칼시토닌 수용체, c-Src 및 인테그린 β3의 발현을 억제하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 탄시논 ⅡA는 파골세포 전구체에서 RANKL의 발현을 억제함으로써, RANKL에 의해 유도되는 Akt, ERK 및 NF-κB의 활성을 차단하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제