KR20120028400A

KR20120028400A - 카나비노이드의 새로운 용도

Info

Publication number: KR20120028400A
Application number: KR1020127003649A
Authority: KR
Inventors: 제프리 가이; 로저 페르트위
Original assignee: 지더블유 파마 리미티드
Priority date: 2004-11-16
Filing date: 2005-11-15
Publication date: 2012-03-22
Also published as: GB2434097A; CN101060836B; KR101221505B1; CN104800205A; IL183101A0; KR20090116831A; JP2012051918A; GB2434097B; PL383073A1; US20160220529A1; IL183101A; US9669002B2; GB0515704D0; JP4934048B2; GB2434097C; JP2008520559A; CN101060836A; BRPI0518011A; GB0425248D0; NZ554868A

Abstract

본 발명은 카나비노이드 수용체인 CB₁의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 및 병리현상의 치료를 위한 약제 제조에 이용되는 카나비노이드(cannabinoid)의 하나 또는 그 이상의 용도에 관한 것이다. 상기 카나비노이드는 바람직하게는 테트라하이드로카나비노이드(THCV: tetrahydrocannabivarin)이다. 상기 CB₁의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 및 병리현상은 다음의 군으로부터 선택되어 치료될 수 있다: 비만증, 정신분열증, 간질, 알츠하이머같은 인지장애, 골격장애, 폭식증, 제2형 당뇨병(인슐린 비-의존성 당뇨병)과 관련된 비만증 및 약물, 알코올 및 니코틴 남용 또는 의존증.

Description

카나비노이드의 새로운 용도{NEW USE FOR CANNABINOID}

본 발명은 질병 및 CB₁ 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용(neutral antagonism)에 의한 병리현상의 치료를 위한 약제 제조에 이용되는 카나비노이드(cannabinoids)의 하나 또는 그 이상의 용도에 관한 것이다.

많이 알려진 바와 같이, 카나비노이드의 작용은 카나비노이드 수용체와 그들의 상호작용의 특징이라고 볼 수 있다. 카나비노이드 수용체가 포유류계에 존재한다는 것을 발견함으로써 더 많은 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 주로 중앙 신경계(nerve system)에 있는 G-단백질(protein) 연결 수용체의 분류가 알려졌고, 이는 CB₁ 수용체라 명명되었다.

다른 타입의 G-단백질 연결 수용체로는 면역계(immune system)에서 발견된 CB₂ 수용체가 있다. 카나비노이드는 일반적으로 카나비노이드 작동체(agonist)이며, 이것은 카나비노이드가 카나비노이드 수용체와 결합하여 이를 활성화한다는 것을 의미한다.

잘 알려진 바와 같이, 카나비노이드 수용체 작동체는 종래 식물에서 유래된 카나비노이드 델타-9 테트라하이드로카나비놀(THC: tetrahydrocannabinol), 종래에 없던 카나비노이드 수용체 작동체 R-(+)-WIN55212 및 에이코사노이드(eicosanoid) 또는 동물에서 유래된 카나비노이드 수용체 작동체 아난다마이드(anandamide)를 포함한다. 상기 모든 화합물은 CB₁ 수용체에 결합한다는 것을 보여 준다.

수용체의 작동체는 종종 세포에 의해 활성 반응을 하게 한다. 많은 질병들이 그 수용체의 작동체의 과도한 활성화 또는 과잉으로 인해 발생한다.

연구는 카나비노이드 수용체와 카나비노이드 수용체 길항제로 알려진 일련의 화합물의 발견에 대해 밝히고 있다. 카나비노이드 수용체의 경쟁적 길항제는 수용체와 결합되지만, 세포의 반응을 유도하지는 않는다. 역작동체(inverse agonist)는 작동체가 산출하는 반응에 상반된 효과를 산출하기 위하여 수용체에 작용한다.

화합물 SR141716A(EP0576357 참조)는 CB₁ 카나비노이드 수용체에 길항작용을 하는 것으로 보여진다. 그러나 SR141716A가 비활성 또는 중립성 길항제라기보다는 역작동체라는 증거(Pertwee, R.G., 2003 참조)가 있다.

Maruani와 Soubrie는 US 6,444,474와 EP0969835에서 친화력 장애(appetency disorders)의 조절에 있어서 SR141716A 같은 CB₁ 수용체 역작동체의 사용에 대해 기재하고 있다.

CB₁을 포함하는 많은 분석 시스템에서, SR141716A 자체가 THC 같은 CB₁ 작동체에 의해 산출되는 효과들과 반대되는 효과를 생산한다. 그러므로 이는 CB₁ 수용체의 역작동체라 추론할 수 있다. 어떤 경우에 이는 내생적 CB₁ 작동체(분석 시스템 자체에 의한 CB₁ 작동체)의 길항작용(antagonism)을 반영하고 있다고 볼 수 있는 반면에, 다른 경우에는 CB₁ 수용체가 항시활성(constitutively active)이 있다고 생각되어 지기도 한다.

일반적으로 항시활성 수용체는 투여된 혹은 내생적인 어떤 작동체가 없더라도 촉발작용(trigger effect)을 한다고 여겨진다. 역작동체가 대항함에도 불구하고 작동체는 상기 활성을 촉진시킨다.

반대로 중립성 길항제는 항시활성에 아무런 변화를 주지 않는다. 중립성 길항제는 아난다마이드 또는 투여된 작동체와 같이, 내생적으로 제조된 CB₁ 작동체와 상호작용하는 수용체의 능력만 막기 때문에 역작동체에 비하여 선호된다.

내생적 CB₁ 작동체, 아난다마이드는 음식 섭취와 식욕 같은 과정을 조정하기 위해 뇌에서 분비된다는 증거(Di Marzo et al., 2001 참조)가 있다. 이 수용체의 길항제는 식욕 억제제로 임상에서 효과가 있을 수 있다는 가능성을 높여 준다.

화합물 SR141716A는 활성화되지 못하도록 CB₁ 카나비노이드 수용체와 결합한다. CB₁ 수용체계(receptor system)를 차단하는 것은 감정, 수면 및 진통 경감 같은 CB₁의 부정적인 면을 조정할 수도 있다는 것을 의미한다. 엔도카나비노이드(endocannabinoid)는 신경보호제와 항산화기능을 갖고 있기 때문에, SR141716A의 이용자는 암 또는 뇌졸중의 위험이 높아질 수 있다.

중립성 CB₁ 수용체 길항제는 역작동체에 비해 약학적으로 덜 복잡한 경향이 있다. 따라서 길항제같이 자체적으로 투여될 때에는 끊임없이 CB₁ 수용체에 내생적 카나비노이드를 분비하는 카나비노이드계(system)의 영역에만 영향을 미치고, 구조적인 활성 CB₁ 수용체의 카나비노이드 시스템의 일부분에서 일어나는 내생적 카나비노이드계(system)의 활성에는 영향을 미치지 않는다.

CB₁ 수용체 길항제, 특히 중립성 CB₁ 수용체 길항제 같은 것은 CB₁ 수용체의 상호작용에 의해 발생한 질병 또는 병리현상의 치료에 효과적이다. 예를 들어, 그러한 질병 및 병리 현상에는 비만증, 정신분열증, 간질, 알츠하이머 같은 인지장애, 골격장애, 폭식증, 제2형 당뇨병(인슐린 비-의존성 당뇨병)과 관련된 비만증 및 약물, 알코올 및 니코틴 남용 또는 의존증 등이 있다(Pertwee, R.G., 2000 참조).

CB₁ 수용체 항시 활성의 결과(consequences)를 증가시키지 않아 부작용이 덜 있는 것 같기 때문에, 역작동체 대신에 중립성 길항제를 사용하는 것이 특히 효과적일 수 있다.

현재 알려진 중립 CB₁ 수용체 길항제는 거의 없다. 향정신성 카나비노이드 THC의 유사체(analogue)는 시험관 내 조건(in vitro)에서 중립성 CB₁ 길항제처럼 활동하는 것을 제조하여 왔다(Martin, B.R. et al., 2002 참조). 화합물, O-2050은 델타-8-테트라하이드로카나비놀(tetrahydrocannabinol)의 설폰아마이드(sulphonamide) 유사체이며, 곁사슬과 결합된 아세틸렌(acetylene)이 있다.

상기 유사체는 쥐의 정관에서 중립성 CB₁ 수용체 길항제처럼 활동한다. 그러나 O-2050은 쥐의 생체 내(in vivo)에서 CB₁ 수용체 길항제처럼 활동하지 않으며 CB₁ 수용체 작동체의 작용과 같이, 쥐의 자연(spontaneous) 활성을 저하시킨다. 또한 R = 에틸기(ethyl) 또는 R = 부틸기(butyl)가 있는 O-2050의 유사체는 쥐의 생체 내에서 전형적인 CB₁ 수용체 작동체처럼 활동한다.

놀랍게도 출원인은 카나비노이드 테트라하이드로카나비바린(THCV: tetrahydrocannabivarin)이 CB₁ 과 CB₂ 카나비노이드 수용체의 중립성 길항제라는 것을 밝히고 있다.

카나비노이드 THCV는 종래의 식물 카나비노이드로서, 구조적으로 THC와 관련되어 있으며, THC의 3-펜틸기(pentyl) 곁사슬이라는 점에서, THCV 분자는 3-프로필기(propyl) 곁사슬을 가지고 있다. 두 카나비노이드의 구조는 도면 1에 나타나있다.

THCV가 CB₁ 수용체의 중립성 길항제로 활동한다는 발견은 THC가 CB₁ 작동체로 알려져 있었기 때문에 매우 놀라우며, 따라서 THCV 같이 구조적으로 관련이 있는 화합물은 또한 길항제라기 보다는 작동체라고 할 수 있다.

본 발명의 목적은 CB₁ 수용체의 중립 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료를 위한 약제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비만증, 정신분열증, 간질 또는 알츠하이머같은 인지장애, 골격장애, 폭식증, 타입 당뇨병(인슐린 비-의존성 당뇨병) 및 관련된 비만증 및 약물, 알코올 및 니코틴 남용 또는 의존증의 치료를 위한 약제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CB₁ 수용체의 중립 길항작용에 따른 식욕 억제제를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 CB₁ 수용체의 중립 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료를 위한 약제의 제조에서 THCV의 용도를 제공한다.

본 발명의 또한 치료적으로 유효량의 THCV를 대상에게 투여하는 것으로 구성되는, THCV를 CB₁ 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 더 나아가 유효량의 THCV를 대상에 투여하는 것으로 구성되는 식욕 억제를 하는 것을 포함하여 미용학적으로 체중 감소의 효과를 볼 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 아울러 하나 또는 그 이상의 타입의 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료에 이용할 수 있는 약제의 제조하기 위한 중립 카나비노이드 수용체 길항제의 용도를 제공한다.

본원발명의 THCV는 CB₁ 수용체에 대한 역작용제가 아니라, 중립적 길항제이기 때문에, 길항제같이 자체적으로 투여될 때에는 끊임없이 CB₁ 수용체에 내생적 카나비노이드를 분비하는 카나비노이드계(system)의 영역에만 영향을 미치고, 구조적인 활성 CB₁ 수용체의 카나비노이드 시스템의 일부분에서 일어나는 내생적 카나비노이드계(system)의 활성에는 영향을 미치지 않아, CB₁ 수용체 항시 활성의 결과(consequences)를 증가시키지 않아 부작용이 덜 있는 것 같기 때문에, 역작동체 대신에 중립성 길항제를 사용하는 것이 특히 효과적일 수 있다. 이런 이유로 CB1 수용체에 대한 중립적 길항제를 찾으려는 노력들이 경주되어 왔으나, 아직까지 그러한 물질은 보고된 바 없다. 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 THCV가 CB1 수용체에 대한 중립적 길항작용을 갖고 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

도면 1은 카나비노이드 THCV와 THC의 2차원 구조를 보여주고 있다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 첫 번째 관점에 따르면, CB₁ 수용체의 중립 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료를 위한 약제의 제조에서 THCV의 용도를 제공한다.

바람직하게는 THCV는 비만증, 정신분열증, 간질 또는 알츠하이머같은 인지장애, 골격장애, 폭식증, 제2형 당뇨병(인슐린 비-의존성 당뇨병) 및 관련된 비만증 및 약물, 알코올 및 니코틴 남용 또는 의존증의 치료를 위한 약제의 제조에 이용된다.

더욱 바람직하게는 THCV는 식욕 억제제로 이용을 위한 약제의 제조에 이용된다.

중립성 길항제는 역작동체보다 부작용이 덜하다. 이는 약물로 인한 CB₁ 수용체의 활동에 대항하리라 예상할 수 있지만 구조적으로 활성이 있는 CB₁ 수용체에 의해 감쇠효과(attenuate effect)가 나타나지 않기 때문이다.

반대로, 역작동체는 약물로 인한 CB₁ 수용체의 활성에 의해서 뿐만이 아니라, 항시활성 CB₁ 수용체에 의해서도 감쇠효과가 나타날 수 있으며 중립성 길항제보다 훨씬 많은 부작용을 낳을 것으로 예상된다.

그러므로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 THCV를 CB₁ 수용체의 역작동체로 작용하는 어떤 물질 또는 화합물의 실질적인 부재시 사용될 수 있다.

THCV와 관련하여, 특히 치료를 위한 이용과 관련하여, THCV는 그러한 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고 있다고 이해될 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는 약제학적으로 허용 가능한 무기염(base) 또는 산(acid) 및 유기염 또는 산을 포함하는, 비독성 염 또는 산에서 제조된 염 또는 에스테르(ester)를 말하며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 많은 가능한 무기 및 유기염이 당업계에 많이 알려져 있다.

또한 본 발명의 유효 범위는 중립성 CB₁ 수용체 길항작용의 요구되는(desired) 활성을 가진 THCV의 유도체까지 확장된다. 실제로 출발물질 또는 바람직하게 향상된 활성과 동일한 활성을 가진 유도체는 당업계에 잘 알려진 의약 화학의 표준 원리에 따라 생산될 수 있다. 그러한 유도체는 치료에 효과적일 수 있도록 충분한 활성을 가지는 한, 출발물질보다 더 적은 정도의 활성을 보여줄 것이다. 유도체는 약학적 활성제 같이 다른 특성, 예를 들어 향상된 용해도, 감소된 독성, 향상된 흡수력(uptake)에 있어 향상을 보여줄 것이다.

바람직하게는 THCV는 최소한 하나의 대마초 식물(cannabis plant)의 추출물이다.

더욱 바람직하게는 THCV 추출물은 적어도 하나의 대마초 식물에서 유래한 식물성 약제 제형이다.

실시예에서 최소한 하나의 대마초 식물에서 유래한 THCV 추출물은 초임계(supercritical) 혹은 아임계(subcritical)의 CO₂와 함께 추출되어 제조된다.

선택적으로 THCV는 최소한 하나의 대마초(cannbis)에서 추출된다. 식물은 식물 물질이 식물 물질에서 하나 또는 그 이상의 카나비노이드가 휘발될 수 있고, 추출물을 형성할 수 있을 만큼 증기를 응축시킬 수 있을 정도인 100℃ 이상에서 가열된 가스와 접촉함으로써 생산된다.

바람직하게는 최소한 하나의 대마초 식물에서 추출된 THCV 추출물은 자연적으로 식물에서 발생한 모든 카나비노이드를 포함한다.

선택적으로 THCV는 실질적으로 순수한 혹은 분리된 형태이다.

HPLC 프로파일의 영역 표준화에 정의된 것처럼, 카나비오니드의 "실질적으로 순수한" 제조는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 99.5% 이상의 색층분석 순도(요구되는 카나비노이드의)를 가지는 것으로 정의된다.

바람직하게는 본 발명에서 이용된 실질적으로 순수한 THCV는 어떤 다른 자연적인 발생 또는 합성 카나비노이드를 자연적으로 대마초 식물에서 발생하는 카나비노이드가 포함되지 않은 것이다. 이 문단에서 "실질적으로 포함되지 않은(substantially free)"이란 말은 THCV 이외에 카나비노이드가 HPLC에 의해 검출될 수 없다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 관점에서 THCV는 합성 형태이다.

바람직하게는 THCV는 약제학적 화합물로 명시되며, 나아가 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제 또는 희석제를 포함한다.

또한 본 발명은 THCV, 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 그 유도체, 약제학적 조제로 조직된 형태, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정제, 가용제 등과 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 약제학적 제제로 제제화된다. 제제는 아마도 pH, 삼투압 농도, 맛, 점성, 멸균, 지방친화도, 용해도 등등의 조건을 조절하기 위하여 다른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 희석제, 담체 또는 첨가제의 선택은 요구되는 제제 형태에 따라 결정되며, 다시 환자에 투약하는 방법에 따라 결정되게 된다.

제한은 없으나, 적합한 제제 형태는 예를 들면, 정제, 캡슐(capsule), 파우더, 과립, 캡슐(cachets) 및 좌약 같은 고체 형태를 포함하며, 약효가 지속되며 지연 방출 형태를 포함한다. 파우더와 정제는 일반적으로 약 5%~70% 활성 유효성분을 포함하고 있다. 적합한 고체 담체와 첨가제는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며, 탄산 마그네슘, 스테아린산 마그네슘, 탈크, 당, 락토오스 등을 포함한다. 정제, 파우더, 캡슐(capsule) 및 교갑(cachets)은 경구 복용을 위한 제제 형태에 적합하다.

액체 제제는 용액제(solution), 현탁제(suspension) 및 유제(emulsion)를 포함한다. 액체형태 조제약은 정맥, 대뇌내 출혈(intracerebral), 복강내(intraperitoneal), 비경구적(parenteral) 또는 근육 주사 또는 주입(infusion)에 의해 투여된다. 멸균 주사 제제는 비독성, 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 용액제의 활성제의 멸균 용액제 또는 현탁제를 포함한다. 또한 액체 제제는 비강용, 구강용 및 혀 밑 투여용 용액제 또는 스프레이를 포함한다. 흡입용으로 적합한 에어로졸 조제약은 용액제와 활성이 없는 압축 가스 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 결합된 파우더 형태의 고체를 포함한다.

또한 경피성(transdermal administration) 제제로는 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 유제가 포함될 수 있다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 상기 제제는 매트릭스(matrix) 또는 저장(reservoir) 타입의 경피성 패치를 포함한다.

약제학적 제조약은 약제학적 조제약의 기준 절차에 따라, 유닛 제조 형태로 편리하게 제조될 수 있다. 투약(unit dose)당 활성 화합물의 분량은 활성 화합물의 특성과 의도된 제조 방법에 따라 다양하다. 일반적으로는 0.1 mg-1000 mg 범위이다.

본 발명의 두 번째 관점에 따르면, 치료적으로 유효량의 THCV를 대상에게 투여하는 것으로 구성되는, THCV를 CB₁ 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료 방법을 제공한다.

치료될 수 있는 질병 또는 병리현상은 비만증, 정신분열증, 간질 또는 알츠하이머같은 인지장애, 골격장애, 폭식증, 제2형 당뇨병(인슐린 비-의존성 당뇨병)과 관련된 비만증 또는 약물, 알코올 또는 니코틴 남용 또는 의존증 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 세 번째 관점에 따르면, 본 발명은 유효량의 THCV를 대상에 투여하는 것으로 구성되는 식욕 억제를 하는 것을 포함하여 미용학적으로 체중 감소의 효과를 볼 수 있는 방법을 제공한다.

어떤 환경에서는 식욕 억제제가 대상에게 의학적 또는 치료학적으로 문제를 발생시키지 않고, 인간 대상의 미용을 위한 체중 감소를 성취하는데 유용하다. 이 문맥에서 식욕 억제제의 복용은 대상의 의학적 또는 치료학적인 방법으로 해석되지 않는다.

본 발명의 네 번째 관점에 따르면, 하나 또는 그 이상의 타입의 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료에 이용할 수 있는 약제의 제조하기 위한 중립 카나비노이드 수용체 길항제의 용도를 제공한다.

바람직하게는 중립성 카나비노이드 수용체 길항제는 CB₁ 카나비노이드 수용체의 중립 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료에 이용할 수 있는 약제의 제조에 이용되며, CB₁ 수용체의 카나비노이드 수용체 길항제의 해리상수는 대략 75 nM이다.

바람직하게는 중립성 카나비노이드 수용체 길항제는 CB₂ 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용에 의해 이득을 얻는 질병 또는 병리현상의 치료에 이용할 수 있는 약제의 제조에 이용되며, CB₂ 수용체의 카나비노이드 수용체 길항제의 해리상수는 대략 62 nM이다.

"대략(approximately)"는 오차범위 ±10%를 나타낸다.

본 발명의 몇몇 관점이 하기 도면 및 실시예를 참조로 하여 더 설명되어 있다:

실시예 1 : 카나비노이드 THCV 가 카나비노이드 CB ₁ 또는 CB ₂ 수용체에 미치는 영향에 대한 조사

CB₂ 수용체보다 CB₁ 수용체의 밀도가 더 높은 세포막은 건강한 뇌 조직에서 준비되어 실험이 이루어졌다(Howlett et al. 2002 참조).

이후 hCB₂ 수용체가 형질 감염된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 가지고 실험을 수행하였다. 상기 세포막은[³H]CP55940 CB₂ 결합 자리를 치환하는 THCV의 기능을 시험하기 위하여 이용되었다.

이들 실험은 THCV가 CB₁ 및 CB₂ 수용체 작동체 또는 길항제로 작용하는지를 결정하기 위하여 실행되었다.

또한 실험은 정관이 분리된 쥐 및 R-(+)-WIN55212, CP55940, THC 및 아난다마이드(2-arachidonoyl ethanolamide) 같이 전기적으로 유발되는 수축을 억제할 수 있는 카나비노이드 수용체 길항제가 있는 조직을 대상으로 이루어 졌다(Devane et al., 1992, Pertwee et al., 1995).

카나비노이드 수용체 작동체는 수축성 신경전달 물질(contractile neurotransmitters), ATP(postjunctional P2X purinoceptor에 작용) 및 노르아드레날린(postjunctional α₁-adrenoceptors에 작용)의 방출을 억제하기 위하여 전접합(prejunctional) 뉴런 카나비노이드 CB₁ 수용체에 작용하여 전기적으로 발생한 수축을 억제한다고 여겨지고 있다(Trendelenberg et al., 2000).

또한 실험은 전접합으로(prejunctionally) 운영되고 최소한 부분적으로라도 독립적인 CB₁ 수용체가 나타나는 메카니즘을 통해 쥐의 정관의 전기적인 발생 수축을 억제하는 (-)-7-하이드록시(hydroxy)-카나비노이드-디메틸헵틸 (dimethylheptyl), 카나비노이드 식물의 합성 유사체, (-)-카나비디올 (cannabidiol)을 가지고도 수행되었다.

방 법 :

방사성 리간드 치환 분석( Radioligand displacement assay )

분석은 [³H]CP55940, 1mg ml^-1BSA(bovine serum albumin) 및 50 mM 트리스 버퍼(Tris buffer)를 가지고 수행되었으며, 총 분석 부피는 500 ㎕, Ross et al.(1999b)에 기재된 여과법을 이용하였다.

결합은 뇌 세포막(튜브 당 33 ㎍) 또는 형질 감염된 hCB₂ 세포(튜브 당 25 ㎍)를 추가하는 것으로 시작하였다.

모든 분석은 냉각한 세척 버퍼(ice-cold wash buffer: 50 mM 트리스 버퍼, 1mg ml^-1BSA, pH 7.4)를 추가하여 끝내기 전에, 37℃에서 60분간 수행하였으며, 24-well 시료 다기관(manifold) 및 세척 버퍼에 4℃에서 최소한 24시간 동안 담근 GF/B 필터를 이용하는 진공 여과를 수행하였다.

각각의 반응 튜브는 1.2 ㎖ 분주된 세척 버퍼로 6회 세척되었다. 필터는 60분간 오븐에서 건조한 후에 신틸레이션(scintillation) 용액 5 ㎖로 옮겼다. 방사선은 액상 신틸레이션 분석(spectrometry)에 의해 정량되었다.

특정 결합은 분류되어 있지 않은 CP55940 1 μM의 유무의 차이에 의해 정의되었다. THCV는 DMSO에서 10 μM씩 저장액(stock solution)으로 저장되었고, 모든 분석 튜브의 용액 농도는 0.1% DMSO이 되었다.

[³H]CP55940의 결합 파라미터(parameter)는 쥐의 뇌 세포막에서 2336 fmol mg^-1단백질(B_max) 및 2.31 nM(K_d)이며(Thomas et al., 2004), 감염된 hCB₂ 세포에서 72570 fmol/mg 및 1.043 nM(K_d)이다.

[ ³⁵ S] GTP γS 결합 분석

카나비노이드 CB₁ 수용체에 결합되어 있는 작동체-자극된(stimulated) [³⁵S]GTPγS를 측정하는 방법은 Kurkinen et al.(1997)과 Breivogel et al.(2001)의 방법을 개조한 것이다.

형질 감염된 카나비노이드 CB₂ 수용체에 결합되어 있는 작동체-자극된(stimulated) [³⁵S]GTPγS를 측정하는 조건은 MacLennan et al.(1998)과 Griffin et al.(1999)의 방법을 개조한 것이다.

분석은 GTPγS 결합 버퍼(50 mM This-HCL; 50 mM Tris-Base; 5 mM MgCl₂; 1 mM EDTA; 100 nM NaCl; 1 mM DTT; 0.1% BSA)에 [³⁵S]GTPγS 및 GDP 존재 하에 실행되었으며, 최종 부피는 500 ㎕이다. 튜브에 [³⁵S]GTPγS를 추가함으로써 결합을 시작하였다. 30 μM GTPγS 존재 하에서 비특이적 결합이 측정되었다.

분석시 약품을 30℃에서 60분간 처리하였다. 트리스 버퍼(50 mM This-HCL; 50 mM Tris-Base; 0.1% BSA)를 이용하여 빠른 진공 여과 방법을 통해 반응이 진행되었으며, 방사선은 액상 신틸레이션 분석에 의해 정량되었다.

분석시 존재하는 [³⁵S]GTPγS 및 GDP의 농도는 분석시 쥐의 뇌를 가지고 했는지 형질 감염된 세포의 세포막을 가지고 했는지에 따라 달라진다. 쥐의 뇌를 가지고 했을 때 분석시 농도는 0.1 nM [³⁵S]GTPγS 및 30 μM GDP이고, 감염된 세포 세포막을 가지고 했을 때 분석시 농도는 각각 1 nM 및 320 μM이다.

추가적으로, 쥐 뇌 세포막은 내생적 아데노신(adenosine)을 제거하기 위하여 30℃에서 30분간 0.5 U ml^-1아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase)과 함께 사전에 배양하였다. 작동체 및 길항제는 1 또는 10 mM DMSO 용액으로 저장되었으며, 모든 분석 튜브의 용액 농도는 0.11% DMSO이다.

정관 실험( Vas deferens experiments )

정관(vasa deferentia)은 무게가 대략 31-59 g 가량의 알비노 MF1 쥐에서 수득되었다. 조직은 4 ml organ bath에서 수직적으로 고정하였다. 그후에는 진폭이 꾸준해지는 수축 때까지 자극기(2분)와 휴지기(10분)의 교체 기간에 노출되는 평형기 이후에 오는 강한 강도의 전기 자극의 영향을 받기가 쉽다(Thomas et al., 2004). 이런 수축은 단상적(monophasic)이고 같은 값을 가지며(isometric) 110% 최고 전압(maximal voltage)의 0.5 s 펄스의 연속에 의해 유발된다(연속 진동수 0.1 Hz; 펄스 진동수 5 Hz; 펄스 지속성 0.5 ms).

페닐에프린으로 하는 실험을 제외하고, 모든 약품은 평형기 이후에 organ bath를 할 때 추가하였으며 이러한 추가 사이에 어떠한 세척 과정도 없다. 대부분의 실험에서 잠재적인 길항제 또는 그 용액의 초기 적용이 있다. 이것은 경련 반응 억제제, R-(+)-WIN55212, CP55940, THC, 아난다마이드, (-)-7-하이드록시-카나비디올-디메틸헵틸((-)-7-hydroxy-cannabidiol -dimethylheptyl) 또는 클로니딘의 농도 중 가장 낮은 부분이 적용된 마지막 2분간의 전기적 자극 후에 28분간 실행되었다.

휴지기 이후에, 조직은 전기적 자극을 2분 동안 자극받으면 이후의 경련 반응 억제제에 반응을 잘 보이는 경향이 있다.

휴지기와 2분 자극기의 약품을 추가하는 주기(cycle)는 누적(comulative) 농도-반응 커브를 구축하기 위해서 반복된다. 한 조직당 오직 하나의 농도-반응 커브가 구축되었다. 휴지기는 클로니딘은 3분, R-(+)-WIN55212, CP55940 및 아난다마이드에는 13분, THC 및 THV는 28분, (-)-7-hydroxy-cannabidiol-dimethylheptyl은 58분이었다.

실험은 또한 캅사이신(capsaicin)과 함께 수행되었다. 상기 약품은 3분의 간격을 두고 추가되며 조직은 전기적 자극과 약품의 추가 사이에 휴지하지 않는다.

몇몇 실험에서는 THCV의 누적(comulative) 농도-반응 커브가 이전에 어떤 혼합물의 추가가 없이 구축되며, 다시 약품 추가 주기를 이용하게 되면, 휴지기는 28분, 자극기는 2분이었다.

β,γ-메틸렌-ATP를 이용한 실험에는 평형기 이후에 어떠한 전기 자극도 주지 않는다. β,γ-메틸렌-ATP의 로그 농축-반응 커브는 세척 없이 누적되어 구축되었다.

THCV, WIN 또는 약품 용액은 β,γ-메틸렌-ATP를 처음 추가하기 30분 전에 추가되며, 각각이 추가될 때마다 이전의 실시 후 반응이 안정기에 접어들면 즉시 추가하였다(1-2분의 실시 주기).

페닐에프린 한 가지만을 추가하면 각각의 조직에 적용되며 THCV, WIN 또는 약품 용액 30분 이후에 실행되었다.

데이터 분석

값(value)은 수단(means)으로 다양성은 s.e.mean 또는 95% 신뢰 한계로 표현되었다. 특정 결합 자리(IC₅₀ 값)의 방사성 리간드(radioligand)를 50% 치환하여 제조된 THCV 농도는 GraphPad Prism 4를 이용하여 계산되었다. 이것의 해리 상수(K₁ 값)는 Cheng & Prusoff(1973)의 등식을 이용하여 계산되었다.

상세된 것처럼, 넷(net) 작동체-자극된(stimulated) [³⁵S]GTPγS의 결합값(biding value)은 작동체-자극된(stimulated) 값(작동체를 존재시 수득된)에서 기초 결합 값(작동체의 부재시 수득된)을 차감하여 계산되었다(Ross et al., 1999a).

정관의 전기적으로 유발되는 경련 반응의 억제는 백분율로 표현되고 있으며 이것은 각각의 경련 억제제를 추가한 후의 경련 반응의 진폭과 억제제를 처음 추가하기 직전의 진폭을 비교하여 계산된 것이다. 페닐에프린과 β,γ-메틸렌-ATP에 대한 수축 반응은 긴장(tension)(g)을 증가시키는 것으로 표현되고 있다.

EC₅₀ 값, 최대 효과(E_max) 및 s.e.mean의 값 또는 이들 값의 95% 신뢰 한계는 sigmoid 농도-반응 커브 등식을 이용한 비선형회귀분석에 의해 계산되었다(GraphPad Prism).

정관 또는 [³⁵S]GTPγS 결합 분석의 THCV 작동체의 길항작용의 가현 해리상수(apparent dissociation constant) 값(K_B)은 길항제가 없을 경우에 동일한(identical) 반응을 유도하는 같은 작동체의 농도에서 분리된 농도, B에서 길항적 가역 길항제가 있는 특정 크기의 반응을 유도하는 작동체의 농도로 정의된 농도 비율로부터 Schild 분석법에 의해 계산되었다.

농축비(concentration ratio) 및 가현 해리상수 K_B를 결정하고 유사한 반응에서 많이 벗어난 플롯(plot)을 농도-반응 구성을 구축할지 여부를 결정했던 방법은 상세되어 있다(Pertwee et al., 2002). 평균 값은 Dunnett 테스트를 이용하여 Student's 홀 데이터(unpaired data) 양측 검증(two-tailed t-test) 또는 가변 변수(variance)(ANOVA)의 단일 분석법(one-way analysis)을 이용하여 비교하였다. P-value는 0.05 미만을 기준으로 하였다.

결 과 :

방사성 리간드 ( Radioligand ) 실험

THCV는 쥐의 뇌 및 CHO-hCB2 세포 세포막에서 어떤 의미로는 어느 정도는 두-자리 경쟁 커브(two-site competition curve)보다 더 한-자리 경쟁 커브(one-site competition curve)에 적합한 특정 결합자리에서 [³H]CP55940가 치환되었다(P<0.05; GraphPad Prism 4).

그의 평균 K₁ 값은 각각 75.4 nM 및 62.8 nM이었다.

또한 THCV는 쥐의 뇌 세포막의 특정 결합자리에서 [³H]R-(+)-WIN55212 및 [³H]SR141716A를 치환하였으며, 신뢰 한계 95%의 그 평균 EC₅₀ 값은 괄호 안에서 볼 수 있는 바와 같이 각각 61.3 nM(48.6 및 77.3 nM; n=4-7) 및 86.8 nM(63.8 및 188.1 nM; n=4-6)이다.

[³H]CP55940의 치환에 관련된 THCV의 참조 EC₅₀ 값은 98.2 nM(69.6 및 138.6 nM; n=4-8)이다.

[³⁵S]GTPγS와 쥐의 뇌 및 CHO-hCB₂ 세포막의 결합을 향상시키는 CP55940의 능력은 평형에서 유의적으로 벗어나지 않은 이 카나비노이드 수용체 작용체의 로그 농도 반응 커브에서 오른쪽으로 이동(dextral shift)하여 제조된 1 μM, THCV에 의해 감소된다.

길항작용에 관한 평균 가현(mean apparent) K_B 값은 표1을 참조하면, 쥐의 뇌 세포막에서 CP55940의 길항작용에 관한 SR141716A 및 CHO-hCB2 세포 세포막에서CP55940의 길항작용에 관한 SR144528의 평균 가현 K_B 값을 볼 수 있다. GTPγS가 쥐의 뇌 세포막과 결합하는 것을 향상시키는 것과 관련하여 1 μM, THCV는 또한 R-(+)-WIN55212의 로그 농도 반응 커브에서 오른쪽으로 상당히 많이 이동한다.

표 1 :

길항제	작동체	세포막 준비	평균 가현 K_b(nM)	95% 신뢰 한계	n
THCV (1000 nM)	CP55940	뇌	93.1	66.5 130.6	6
THCV (1000 nM)	R-(+)-WIN55212	뇌	85.4	29.3 270.5	5
SR141716A (10 nM)	CP55940	뇌	0.09	0.021 0.41	4

THCV (1000 nM)	CP55940	CHO-hCB₂	10.1	5.0 20.5	6
SR144528 (100 nM)	CP55940	CHO-hCB₂	0.49	0.26 0.85	6

* 정관 실험( Vas deferens experiments )

THCV는 12.7 μM EC₅₀ (6.9 및 23.2 μM)로 쥐에서 분리된 정관의 전기적으로 유발된 수축의 농도와 연관된 억제를 생성한다.

이 효과로 CB₁ 수용체가 SR141716A에 의해 100 nM(n=7; 데이터 보여주지 않음)으로 감소되어 조정되는 것같지는 않으며, 농도는 이전에 같은 바이오 분석에서 길항작용을 하여 구축된 CB₁ 수용체 작동체가 발견된 CB₁-선택적 길항제의 농도와 같거나 그보다 높다(Pertwee et al., 1995; Ross et al., 2001).

31.6 μM의 농도에서 전기적으로 유발된 수축의 현격한 억제를 생성하고, 또한 THCV는 정관의 P2 수용체 작동체, β,γ-메틸렌(methylene)-ATP 및 α-아드레노셉터(adrenoceptor) 작동체, 페닐에프린 하이드로클로라이드(phenylephrine hydrochloride)에 대한 수축 반응을 감소시킨다.

이와는 대조적으로 1 μM의 농도에서 전기적으로 유발되는 수축에 대해 감지할 수 있는 억제효과가 없으며, THCV는 β,γ-메틸렌(methylene)-ATP 또는 페닐에프린(phenylephrine)에 의해 유발된 수축의 진폭을 유의적으로 감소시키지 않는다. 이러한 발견으로 THCV가 내생적으로 분비된 ATP 및 노르아드레날린(noradrenaline)의 수축 반응울 막기 위하여 후접합으로(postjunctionally) 활동함으로써 정관의, 최소한 부분적으로라도, 전기적으로 유발되는 수축을 억제한다는 것을 알 수 있다.

전기적으로 유발된 수축이 억제받는 농도 이하에서, THCV는 경련 반응의 R-(+)-WIN55212-유도하는 억제에 대항하였고 어느 정도 농도가 관련되어 있었고 R-(+)-WIN55212(P>0.05; Dunnett test에 따른 ANOVA; n=6-9)의 최대 효과(E_max)에 큰 변화를 주지 않았다. R-(+)-WIN55212의 로그 농도 반응 커브에 있는 THCV에 의한 오른쪽 이동은 평형에서 많이 벗어나지 않으며 개체와 많이 틀리지 않은 경사도가 있는 Schild 영역을 산출했다. THCV의 평균 가현 K_B 값은 Tallarida 방법(Pertwee et al., 1995)으로 계산됐으며 표2에 나타난 바와 같이 1.5 nM이다. 전기적으로 유발된 수축이 현격하게 감소하는 농도인 1 μM에서, R-(+)-WIN55212는 정관의 수축을 유발하는 β,γ-methylene-ATP 또는 페닐에프린(phenylephrine)의 능력을 감소시키지 않는다.

표 2 :

THCV (nM)	경련 억제제	THCV의 평균 가현 K_b(nM)	95% 신뢰 한계 (nM)	n
10-1000	R-(+)-WIN55212	1.5	1.1, 2.3	6-9
100	아난다마이드(anandamide)	1.2	0.2, 6.2	7
100	메타난다마이드 (methanandamide)	4.6	1.5, 11.6	12
100	CP55940	10.3	3.8, 31.7	14
1000	THC	96.7	15.4, 978	10
100	클로니딘(clonidine)	>100	-	8
100	캡사이신(capsaicin)	>100	-	8
100	7-OH-CBD-DMH	>100	-	8

THCV는 10, 100 및 1000 nM에서 아난다마이드에, 100 nM에서 메타난다마이드 및 CP55940에 길항작용을 하는 것을 볼 수 있었다. 이들 경련 반응의 로그 농도 반응 커브에서 THCV에 의해 유발된 오른쪽 이동은 평형에서 심하게 벗어나지 않았다. 95% 신뢰 한계인, 10 nM THCV에 의한 아난다마이드의 길항작용에 대한 평균 가현 K_b 값은 표에서 볼 수 있듯이 1.4 nM이다(0.36 및 7.50 nM). 100 nM THCV에 의한 아난다마이드, 메타난다마이드 및 CP55940의 길항작용에 대한 평균 가현 K_b 값은 표2에서 볼 수 있다.

THCV가 100 nM일 때는 클로니딘, 캡사이신 또는 7-하이드록시-카나비디올-디메틸헵틸(7-hydroxy-canabidiol-dimethylheptyl)이 전기적으로 유발된 수축을 억제하는 능력을 감소시키지 않으며, 이는 정관에서 경련 억제제의 길항제로서 최소한 어느 정도의 선택도를 THCV가 포함하고 있음을 의미한다.

또한 THCV가 100 nM일 때 카나비노이드 수용체 작동체인, THC에 대해 길항 작용을 하지 않았다(n=11, 데이터 제시 없음). 그러나 THCV가 1 μM일 때는 평형에서 많이 벗어나지 않은 THC에 의해 유발된 로그 농도 반응 커브시 오른쪽으로 많이 이동시키지 않았다(THC에 대한 그 가현 K_b 값은 표2를 참조바람).

이 데이터로부터 THC와 함께 적은 양의 THCV를 함께 복용하면 심장 박동수 증가 및 향정신작용(psychoactivity)같은 THC 과다 복용 부작용을 개선할 수 있다는 것을 알 수 있다. 적은 양의 THCV 복용은 CB₁ 수용체의 극복 가능한 경쟁 길항제로 작용할 수 있으며 따라서 THC의 과다 복용에 따른 부작용을 막을 수 있다. 당기술에서 부분 작동체의 효과 및 효능이 수용체 밀도와 함께 증가하고 극복 가능한 경쟁 길항제의 효능이 수용체 밀도에 의해 영향을 받지 않는 다는 것이 확립되어 있다. THCV 복용이 THC의 치료법상 효과를 막을 수 있을 만큼 충분하지는 않지만 THC의 과도한 복용으로 인한 부작용을 막을 수 있을 만큼 충분할 것이다.

결 론 :

?THCV(△⁹-tetrahydocannabivarin)는 뇌의 특정 결합자리에서 [³H]CP55940 및 CHO-hCB₂ 세포 세포막(각각 K_i=75.4 및 62.8 nM)을 치환되었는데 이는 THCV가 CB₁ 및 CB₂ 수용체 길항제라는 것을 나타낸다.

?THCV는 또한 이들 세포막에 결합된 [³⁵S]GTPγS의 향상이 유도된-CP55940에 길항작용을 하며, 이는 THCV가 합리적인 유력한 경쟁 길항제라는 것을 나타낸다. K_b 값은 THCV가 CB₁ 수용체 길항제보다 CB₂ 수용체 길항제로 더욱 유력함을 나타낸다.

?쥐의 정관에서, THC(△⁹-tetrahydocannabinol)의 전기적으로 유발된 수축을 억제하는 능력은 THCV에 의해 길항작용을 받고, 그 가현 K_b 값(96.7nM)은 쥐 뇌의 세포막에 결합된 [³⁵S]GTPγS의 향상이 유도된 CP55940 및 R-(+)-WIN55212의 길항작용에 대한 가현 K_b 값에 근접한다.

?또한 THCV는 정관내에서 R-(+)-WIN55212, 아난다마이드, 메탄다마이드(methanandamide) 및 CP55940에 길항작용을 하지만 가현 K_b 값이 더 낮은데, 이는 THCV가 경쟁적, 극복 가능한 방법으로 행동한다는 것을 나타낸다.

?THCV는 스스로 전기적으로 유발된 수축의 진폭 또는 쥐 뇌의 세포막 또는 CHO-hCB₂ 세포 세포막에 결합되는 [³⁵S]GTPγS의 능력에 영향을 주지 않는 농도에서 카나비노이드의 길항작용을 하므로, THCV는 중립성 카나비노이드 수용체 길항제라 할 수 있다.

?THCV(100nM)는 클로니딘, 캡사이신 또는 정관의 전기적으로 유발되는 수축의 억제가 유도된 (-)-7-하이드록시-카나비디올-디메틸헵틸에 저항하지 않는다. 이것은 THCV가 선택능력이 있다는 것은 나타낸다.

?정관의 페닐에플린 하이드로클라이드(phenylephrine hydrochloride) 또는 β,γ-메틸렌-ATP에 대한 수축 반응은 1 μM THCV 또는 R-(+)-WIN55212에 의해 감소하지 않으며, THCV는 전접합자리(prejunctional sites)의 R-(+)-WIN55212와 상호반응한다고 할 수 있다.

?31.6 μM THCV 일 때, 페닐에플린 하이드로클라이드 또는 β,γ-메틸렌-ATP에 대한 수축 반응을 감소시키고, 3 μM 초과일 때 SR141716A-독립 방법으로 정관의 전기적으로 유발된 수축을 억제한다.

결론적으로, THCV는 중립 경쟁 CB₁ 및 CB₂ 수용체 길항제로 활동한다. 정관 내에서, 몇몇 카나비노이드에 THC보다 더 효과적으로 길항작용을 하며 뇌 세포막내에서 보다 이 조직 내에서 CP55940 및 R-(+)-WIN55212에 대해서도 더 효과적이다.

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Claims

CB₁ 카나비노이드 수용체의 중립성 길항작용(neutral antagonism)에 의해 이득을 얻는 질환의 치료를 위한 THCV(tetrahydrocannabivarin)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.