KR100748151B1 - 항암활성을 갖은 헥사클로로펜을 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암활성을 갖은 헥사클로로펜, 이의 유도체 및 이들의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 약학적 조성물은 대장암 및 흑색종에 효과적이다.

헥사클로로펜, 대장암, 흑색종

Description

항암활성을 갖은 헥사클로로펜을 포함하는 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition Containing Hexachlorophene Having Anticancer Activity}

도 1은 헥사클로로펜을 작은 분자량의 Wnt/베타-카테닌의 저해제로 발견하는 것을 보인다.

(A)는 Wnt/베타-카테닌 신호을 억제하는 물질을 탐색하는 것이다. HEK293 리포터 세포를 이용하여 TOPFlash 리포터 활성을 조절하는 물질을 찾았다. 대조군은 Wnt3a CM의 존재 또는 부존재하에서 분석되었다. TOPFlash의 활성은 셀타이터-글로(Promega) 활성으로 표준화(normalize) 하였다.

(B)는 헥사클로로펜의 구조를 보인다.

(C) 헥사클로로펜이 Wnt3a CM에 의해 활성화되어진 TOPFlash의 활성을 투여량 의존적으로 억제하는 것을 보인다.

(D) 헥사클로로펜이 Wnt3a에 의하여 증가되어진 베타-카테닌의 수준을 감소시키는 것을 보인다.

(E) 헥사클로로펜이 LiCl에 의하여 활성화된 TOPFlash의 활성을 억제하는 것인다. 상기 (C)와 (E)에서는 HEK293 리포터 세포가 Wnt3a CM의 존재하(C) 또는 20 mM LiCl의 존재하(E)에서 헥사클로로펜의 농도를 증가시키면서(2.5, 5 및 10 μM) 항온배양되었다. 15시간후에, 루시퍼라아제의 활성이 측정되었다. 결과는 3반복의 평균값이고, 바는 표준편차를 나타낸다. (D)와 (F)에서 Wnt 3a CM의 존재하에서 비히클(DMSO) 또는 헥사클로로펜 (10μM)을 처리한 15시간 후, 세포질 분획이 베터-카테닌 항체와의 웨스턴 블랏을 위해서 준비되었다. 같은 양이 로딩됐는지 지 확인하기 위해서, 그 블랏은 액틴의 항체로서 다시 탐색되었다.

도 2는 대장암 세포에서의 헥사클로로펜의 효과를 보인다.

(A)는 헥사클로로펜이 HCT116 세포에서의 TOPFlash 리포터 활성을 감소시키는 것을 보인다.

(B)는 헥사클로로펜이 HCT116 세포에서 단백질의 양을 감소시키는 것을 보인다.

(C)에서는 헥사클로로펜이 SW480 세포의 TOPFlash 리포터에는 영향이 없는 것을 보인다.

(D) 헥사클로로펜이 SW480 세포의 베타-카테닌의 단백질양에는 영향이 없는 것을 보인다. (A)와 (C)에서, 세포는 TOPFlash 및 pCMV-RL 플라스미드로 공-형질전환되었고, 헥사클로펜의 양을 증가시키면서(2.5, 5, 및 10 μM) 15시간동안 항온반응되었다. 루시퍼라아제의 활성은 형질전환시킨 후 39 시간뒤에 측정되었다. 결과는 3 반복실험의 평균으로 나타내었고, 바는 표준편차를 나타낸다. (B)와 (D)에서, 비히클(DMSO) 또는 헥사클로로펜 (5 및 10 μM)을 15시간동안 처리한 후, 세포질분획이 베타-카테닌 항체로 웨스턴 블랏팅하기 위해 준비되었다. 동량이 로딩되었는지 확인하기 위하여 상기 블랏은 액틴 항체로 재조사되었다.

(E) 헥사클로로펜은 사이클린 D1 프로모터의 활성을 억제하였다. HCT116 세포는 사이클린 D1-RL 및 pSV40-FL로 공-형질전환되었고, 헥사클로로펜의 양을 증가시키면서(2.5, 5, 및 10 μM) 15시간동안 항온반응 되었다. 루시퍼라아제의 활성은 형질전환 뒤 39시간 뒤에 측정되었다. 결과는 3반복의 평균값이고, 바는 표준편차를 나타낸다. (F)는 헥사클로로펜이 사이클린 D1의 발현을 감소시키는 것을 보인다. HCT116 세포는 비히클(DMSO) 또는 헥사클로펜의 여러 농도(2.5, 5, 및 10 μM)로 15시간동안 항온반응되었다. 전체-세포 추출물은 항-사이클린 D1으로 웨스턴 블랏팅 하기 위하여 준비되었다. 동량이 로딩되었는 지 확인하기 위하여, 상기 블랏은 액틴 항체로 재조사되었다.

도 3은 헥사클로로펜-유도 베타-카테닌 분해에 Siah-1이 관여함을 보인다.

(A)는 헥사클로로펜이 단백질복합체을 통하여 베타-카테닌의 단백질 수준을 떨어뜨렸다. 비히클(DMSO), 헥사클로로펜(10μM), 또는 MG-132 (10μM)을 HEK293 리포터 및 HCT116 세포과 항온배양한 후, 세포질 분획은 베타-카테닌 항체로 웨스턴 블랏팅하기 위하여 준비되었다. 동량이 로딩되었는지를 확인하기 위하여, 상기 블랏은 액틴 항체로 재조사되었다.

(B) 헥사클로로펜이 Siah-1의 발현을 유도한다. 비히클(DMSO) 또는 헥사클로로펜(1.25, 2.5, 5, 및 10 μM)을 15시간 동안 처리한 HEK293 리포터 및 HCT116 세포에서 전체 RNA를 준비하여 Siah-1, Siah-2 및 GAPDH에 대한 반정량적인 RT-PCR이 행해졌다.

(C)는 우성적-음성적으로 Siah-1이 헥사클로로펜에 의해 유도된 베타-카테닌의 분해를 억제하였다. HEK293 세포는 표시되어진 플라스미드로 공-형질전환되었다. 각 형질전환에서 DNA의 양은 적절한 양의 빈 발현벡터을 첨가함으로서 일정하게 유지되었다. 세포질 분획은 베타-카테닌 항체와 블랏팅하기 위하여 준비되었다. 동량이 로딩되었는지 확인하기 위하여 상기 블랏은 액틴 항체로 재조사되었다.

도 4는 CRT-양성 세포의 헥사클로로펜의 선택적 세포독성을 보인다.

(A) 세포는 48시간 동안 24개의 웰 플레이트에서 표시되어진 농도의 헥사클로로펜으로 항온반응 되었다. 성장의 저해를 계산하기 위해서 시간 0 에서의 값을 우선 감하였다. 시험의 결과는 3반복시험의 평균값이며, 바는 표준편차를 나타낸다.

(B) 세포가 비히클(DMSO) 또는 헥사클로로펜(2.5μM)과 함께 48 시간 동안 항온배양되고, 100배의 비율로 광학현미경에 아래에서 관찰된 것을 보인다.

Wnt/β-카테닌 신호의 조절장애와 이에 따른 베타-카테닌 반응 전사(β-catenin response transcription; CRT)는 어떤 종류의 암의 발생동안에 초기에 종종 일어난다(참고문헌 1 참조). 선종성 대장 폴립(Adenomatous polyposis coli; APC) 유전자의 돌연변이가 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis; FAP) 뿐만이 아니라 대부분의 산발성의 대장암에서도 나타난다(참조문헌 2 참조). 더불어서, 베타-카테닌 유전자의 돌연변이가 직장암 및 흑색종에서 관찰되었다(참조문헌 3 참고). 베타-카테닌 돌연변이의 공통적인 부분은 N-말단 도메인의 인산화되는 모티프이다. 이들 돌연변이는 핵내에 과량의 베타-카테닌의 축적을 가져오고, 사이클린 D1, myc, 세포 기질 금속 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase-7; MMP-7) 및 PPAR-δ을 포함하는 베타-카테닌 타켓 유전자의 자극을 가져온다. 따라서, 계속적인 CRT 활성은 대장암 및 흑색종의 치료 및 예방에 주요한 타켓이다.

Wnt/β-카테닌 신호의 비정상적인 활성화는 암의 발생과 관련이 있다. 특히 대장암 및 흑색종과 관련이 있다. 따라서, Wnt/베타-카테닌 신호는 항암물질을 개발하는데 좋은 타겟이다. 본 발명자는 헥사클로로펜(hexachlorophene)이 세포기초 화합물 탐색(cell-based chemical screening)을 이용하여 Wnt/베타-카테닌의 저해제가 될 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 헥사클로로펜, 이의 유도체 및 이들의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헥사클로로펜(hexachlorophene) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암활성의 약학적 조성물에 관한 것이다.

헥사클로로펜은 C₆H(0H)Cl₃CH₂Cl₃(OH)C₆H의 하기 화학식 1의 화합물로서 항생물질로 알려져 있다. 이것은 스킨 또는 점막에 사용하여도 독성이 없다. 따라서, 주로 손이나 얼굴을 세척하는데 사용이 되었다.

[화학식 1]

Wnt/β-카테닌 신호의 비정상적인 활성화는 암의 발생과 관련이 있다. 특히 대장암 및 흑색종과 관련이 있다. 따라서, Wnt/베타-카테닌 신호는 항암물질을 개발하는데 좋은 목표이다. 본 발명자는 헥사클로로펜(hexachlorophene)이 세포기초 화합물 탐색(cell-based chemical screening)을 이용하여 Wnt/베타-카테닌의 저해하는 것을 발견하였다(도 1(A) 참조).

헥사클로로펜은 Siah-1의 발현을 높임으로서 베타-카테닌의 분해를 유도한다. 더불어서, 헥사클로펜은 베타-카테닌 타겟 유전자로 알려진 사이클린 D1(cyclin D1)의 발현을 억제한다. 중요하게 헥사클로펜은 이상적으로 활성화된 베타-카테닌 반응 전사(β-catenin response transcription; CRT)를 억제함으로서 암세포의 성장을 억제한다. 때문에, 헥사클로로펜은 Wnt/베타-카테닌 신호의 조절장애에 의한 암의 치료제로 사용되어질 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 무기산의 실례는 염산, 인산, 황산, 브롬화수소 산, 요오드화수소 산, 아인산 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 유기산의 실례는 지방족 모노- 및 디카복실 산, 옥살산, 탄산, 구연산, 숙신산, 페닐-치환된 알카노산, 지방족 및 방향족 설폰산 등을 포함한다. 그러므로, 상기 무기 또는 유기산으로부터 제조되는 약학적으로 허용가능한 염은 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 니트레이트, 설페이트, 피로설페이트, 비설페이트, 설파이트, 비설파이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 하이드로요오다이드, 하이드로플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 포르메이트, 옥살레이트, 시트레이트, 락테이트, p-톨루엔설포네이트, 메탄설포네이트, 말리에이트등을 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 화합물들은 넓은 투여 범위에서 유효하다. 예를 들면, 일반적으로 하루 투여량은 약 10내지 약 1000 mg/kg체중의 범위일 것이다. 성인 인간을 치료하는 경우, 약 50 내지 약 600 mg/kg 범위의 투여량을 1회 또는 나누어 복용시키는 것이 바람직하다. 그러나 실제로 투여되는 화합물의 양은 치료 질병, 투여되는 화합물의 선택, 각 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 및 투여 경로의 선택을 포함하는 상황을 고려하여 전문의에 의해 결정될 것임은 이해할 것이다. 그러므로, 상기 투여량 범위는 어떤 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.

본 화합물들은 경구 투여되는 것이 바람직하지만, 경피, 피하, 비강내, 근육내 및 정맥내 경로와 같은 기타 다양한 경로를 통하여 투여될 수도 있다.

본 발명의 화합물을 직접 투여하는 것이 가능하지만, 이 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 제형의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 제형은 약 0.01% 내지 약 99%의 본 발명의 화합물을 포함할 것이다.

본 발명의 제형을 제조함에 있어서, 보통 상기 활성 성분을 하나 이상의 담체와 혼합하거나, 또는 하나 이상의 담체로 희석하거나 또는 캡슐, 종이 또는 기타 용기의 형태일 수 있는 담체내에 넣을 수 있다. 담체가 희석제로서 작용하는 경우, 이것은 상기 활성 성분을 위한 비히클, 부형제 또는 매질로서 행동하는 고체, 반고체 또는 액체물질일 수 있다.

그러므로, 상기 제형은 정제, 과립, 환제, 분말, 유제, 용액, 시럽, 현탁액, 에어로졸(고체로서 또는 액체 매질중에서) 및 연질 및 경질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 희석제 및 부형제의 실례는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아라비아 고무, 칼슘 포스페이트, 알긴산 염, 액체 파라핀, 칼슘 실리케이트, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈, 트라가칸트, 젤라틴, 시럽, 메틸 셀룰로즈, 메틸- 및 프로필-하이드록시벤조에이트, 올리브유와 같은 식물성유, 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 물 및 무기유를 포함한다. 상기 제형은 또한 습윤제, 윤활제, 유화 및 현탁제, 방부제, 감미료, 향료, 안정화제 또는 조미료를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 제형은, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여, 환자에게 투여후 활성 성분이 신속, 지속 또는 지연 방출되도록 제형화 시킬 수 있다.

경구 투여를 위해, 본 발명의 화합물을 이상적으로 담체 및 희석제와 혼합시킬 수 있고 정제로 주형하거나 또는 젤라틴 캡슐에 넣을 수 있다.

상기 조성물은, 각 투여단위가 약 1 내지 약 500 mg, 보다 일반적으로는 약 5 내지 약 300 mg의 활성 성분을 포함하는 단위 투여 형태로 제형화되는 것이 바람직하다. 용어 " 단위 투여 형태" 는 인간 및 기타 포유동물을 위한 단위 투여로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 나타내며, 각 단위는, 적합한 약학적 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 원하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 만큼 예정된 양의 활성 물질을 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Wnt/β-카테닌 시그널의 억제제의 발견

세포배양, 형질전환 및 루시퍼라아제 분석

HEK293, HCT-116, SK-MEL5, A375SM 및 Wnt3a-분비 L 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 구매하였고, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 120 ㎍/ml 페니실린, 및 200 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 배양하였다. Wnt3a 적응용 배지(Wnt3a conditioned medium; Wnt3a CM)을 위해서, Wnt3a 분비 L 세포는 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 4일간 배양되었다. 상기 배지는 수확되고, 0.22-㎛ 여과기를 사용하여 멸균되었다. 새 배지성분이 첨가되고, 세포들은 다른 3일 동안 배양되었고, 배지는 수확되어서 전의 배지와 합해졌다. 형질전환은 리포펙타민 2000(인비트로젠, 칼스바드, CA, USA)으로 제조자의 지시에 따라 행해졌다. 루시퍼라아제의 활성은 듀얼 루시퍼라아제 분석 키트(프로메가, 메이디슨, WI, USA)을 이용하여 측정되었다.

플라스미드의 제조

hFz-1(Human Frizzled-1) cDNA가 SW480 cDNA(클론텍, 팔로 알토, CA, USA)로부터 PCR를 이용해 클론 되었고(참고문헌 8 참조), pCDNA3.1(인비트로겐)으로 서브클론되었다. 사이클린 D1 프로코터 지역은 PCR에 의해 증폭되었고, pRL-널 리포터 플라스미드(프로메가)로 삽입되었다. pTOPFlash 리포터 플라스미드는 업스테이트 바이오테크놀로지(레이크 플라시드, NY, USA)로부터 얻어졌다. ΔSiah-1 플라스미드는 와이. 양(NIH, USA)로부터 제공받았으며, pCMV-RL 플라스미드는 프로메가로부터 구입하였다.

Wnt/베타-카테닌 신호전달의 저분자 억제제의 탐색

세포주는 G418 (1mg/ml)를 포함하는 배지를 이용하여 hFZ-1 및 TOPFlash를 모두 발현하는 플라스미드로 공-형질전환된 HEK293 세포를 선택하여 만들었다. 세포는 2배수로 웰당 15,000개의 세포로 96-웰 플레이트에 접종하였고, 24시간 동안 배양했다. 다음으로, Wnt3a CM이 첨가되고, 웰에 저분자물질을 첨가하여 최종농도가 10 μM이 되도록 하였다. 15시간 이후에, 플레이트는 반딧불 루시퍼라아제 및 세포의 생존도를 측정하였다.

웨스턴 블랏팅

세포질 분획은 이전에 기재되었던 방식으로 준비되었고(참고문헌 9 참조). 단백질은 4-12% 구배 SDS-PAGE(인비트로젠)에서 분리되었고, 니트로셀룰로오즈 막(바이오-레드, 헤르쿨레스, CA, USA)로 전달되었다. 상기 막은 5% 논팩 밀크로 블록되었고, 항-베타-카테닌 항체(BD 트랜스덕션 레버레토리, 렉싱톤, KY, USA), 항-사이클린 D1 항체(산타 크루츠 바이오테크놀로지, 산타 크루츠, CA, USA), 및 항-액틴 항체(셀 시그널링 테크놀로지, 비버리, MA, USA)로 탐색되었다. 막은 호스레디쉬 퍼옥시다아제 연결 항-쥐 IgG 항체(산타 크루츠 바이오테크놀로지)로 항온반응되었고, ECL 시스템(산타 크루츠 바이오테크놀로지)을 이용하여 시각화되었다.

RNA 추출 및 반-정량적 RT-PCR

전체 RNA는 트리졸 리전트(인비트로젠)으로 제조자의 지시에 따라 분리되었다. cDNA 합성, 역전사, PCR은 기존에 기술된 것처럼(참고문헌 10 참조) 행해졌다. 증폭되어진 DNA는 2% 아가로스 젤에서 분리되어졌고, 에티디움 브로마이드를 염색되었다.

세포 생존력의 측정

세포는 24-웰 플레이트에 접종되어졌고, 헥사클로로펜으로 2일 동안 처리되었다. 처리된 샘플로부터의 세포들은 트리판 블루 익스클루젼 및 헤마토사이토미터를 이용하여 3 반복 세어졌다.

Wnt/β-카테닌 시그널의 억제제의 발견

적은 분자량의 Wnt/β-카테닌의 신호전달을 억제하는 물질을 찾기 위하여, TOPFlash 리포터 및 hFz-1 발현 플라스미드를 포함하는 HEK293 리포터 세포를 만들기 위해서 HEK293 세포를 안정적으로 형질전환 하였다. HEK293 리포터 세포가 Wnt3a CM과 함께 항온배양 되었을 때, TOPFlash 리포터 활성은 매우 증가하였다(도 1(A) 및 (C) 참조). 상기와 같은 시스템을 사용하여서 1000개의 생물학적 활성을 가지고 있는 화합물 라이브러리에서 저분자량의 물질을 탐색하였다(도 1(A)). 이와 같은 탐색에서 발견되어진 물질이 헥사클로로펜(도 1(A) 및 (B))이다. 도 1(C)에서 보여주듯이, 헥사클로로펜을 처리하게 되면 투여량 의존적으로 Wnt/β-카테닌의 시그널이 저해된다. Wnt/β-카테닌 신호전달에서, CRT는 주로 β-카테닌 단백질의 안정성에 의존한다. β-카테닌 단백질은 유비퀴틴-의존 분해에 의해서 조절된다(참고문헌 11 참조). 세포내 β-카테닌의 수준에 대한 헥사클로로펜의 효과를 살펴보기위해서, 헥사클로로펜에 대한 세포내 β-카테닌의 양을 측정하기 위해서 항-β-카테닌 항체로 웨스턴 블랏팅 하였다. 전의 결과와 마찬가지로(참고문헌 12 참조), Wnt3a CM(도 1(D))과의 항온반응은 베타-카테닌의 양을 증가시켰다. 흥미롭게도 헥사클로로펜의 처리는 베타-카테닌의 수준을 떨어뜨렸다(도 1(D)). 이와 같은 결과를 바탕으로 하여, 헥사클로로펜 관여 Wnt/베타-카테닌 신호전달의 저해는 베타-카테닌 수준의 감소 때문이라는 것을 보인다.

다음으로, 헥사클로펜 관여 CRT 저해가 GSK-3β가 필요한지 시험하였다. 이를 위해서, HEK293 리포터 세포는 GSK-3β의 억제제인 LiCl과 함께 항온반응되었고, 헥사클로로펜의 양을 증가시켰다. 도 1(E)에서 보이듯이, LiCl에 의한 CRT는 헥사클로로펜의 처리에 의해 감소하였다. 더욱이, LiCl 때문에 축적되어진 세포내 베타-카테닌 단백질의 양은 일관되게 감소하였다(도 1(F)). 이들의 결과는 헥사클로로펜의 CRT 억제는 GSK3β와는 독립적으로 억제되는 것을 보인다.

[실시예 2] 대장암세포에 대한 헥사클로로펜의 성장 억제효과

헥사클로로펜의 대장암세포에 대한 효과를 테스트하였다. 왜냐하면, 대장암세포에서 베타-카테닌의 축적이 빈번하게 일어나기 때문이다. HCT-116 대장암 세포-이것은 야생형의 APC 및 베타-카테닌에 Ser 45 결실 돌연변이를 가지고 있다-에 TOPFlash로 형질전환되었고, 헥사클로로펜으로 처리되었다. 도 2(A) 및 (B)에서 볼 수 있듯이, 헥사클로로펜과의 항온반응은 CRT의 감소를 가져왔고, 베타-카테닌 단백질의 수준을 떨어뜨렸다. 반면에, 야생형의 베타-카테닌 및 APC가 결손되어진 SW480 대장암세포에서는 헥사클로로펜의 처리가 CRT의 저해나 베타-카테닌 발현의 억제를 가져오지 않았다(도 2(C) 및 (D)). 이들의 결과는 헥사클로로펜이 베타-카테닌의 수준을 떨어뜨리는데에는 야생형의 APC가 필요하다는 것을 나타낸다.

사이클린 D1의 유전자는 베타-카테닌에 의해서 조절되어지고, 많은 암세포(참고문헌 4 참조)에서 중요한 역할을 한다. 베타-카테닌의 발현에 대한 헥사클로로펜의 효과를 결정하기 위해서, 360 염기쌍의 사이클린 D1 프로모터 유전자를 자기고 있는 리포터 구조체를 HCT116 세포에 형질전환 하였다. 그리고 여기에 헥사클로로펜의 양을 조금씩 증가시키면 처리하였다. 도 2(E)에서 볼 수 있듯이, 헥사클로로펜은 사이클린 D1 프로모터 활성을 감소시켰다. 상기 실험과 함께, 헥사클로로펜이 처리된 세포에서 사이클린 D1의 발현을 조사하였다. 리포터 분석과 일관하게, 사이클린 D1의 단백질 수준은 헥사클로로펜의 처리에 대응하여 농도 의존적으로 감소하였다.

[실시예 3] 헥사클로로펜 의한 베타-카테닌의 분해에 Siah-1의 관여

헥사클로로펜에 의한 베타-카테닌 단백질의 다운-조절은 단백질복합체가 관여하는지 살펴보기 위해서, MG-132를 사용하여 단백질 복합체에 의한 단백질 분해를 막았다. 헥사클로로펜의 처리는 일관되게 베타-카테닌 단백질 수준의 감소를 가져왔다(도 3(A)). 그러나, 헥사클로로펜의 베타-카테닌의 효과는 HEK 293 리포터 및 HCT 116세포에 MG-132를 첨가하면서 무효화되었다(도 3(A)). 때문에, 헥사클로로펜은 단백질 복합체에 의존하는 방법으로 베타-카테닌을 분해시킨다. 전의 연구에서 Siah가 GSK3β-독립적 및 APC-의존적 베타-카테닌 분해를 일으킨다는 것을 보였다(참고문헌 15 참조). 더욱더, 헥사클로로펜의 암세포주에 대한 상기 결과는 헥사클로로펜이 GSK3β-독립적 및 APC-의존적인 기작에 의해서 베타-카테닌 분해를 촉진시키는 것을 보인다. 때문에, Siah 활성이 헥사클로로펜 유도 베타-카테닌의 분해에 필요한지 확인하였다. HEK293 리포터 및 HCT116 세포는 헥사클로로펜의 양을 증가시키면서 처리되었고, 그리고 Siah-1 mRNA 수준이 정량적인 역전사효소-PCR로 측정되었다. 도 3(B)에서 보이듯이, 헥사클로로펜의 처리는 양쪽의 세포주에서 Siah-1 mRNA의 양을 증가시켰다. 그러나 Siah-2 mRNA의 양은 증가시키지 않았다. 더불어서, 우성적-음성의 Siah-1(ΔSiah-1)은 헥사클로로펜의 처리에 의한 베타-카테닌의 분해를 억제하였다(도 3(C)). 이들의 결과는 헥사클로로펜 Siah-1 의존적 방식으로 베타-카테닌의 분해를 촉진한다는 것을 제시한다.

[실시예 4] 헥사클로로펜이 CRT-양성의 세포에서 세포성장의 선택적 억제제

여러 연구결과가 베타-카테닌의 기능의 파괴가 인간의 대장암 세포의 성장을 감소한다는 것을 보인다(참고문헌 16, 17 참고). 헥사클로로펜이 베타-카테닌의 분해를 촉진한다면, 헥사클로로펜이 Wnt/베타-카테닌 신호전달 성분의 돌연변이를 가지고 있는 암세포의 성장을 저해할 것이라고 가정하였다. 이 가정을 탐색하기 위해서, CRT가 비정상적으로 활성화된 인간의 암세포(HCT 116 및 SK-MEL5)(참고문헌 14, 18 참고)에서 헥사클로로펜의 성장억제효과를 살펴 보았다. 비교를 위해서, 정상의 Wnt/β-카테닌 경로를 가진 형질전환된 세포주(HEK293 및 A375SM)를 사용하였다. 세포는 여러 농도의 헥사클로로펜으로 항온반응 되었고, 세포성장은 측정되었다. 표 3에서 보이듯이, 헥사클로로펜은 SK-MEL5 및 HCT116 세포의 성장을 낮은 농도에서 (IC50 < 1.5 μM) 억제하였다. 반면에, HEK293 및 A375SM 세포들은 헥사클로로펜에 의해서 적게 영향 받았다(도 3 참조). 이들의 결과는 헥사클로로펜이 비정상적으로 활성화된 CRT를 가지고 있는 암세포의 성장을 선택적으로 억제한다는 것을 보인다.

[실시예 5] 헥사클로로펜의 세포내 베타-카테닌 단백질의 양 감소

헥사클로로펜은 세포질의 베타-카로텐의 양만을 특이적으로 감소시켰다. 헥사클로펜은 CRT-양성의 세포(HCT116 및 SK-MEL5)의 증식을 억제하였으나, CRT-음성의 세포(HEK293 및 A375SM)의 증식을 억제하지 않았다(도 4 참고).

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의 헥사클로로펜 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

헥사클로로펜 나트륨염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖이 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

헥사클로로펜 나트륨염·············································· 2 g

사카린·························································· 0.8 g

당 ·····························································25.4 g

글리세린························································ 8.0 g

향미료 ·························································0.04 g

에탄올 ··························································4.0 g

소르브산 ························································0.4 g

증류수 ···························································정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

헥사클로로펜·나트륨염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

헥사클로로펜 나트륨염············································250 g

락토오스 ······················································175.9 g

감자전분 ························································180 g

콜로이드성 규산 ··················································32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ························································160 g

활석 ···························································· 50 g

스테아르산 마그네슘 ·············································· 5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

헥사클로로펜 나트륨염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

헥사클로로펜 나트륨염 ·············································1 g

염화나트륨·······················································0.6 g

아스코르브산·····················································0.1 g

증류수····························································정량

본 발명에 따른 헥사클로로펜, 이의 유도체 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 대장암 및 흑색종 세포에서 선택적인 억제효과를 보였다. 때문에 본 발명에 따른 헥사클로로펜, 이의 유도체 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 대장암 및 흑색종의 국부 치료제로 효과적이다.

Claims (3)

1. 헥사클로로펜 또는 이들의 약학적 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 암치료를 위한 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 암이 대장암 또는 흑색종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 삭제

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