KR20120025707A - 2-리놀레오일 글리세롤을 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 잔대(사삼) 추출물 및/또는 이로부터 분리된 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 상기 질환들의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

2-리놀레오일 글리세롤을 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for treating or preventing allergic diseases comprising 2-linoleoyl glycerol}
본 발명은 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 잔대(사삼) 추출물로부터 분리된 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 상기 질환의 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
각종 공해로 인한 환경오염, 스트레스, 또는 변화된 의식주를 포함한 주거환경 등의 원인에 의해 알러지성 질환이 날로 증가하는 추세에 있다. 알러지성 질환이란 신체가 원인 물질에 지나칠 정도로 과민하게 반응함으로써 발생하는 매우 까다로운 만성적인 질환으로, 인체의 면역 체계에 이상이 생겨 나타나는 질환이다.
알러지성 질환으로는 외부로부터 들어온 항원에 의한 면역반응이 일어나는 부위에 따라 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염 등 다양하지만, 질병의 원인이 외부로부터 유입된 원인 물질에 대한 과민성에 기인한다는 점에서 공통적이기 때문에 과다한 면역 반응을 억제시켜 줄 수 있는 약물이 공통적으로 사용될 수 있다.
대표적 알러지성 질환인 천식은 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민성을 그 특징으로 하는 질환으로 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들은 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다. 대부분의 천식은 알레르기성이며, 만성 기도염증(chronic airway inflammation)과 기도 과민반응성 (bronchial hyperresponsiveness)이 특징이다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp.97-104).
알레르기성 천식 환자는 세계인구의 약 10 %를 차지하는 것으로 알려져 있으며(2억 7500만 명, 1995년), 미국에만 1700만 명이 천식으로 고생하고 있고, 이 중 500만 명이 청소년이라고 보고 되어 있다. 2000년도에 알레르기성 천식 치료제의 미국 시장 규모가 약 64억 $ 이었으며, 한국 시장도 약 10억 $로 전체 한국의 약품 시장의 20 % 정도를 차지한다고 보고되었다.
현재 천식 치료에 사용되는 약물로는 흡입용 기관지 확장제, 경구용 또는 주사용 기관지 확장제(교감신경 자극제 및 테오필린계 약제들), 류코트리엔 길항제(몬테루카스트, 트란루카스트, 질루톤 등), 항알러지 약제(크로모린 소디움, 케토티펜) 등이 있다. 이 중 항콜린제, 베타2수용체 항진제 등의 기도확장제는 질병을 악화시키는 염증에는 효과가 없이 단순히 증상만 완화하기 때문에 장기간 사용시 약제 내성 발생 및 병증 악화의 우려가 있다. 염증에 효과가 있다고 알려진 스테로이드제는 심한 부작용으로 인해 장기간 사용 시 문제가 되고 있다. 따라서, 이 둘을 병용 처방하는 경우가 많은데 스테로이드류의 부작용으로 인해 경구제보다 흡입제 형태로 개발되어 복용이 어렵기 때문에 복용순응도가 떨어지는 문제점이 있다.
알러지성 비염(allergic rinitis)은 화분, 먼지, 곰팡이 또는 동물의 털과 같은 알러지 유발물질(allergen)에 의해 재채기, 간지러움, 코막힘, 콧물 등의 증상을 나타내는 비(鼻)질환으로, 비염을 잘 일으키는 원인물질(allergen)이 코 안에 닿게 되면 코 점막 아래의 혈관이나 분비샘을 자극하여 콧물이 많이 나오게 되며, 신경반사로 코가 가렵고, 재채기가 나오며, 외부로부터 이물질의 흡입을 줄이려는 노력으로 코가 막히게 된다. 또한, 알러지성 비염의 증상은 대부분의 환자에서 다른 만성비염의 증상과 임상적으로 잘 구분되지 않을 뿐 아니라 알러지의 원인 물질에 대한 노출 이외에도 대기 중의 여러 오염물질, 분진, 습도나 기온의 변화 등 여러 가지 일반적인 자극에 의해서도 증상이 유발될 수 있어서 치료가 어려운 실정이다.
현재 이러한 알레르기성 비염 치료제로는 이부프로펜(ibuprofen), 디클로페낙(diclofenac), 나프록센(naproxen) 등과 같은 소염진통제 및 트라닐라스트(tranilast), 케토티펜(ketotifen) 등의 화학물질이 사용되고 있다. 그러나 이러한 화학물질은 독성이 심하여 소화장애, 어지러움증 및 속쓰림 등의 부작용을 유발시킬 뿐만 아니라 장기적으로 복용할 경우 내성을 생기게 하여 비염을 만성화시키는 문제점을 갖는다.
알러지성 결막염은 세균, 바이러스, 알레르기, 또는 환경적 요인에 의해 발생하는 결막의 염증상태로서 가장 일반적으로 발병되는 안(眼)질환으로, 눈의 가려움, 눈물, 따가움, 붉은 눈 및 두통 증상을 나타내며, 크게 감염성 결막염(infectious conjunctivitis) 및 비감염성 결막염(non-infectious conjunctivitis)으로 분류되고, 치료시 보통은 잘 치유되나 경우에 따라서는 치명적이어서 조직손상에 의한 실명까지 초래할 수 있다.
알레르기성 결막염은 항히스타민제 안약이나 스테로이드 안약으로 치료되어 왔다. 결막염의 대표적인 치료제인 글루코코르티코이드 계통의 스테로이드성 항염증 약물은 두 가지 범주의 부작용을 유발하는데, 첫째는 장기간 사용 후 갑자기 투약을 중지할 때와, 둘째는 장기간 과잉 사용으로 나타나는 증상이다. 부신 피질 호르몬을 장기간 투여하다가 갑자기 중단하면 급성 부신 기능 부전으로 전신 쇠약감, 발열, 근육통, 관절통 및 식욕감퇴 등의 증상이 나타나며, 세균, 바이러스 등에 대한 감염의 위험성이 증가하고, 체중이 늘고 체형이 변하며, 불면증이 잘 동반된다. 특히, 글루코코르티코이드의 점안제 또는 연고는 환자의 자의적인 판단에 의해 장기적으로 사용하면 안압상승으로 인한 녹내장, 백내장 또는 세균성 감염 등의 부작용을 유발하기 쉽다. 이와 같은 부작용 때문에 글루코코르티코이드류의 사용상 문제점이 많다.
알러지성 질환은 대부분이 항원-항체 반응에 의해 활성화된 조직의 비만세포 및 혈액의 호염기성 세포 및 호산구에서 유리되는 매개체들(주로 히스타민, 류코트리엔, 프로스타글란딘, TNF-α, 사이토카인 등)에 의해서 야기된다. 현재 사용되는 알러지 치료 약물들의 용도는 증상완화에 머무르고 있거나 부작용이 있기 때문에 보다 근본적이고 안전한 치료 약물의 개발이 절실히 요구된다.
알러지성 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질인 프로스타글란딘류(prostaglandindes), 류코티리엔류(leukotriens)를 포함하는 에이코사노이드(eicosanoid), 혈소판활성화인자(PAF) 등은 포스포리파제 A2(phospholipase A2, PLA2) 및 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로 부터 생성된다.
아라키돈산 대사계 율속효소(rate-limiting enzyme)인 포스포리파제 A2(PLA2)는 세포내 분포위치에 따라 세포내성(cPLA2) 및 세포외성(분비성 PLA2, sPLA2)으로 나누며, sPLA2의 동종효소(isozyme)는 10종류가 있으며, 이 효소중에서 특히 sPLA2-IIA, sPLA2-V는 각종 염증질환, 알러지 반응에 직접 및 간접적으로 관여함이 알려져 있다(Murakami M et al, Phospholipase A2 enzymes. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 68-69, pp.3-58, 2002; Reid RC, Inhibitors of secretory phospholipase A2 group IIA. Curr. Med. Chem. 12, pp.3011-3026, 2005). 포스포리파제 A2는 세포막구성 인지질인 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine) 및 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine)의 sn-2 위치에 작용하여 아라키돈산을 유리하는 작용을 한다. 아라키돈산은 시클로옥시게나제에 의해 에이코사노이드로 변환된다. 결과적으로 포스포리파제 A2를 억제하면 염증 유발물질인 에이코사노이드가 감소하게 되며, 이러한 기전은 사람을 포함한 포유동물의 천식(asthma), 관절염(arthritis), 류마티스성 질환(rheumatic disease)의 증상을 치료 또는 완화시키는 방법에 이용될 수 있다(Pinon P. et al., Rev. Esp. Cardiol. 59, pp.247-250, 2006; Farooqui AA et al., LA. Neuroscientist. 12, pp.245-260, 2006).
시클로옥시게나제(cyclooxygenase)는 혈액 응고(blood clotting)와 염증(inflammation)에 중요한 영향을 미치는 효소로, 세포막에 결합되어 있다. 이 효소는 아라키돈산의 산화반응으로 프로스타글란딘(prostaglandin), 프로스타사이클린(prostacyclin)과 트롬복산(thromboxane)이란 주요한 산물을 형성한다. 트롬복산은 혈소판(platelets)에 존재하는 COX-1이라는 효소에 의해 생성되며 혈관의 수축과 혈소판의 끈적거리는 성질을 유도하는 기능을 갖는다. 이에 반해서 COX-2라는 효소는 혈관에서 발현되면서 프로스타글란딘, 프로스타사이클린을 생성한다. 프로스타사이클린은 혈관을 확장시키며 혈소판의 활성을 차단하는 기능을 갖고 있다. 시클로옥시게나제 저해작용이 있는 대부분의 약물은 국소염증에서의 프로스타글란딘의 생성억제에 의한 진통, 항부종작용, 해열작용, 항염증 및 혈소판 항응집성이 있다(Learney, PM, et al. BMJ, 332, pp.1302-1308, 2006; Silva, PJ, et al. Theoret. Chem. Accounts, 110, pp.345-351, 2003; Vally, M et al. Curr. Pharm. Biotechnol. 7, pp.241-246, 2006; Capone, ML et al. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 1, pp.269-282, 2005).
리폭시게나제(Lipoxygenase)는 아라키돈산(arachidonic acid)의 산화반응을 촉매시켜 류코트리엔을 생합성시키는 경로에서 첫 번째로 공개된 효소이다. 리폭시게나제는 아라키돈산을 하이드로퍼옥시에이코사테트라에노산(HPETE)으로 전환시키는데, 이것은 하이드록시에이코사테트라에노산(HETE) 및 류코트리엔을 생성시키는 대사경로의 첫번째 단계이다. 아라키돈산의 리폭시게나제 대사로부터의 생성물은 관련되며 이들은 여러 가지 질병상태에서의 조절제로서 관련된다. 예를들면, 류코트리엔 C4 및 D4의 에어로졸은 기관지 수축을 유발시키며, 류코트리엔 B4와 5-HETE는 다형핵 류코사이트(polymorphonuclear leukocytes)와 같은 염증세포에 대해 강력한 주화인자이다. 이들은 또한 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 환자의 혈액에서 발견된다. 류코트리엔은 또한 알러지성 비염, 건선, 성인 호흡기 질환 증상, 크론병(Crohn's disease), 체내독성 쇼크(endotoxin shock) 및 심근 손상으로 유도된 허혈(ischemia)에서 중요한 조절제로서 관련된다. 따라서, 리폭시게나제 효소가 염증, 천식, 알러지성 관절염, 건선(psoriasis) 및 암 등 다양한 질병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Radmark O. J. Lipid Mediat. Cell Signal. 12, pp.171-184, 1995; Dwyer JH, et al. New Engl. J. Med. 350, pp.4-7, 2004; Taccone-Gallucci M, et al. Kidney Int. 69, pp.1450-1454, 2006; Manev H et al., Med. Hypotheses 66, pp.501-503, 2006).
잔대(사삼)(Adenophora triphylla var. japonica Hara, Adenophora polyantha Nakai, Adenophora triphylla var. hirsuta Nakai, Adenophora lilifolia Ledeb., Adenophora stricta Miq., Adenophora taquetii Lev., Adenophora palustris Kom.)는 초롱꽃과(도라지과)에 속하는 오래살이풀로서 전국의 어디에서나 자생하며 주로 양지 바른 산기슭에서 자라고 있다. 키는 40-120cm정도 되며 식물체 전체에 잔털이 있다. 잎은 줄기를 따라 대생, 윤생 또는 호생하며 긴타원형 또는 둥근타원형에 길이는 4-8 cm, 폭은 0.5-4 cm 정도로 가장자리에는 톱니가 있다. 뿌리의 주성분은 더덕, 도라지와 같은 사포닌이다. 그러나 잔대(사삼) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 천식, 결막염 등의 알러지 질환에 효과가 있다는 것에 대해서는 교시되거나 개시된 바가 없다.
본 발명자들은 잔대(사삼) 추출물로부터 분리된 2-리놀레오일 글리세롤(linoleoyl glycerol) 화합물이 여러가지 사이토카인 및 관련 단백질인 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α, 시클로옥시게나제-2(COX-2) 및 리폭시게나제의 활성을 억제하여 류마티스성 관절염, 다른 유형의 관절염, 천식, 비염, 결막염 등을 포함하는 알러지성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 또는 상기 질환들의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 잔대(사삼) 추출물 및 이로부터 분리된 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 또는 상기 질환들의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 잔대(사삼) 추출물 및 2-리놀레오일 글리세롤을 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 잔대(사삼) 추출물 및 2-리놀레오일 글리세롤을 포함하는 알러지성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 2-리놀레오일 글리세롤은 잔대(사삼)로부터 추출?분리?정제하여 얻는 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다. 즉, 상기 화합물은 다른 원료로부터 추출?분리?정제하여 얻을 수도 있으며, 공지의 합성방법으로 제조될 수도 있고, 시판되는 시약으로도 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 잔대(사삼)로부터 2-리놀레오일 글리세롤을 분리, 정제하는 방법을 제공한다. 분리, 정제하는 방법은 구체적으로 다음과 같다.
우선, 잔대(사삼)를 물, C1~C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 잔대(사삼) 추출물을 수득한다. 그리고 상기 잔대(사삼) 추출물을 물, n-헥산(n-hexane), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 또는 n-부탄올(n-butanol)로 분획하여 잔대(사삼) 분획물을 수득한다. 마지막으로 상기 잔대(사삼) 분획물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 2-리놀레오일 글리세롤을 얻는다.
본 발명의 잔대(사삼) 추출물은 바람직하게 잔대(사삼) 뿌리 추출물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 잔대(사삼) 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올과 같은 C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 잔대(사삼) 추출물은 에탄올로 추출한 것이며, 가장 바람직하게는 상기 잔대(사삼) 추출물은 10 내지 100 % 에탄올 추출물이다.
또한, 본 발명의 상기 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물 및 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 잔대(사삼) 추출물 및/또는 2-리놀레오일 글리세롤을 포함하는 조성물은 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명에서 알러지성 질환은 호흡기 질환, 안(眼)질환, 비(鼻)질환, 위장질환, 폐질환 또는 염증질환일 수 있으며, 구체적으로는 기관지 천식, 알러지성 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 위장관 알러지, 또는 관절염이며, 감기, 재채기, 혈관부종, 호산구증다증, 복통, 구토, 설사 증상을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "질환의 예방 또는 치료"란, 상기 질환의 예방, 완전한 또는 부분적인 치료를 포함한다. 이는 또한 증상의 감소, 증상의 개선, 증상의 고통 경감, 질환의 발생율 감소를 포함한다.
알러지성 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질은 인터루킨, 프로스타글란딘, 류코트리엔 등으로서, 이들은 포스포리파제 A2, 시클로옥시게나제-2, 리폭시게나제 등에 의하여 생성될 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 2-리놀레오일 글리세롤을 처리한 경우 알러지성 질환의 원인이 되는 상기 사이토카인 또는 관련 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 2-리놀레오일 글리세롤이 농도 의존적으로 지방세포내 염증유발 화학적 매개체들의 탈과립 반응을 억제시킴을 확인하였고(도 2), 2-리놀레오일 글리세롤의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α, 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 2-리놀레오일 글리세롤이 COX-2 및 사이토카인에 의한 신호전달 과정에 관여하는 단백질들(p-AKT, p-ERK, p-JNK, p-p38)의 발현을 억제함을 확인하였으며(도 4), 2-리놀레오일 글리세롤의 농도가 증가할수록 리폭시게나제의 활성 억제률이 비례적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 5).
따라서, 본 발명의 2-리놀레오일 글리세롤의 염증유발 반응 메커니즘을 차단하거나 그의 활성을 억제함으로서 알러지성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 이용할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 상기 2-리놀레오일 글리세롤은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.
염으로는 약제학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴)를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예를 들어, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있는데, 무기산으로는 염산, 브롬산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예를 들어, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등이 포함된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐 제형의 경우, 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서, 상기 화학식 1의 화합물을 안정제, 완충제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제 등을 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플이나 바이알의 단위 투여형으로 제제한다. 비수성용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 2-리놀레오일 글리세롤은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 치료 기간 및 질환의 중증도에 따라 적절하게 변화될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 알러지성 질환의 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 예를 들어, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 환제, 액제 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 단백질, 지방, 영양소, 조미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제(예를 들어, 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등과 같은 스테비아 추출물) 및 합성 향미제(예를 들어, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)은 지방세포내 염증유발 화학적 매개체들의 탈과립 반응 억제효과 및 알러지 유발 사이토카인 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α 활성을 억제하는 효과, 염증 발생 산물을 합성하는 효소인 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 유전자 발현 억제효과, 리폭시게나제의 활성을 억제하는 효과를 나타내어 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 상기 질환들의 개선용 식품 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 잔대(사삼) 추출물로부터 분획물을 획득하고 분획물로부터 2-리놀레오일 글리세롤을 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 2-리놀레오일 글리세롤에 의한 지방세포내 염증유발 화학적 매개체들의 탈과립 억제효과를 나타낸 것이다.
도 3은 2-리놀레오일 글리세롤에 의한 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α, 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 2-리놀레오일 글리세롤에 의해 체내 사이토카인 생성에 중요한 역할을 하는 MAP 키나아제의 활성도가 농도 의존적으로 감소되는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 2-리놀레오일 글리세롤에 의한 리폭시게나제 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 잔대( 사삼 ) 추출물 제조
음건한 건조분말 잔대(사삼)(Adenophorae Radix) 1.5 kg에 80 % 에탄올을 가하고 24시간 2회 냉침추출 하였다. 추출액을 여과한 후에 회전 감압 농축기로 농축시켜 에탄올 추출물을 얻었다.
실시예 2: 잔대(사삼) 추출물 유래 용매분획물 분리
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조한 잔대(사삼) 에탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올로 용매 분획하여 추출물(16 g), 에틸아세테이트 추출물(1 g), 부탄올 추출물(9 g)을 얻었다. 상기 얻어진 디클로로메탄 분획층을 감압상태에서 증발시켜 16 g의 추출물을 얻었고, 추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래프를 실시하였다. 용출액은 헥산-아세톤 (1:0, 90:1, 70:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1)의 조성을 바꾸어 단계적으로 용출시켰다. 총 12 개의 소분획(G22JC-72-1~12)으로 나누었고, 이 중 G22JC-72-9 소분획에 대하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래프(디클로로메탄-아세톤 = 90:1, 70:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1)를 실시하였으며, 9개의 소분획(G22JC-75-1~9)으로 구분하였으며, G22JC-75-5번과 6번 분획을 합하여 prep. HPLC(80 % 아세토니트릴; 20 ml/min; ODS 컬럼)를 진행하여 화합물 1을 분리하였다. 순수하게 분리된 화합물들은 UV, NMR, 질량분석 등을 실시하여 구조를 결정하였다.
실시예 3: 잔대(사삼) 추출물로부터 얻은 화합물의 이화학적 특성 분석
상기 실시예 2에서 순수하게 분리된 화합물 1에 대해 물리화학적 및 분광학적 분석을 실시하였다. 상기 화합물의 분자량을 측정하기 위하여 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)를 사용하였으며, 구조를 규명하기 위하여 핵자기공명기(NMR, Bruker Co., 100MHz, 400MHz)를 사용하였다. 상기 화합물을 NMR전용 Merck Co.에 CDCl3에 녹여 NMR 튜브 내에 넣고, 수소 및 탄소 핵자기공명을 측정하였고, 각 용매의 피크를 내부 표준물질로 하거나 TMS(tetramethylsilane)의 피크를 기준으로 하여 측정하였다.
상기 화합물 1은 무색의 오일상(colorless oil) 성분으로 분리되었으며, ESI-MS로부터 분자량 m/z 377 [M + Na]+로부터 분자량은 354 amu로 확인하였고, 분자식 C21H38O4임을 알 수 있었으며, 불포화도는 3으로 나타났다. 1H-NMR 및 13C-NMR에서 δH 5.31-5.41(4H, m)과 δC 130.2, 130.0, 128.1, 127.9로부터 olefinic group signal을 확인하였으며, δH 2.77 (2H, brt, Ｊ = 6.5 Hz)에서 2 개의 이중결합 사이에 존재하는 1 개의 methylene signal을 확인하였으며, δH 2.38 (1H, t, Ｊ = 7.5 Hz)에서는 ester group에 연결되어 있는 methylene signal을 각각 확인하였다. 또한, δH 2.05 (4H, dd, Ｊ = 13.5, 6.5 Hz)에서는 2 개의 allylic methylene signal 및 δH 1.64 (2H, m)에서 ester bond의 β 위치에 있는 methylene signal과 δH 1.27-1.37 (14H, brs)에서 7 개의 methylene signal을 확인하였으며, δH 0.89 (3H, t, Ｊ = 7.5 Hz)에서는 primary methyl group에 기인하는 signal을 확인할 수 있었다. 이상의 기기분석 데이터로부터 linoleic acid의 부분 구조를 결정하였다.
또한, 나머지 signal인 δH 4.93 (1H, qui, Ｊ= 5.0 Hz, H-2), 3.83 (4H, d, Ｊ = 5.0 Hz, H-1, H-3)과 δC 75.0 (C-2), 62.6 (C-1, C-3)로부터 화학식 2에 나타낸 바와 같이 화합물 1은 C-1과 C-3은 대칭을 이루고 있으며, C-2 위치에 linoleic acid가 결합된 glycerol 화합물로 추정하였으며, HMBC로부터 H-2 (δH 4.93)와 δC 174.1 (C-1')과의 상호관계(correlation)로 linoleic acid는 glycerol 2번 위치에 결합하고 있음을 확인하였다. 이상의 기기분석 결과 및 문헌과의 비교로 화합물 1의 구조를 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoylglycerol)로 구조 결정하였으며, 하기 화학식 1로 표시하였다.
Figure pat00002
1) 성상 : 무색 오일상 (colorless oil)
2) 분자식 : C21H38O4
3) 분자량 : 354.52
4) ESI-MS m/z : 377 [M + Na]+
5) 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ : 5.31-5.38 (4H, m, H-9', 10', 12', 13'), 4.93 (1H, qui, Ｊ = 5.0 Hz, H-2), 3.84 (4H, d, Ｊ = 5.0 Hz, H-1, H-3), 2.77 (2H, brt, Ｊ = 6.5 Hz, H-11'), 2.38 (1H, t, Ｊ = 7.5 Hz, H-2'), 2.05 (4H, dd, Ｊ = 13.5, 6.5 Hz, H-8', 14'), 1.64 (2H, m, H-3'), 1.27-1.37 (14H, brs, H-4', 5', 6', 7', 15', 16', 17'), 0.89 (3H, t, Ｊ = 7.5 Hz, H-18')
6) 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ : 174.1, 130.3, 130.0, 128.1, 127.9, 75.0, 62.6, 34.3, 31.5, 29.7, 29.6, 29.4, 29.2, 29.1, 29.08, 27.2, 27.19, 25.6, 24.9, 22.6, 14.1
Figure pat00003
실험예 1: 베타- 헥소사미니데이즈 (β- hexosaminidase ) 분석
상기 실시예 2에서 제조된 2-리놀레오일 글리세롤에 의해 염증유발시 발생되는 비만세포에서의 탈과립(degranulation) 억제 효과를 측정하기 위해서, 베타-헥소사미니데이즈 분석을 하기와 같이 수행하였다.
헥소사미니데이즈(hexosaminidase)는 N-아세틸-β-D-헥소사미니드에서 N-아세틸-D-헥소사민을 가수분해하는 효소로서, 항원 자극 후 비만세포에 의해 분비되고, 상기 분비된 효소의 양에 따라 탈과립 정도를 측정할 수 있다. 탈과립 정도 측정은 RBL-2H3 세포주를 이용하는데 이 세포는 표면에 IgE 항체의 수용체를 갖고 있고, 이 수용체는 항원에 의한 자극으로 서로 복합체를 이루게 되면 세포 내의 입자들이 터지면서 입자 내에 포함된 베타 헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase)라는 효소를 분비하게 된다. 이 효소의 분비가 급격히 증가하게 되면 알러지 반응이 발생하고, 알러지 반응시 칼슘(calcium) 이온의 유입이 증가하여 타이로신 키나제의 일종인 세린/타이로신 키나제(Syk)의 활성화가 일어나서 미토젠 활성화 단백질 키나제(mitogen activated protein kinase; MAPK) 등의 키나제 활성이 연쇄적으로 일어나게 된다.
Rat basophlic leukemia 셀 라인인 RBL-2H3 세포주를 15 % FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 배지와 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 24 well plate에 2X105/well로 분주한 후 24시간 배양하였다.
상등액을 제거 후 민감화를 위하여 25 ng/ml anti-DNP IgE 가 포함된 MEM 배지를 넣고 4시간 배양 후 PIPES buffer 500 ㎕로 두 번 세척하고 0.4 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 0.1 % BSA를 포함시킨 PIPES buffer를 180 ㎕ 넣고 10분 동안 배양하였다. 전 배양 후 실시예 2에서 제조된 시료를 25, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 20분간 처리 후 50 ng/ml DNP-BSA 20분간 반응시켜 자극하였다. Ice에서 10분 방치하여 반응을 종결시킨 후 상등액을 25 ㎕씩 96 웰 플레이트에 넣고, 1mM P-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드를 25 ㎕ 넣은 후 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응을 종결시키기 위해 stop solution(0.1 M NaHCO3, 0.1 M Na2CO3)을 첨가하였고, 이후 405 nm 파장대에서 ELISA 리더로 흡광도를 측정하여 분비된 베타-헥소사미니데이즈 양을 확인하였다. 양성 대조군으로는 ketotifen(100 ㎍/ml)을 사용하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실험결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 2-리놀레오일 글리세롤이 농도 의존적으로 탈과립 반응을 억제시킴을 확인할 수 있었고, 탈과립 최대 반응의 50 %를 나타내는데 필요한 농도인 EC50은 196.85 uM였다(도 2 참조).
실험예 2: RT - PCR 측정
상기 실시예 2에서 제조된 2-리놀레오일 글리세롤에 의한 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α, 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제 효과를 측정하기 위해서, 하기와 같이 실험을 수행하였다.
RBL-2H3 세포를 1X106/well로 6 well plate에 배양 후 IgE를 넣은 후 4시간 반응 시켰다. 그 이후 2-리놀레오일 글리세롤 처리 후 DNP-BSA를 첨가하여 각각 37℃에서 20분씩 반응시켰다. PBS로 2번 세척 후 Trizol(Invitrogen)을 넣어서 세포를 용해시킨 후 클로로포름(sigma)을 넣고 13000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액과 이소프로판올(isopropanol)을 섞은 후 반응시켜 RNA를 침전시킨 후 에탄올로 1회 세척하여 RNA를 분리하였다.
추출한 RNA를 이용하여 역전사 효소인 SuperscriptⅢ(Invitrogen)를 사용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 합성하였다. 상기 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α, 시클로옥시게나제-2(COX-2) 및 대조군인 GAPDH의 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다. PCR 조건은 94 ℃ 45초, 55 ℃ 45초, 72 ℃ 1분 30초를 35 cycle 반응시켜 DNA를 증폭시켰다. 각 유전자의 발현 억제 효과를 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
Figure pat00004
실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 2-리놀레오일 글리세롤의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10), TNF-α, 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 유전자 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
실험예 3: Western blotting 측정
상기 실시예 2에서 제조된 2-리놀레오일 글리세롤에 의한 COX-2 및 사이토카인에 의한 신호전달 과정에 관여하는 단백질들(p-AKT, p-ERK, p-JNK, p-p38)의 발현 억제효과를 측정하기 위해서, 하기와 같이 실험을 수행하였다.
RBL-2H3 세포를 IgE로 감작 시킨 후 DNP-BSA로 자극 시킨 세포를 PBS로 세척 후 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 with 150 mM sodium chloride, 1 % NP40, 0.5 % sodium deoxycholate, 0.1 % sodium dodecyl sulfate)에 용해시켰다. 13000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 단백질을 추출하여 정량 후 100 ℃에서 5분간 단백질을 변성시켰다. 정량된 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 전기 영동 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인은 0.1 % Tween 20과 5 % 탈지 건조된 우유를 포함하고 있는 TBS-T buffer로 블로킹(blocking) 하였다. 또한, 상기 멤브레인의 단백질은 1차 항체 (1:1000)와 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase)와 복합된 2차 항체 (1:10000)에 반응시킨 후 ECL western detection 시약으로 원하는 단백질을 규명하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 2-리놀레오일 글리세롤의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 사이토카인 생성에 영향을 미치는 p-AKT, p-ERK, p-JNK, p-p38 단백질 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
실험예 4: 리폭시게나제(lipoxygenase)의 활성 억제효과 측정
상기 실시예 2에서 제조된 2-리놀레오일 글리세롤에 의한 리폭시게나제(lipoxygenase)의 활성 억제효과를 측정하기 위해서, 하기와 같이 실험을 수행하였다.
0.1 M 트리스 완충용액(Tris buffer, pH 8.5) 2 ml에 각각의 농도별로 2-리놀레오일 글리세롤 20 ul를 첨가하고, 기질인 linoleic acid(최종농도 110 uM) 20 ul를 혼합하고 실온에서 5분간 전반응 시켰다. 반응액에 soybean lipoxygenase(Type Ⅴ, 500 UNIT/ 최종농도) 20 ul를 첨가한 후 5분간 반응시키고 234 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 2-리놀레오일 글리세롤의 농도가 증가할수록 리폭시게나제의 활성 억제률이 비례적으로 증가하는 것을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

    [화학식 1]
    Figure pat00005

  2. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 잔대(사삼)(Adenophora triphylla)로부터 분리된 것인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 잔대(사삼) 추출물을 더 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 알러지성 질환은 호흡기 질환, 안(眼)질환, 비(鼻)질환, 위장질환, 폐질환 또는 염증질환인 것인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 알러지성 질환은 기관지 천식, 알러지성 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 위장관 알러지, 또는 관절염인 것인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 2-리놀레오일 글리세롤(2-linoleoyl glycerol)을 포함하는 알러지성 질환의 개선용 식품 조성물.

    [화학식 1]
    Figure pat00006

  7. 제 6항에 있어서, 상기 화합물은 잔대(사삼)(Adenophora triphylla)로부터 분리된 것인 알러지성 질환의 개선용 식품 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 잔대(사삼) 추출물을 더 포함하는 알러지성 질환의 개선용 식품 조성물.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 알러지성 질환은 호흡기 질환, 안(眼)질환, 비(鼻)질환, 위장질환, 폐질환 또는 염증질환인 것인 알러지성 질환의 개선용 식품 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 알러지성 질환은 기관지 천식, 알러지성 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 비염, 위장관 알러지 또는 관절염인 것인 알러지성 질환의 개선용 식품 조성물.


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