KR20120023814A

KR20120023814A - 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유하는 항비만제

Info

Publication number: KR20120023814A
Application number: KR1020117030449A
Authority: KR
Inventors: 유코 후쿠이; 스미오 아사미; 미츠루 마에다
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2009-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2012-03-13
Also published as: EP2433625B1; US20120065410A1; US9169231B2; ES2643463T3; TW201109018A; KR101624006B1; AU2010250330B2; JPWO2010134595A1; JP2014237649A; US20150038573A1; CN102427807B; JP5694149B2; WO2010134595A1; US8658237B2; EP2433625A1; JP5881780B2; AU2010250330A1; US20140121388A1; EP2433625A4; CN102427807A

Abstract

본 발명의 목적은 차 유래의 성분을 함유하는, 안전하고 향미를 손상시키는 경우가 없는 항비만제를 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 차 유래의 높은 리파아제 저해 활성 및 α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유함으로써, 안전하고 기호성이 높은 항비만제를 제공할 수 있다. 본 발명의 항비만제는 향미를 손상시키지 않고, 기호성이 높으며, 또한 중성 지방 저감 등의 건강 증진을 목적으로 한 음식료를 포함하는 여러 가지 용도에 이용할 수 있다.

Description

벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유하는 항비만제{ANTI-OBESITY AGENT COMPRISING COMPOUND CONTAINING BENZOTROPOLONE RING}

본 발명은 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유하는 항비만제에 관한 것이다.

비만은 현대 사회에 있어서의 가장 중대한 질환의 하나인데, 그 주된 요인은 지방의 과잉 섭취이다. 또, 지방의 과잉 섭취는 비만뿐만 아니라, 비만에서 기인되는 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 동맥 경화 등을 발증시키는 것이 알려져 있다. 내장 지방형 비만에 더하여, 고혈당?고혈압?지질 이상 중 어느 2 가지 이상을 함께 가진 상태는 메타볼릭 신드롬 (내장 지방 증후군) 이라고 불리며, 심장병이나 뇌졸중을 발병할 위험성이 높기 때문에, 최근 문제시되고 있다. 비만에 대한 치료약으로는 예를 들어 리파아제 저해 활성에 의해 장관으로부터의 지방 흡수의 억제 작용을 갖는 제니칼 (등록 상표) 이 비만 개선약으로서 시판되고 있지만, 지방변, 배변수의 증가, 연변, 설사, 복통 등의 부작용이 보고되어, 반드시 안전하다고는 말하기 어렵다 (비특허문헌 1).

비만을 예방하기 위해서는, 식사 제한에 의해 섭취 칼로리를 줄이는 것이 유효한 수단이기는 하지만, 확실한 영양 지도를 받아야 하고, 일상 생활에 있어서의 실행은 곤란한 경우가 많다. 그래서, 식사 유래의 지방이 체내에 흡수되는 것을 안전하게 또한 건강적으로 억제하는 것은, 비만 및 그것에 관련된 질환의 치료 혹은 건강 증진의 목적에서, 현실적이고 유용한 방책이다고 생각된다.

이와 같은 배경하에, 안전하며 또한 사람에 대한 유효성이 증명되어 있는 특정 보건용 식품의 개발이 주목되고 있다. 지금까지 식후의 혈청 중성 지방치의 상승을 억제하는 식품 소재로는, 췌장 리파아제 저해에 의해 지방 흡수를 억제하는 글로빈 단백 분해물, 트리아실글리세롤과는 상이한 소화 흡수 특성을 갖는 디아실글리세롤, 어유로부터 정제된 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사헥사엔산 (DHA) 등이 특정 보건용 식품으로서 발매되고 있다.

또, 식물 유래의 리파아제 저해 활성 물질도 최근 주목되고 있으며, 특히, 리파아제 저해 활성을 갖는 폴리페놀류에 관해서는, 식물 수피 유래의 타닌, 콩과 식물 차풀에 함유되는 타닌류나 플라보노이드류 및 그 배당체, 녹차 중의 주요한 성분 에피갈로카테킨갈레이트 및 에피카테킨갈레이트를 배합한 지질 흡수 억제 식품, 피망, 송이 버섯, 호박, 잎새 버섯, 녹미채, 녹차, 우롱차 등의 수추출물로 이루어지는 리파아제 저해제, 플라본 및 플라보놀류, 하이드록시벤조산류 (갈산), 트리테르펜류 화합물 및 그 유도체, 타마린드의 프로시아니딘을 유효 성분으로 하는 항비만제 등이 보고되어 있고, 또한 포도 종자 추출물의 리파아제 저해 작용 (비특허문헌 2), 살라시아 유래 폴리페놀에 의한 리파아제 저해 작용과 래트의 항비만 작용 (비특허문헌 3), 우롱차 추출물에 의한 마우스의 항비만 작용 (비특허문헌 4) 등이 알려져 있다. 또, 차에는 카테킨류가 많이 함유되고, 그 성분이 많이 분리?동정되어 있고 (비특허문헌 5), 차 유래의 성분을 함유하는 리파아제 저해제 (특허문헌 1, 특허문헌 2) 에 관한 보고가 있다. 그 중에서도 홍차나 우롱차의 색소로서 알려진 테아플라빈은 그 분자 내 갈레이트기의 수에 비례하여 강한 리파아제 저해 활성을 나타낸다 (특허문헌 2, 비특허문헌 6). 그러나, 이들 테아플라빈류의 함유량이나 비율은 차의 품종에 따라 일정하지는 않다.

또, α-글루코시다아제 저해 물질은 소장 상피 상에 국재되는 α-글루코시다아제를 저해하고, 당질의 분해?흡수를 억제?지연시킴으로써, 혈당치 상승 억제 작용을 갖는다. 따라서, α-글루코시다아제 저해 물질은 고혈당 증상의 만성화에서 유래되는, 당뇨병이나 비만증 등 여러 가지 질환에 유용하다.

1933년에 맥아 성분에 α-글루코시다아제 저해 활성이 발견된 이래, 많은 밀이나 콩류 등 식물 유래의 α-글루코시다아제 저해 물질이 발견되어 왔다. 1966년에는, 미생물 대사 산물로부터, α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는 노지리마이신이 단리되고, 구조 결정되었다. 이 유연 화합물인 1-데옥시노지리마이신이 상엽의 추출물로부터 얻어지고, α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는 것이 알려져 있고, 그 활성 저하를 시키지 않기 위한 추출 방법이 개시되어 있다 (특허문헌 3).

또, 코타라힘브트의 뿌리로부터의 추출물에서 단리된 술폭사이드를 갖는 13 원자 고리 시클리톨 구조를 갖는 것은 말타아제 저해 활성을 갖는 것이 보고되어 있다 (특허문헌 4). 또, 나팔꽃이나 자색 고구마의 뿌리에서 단리된 안토시아닌 화합물로서, 디아실화된 펠라르고니딘, 시아니딘, 페오니딘의 3-소포로시드-5-글루코사이드는 말타아제 저해 활성을 갖는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 7). 또, 찻잎 중에 함유되는 테아시넨신 A, 갈로일기를 갖는 테아플라빈 유도체, 에피아프젤레틴갈레이트를 구성 유닛으로서 갖는 프로안토시아니딘 등에, 말타아제 저해 활성이 확인되어 있다. 그러나, 갈로일기를 갖는 테아플라빈 유도체는 말타아제 저해 활성을 갖지만, 찻잎 중의 함유량은 0.1 ? 0.2 ％ 로 매우 적다 (특허문헌 5, 비특허문헌 8).

홍차의 테아플라빈 및 녹차의 카테킨류가 α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는 것은 보고되어 있고 (비특허문헌 8), 카테킨류 중에서는, 3 위치에 갈로일기를 갖는 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트 (이하, 「EGCG」라고 한다) 나 에피카테킨-3-O-갈레이트, 테아플라빈류에서는 테아플라빈-3-O-갈레이트, 테아플라빈-3,3'-디-O-갈레이트에 활성이 확인되어 있다. 홍차의 α-글루코시다아제 저해 활성에 대해서는, 그 분획물 등에 대해서도 조사되어 있으며, 발효에 의한 중합이 진행된 고분자 획분에도 활성이 있는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 9).

한편, 홍차나 우롱차의 제조에 있어서의 발효에 있어서, 찻잎의 폴리페놀옥시다아제 등의 효소의 기능에 의해, 카테킨 혹은 갈산 등의 폴리페놀류가 축합되고, 벤조트로폴론 고리를 갖는 화합물이 형성되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 10).

차 중에는 테아플라빈 이외에도 많은 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 존재가 보고되어 있다. 예를 들어, 푸르프로갈린 유도체의 아포토시스 유도 (특허문헌 6) 나 에피테아플라갈린류의 식품용의 제조 방법 (특허문헌 7), 혹은 테아플라빈의 3량체인 테아디벤조트로폴론 A (Theadibenzotropolone A) 의 효소적 제법과 홍차 중에서의 존재 (비특허문헌 11) 등이 보고되어 있다. 또한 여러 가지의 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 항염증 작용 (비특허문헌 12) 에 대해서도 알려져 있다. 그러나, 테아플라빈류, 에피테아플라갈린류 이외의 벤조트로폴론 고리 함유 화합물에 대해서는, 지방 흡수에 관련된 리파아제 저해 작용이나 혈당치 상승 억제 작용에 관련된 α-글루코시다아제 저해 작용은 알려져 있지 않다.

WO2005/077384호 WO2006/004110호 일본 공개특허공보 2007-60908호 일본 공개특허공보 2008-137925호 일본 공개특허공보 2007-231009호 일본 공개특허공보 2004-359576호 WO2007-141945호

Lancet 1998；352：167-172 Nutrition 2003 ; 19(10) : 876-879 J. Nutr. 2002 ; 132 : 1819-1824 Int. J. Obes. 1999 ; 23 : 98-105 일본 식품 과학 공업회지 제46권, 제3호, 138 ? 147 페이지, 1999년 3월 Chem. Pharm. Bull. 2008 ; 56 : 266-272 J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1952-1956 J. Agric. Food. Chem., 55, 99-105, 2007 Chem. Pharm. Bull. 56(3), 266-272, 2008 Tetrahedron 1973 ; 29 : 125-142 Tetrahedron Letters 2002 ; 43 : 7129-7133 Bioorganic & Medicinal Chemistry 2004 ; 12 : 459-467

어느 식물의 추출물에서 효과가 있었다고 해도, 그 중에 함유되는 활성 성분량을 명확하게 하지 않는 한, 천연물이 기원이기 때문에, 안정적으로 항비만 활성을 유지시키는 것은 곤란하다. 또, 상기에 나타낸 이미 알려진 리파아제 저해제나 α-글루코시다아제 저해제는 효과가 충분하지 않은 것도 있다.

또, 기호성이 낮은 식물 유래의 항비만제는 음식물로서 이용하면 향미에 악영향을 미치는 것이 예상된다. 한편, 기호성이 높은 차에 기원을 발하는 항비만제는 유효한 소재 후보가 될 수 있지만, 예를 들어 기호성이 높은 홍차나 우롱차를 음용하여 지질 저하를 도모한다고 해도, 대량으로 음용하지 않으면 효과가 얻어지지 않고, 일상 생활 중에서 실시하는 것은 현실적이지 않다. 단순하게 농축시킨 홍차나 우롱차를 제공했다고 해도, 쓴 맛?떫은 맛이 강하고, 카페인량도 증가해 버리기 때문에, 역시 이 방법도 현실적인 방책으로서 적당하지는 않다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연물 기원이고, 효과가 높은 항비만제를 제공하는 것이다.

또 본 발명의 목적은, 차 유래의 기호성이 높은, 췌장 리파아제에 대하여 높은 저해 활성을 나타내고, 식사 유래의 지방 흡수를 억제하고, 및/또는 비만의 억제나 예방에 기여하는 리파아제 활성 저해제를 제공하는 것이다. 또, 식사 유래의 당분의 흡수 억제, 나아가서는 고혈당 증상의 만성화에서 기인되는 당뇨병의 장기적인 예방 및/또는 치료에 기여하는 α-글루코시다아제 저해제를 제공하는 것이다.

또 본 발명의 목적은 기호성이 높으며, 또한 혈중의 중성 지방 저감, 건강 증진을 목적으로 한 음식료를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 식사 유래의 지방의 흡수를 억제하여, 혈중 중성 지방의 상승을 억제하는 의약 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 찻잎으로부터 지방 흡수에 필수적인 췌장 리파아제를 강력하게 저해하는 성분이며, 또한 높은 α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는 성분을 알아냈다. 구체적으로는, 찻잎 중에 존재하는 여러 가지 폴리페놀의 리파아제 저해 활성 및 α-글루코시다아제 저해 활성을 평가하여, 식 (1) 로 나타내는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물에 강한 리파아제 저해 활성이 있는 것, 및 강한 α-글루코시다아제 저해 활성이 있는 것을 밝혀냈다. 그들 화합물은 홍차에 함유되는 카테킨이나 폴리페놀의 산화물인 점에서, 향미, 안전성이 우수하여, 장기 섭취가 가능하다. 이러한 지견으로부터, 리파아제 저해제나 α-글루코시다아제 저해제를 음식품 등에 첨가함으로써, 식사 유래의 지방이나 당분의 흡수를 억제하고, 혈중 중성 지방의 상승을 억제하며, 나아가서는 고혈당 증상의 만성화에서 기인되는 당뇨병의 장기적인 예방 및/또는 치료를 목적으로 한 음식품을 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

즉 본 발명은 다음의 [1] ? [9] 이다.

[1] 식 (1)

[화학식 1]

(R₁ 은 H 또는 OH 이고；

R₂ 는 H 또는 식 (2)

[화학식 2]

로 나타내는 기로서, 여기서 R₄ 는 OH 또는 식 (3)

[화학식 3]

으로 나타내는 기, 또는 식 (4)

[화학식 4]

로 나타내는 기이고；

R₃ 은 H, COOH, 식 (5)

[화학식 5]

로 나타내는 기, 또는 식 (6)

[화학식 6]

으로 나타내는 기로서, 여기서 R₅ 는 OH, 식 (7)

[화학식 7]

로 나타내는 기, 또한 식 (8)

[화학식 8]

로 나타내는 기이고, R₆ 은 식 (9)

[화학식 9]

로 나타내는 기, 또는 식 (10)

[화학식 10]

으로 나타내는 기이고, 여기서 R₁' 는 상기 정의와 동일한 기이고, R₂' 는 식 (11)

[화학식 11]

로 나타내는 기이고, 여기서 R₄' 는 상기 R₄ 와 동일한 기이다)

로 나타내는 화합물 (단 에피테아플라갈린, 에피테아플라갈린-3-O-갈레이트, 테아플라빈, 테아플라빈-3-O-갈레이트, 테아플라빈-3'-O-갈레이트, 및 테아플라빈-3,3'-O-디갈레이트를 제외한다) 을 1 종 이상 함유하는 항비만제.

[2] R₁ 이 H 인 화합물을 1 종 이상 함유하는 [1] 에 기재된 항비만제.

[3] 상기 화합물이 이하의 식 (12),

[화학식 12]

식 (13),

[화학식 13]

식 (14),

[화학식 14]

식 (15),

[화학식 15]

식 (16),

[화학식 16]

식 (17),

[화학식 17]

식 (18),

[화학식 18]

식 (19),

[화학식 19]

식 (20),

[화학식 20]

식 (21),

[화학식 21]

식 (22),

[화학식 22]

또는 식 (23),

[화학식 23]

으로 나타내는 화합물인 [1] 에 기재된 항비만제.

[4] 리파아제 저해제 및/또는 α-글루코시다아제 저해제인 [1] ? [3] 중 어느 하나에 기재된 항비만제.

[5] 식사 유래의 지방 및 당의 흡수를 억제하기 위한 [1] ? [4] 중 어느 하나에 기재된 항비만제.

[6] 음식료의 형태인 것을 특징으로 하는 [1] ? [5] 중 어느 하나에 기재된 항비만제.

[7] 음식료가 차 음료, 청량 음료 및 건강 식품으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 [6] 에 기재된 항비만제.

[8] 의약 조성물의 형태인 것을 특징으로 하는 [1] ? [5] 중 어느 하나에 기재된 항비만제.

[9] 식 (24)：

[화학식 24]

로 나타내는 화합물.

본 발명의 항비만제로서의 리파아제 저해제는, 찻잎에서 유래되는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유함으로써, 우수한 리파아제 저해 활성을 나타낸다. 본 발명의 리파아제 저해제는 향미를 손상시키지 않고, 기호성이 높으며, 또한 중성 지방 저감, 건강 증진을 목적으로 한 음식료를 포함하는 여러 가지 용도에 이용할 수 있다. 식사성 지방의 흡수를 억제하기 위해서는, 식사와 함께 섭취하는 것이 바람직하고, 차로부터 얻어진 유효 성분을 강화한 음료는 의의가 크다. 특히, 이들 성분을 증강함으로써, 항비만 작용, 건강 증진을 목적으로 한 음료의 제공이 가능하게 되었다.

본 발명의 항비만제로서의 α-글루코시다아제 저해제는 종래 알려져 있는 천연물 유래의 α-글루코시다아제보다 소량으로 식사 유래의 전분, 다당에서 유래되는 당분의 분해를 억제하고, 흡수를 억제할 수 있다. 또한 어느 화합물도 차류에 함유되는 카테킨이나 폴리페놀의 산화물이라는 점에서, 향미, 안전성이 우수하여, 장기 섭취가 가능하다.

또, 본 발명의 항비만제는, 식경험이 풍부한 차 유래의 성분인 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유하기 때문에, 안전성이 높고, 부작용이 저감된 의약 조성물로도 이용할 수 있다.

도 1 은 화합물 12 의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2 는 화합물 12 의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 상세하게 설명한다.

항비만제

본 발명은 식 (1)

[화학식 25]

로 나타내는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 항비만제이다. 특히, 유효 성분으로는, 이하의 식 (12)

[화학식 26]

로 나타내는 푸르프로갈린 (purprogallin),

식 (13)

[화학식 27]

으로 나타내는 푸르프로갈린카르복실산 (purprogallin carboxylic acid),

식 (14)

[화학식 28]

로 나타내는 테아플라바닌3-0-갈레이트 (theaflavanin 3-O-gallate),

식 (15)

[화학식 29]

로 나타내는 EGCG-카테콜 (EGCG-catechol),

식 (16)

[화학식 30]

으로 나타내는 테아플라베이트 A (theaflavate A),

식 (17)

[화학식 31]

로 나타내는 테아디벤조트로폴론 A (theadibenzotropolone A),

식 (18)

[화학식 32]

로 나타내는 테아플라빈디갈레이트-트리머 1 (TFdiGA-tri1),

식 (19)

[화학식 33]

로 나타내는 테아플라빈디갈레이트-트리머 2 (TFdiGA-tri2),

식 (20)

[화학식 34]

으로 나타내는 에피테아플라브산 (epitheaflavic acid),

식 (21)

[화학식 35]

로 나타내는 3,4,6-트리하이드록시-1-((2R,3R)-3,5,7-트리하이드록시크로만-2-일)-5H-벤조[7]아눌렌-5-온,

식 (22)

[화학식 36]

로 나타내는 에피테아플라브산-3-O-갈레이트 (epitheaflavic acid-3-O-gallate),

또는 식 (23)

[화학식 37]

으로 나타내는 (2R,3R)-2-(3,4-디하이드록시페닐)-5,7-디하이드록시크로만-3-일2,3,4,6-테트라하이드록시-5-옥소-5H-벤조[7]아눌렌-8-카르복실레이트가 바람직하다.

본 발명의 항비만제의 유효 성분인 상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물은, 녹차, 홍차, 우롱차 등의 천연 재료로부터 용매 추출에 의해, 또는 화학 합성 혹은 효소 합성에 의해서도 얻을 수 있다.

추출 원료의 천연 재료는 찻잎을 그대로 사용해도 되고, 분쇄하여 사용해도 된다. 추출에 사용하는 용매는 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있지만, 열수가 바람직하다. 얻어진 추출액은, 적절한 분리용 담체를 사용하여, 분리?정제할 수 있다. 분리용 담체로는, 상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 흡착시켜, 적절한 분리용 용매에 의해 분리할 수 있는 것이면, 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, 스티렌계나 덱스트란계의 합성 흡착제를 사용하여 분리?정제할 수 있다. 이와 같은 분리용 담체에 상기 추출액을 부하한 후, 적절한 용매를 사용하여, 상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 분리한다. 보다 구체적으로는, 본 명세서의 실시예 1 의 기재에 따라, 본 발명의 항비만제에 사용하는 상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물은 농축시켜 사용해도 되고, 또, 동결 건조 등의 방법에 의해 분말로 하여 사용해도 된다.

상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 합성은, 폴리페놀옥시다아제 (PPO), 퍼옥시다아제 (POD) 등의 효소에 의해, 혹은 페리시안화칼륨 (K₃[Fe(CN)₆]) 등의 산화제를 촉매로 하고, 카테킨류 (epigallocatechin-3-O-gallate, epicatechin-3-O-gallate, epicatechin, epigallocatechin 등) 와 갈산을 원료로 하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 본 명세서의 실시예 2 및 7 의 기재에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 항비만제는 리파아제, 특히 췌장 리파아제에 대한 강한 저해 작용을 갖는다. 리파아제 저해 활성의 측정은 배경 기술에 나타낸 선행 출원에 기재되어 있는 어느 리파아제 활성 평가법에 의해서도 실시될 수 있다. 예를 들어, 형광성의 4-메틸운베리페론의 올레산에스테르를 기질로서 사용하고, 리파아제에 의한 반응에서 생성된 4-메틸운베리페론의 형광을 측정함으로써 평가할 수 있다. 예시적으로는, 실시예 6 에 기재된 방법으로 리파아제 저해 활성을 측정할 수 있다. 리파아제 저해 활성은 예를 들어 50 ％ 의 저해를 부여하는 시료량 (IC₅₀) 으로서 나타낼 수 있다.

본 발명의 항비만제는 강한 α-글루코시다아제 저해 작용을 갖는다. α-글루코시다아제 저해 활성의 측정은 배경 기술에 나타낸 선행 출원에 기재되어 있는 어느 활성 평가법에 의해서도 실시될 수 있다. 예시적으로는, 실시예 11 에 기재된 방법으로 α-글루코시다아제 저해 활성을 측정할 수 있다. α-글루코시다아제 저해 활성은 예를 들어 50 ％ 의 저해를 부여하는 시료량 (IC₅₀) 으로서 나타낼 수 있다.

상기 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 정제품 또는 조(粗)정제품은 단독으로 항비만제로서 사용할 수도 있고, 또는 용매나 담체와 함께 항비만제로서 사용할 수 있다. 용매 또는 담체는, 하기 음식료 및/또는 의약품으로서의 사용을 생각하여, 식품으로서 또는 의약품으로서 안전하게 사용할 수 있는 것인 것이 바람직하다. 본 발명의 항비만제는 여러 가지 용도를 갖고, 예를 들어 시험 연구용, 중성 지방의 축적을 예방하기 위한 음식료, 의약 조성물로서의 사용이 예시된다.

음식료

본 발명의 항비만제는 식사로부터의 지방 성분의 섭취에 수반하는 혈중 중성 지방의 바람직하지 않은 상승을 억제하는 음식료의 형태일 수 있다. 음식료의 바람직한 예는 일상적으로 섭취하는 음식료, 예를 들어 녹차, 보리차, 우롱차, 홍차, 커피, 스포츠 드링크, 음료수, 조미료, 드레싱이다. 그러나 음식료는 통상 먹는 것이면 되고, 청량 음료, 칵테일, 맥주, 위스키, 소주, 와인, 청주, 조미료, 드레싱, 맛을 가미한 쌀, 가공 식품, 인스턴트 식품, 레토르트 식품, 초콜릿, 생크림, 양과자, 유제품, 건강 식품, 서플리먼트 등이어도 된다.

음식료의 형태인 본 발명의 항비만제에 있어서는, 식 (1) 로 나타내는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 섭취량이 1 식당 0.1 ㎎ ? 10 g 이 되도록 함유되는데, 0.5 ㎎ ? 5 g 의 범위가 바람직하다. 단, 본 발명의 항비만제에 사용하는 식 (1) 로 나타내는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물은 식품에서 유래되기 때문에, 안전성이 매우 높아, 음식료에 대한 첨가량에 실질적 상한은 없다.

의약 조성물

본 발명의 항비만제는, 리파아제 저해제로서, 식사 유래의 지방의 흡수를 억제하여, 혈중 중성 지방의 바람직하지 않은 상승을 방지 및/또는 저하시키기 위한 의약 조성물로도 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 항비만제는, α-글루코시다아제 저해제로서, 식사 유래의 지방의 흡수를 억제하여, 혈중 중성 지방의 바람직하지 않은 상승을 방지 및/또는 저하시키기 위한 의약 조성물로도 사용할 수 있다. 바람직한 약제는 경구 투여되는 약제이고, 그 예로서, 드링크제, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 캔디, 드롭제 등을 들 수 있다. 약제에는, 식 (1) 로 나타내는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을, 1 회 복용량당 0.1 ㎎ ? 10 g, 바람직하게는 0.5 ㎎ ? 5 g 의 양으로 함유한다.

본 발명의 의약 조성물은, 리파아제 활성 저해 성분 및 α-글루코시다아제 저해제 성분의 안전성이 높기 때문에, 장기간에 걸쳐서 복용해도 안전하다. 따라서, 생활 습관병으로서의 비만의 방지 또는 해소를 위해서, 일상적으로 복용할 수도 있다.

신규 화합물

또한 본 발명은 홍차 중에 존재하는 신규 화합물로서, 아래에 나타내는 화합물을 제공한다.

[화학식 38]

본 화합물은 항비만 소재로서 유용하다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

LH-20 에 의한 분리

인도?아삼종의 홍찻잎을 90 ℃ 의 열수로 추출하고 동결 건조시킨 것에, 10 ㎎/㎖ 가 되도록 증류수를 첨가하고, 가온 용해시켰다. 탕욕 중에서 60 - 70 ℃ 로 가온하면서, 15 ㎖ 를 세파덱스 LH-20 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주) 제조) 60 ㎖ 에 부하하였다. 20 ％ 아세톤 (아세톤：증류수 = 2：8, v/v) 45 ㎖, 이어서 60 ㎖ (1 칼럼 체적) 로 세정하고, 그 후, 30 ％ 아세톤 (아세톤：증류수 = 3：7, v/v), 50 ％ 아세톤 (아세톤：증류수 = 1：1, v/v), 60 ％ 아세톤 (아세톤：증류수 = 6：4, v/v), 각각 4 칼럼 체적분의 용매로 용출하고 1 칼럼 체적씩 분획하였다. 합계 14 의 프랙션 각 60 ㎖ 로부터 2 ㎖ 를 채취하고, 감압 농축 처리에 의해 0.1 ㎖ 로 조제한 50 ％ 디메틸술폭사이드 수용액 (디메틸술폭사이드：증류수 = 1：1, v/v) 을 리파아제 저해 활성 측정에 제공하였다. 또, 각 프랙션을, 감압 농축, 동결 건조시키고, 얻은 고형분으로부터 회수량을 산출하여, 실시예 5 의 성분 분석에 사용하였다. 중량 및 리파아제 저해 활성의 회수율은 표 1 에 나타냈다.

실시예 6 의 방법으로 리파아제 저해 활성을 측정한 결과, 수량(收量)이 많았던 20 ％ 아세톤-1 프랙션 및 20 ％ 아세톤-2 프랙션은 각각, 다당류, 카페인류를 함유하고, 활성은 거의 없는 것을 알 수 있었다. 한편 다음으로 수량이 많고, 중량비로 11.2 ％ 를 함유하는 50 ％ 아세톤-2 프랙션은 33.6 ％ 의 활성이 용출되어 있고, 그 뒤의 50 ％ 아세톤-3 프랙션에는 17.1 ％ 의 활성이 용출되어 있다. 이들의 획분을 함유하는 50 ％ 아세톤 용출 부분에 활성의 70.9 ％ 가 용출되어 있는 것을 알 수 있었다. 실시예 5 의 분석에서는 활성이 높은 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 상당수는 50 ％ 아세톤에서 용출되어 있고, 높은 활성과 잘 일치하고 있다.

실시예 2

시험 화합물의 합성

1. 푸르프로갈린 (purprogallin)

2. 푸르프로갈린카르복실산 (purprogallin carboxylic acid)

3. 에피테아플라갈린 (epitheaflagallin)

4. 에피테아플라갈린-3-O-갈레이트 (epitheaflagallin-3-O-gallate)

5. 테아플라베이트 A (theaflavate A)

6. 테아디벤조트로폴론 A (theadibenzotropolone A)

7. 테아플라빈디갈레이트-트리머 1 (TFdiGA-tri1)

8. 테아플라빈디갈레이트-트리머 2 (TFdiGA-tri2)

9. 에피테아플라브산 (epitheaflavic acid)

10. 테아플라바닌 (theaflavanin)

11. 에피테아플라브산-3-O-갈레이트 (epitheaflavic acid-3-O-gallate)

12. (2R,3R)-2-(3,4-디하이드록시페닐)-5,7-디하이드록시크로만-3-일2,3,4,6-테트라하이드록시-5-옥소-5H-벤조[7]아눌렌-8-카르복실레이트

에피테아플라갈린 (3) 및 에피테아플라갈린-3-O-갈레이트 (4) 의 합성

에피갈로카테킨 (EGC ; 와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 또는, 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트 (EGCG ; 와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 0.2 mmol 에 페리시안화칼륨, 0.8 mmol 및 NaHCO₃, 0.8 mmol 을 첨가한 수용액 150 ㎖ 를 빙랭시키고, 0.2 mmol 의 피로갈롤의 수용액 50 ㎖ 를 적하하여, 1 시간 교반을 계속하였다. 반응액을 20 ㎖ 용량의 Sep-pak C18 (워터즈 주식회사 제조) 에 부하하고, 60 ㎖ 의 수세 후, 5 ％ 아세토니트릴/물로 세정하고, 0.1 ％ 포름산을 함유하는 50 ％ 아세토니트릴/물로 반응 생성물을 용출하였다. 용출물을 동결 건조시키고, 이하의 분취 HPLC 로 정제하였다.

EGC 와 피로갈롤의 반응물은 YMC-Pak Polymer C-18 (20 × 300 ㎜, 와이엠씨 주식회사 제조) 에 부하하고, 0.1 ％ 포름산 존재하에, 30 - 50 ％ 아세토니트릴의 직선 구배 (6 ㎖/min, 60 분) 에 있어서 용출시키고, 48 분부터 50 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 4 ㎎ 의 갈색 고체 (에피테아플라갈린 (3)) 를 얻었다. 또한 이 크로마토그램에 있어서 68 분부터 70 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 2 ㎎ 의 갈색 고체 (푸르프로갈린 (1)) 를 얻었다.

EGCG 와 피로갈롤의 반응물은 Develosil C30-UG-5 (20 ㎜ × 250 ㎜, 노무라 화학 주식회사 제조) 에 부하하고, 0.1 ％ 포름산 존재하에, 15 - 50 ％ 아세토니트릴의 직선 구배 (6 ㎖/min, 60 분) 에 있어서 용출시키고, 44 분부터 46 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 6 ㎎ 의 갈색 고체 (에피테아플라갈린-3-O-갈레이트 (4)) 를 얻었다. 또한 이 크로마토그램에 있어서 48 분부터 50 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 3 ㎎ 의 갈색 고체 (푸르프로갈린 (1)) 를 얻었다.

상기 반응과 동일하게, 갈산 800 ㎎ 을 반응시켜, 갈산 2 분자가 중합하여 생성되는 푸르프로갈린카르복실산 (purprogallin carboxylic acid (2)) 65 ㎎ 을 얻었다. 또, 에피카테킨-3-O-갈레이트 (epicatechin-3-O-gallate (ECG)) 100 ㎎ 을 반응시켜, ECG 2 분자가 중합하여 생성되는 테아플라베이트 A (theaflavate A (5)) 3 ㎎ 을 얻었다. 또한, 에피카테킨 (epicatechin (EC)) 과 EGCG 각각 400 ㎎ 을 반응시켜, 주생성물로서 얻어지는 테아플라빈-3-O-갈레이트와 함께, 부생성물인 테아디벤조트로폴론 A (theadibenzotropolone A (6)) 2 ㎎ 을 얻었다. 또한 상기 반응과 동일하게, 에피카테킨-3-O-갈레이트 (epicatechin-3-O-gallate (ECG)) 와 EGCG 각각 200 ㎎ 을 반응시켜 얻은 12 ㎎ 의 테아플라빈-3,3'-디갈레이트와 20 ㎎ 의 ECG 를 반응시켜, 테아플라빈디갈레이트-트리머 1 (TFdiGA-tri1 (7)) 및 테아플라빈디갈레이트-트리머 2 (TFdiGA-tri2 (8)) 각각 1.7 ㎎ 및 0.6 ㎎ 을 얻었다. 또한 동일하게 330 ㎎ 의 갈산과 101 ㎎ 의 EC 로부터 에피테아플라브산 (epitheaflavic acid (9)) 을 48 ㎎, 869 ㎎ 의 피로갈롤 (pyrogallol) 과 400 ㎎ 의 EC 로부터 테아플라바닌 (theaflavanin) (10) 12 ㎎, 470 ㎎ 의 갈산과 221 ㎎ 의 ECG 로부터 에피테아플라브산-3-O-갈레이트 (epitheaflavic acid-3-O-gallate (11)) 를 37 ㎎ 및 (2R,3R)-2-(3,4-디하이드록시페닐)-5,7-디하이드록시크로만-3-일2,3,4,6-테트라하이드록시-5-옥소-5H-벤조[7]아눌렌-8-카르복실레이트 (12)) 3.3 ㎎ 을 동시에 얻었다.

실시예 3

화합물의 구조 해석

실시예 2 에서 얻어진 화합물에 대하여, MS 및 NMR 측정을 실시하였다. 매스스펙트럼은 Q-TOF Premier (Micromass 사 제조, UK) 에 의해, 이온원에 Z 스프레이 이온 소스를 부착한 ESI 를 사용하여, 네거티브, V 모드로 측정하였다. Cone voltage：45 V Capillary voltage：3 KV, Source Temp.：80 ℃, Desolvation Temp：180 ℃, 로크 스프레이에 의한 질량 보정을 실시하고, 레퍼런스에는 류신엔케팔린 (m/z 554.2615[M-H]^-) 을 사용하였다.

각 화합물의 정밀 질량과 분자식, 질량의 이론치를 표 2 에 나타낸다.

실시예 4

(찻잎 추출물 중에서의 정량)

LC-MS/MS 의 측정은, 4000 Q TRAP (어플라이드사 제조) 로, 터보 이온 스프레이를 사용하고, 네거티브 모드로, 이하의 조건에서 측정하였다；Collision energy：46 eV (nega.), Ionspray voltage：4500 V, 온도：450 ℃.

MRM (multiple reaction monitoring) 에 있어서의 각 화합물의 용출 시간과 측정 채널은 표 3 과 같다.

칼럼：YMC-Polymer C18, S-6㎛ (주식회사 와이엠씨, 2 ㎜φ × 150 ㎜)

유속：0.2 ㎖/분

칼럼 온도：40 ℃

이동상 A：0.1 V/V％ HCOOH/H₂O

이동상 B：0.1 V/V％ HCOOH/CH₃CN

그레이디언트 프로그램：A/B = 91/9 (0 분) → A/B = 40/60 (17 분) → A/B = 15/85 (17.1 분) → A/B = 15/85 (17.1 분 ? 19 분)

상기 조건을 이용하여 인도 아삼 CTC 의 열수 추출물의 측정을 실시하였다. 화합물 2 내지 8 이 찻잎에 존재하는 것이 확인되었다. 정량치는 표 4 에 나타낸다.

실시예 5

(각 화합물의 찻잎 분획물 중에서의 분포)

LC-MS/MS 의 측정은, Q-TOF Premier (Micromass 사 제조, 영국) 로, 이온원에 Z 스프레이 이온 소스를 부착한 ESI 를 사용하고, 네거티브, V 모드로 측정하였다. Cone voltage：33 V, Capillary voltage：3 KV, Source Temp：150 ℃, Desolvation Temp：250 ℃, 로크 스프레이에 의한 질량 보정을 실시하고, 레퍼런스에는 류신엔케팔린 (m/z 554.2615[M-H]^-) 을 사용하였다.

유속：0.2 ㎖/분

칼럼 온도：40 ℃

이동상 A：0.1 V/V％ HCOOH/H₂O

이동상 B：0.1 V/V％ HCOOH/CH₃CN

그레이디언트 프로그램：A/B = 70/30 → A/B = 50/50 (20 분) → A/B = 50/50 (25 분)

상기 조건을 이용하여 실시예 2 에서 분획한 인도 아삼 찻잎의 각 프랙션의 측정을 실시하였다. 화합물 2 (m/z 263.02, R.T. = 9.29 분) 는 30 ％ 아세톤-1 프랙션, 화합물 3 (m/z 399.07, R.T. = 9.83 분) 은 50 ％ 아세톤-2, 3 프랙션, 화합물 4 (m/z 551.08, R.T. = 13.48 분) 는 50 ％ 아세톤-3, 4 프랙션, 화합물 5 (m/z 851.15, R.T. = 17.50 분) 는 50 ％ 아세톤-4 프랙션, 화합물 9 (m/z 427.07, R.T. = 8.60 분) 는 50 ％ 아세톤-3 프랙션, 화합물 10 (m/z 383.08, R.T. = 9.65 분) 은 30 ％ 아세톤-3 및 4 프랙션, 화합물 11 (m/z 579.08, R.T. = 13.86 분) 은 50 ％ 아세톤-2 프랙션, 화합물 12 (m/z 535.09, R.T. = 13.90 분) 는 50 ％ 아세톤-2 프랙션에 검출되었다.

실시예 6

리파아제 저해 활성의 측정

측정 샘플은 실시예 2 의 방법에 따라 합성, 정제하였다.

1. 푸르프로갈린 (purprogallin)

2. 푸르프로갈린카르복실산 (purprogallin carboxylic acid)

5. 테아플라베이트 A (theaflavate A)

6. 테아디벤조트로폴론 A (theadibenzotropolone A)

7. 테아플라빈디갈레이트-트리머 1 (TFdiGA-tri1)

8. 테아플라빈디갈레이트-트리머 2 (TFdiGA-tri2)

9. 에피테아플라브산 (epitheaflavic acid)

10. 테아플라바닌 (theaflavanin)

11. 에피테아플라브산-3-O-갈레이트 (epitheaflavic acid-3-O-gallate)

13. 에피갈로카테킨갈레이트 (EGCG) (와코 쥰야쿠 주식회사 제조)

측정 방법

리파아제 활성의 측정은 기질에 형광성의 4-메틸운베리페론의 올레산에스테르 (4-MUO；시그마사 제조) 를 사용하고, 반응에 의해 생성된 4-메틸운베리페론의 형광을 측정함으로써 실시하였다. 측정에 있어서, 완충액은 150 mM NaCl, 1.36 mM CaCl₂ 를 함유하는 13 mM Tris-HCl (pH 8.0) 을 사용하였다. 기질인 4-MUO 는 0.1 M 의 DMSO 용액으로 한 후에 상기 완충액으로 4000 배 희석한 것을, 또한, 리파아제는 돼지 췌장 리파아제 (시그마사 제조) 를 동일하게 상기 완충액을 사용하여 400 U/㎖ 용액으로서 조제한 것을 효소 측정에 제공하였다.

효소 반응은, 25 ℃ 조건하에서, 96 구멍 마이크로플레이트에 50 ㎕ 의 4-MUO 완충액 용액, 25 ㎕ 의 증류수 (혹은 시료 수용액) 를 첨가하여 혼합한 후에, 25 ㎕ 의 리파아제 완충액 용액을 첨가함으로써 개시시켰다. 30 분간 반응을 실시한 후에, 100 ㎕ 의 0.1 M 시트르산 완충액 (pH 4.2) 을 첨가하고 반응을 정지시켜, 반응에 의해 생성된 4-메틸운베리페론의 형광 (여기 파장 355 ㎚, 형광 파장 460 ㎚) 을 형광 플레이트 리더 (Labsystem 사 제조 Fluoroskan Asent CF) 를 사용하여 측정하였다.

피험 시료의 저해 활성은 대조 (증류수) 의 활성에 대하여 50 ％ 저해를 부여하는 시료량 (IC₅₀) (μM) 으로서 구하였다.

결과

화합물 1 ? 2, 및 5 ? 14 의 리파아제 저해 활성을 표 5 에 나타냈다.

벤조트로폴론 고리 함유 화합물은 모두 리파아제 저해 활성을 나타냈다. 또한, 강한 리파아제 저해를 나타내는 것이 알려져 있는 (-)-에피갈로카테킨-3-O-갈레이트 (EGCG ; 화합물 13) 는 IC₅₀ = 0.349 μM 이었다. 프리의 카르복실산 잔기를 갖는 푸르프로갈린카르복실산 (purprogallin carboxylic acid (2)), 에피테아플라브산 (epitheaflavic acid (9)) 이외에는 EGCG 와 동등하거나 그 이상의 강한 활성을 나타내고, 벤조트로폴론 고리가 리파아제 저해 활성에 기여하고 있는 것이 나타났다. 카르복실산 잔기는 활성을 약하게 하는 기능이 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 식 (1) 에 있어서, R₃ 은 COOH 이외가 바람직하다.

실시예 7

(1) 화합물의 조제

퍼옥시다아제를 사용한 화합물 12 및 화합물 14 (테아플라바닌-3-O-갈레이트) 의 합성

퍼옥시다아제는 Zymed Laboratories 제조 Horseradish Peroxidase 를 사용하고, epicatechin 3-O-gallate (ECG) 는 차추출물로부터 역상 HPLC 로 정제한 순도 90 ％ 이상의 것, 피로갈롤은 나카라이테스크 (주) 제조 (순도 99.0 ％) 를 사용하였다.

(2) 반응

4.3 ㎎ 의 Horseradish Peroxidase 를 10 ㎖ 의 0.058 M 아세트산 버퍼에 용해하고, 아세톤 500 ㎕ 에 용해한 ECG 250 ㎎ (0.566 mmol) 과, 아세톤 500 ㎕ 에 용해한 Pyrogallol 192.8 ㎎ (1.53 mmol) 을 첨가하여 교반하고, 30 ℃ 의 조건하에서, 3 ％ (w/v) 과산화수소수를 450 ㎕ 첨가하고 반응을 개시하였다. 반응의 효율을 높이기 위해서, 반응 개시부터 10 분 후, 20 분 후에 두 번에 걸쳐 3 ％ 과산화수소수를 450 ㎕ 추가하였다. 반응 개시부터 30 분 후에 192.8 ㎎ (1.53 mmol) 의 Pyrogallol 과 3 ％ 과산화수소수, 450 ㎕ 를 추가하고, 또한 30 분간 반응하였다.

반응 개시부터 60 분 후에, 반응액을 역상계의 고상 (Waters 제조, Sep-Pak, C18-Vac 20 cc (5 g)) 에 부하하고, 증류수 40 ㎖ 로 세정 후, 20 ％ (v/v) 아세토니트릴 수용액 20 ㎖, 70 ％ (v/v) 아세토니트릴 수용액 40 ㎖ 로 계속해서 용출하여, 70 ％ 아세토니트릴 용출액을 농축, 동결 건조시킴으로써 68.0 ㎎ 의 화합물 12 및 화합물 14 (테아플라바닌3-O-갈레이트) 를 함유하는 획분을 얻었다.

화합물 12 및 화합물 14 (테아플라바닌3-O-갈레이트) 를 함유하는 혼합물을 하기 조건의 HPLC 에 의해 정제하였다.

YMC-Pak Polymer C-18 (20 × 300 ㎜, 와이엠씨 주식회사 제조) 에 부하하고, 0.1 ％ 포름산 존재하에, 30 ％ 아세토니트릴의 아이소크라틱 용출 30 분 후, 30 - 45 ％ 아세토니트릴의 직선 구배 (6 ㎖/min, 150 분) 에 있어서 용출시키고, 144 분부터 148 분에 용출된 성분 및 158 분부터 162 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 실시예 2 에 있어서의 화합물 12 와 동일한 화합물을 3.9 ㎎, 화합물 14 (테아플라바닌3-O-갈레이트) 를 3.0 ㎎ 얻었다. 또 이 크로마토그램에 있어서 108 분부터 113 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 36 ㎎ 의 갈색 고체 (실시예 2 에 있어서의 화합물 1：purprogallin) 를 얻었다.

실시예 8

반응 생성물의 기기 분석?구조 해석

실시예 7 에서 얻어진 화합물 12 및 14 에 대하여, MS 및 NMR 측정을 실시하였다.

매스스펙트럼은 Q-TOF Premier (Micromass 사 제조, UK) 에 의해, 이온원에 Z 스프레이 이온 소스를 부착한 ESI 를 사용하고, 네거티브, V 모드로 측정하였다. Cone volt.：33 V Capillary voltage：2.7 kV, Source Temp. ：80 ℃, Desolvation Temp：180 ℃, 로크 스프레이에 의한 질량 보정을 실시하고, 레퍼런스에는 류신엔케팔린 (m/z 554.2615[M-H]^-) 을 사용하였다. MS 측정시에는 컬리전 에너지는 4 eV, MS/MS 측정시에는 22 eV 로 설정하였다.

화합물 12 및 14 는 각각, m/z 535.0883, 535.0871 [M-H]- 의 분자 이온을 부여하고, 분자식은 C₂₇H₂₀O₁₂ (이론치：535.0877) 로 산출되었다. 컬리전 에너지를 22 eV 로 한 MS/MS 의 결과, 화합물 12 는 263.07 및 219.07 의 프래그먼트 이온을 검출하고, 화합물 14 는 383.08 및 169.01 의 프래그먼트 이온을 검출하였다. 화합물 14 는 이미 알려진 화합물인 테아플라바닌3-0-갈레이트 (theaflavanin 3-O-gallate) 로 판명되었다.

화합물 12 의 구조를 확인하기 위해서 NMR 을 측정하였다. 화합물 12 의 13C NMR 및 1H NMR 스펙트럼을 각각 도 1 및 도 2 에 나타낸다. NMR 은 이하의 조건에서 측정을 실시하였다. 실시예 7 에서 얻어진 3 ㎎ 의 화합물 12 를 CD₃OH 에 용해하고, CD₃OH 의 프로톤과 ¹³C 의 잔존 피크인 δ3.30 및 δ48.97 을 내부 표준으로 하였다. 항목은 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H｛¹³C｝-HSQC, ¹H｛¹³C｝-HMBC, TOCSY, DQF-COSY, NOESY 및 ROESY 를 DMX-750 spectrometer (BRUKER BIOSPIN, Germany) 로 측정하였다. 그 결과, 실시예 7 에서 얻어진 화합물 12 는 아래에 나타내는 구조인 것으로 확인되었다.

[화학식 39]

상기 구조식에는 각 원자의 넘버링을 나타내고 있다.

NMR 의 측정 결과와 시그널의 귀속을 이하에 나타낸다.

또, 아래에 화합물 14 의 구조를 나타낸다.

[화학식 40]

실시예 9

화합물 15 의 합성

epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG ; 와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 229.2 ㎎ (0.5 mmol) 에 페리시안화칼륨 (나카라이테스크 제조), 3.293 g (10 mmol) 및 NaHCO₃, 0.84 g (10 mmol) 을 첨가한 수용액 400 ㎖ 를 빙랭시키고, 275.3 ㎎ (2.5 mmol) 의 catechol 의 수용액 100 ㎖ 를 1 시간 동안 적하하고, 교반을 계속하였다. 반응액을 300 ㎖ 의 Sephadex LH-20 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주) 제조) 에 부하하고, 40 ％ 아세톤/물 1 ℓ, 45 ％ 아세톤/물 1.2 ℓ, 50 ％ 아세톤/물 900 ㎖ 로 순차 용출하고, 동결 건조시켜, 45 ％ 획분에 77 ㎎ 의 EGCG-catechol 을 함유하는 획분이 얻어졌다. 이하의 분취 HPLC 로 정제하였다.

EGCG-catechol 을 함유하는 획분은 YMC-Pak Polymer C-18 (20 × 300 ㎜, 와이엠씨 주식회사 제조) 에 부하하고, 6 ㎖/min 의 유속으로, 0.1 ％ 포름산 존재하에, 25 - 45 ％ 아세토니트릴의 직선 구배 (75 분) 후, 45 ％ 아세토니트릴의 아이소크라틱 용출 30 분간 유지하였다. 92 분부터 95 분에 용출된 성분을 동결 건조시켜, 24 ㎎ 의 갈색 고체 (화합물 15：EGCG-catechol) 를 얻었다. 아래에, 화합물 15 의 구조를 나타낸다.

[화학식 41]

실시예 10

리파아제 활성 측정

측정 방법

리파아제 활성의 측정은 기질에 형광성의 4-메틸운베리페론의 올레산에스테르 (4-MUO；시그마사 제조) 를 사용하고, 반응에 의해 생성된 4-메틸운베리페론의 형광을 측정함으로써 실시하였다. 측정에 있어서, 완충액은 150 mM NaCl, 1.36 mM CaCl₂ 를 함유하는 13 mM Tris-HCl (pH 8.0) 을 사용하였다. 기질인 4-MUO 는 0.01 M 의 DMSO 용액으로 한 후에 상기 완충액으로 667 배 희석한 것을, 또, 리파아제는 돼지 췌장 리파아제 (시그마사 제조：Type VI-S) 를 동일하게 상기 완충액을 사용하여 400 U/㎖ 용액으로서 조제한 것을 효소 측정에 제공하였다.

효소 반응은, 25 ℃ 조건하에서, 96 구멍 마이크로플레이트에 50 ㎕ 의 4-MUO 완충액 용액, 25 ㎕ 의 증류수 (혹은 시료 수용액) 를 첨가하여 혼합한 후에, 25 ㎕ 의 리파아제 완충액 용액을 첨가함으로써 개시시켰다. 반응시의 기질 농도는 7.5 μM 이 되고, 실시예 6 의 12.5 μM 과 비교하여 희석되어 있는 것, 또한 DMSO 농도가 높아지고 있는 것으로부터, 기질의 용해성이 높아져 보다 정확한 저해 활성을 측정할 수 있도록 연구하고 있다. 30 분간 반응을 실시한 후에, 100 ㎕ 의 0.1 M 시트르산 완충액 (pH 4.2) 을 첨가하고 반응을 정지시켜, 반응에 의해 생성된 4-메틸운베리페론의 형광 (여기 파장 355 ㎚, 형광 파장 460 ㎚) 을 형광 플레이트 리더 (Labsystem 사 제조 Fluoroskan Asent CF) 를 사용하여 측정하였다.

화합물 3, 4, 12, 13, 14, 15 의 리파아제 저해 활성을 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타냈다.

화합물 12, 14, 15 모두 양성 대상인 EGCG 보다 강한 활성을 갖고, 또한 리파아제 저해제로서 공지된 4 (일본 공개특허공보 2009-114079호) 와 비교해도 동등하거나 그 이상의 강한 활성을 나타냈다.

또한, 화합물 14 및 15 는 일본 공표특허공보 2007-504168호에 항산화제, 항염증제로서 그 구조가 나타나 있지만, 리파아제 저해, α-글루코시다아제 저해에 대해서는 알려져 있지 않다.

화합물 12, 14 는 실시예에 나타낸 효소 외에, 폴리페놀옥시다아제 (PPO), 혹은 페리시안화칼륨 등의 산화제를 사용해도 합성할 수 있다. 또한 ECG 와 pyrogallol 의 조합뿐만 아니라 gallic acid 와 반응하는 것에 의해서도 합성할 수 있다.

실시예 11

각종 벤조트로폴론 고리 함유 화합물의 α-글루코시다아제 저해 활성의 측정

1 M 인산나트륨 완충액은, 0.1 M NaH₂PO₄?2H₂O 와 0.1 M Na₂HPO₄?12H₂O 를 혼합하고 pH 7.0 으로 조정하고, 2 g/ℓ 의 우혈청 알부민 (나카라이테스크 주식회사 제조, F-V, pH 5.2, 순도 96 ％) 및 0.2 g/ℓ 의 NaN₃ (나카라이테스크 주식회사 제조, 시약 특급) 를 첨가하였다. 효소 용액은 상기 완충액에 α-글루코시다아제 (와코 쥰야쿠 공업 주식회사 제조, 효모 유래, 100 units/㎎) 를 0.5 units/㎎ 단백/㎖ (100 ㎍/20 ㎖) 가 되도록 용해하였다. 기질 용액은 상기 완충액에 p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드 (나카라이테스크 주식회사 제조, 시약 특급) 를 5 mM (7.525 ㎎/5 ㎖) 이 되도록 용해하였다.

평가에 사용한 샘플 중, 양성 대상인 에피갈로카테킨-3-O-갈레이트 (13：EGCG) 는, 와코 쥰야쿠 공업 제조, 화합물 1, 3, 4, 5, 11, 12, 14, 15 는 실시예 1 ? 2 또는 7 에서 합성?정제한 것을 사용하였다.

이들 샘플을 10 ㎎/㎖ DMSO 가 되도록 조제하고, 6 단계로 2 배 희석을 실시하였다. 96 구멍 마이크로플레이트를 사용하고, 샘플 용액 10 ㎕ 에 효소액 45 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간, 프레인큐베이션한 후, 기질 용액을 45 ㎕ 첨가하고 405 ㎚ 에 있어서의 흡광도 (A405㎚) 를 측정하고, 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션한 후, A405㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 저해율은 컨트롤로서 샘플 대신에 DMSO 만을 첨가한 것과의 A405㎚ 의 차로서 산출하고, 각 활성 측정은 2련으로 실시하였다.

이 결과, 각 화합물의 α-글루코시다아제 저해 활성을 IC₅₀ 값으로 나타내면, 표 8 과 같이 되고, 화합물 12, 14 는 특히 강한 활성을 나타냈다.

리파아제 저해 활성의 결과와 더불어, 이들 벤조트로폴론 고리 함유 화합물에는, 강한 소화 효소의 저해 활성이 있고, 그 중에서도 양 효소에 대하여 강한 저해 활성을 나타내는, 화합물 12 는 홍차 중에도 존재하는 것이 확인되었지만 지금까지 알려지지 않았던 화합물이고, 항비만 소재로서 유용하다는 것을 알아내었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 항비만제는, 찻잎에서 유래되는 벤조트로폴론 고리 함유 화합물을 함유함으로써, 우수한 리파아제 저해 활성 및 α-글루코시다아제 저해 활성을 나타낸다. 본 발명의 항비만제는 향미를 손상시키지 않고, 기호성이 높으며, 또한 중성 지방 저감 등, 건강 증진을 목적으로 한 음식료를 함유하는 여러 가지 용도에 이용할 수 있다.

Claims

식 (1)
[화학식 1]

(R₁ 은 H 또는 OH 이고；
R₂ 는 H 또는 식 (2)
[화학식 2]

로 나타내는 기로서, 여기서 R₄ 는 OH, 식 (3)
[화학식 3]

으로 나타내는 기, 또는 식 (4)
[화학식 4]

로 나타내는 기이고；
R₃ 은 H, COOH, 식 (5)
[화학식 5]

로 나타내는 기, 또는 식 (6)
[화학식 6]

으로 나타내는 기로서, 여기서 R₅ 는 OH, 식 (7)
[화학식 7]

로 나타내는 기, 또한 식 (8)
[화학식 8]

로 나타내는 기이고, R₆ 은 식 (9)
[화학식 9]

로 나타내는 기, 또는 식 (10)
[화학식 10]

으로 나타내는 기이고, 여기서 R₁' 는 상기 정의와 동일한 기이고, R₂' 는 식 (11)
[화학식 11]

로 나타내는 기이고, 여기서 R₄' 는 상기 R₄ 와 동일한 기이다)
로 나타내는 화합물 (단 에피테아플라갈린, 에피테아플라갈린-3-O-갈레이트, 테아플라빈, 테아플라빈-3-O-갈레이트, 테아플라빈-3'-O-갈레이트, 및 테아플라빈-3,3'-O-디갈레이트를 제외한다) 을 1 종 이상 함유하는 항비만제.
제 1 항에 있어서,
R₁ 이 H 인 화합물을 1 종 이상 함유하는 상기 항비만제.
제 1 항에 있어서,
상기 화합물이 이하의 식 (12),
[화학식 12]

식 (13),
[화학식 13]

식 (14),
[화학식 14]

식 (15),
[화학식 15]

식 (16),
[화학식 16]

식 (17),
[화학식 17]

식 (18),
[화학식 18]

식 (19),
[화학식 19]

식 (20),
[화학식 20]

식 (21),
[화학식 21]

식 (22),
[화학식 22]

또는 식 (23),
[화학식 23]

으로 나타내는 화합물인 항비만제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
리파아제 저해제 및/또는 α-글루코시다아제 저해제인 항비만제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
식사 유래의 지방 및 당의 흡수를 억제하기 위한 항비만제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
음식료의 형태인 것을 특징으로 하는 항비만제.
제 6 항에 있어서,
음식료가 차 음료, 청량 음료 및 건강 식품으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 항비만제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
의약 조성물의 형태인 것을 특징으로 하는 항비만제.
식 (24)：
[화학식 24]

로 나타내는 화합물.