KR20120022868A

KR20120022868A - 유산균의 냉동건조에 사용하기 위한 냉동보호제

Info

Publication number: KR20120022868A
Application number: KR1020117026255A
Authority: KR
Inventors: 잠 코르벨레인; 파트릭 드해제; 자비네 나이링스; 로타르 슈타이들러
Original assignee: 액토제닉스 엔.브이.
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2012-03-12
Also published as: US11633438B2; ES2425385T3; CN102414310A; AU2010243906A1; CA2760248A1; JP2016105705A; US20200171105A1; EP2424972A1; JP6383717B2; KR101821417B1; WO2010124855A1; CN102414310B; CA2760248C; AU2016201489A1; US9574169B2; US20120039853A1; US20190160119A9; US20170151292A1; AU2016201489B2; EP2424972B1

Abstract

본 발명에서는 유산균(LAB)이 다른 온도하에서의 장기간 안정성을 실현하였고 탈지우유 또는 다른 동물체내에서 추출한 화합물이 함유되지 않은 효과적인 냉동보호제합성물을 제조하여 유산균이 냉동한 후에도 6개월, 9개월 심지어 12개월후에도 생존율이 50%보다 높았다. 본 발명은 냉동건조세균 특히 유산균을 제조한다. 뿐만 아니라 본 발명은 새로운 냉동보호제의 응용?냉동건조세균의 생존율을 높였고 냉동건조 깨지기 쉬운 케이크 구조를 개선하여 냉동건조세균이 다른 온도하에서의 장기간 안정성을 제고시켰다. 또한 본 발명은 이러한 냉동건조세균이 식품공업과 인류및 동물의 보건면에서도 응용된다. 더욱이 본 발명은 생존율을 높이고 외인성단백질 또는 펨타이드의 재조합균능력의 장기간 정장 및 인류와 동물의 치료과 백신접종과정의 관리에도 응용된다.

Description

유산균의 냉동건조에 사용하기 위한 냉동보호제{CRYOPROTECTANTS FOR FREEZE DRYING OF LACTIC ACID BACTERIA}

본 발명은 새로운 냉동보호제의 응용에 관한 것이다. 즉 냉동건조세균의 생존율을 높이고 냉동건조의 쉽게 깨지는 구조를 개선하며 냉동건조세균이 다른 온도조건하에 자기적인 안정성을 높인다.

본 발명은 냉동건조세균 특히 유산균의 제조에 사용한다. 또한 새로운 냉동보호제의 응용인 냉동건조세균의 활착율을 높이고 냉동건조에 쉽게 깨지는 케이크의 구조를 개선하며 냉동건조세균이 다른 온도조건하에 장기적인 안정성을 높인다. 본 발명은 이런 냉동건조세균의 식품공업과 인류 및 동물의 보건에도 응용된다. 특히 본 발명은 활착율의 증가와 시아노코발라민와 펩타이드의 제조직균들의 능력의 장기적인 저장, 인류와 동물의 치료 및 접종예방과정의 관리에 관한 것이다.

유산균(LAB)은 다양한 그람 염색 양성세균으로 구성되었다. LAB는 탄수화합물을 유산으로 발효할 수 있고 이 과정에서 배양기를 산성으로 만든다. 총체적으로 LAB는 그가 식품공업에서의 작용 특히 발효식품으로 유제품과 육류상품의 제조에 인기가 있다. 그가 발효유제품에서의 상업적 가치는 이미 전세계적인 인증을 받았다.

지난 수십 년에서 사람들은 LAB에 대한 흥취가 현저하게 높아졌다. 정선한LAB 균주는 장의 생리기능을 개선할수 있다는 것은 이미 보편적으로 실증되었다.

L.　lactis(유산유구균)에 대한 사람들의 관심이 많아짐에 따라 유산유구균은 시아노코발라민의 생산에서 주요성분으로 되었고 생물활성분자의 원위치생산과 분배계통으로 되었다.

현재 LAB의 유전자 생산에 많은 노력이 직접 주입되어 이를 전형적인 점막생물약품의 관리생산과 교부도구인 세포인자, 항체조각,성장인자, 호르몬과 신경펩티드로 만들었다(예[6-12]). 특히 공업식품용 세균인 L.　lactis(유산유구균)은 생물활성펩티드를 전달하는 미생물로 가장 널리 쓰인다. 공업용 유산유구군균 군주가 구강담백을 전달할 수 있는 이 가능성은 분명히 사람들을 흥분케 한다. 어떠한 약물상품이든 꼭 필요한 속성을 가지고 있다. 그것이 바로 장기적인 안정성이다(수명저장). 보통의 약물상품은 설정된 조건하에 최소로 24개월 저장할 수 있다. 때문에 한가지의 고효율적이고 가변성이 있는 믿음직한 제조 스테이션은 공업용유산유산균을 기초로한 원료약(DS)과 약물상품(DP)처방의 발전이 필요한다.

제조와 그 후의 저장기간에 상품안정성의 임계 수치는 공업용세균의 장기활착력에 의해 결정한다. (보통 기능저장시간에서 매그램의 미생물 군체들의 형성단위(CFU)_로 표시한다) LAB 군주로 생산, 저장과 마지막 치료과정은 모두 세균에 큰 압력을 가하는 원리를 응용하였다[4]. 공업계통에서 유산균은 액체, 건조기체, 응축액 또는 냉동건조등 형태로 보존하고 분배한다. 이와 같은 모든 준비과정이 식품공업의 발효과정에 적용되면 사람들의 중점은 영구보존방법으로 옮길 것 이다. 즉 세균의 고활착율과 신진대사 활동을 높일 것 이다. 또한 이러한 수치는 제약신청의 전제적인 조건들이다. 생존율을 최대화하기 위해 정선한 생물 방동제와 그 후의 냉동건조과정은 모두 중요한 절차이다. 특히 활착할 수 있고 신진대사가 활약한 세균은 예정된 치료효과를 가지게 하는 절대적 요소라는 사실을 고려해야 한다.

냉동건조는 세균이 탈수하고 처리하는 최적의 방법이라고 한다. 냉동건조의 최종적인 목적은 안정한 고체를 얻기 위해서이다 [4]. 비록 군주들의 활착율이 냉동건조 후 또는 저장기간에 변할 수 있지만 이는 제일 많이 쓰이는 미생물세포의 저장기술이다[5]. 냉동건조후의 생존물은 세포가 쾌속 냉동건조에 저항하는 능력을 반영한다. 예컨대 어떠한 위치에서 막에 있는 지방이 과 산화되고 세포가 파괴된다[5]. 주지하는 바와 같이 냉동건조과정은 아무 저항능력이 없는 세균을 죽이고 그 후에 생존한 세균들도 저장하기 전에 신속히 사망한다. 때문에 냉동건조와 저장하기 전에 세균의 활착수를 증가하기 위한 실험도 따라 생겼지만 아주 작은 성공을 얻었다(아래 문장 참조).

냉동건조기술은 지금까지 수명을 오래 연장하는 방법 중에서 제일 많이 사용되고 또한 오직 하나 뿐인 방법이다. 적합한 건조물/냉동보호제 혼합물의 선택은 유산균이 냉동건조와 그 후의 저장단계의 생존율을 높이는데 결정적인 작용이 있다. 유산균이 냉도건조 할 때와 그 후의 저장단계에서의 생존율을 높이기 위한 연구들도 보도되었다(조회,상세한 내용은 [4]를 참조). 하지만 제약신청의 표준온도에서 특히 실내온도가 25℃ 혹은 2-8℃에서 이런 공개된 보도에서도 냉동건조후의 세균이 장기적인 안정성이 있다는 사실을 증명할 수 없다(1년 후에 80%을 넘는 세균이 표준수치에 도달하지 못했다).

상업적 이익을 목적으로 하는 유제품공업에서 대부분의 유산균의 생산은 탈지분유로 건조물로 한다. 그것은 탈지분유는 세포막 성분을 안정시키고 액체 흡수를 촉진하며 세포겉면에 한층의 보호막을 형성한다[4]. 추가로 다른 냉동보호제를 넣은 탈지분유는 그 내재적인 보호작용을 높힐 수 있다.

Font de Valdez 등은 12개 균주를 가진 유산균(LAB)에 10% 탈지우유가 들어 있는 리보오스알코올을 넣어 냉동건조에 보호작용이 있다고 하였다[17]. 보도에서 냉동건조기간에 생존율이 높아졌다고 하였으나(균주에 따라 42-100%고르지 않음) 아직 냉동건조기술이 장기적 안정성을 가지고 있다고 증명할수 있는 수치를 못얻었다. Castro 등은 냉동건주후 탈지우유 또는 푸코오스가 들어있는 생존한 볼가리아 유산균의 유리한 작용은 생수만 넣은 것보다 보유율(살아 있는 세포수)이 1%부터 25%로 제고됐다고 평가하였다[18]. 하지만 이번에도 그후의 저장기간의 안정성을 표시할수 있는 수치는 없었다.

Cavalho 등은 2003년에 소르비톨 또는 글루탐산 나트륨(MSG)만 넣은 유산균중에 유산균를 탈지유유 위에 뜨게 해서 안정작용을 가지고 냉도건조후인 저장기간에서 3-6개월 생존하였다고 증명하였다[19]. 하지만 탈지우유만 넣은 것과 비교하면 이러한 방법은 안정성은 제고되었지만 소르비톨 또는 글루탐산 나트륨(MSG)을 넣은 후에도 생존율은 아직 매우 낮다(<0.1%). 그리고 냉동건조후의 장기간 생존하고 있는 세포를 밀패한 용기에 넣어 보관하더라도 온도가 20℃인 건조하고 선선한 곳에서도 최대적으로 8개월밖에 보관할수 없다. 시간에 따라 이 기록도 점점 내려간다.

Carcoba 와 Rodrigue 는 다양한 화합물의 효과를 연구하여 L.lactis(유산유규균)을 냉동건조한후 세균을 각각 재조직 탈지 우유(RSM)에 넣어 그들을 생존하고 있고 신진대사작용을 가진 세포에 혼합하였다[16]. 그들은 재조직 탈지 우유(RSM)만 넣은 것보다 푸코오스와 설탕의 탕분, 소르비톨, 리보오스 에탄올과 β-알라닌의 아미노산과 글루탐산을 넣은 후에 세포의 생존율이 44.3%이상 높혔다. 하지만 이 수치는 매체물을 포함하는 실제 생존율을 포함하지 않았으며 장기적으로 보존하였다는 자료도 없었다.

마지막으로는 Huang 등의 연구보고이다. 그들은 보호매질인 독일 유산균을 제조하여 그의 효과에 긍정적 태도를 가지고 있다. 결과가 증명하다 시피 냉동건조후에 세포의 생존율은 86%나 도달하였다[20]. 이런 매질의 구성성분으로는 설탕(66.40g/L), 글리세린 (101.20 g/L)소르비톨(113.00 g/L)과 탈지 우유(130.00 g/L) 이다. 이렇듯 이번에도 장기적 안정성을 증명하지 못했다.

Huyghebaert 등은 생산유통기한에서 생존할 수 있는 유산유구균(L.lactis)유전자공학(GM)의 냉동건조분말의 처방을 새로만들려고 힘쓰고 있다[21]. 냉동건조행열의 영향을 연구하기 위해 서로 다른 두 매개물이 실험에 사용하였다. 두 매개물로는 0.5%포도당을 함유한 M17 배양기 (이로 GM17을 얻음)와 0.5%포도당과 0.5%건락소가수분해물를 함유한 10%(w/v)탈지 우유이다. 냉동건조가 끝난 후의 냉동건조파라미터,냉동건조주물질과 다른 저장조건은 단기와 장기의 생존율에 일정한 영향이 있다고 평가되였다.

상규의 GM17 배양기를 넣은 다음 냉동건조후의 절대생존율은 10%보다 낮았다. 하지만 GC-milk 주물질을 넣은 다음 생존율은 훨씬 제고되었다(60.0±18.0%).실험자들이 냉동건조프로그램을 표준화하기 위해 많은 노력을 해왔지만 아직 대규모의 변의를 면할 수 없다.

단기간 안정성에 관한 연구에서 냉동건조한 후 생존율은 이미 ±20%로 내려갔으며 1주일정도 저장할 수 없다고 하였다(GC-milk 주물질). 장기간 안정성에 관한 연구에서 상대생존율은 1개월저장기후 갑자기 급감하여 남은 수개월의 저장동안에는 생존율은 대수속도로 점차 감소한다고 하였다(GC-milk 주물질, 다른 저장조건).이는 장기간 안정이 목적에 도달할 수 없음을 표명한다.

현대의 전체적 기술을 고려해 보면 탈지 우유는 냉동건조유산균매개물의 상용성분뿐만 아니라 세균생존율의 결정적인 요인이라는것을 잘 알 수 있다. 하지만 우유유도체를 전염성해면상뇌질환(TSE)에 사용한 것은 일정한 위험이 있기에 신형약품성분에 강력하게 저지되어 있다.

생산후의 높은 생존율을 제외하고 냉동건조한 후의 유산균은 약물 응용면의 긴 품질 보증 기간의 성질도 가져야 한다. US2005/0100559, US3897307와 WO2004/065584는 안정성을 가진 건세균화합물의 대표이다. US2005/0100559에서 건세포화합물의 특징은 대량의 안정제 과립을 가지고 있다. US2005/0100559의 예를 참조하면[055] 안정제함량은 최소한 40%를 함유하였다(w/v). WO2004/065584에서 설탕 또는 설탕과 맥아 덱스트린의 화합물은 -20℃의 특정한 조건하에 세균양식의 안정성을 향상시켰다. 이러한 참고수치에서는(실내온도하에) 어떻게 냉동건조세균의 합성물의 장기간 유통 보증 기를 늘어야 하는 것에 언급하지 않았다. US3897307에서의 모든 실험은 모두 냉동건주후부터 시작하였다. 실험은 탈지우유에서 다른 종류의 유산간균을 배양하여 좌선괴혈산으로 선택적으로 안정증효제인 식용염과 글루탐산또는 아스파르트산염 또는 염자체를 뽑아 낸다. 이러한 유성분은 안정한 건세균화합물의 중요한 구성성분이다.

다시 말하면 현재의 기술에 의해 아직 생존율도 높고 저장시간도 길며 우유성분을 대체할 수 있는 매개물을 연구해 내지 못했다. 사실 대다수의 연구는 모두 생존율, 안정성과 세균밀도에 관한 정확한 수치가 모자르다. 지금까지 냉동건조세균 유전자 공학 와/또는 그 속성을 유지하는 해당 보고를 연구해 내지 못했다.

도 1: 다른 냉동보호제 혼합물을 사용한 후 Sagx0037 유산유구균(L.lactis)균주의 살아있는 세포수(콜로니 형성단위[CFU]/g 로 설명)로는 냉동건조와 강한 빛에 오래 쪼인 후의 24시간 즉시수치는 25℃/35%RH 이다. 냉동보호제 혼합물의 상세한 구성성분은 표 1을 참조하십시오.
도 2: 다른 냉동보호제 혼합물을 사용한 후 Sagx0037 유산유구균(L.lactis)균주의 살아있는 세포수(콜로니 형성단위[CFU]/g 로 표시)로는 냉동건조와 강한 빛에 오래 쪼인 후의 24시간 즉시수치는 25℃/35%RH 이다. 냉동보호제 혼합물의 상세한 구성성분은 표 3을 참조하십시오.
도 3: Z4 냉동보호제 혼합물을 사용하고 냉동건조의 최종적 칸막이 온도가 25℃와 35℃에서 Sagx0037 유산유구균(L.lactis) 미생물 군체의 살아있는 세포수(콜로니 형성단위[CFU]/g 로 표시)는 냉동건조와 강한 빛에 쪼인후의 4시간과 24시간의 즉시 수치는 모두 25℃/35%RH이다. 세균과 냉동보호제혼합물의 상세한 구성성분은 표4를 참조하십시오.
도 4:3가지 다른 저장조건하에 글루탐산 나트륨,덱스트린(옥수수전부에서 제취)과 소르비톨화합물이 Sagx0037 유산유구균(L.lactis) 미생물 군체가 냉동건조와 장기간 저장기간의 안정효과는 각각 -20℃; 5℃와 25℃/60%RH (PET/ALU 포장 미닐에서)이다. 세균과 냉동보호제혼합물의 상세한 구성성분은 표 5를 참조하십시오.

본 발명은 다른 온도하에 장기간 안정성을 가진 유산균(LAB)을 연구 제고하였고 탈지 우유 또는 다른 동물몸에서 체취한 효과적인 냉동보호제화합물을 함유하지 않았으며 냉동건조후의 유산균이 6개월, 9개월 심지어 12개월 보존해도 생존율은 50%, 60% 더욱이 70%, 80%보다 높았다. 이 냉동 보호제화합물의 처방은 주요한 우세는 냉동건조기간에 정상생산의 흐름하에 단기간 해볕 쪼이는 기간과 포장후의 장기간 저장때에 민감도가 높은 세균에게 보호를 제공하였다.

본 발명은 유산균, 케이크분말이 냉동건조와 그후의 저장기간에 높은 생존력을 갖추는 안정성 화합물(냉동보호제)을 제공하였다. 생존율을 최대화하기 위해 냉동건조하기 전에 안정화합물을 혼합한 화합물을 생물세균에 첨가하였다. 이 안정화합물은 전분가수분해물과 글루탐산염과/또는 폴리알콜을 함유하고 있고 최후로 냉동건조유산균의 생존율과 안정성을 제고하였다. 전반적으로 말해서 본 발명은 신형냉동보호제의 응용 및 냉동건조세균의 생존력과 냉동건주의 파괴하기 쉬운 케이크 구조와 다른 온도 조건하에서의 냉동건조세균의 장기간 안정성을 향상하였다.

다음의 상세한 해석에서 냉동건조기간에 세심하게 고른 냉동보호제 혼합물을 넣으면 높은 생산량의 사는 세포를 얻을 수 있다(>　6　×　10E+11[CFU]/g). 경이로운것은 이런 냉동건조세포의 생존율은 24시간내에 강한 햇볕에 쪼여도 영향받지 않는다[예:충전 캡슐]. 이 와 동시에 관찰을 통하여 다른 저장조건하에 생존한 세포는장기간 방부성을 가지고 있다.

냉동보호제화합물은 글루탐산나트륨 또는 소르비톨과 글루칸으로 구성되였고 이름 난 냉동보호제와 조합하여 냉동건조후에 사는 새포생산량은 으뜸으로 치는 냉동보호제의 처방과 비슷한 정도에 도달하였다(코드 D). 단기간 햇볕 쪼이는 연구에서 전분가수분해물과 글루탐산 나트륨 과/또는 폴리알콜의 혼합물로 구성한 냉동보호제는 아무 방호대책이 없는 저장조건하에서 냉동건조후의 유산유구균을 24시간 보호했다고 충분히 말해 주었다(25℃~35℃ RH). 이 실험에서 글루탐산연은 될수록 글루탐산 나트륨으로 하고 폴리알콜은 소르비톨 또는 마니톨로 하고 전분가수분해물은 글루칸이 최우선 선택이다.

Sagx0037 유구유산균(L. lactis) 미생물 군체의 생존율에 관한 분석(사는 세포수를 결정한 냉동건조의 예와 공기 중에서 강한 햇볕에 쪼이는 실례)에서 전분 가수분해물(글루칸 500),글루탐산 나트륨과 폴리 알코올(예:미니톨)(실례 1,2 과 3에서 설명과 같음)은 방호조치가 없는 저장조건하에서 유산유구균을 24시간 보호하는 최우선 구성이라고 표명하였다)(코드 D).

설탕의 처방에 비해 3가지 냉동보호제로 구성한 혼합물은 냉동건조유산균은 저장기간에서의 안정성“황금법칙”을 가졌다고 인증하였다. 이와 동시에 이는 단기간 햇볕에 쪼인（25℃/35% RH）후 사는 세포수（> 6 x 10E+11 CFU/g ）가 안정하는 유일한 혼합물이다. 글루 탐산만 세균에 넣을 때 단기간 햇볕에 쪼인 후 생존한 세균을 발견하지 못했다.

전분가수분해물(옥수수 전분에서 체취한 덱스트린), 로 글루 탐산염과 폴리 알코올(소르비톨)로 구성한 냉동보호제혼합물은 세균이 장기간 안정성과 생존력을 가지게 하는 냉동건조유산균분말(-20℃부터 5℃까지 냉동건조케이크분말의 사는 세포수량이 적어지는 것을 관찰하지 못했음; 1년저장후 사는 세포수는 최초수량의 90%보다 높고 CFU밀도도 매우 높으며 > 5 x　10E+11 CFU/g이다)을 얻었다. 25℃, 60%RH 하에서 관측하면 사는 세포수는 약간 감소하였다. 1년 저장한 후(25℃, 60%RH) CFU 밀도는 아직 매우 높으며 > 3 x　10E+11 CFU/g이다.

때문에 본 발명은 전분가수분해물, 글루탐산연과 폴리알콜의 냉동건조세균 항목을 제공하였다. 다음과 같은 예에서 화합물에서 전분가수분해물수는 약2.0%부터 10% (w/v)이고 특수한 상황하에서 약 2.5%부터 5%(w/v); 글루탐산 염수는 약 2.0%부터 10%(w/v)이고 특수한 상황하에서 약 5.0% 부터 7.5%(w/v); 폴리 알콜 수는 약 5.0% 부터 30%(w/v)이고 특수한 상황하에 약 10%부터 20%(w/v)이며 더 특수한 상황하에 약 7.5% 부터 15%(w/v)이다.

여기에 사용한‘폴리 알코올’은 보통 설탕류의 혼합물로 소르비톨, 말토오스, 마니톨 등으로 구성되었다. 이러한 작은 단위는 다아스타아제를 넣은후 옥수수전분, 고구마전분 또는 밀전분을 가수 분해한 후 얻은 것이다. 그후의 수소화 분해법과정에서 위에서 말한 작은 단위는 당-소르비톨, 말토오스와 긴 체인 설탕(예를 들면 말토오스)으로 전환한다. 전의 상술에서 소르비톨과 마니톨이 단독으로 차지하는 비율은 약 5.0％부터 15％(w/v);특수한 상황에서 약 7.0％부터 15％이다(w/v). 더나아가 이 점을 표현할 수 있는 점은 위에 서술한 각 설탕이 차지하는 비율은 같고 약7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％ 또는 15％(w/v)이다.

여기에서 사용한 ‘글루탄산 염’은 보통 제서산 나트륨과 그의 식용가능한 수용성염이다. 여기에서의 “식용가능한”염은 인체의 음식 또는 기타 식품중의 염을 말하는데 나트륨과/ 또는 글루탐산나트륨갈륨염이다. 이점부터 우리는 본 발명중의 제서산 염이 바로 글루탄산 나트륨(MSG)이라는 것을 충분히 체현할 수 있다. 나아가 이점을 표현할 수 있는 것은 위에서 말한 글루탄산 나트륨이 차지한 비율은 약 2.0% 부터 10%(w/v)이고 특수한 상황에서 는 약 5.0%부터 7.5%(w/v)이다.

여기에서 사용한 ‘전분가수 분해물’은 대량의 포도당으로 구성한 지점 다당류의 가수분해 산물인 전분과 글루칸이다. 전분은 직선과 나선형의 스트레이트 체인 전분과 분기 분지 체인전분으로 구성하였다. 글루칸에서 스트레이트 체인구조는 포도당분자사이의 α-1,6 배당체의 결합이고, 분지는 α-1,4로 구성하였다(같은 실례에서 α-1, 2 과 α-1,3도 적용한다). 이점에서 여기에 사용하는 전분가수분해물은 글루칸1,글루칸5,글루칸10,글루칸20,글루칸40,글루칸60,글루칸70,글루칸110 또는 글루칸500중의 임의의 한 종류로 구성되였다는 것을 체현할 수 있다. 진일보로 이 점을 체현한 것은 위에 서술한 글루칸의 비례는 약2.0%부터 10%(w/v)이고 특수한 상황하에서는 약 2.5%부터 5%(w/v)이다.

발명과 실례에 대한 서술에서 “a”, “an”와 “the”과 같은 단수구조는 본문 중 별도의 규정이 없을 때 단수와 복수형식을 모두 가리킨다. 예를 들면 “한 세포”는 하나 또는 여러가지 세포를 가리킨다.

여기에서의 "comprising" , "comprises" 와 "comprised of" 전문용어와 "including","includes" 혹은 "containing","contains" 와 같은 뜻으로 쓰인다. 고정적 범위가 없고 추가의 열거성분, 원소 혹은 방법순서를 제거하지 않는다.

열거한 수치범위에는 수자,분수와 열거한 적정 실험 중점를 포함한다.

여기에 사용한 “about”전문용어는 하나의 확실한 가치＿파라미터, 총액,지속시간과 다른 비슷한 대상과 연관될 때 +/-20% 또는 더 적은 주어진 값의 변화를 의미하고 또는 +/-10% 또는 그보다 적고 +/-1% 또는 그보다 적고 +/-0.1% 또는 그보다 더 적은 변화가 본 발명을 표현하는데 적용한다.

현재, 인용한 상세한 설명 문서,특별히 문서중에 연관한 강의는 모두 안에 참고되었다.

별도의 정의 없이는 여기에서 사용한 발명에 관한 전문 용어는 기술적과 과학적 전문용어를 포함하고 본 발명의 보통기능으로 이해한다. 진일보의 지도를 통해 그다음의 정의는 본 발명의 학설을 더 잘 이해할수 있다.

전문용어 “recombinant nucleic acid” 는 DNA 재조합 기술을 통해 합성한 분할 정제로 구성한 핵산이다. 재조합 핵산은 생물체를 복사한 후 그의 어린이세대 핵산을 “recombinant nucleic acid”라고 한다.

DNA 재조합 기술원리의 참고 문헌은 다음과 같다. <무성번식:실험실 수첩>(제2판,1-3권, Sambrook 등 저,레이포트실험실출판사,뉴욕,레이포트,1989년);<분자생물학새협의>(Ausubel 등저,그림출판사와 Weley- Interscience 연합 출판,뉴욕, 1992년[정기갱신]); <중합협의:방법과 응용지침>(Innis 등 저, Harper& Row 출판사,필라델피아석유관리국,1980년)

전문용어 “heterologous”란 특정한 ORF와 보조 촉매제와의 관계를 가리킬 때 위에 서술한 촉매제는 보통 관련되지 않았고 사실상 ORF 의 전사를 조종하지 못했다는 뜻이다. 다시말하면 본 발명중의 관련은 재조합 핵산중의 DNA 재조합 기술로 만들었다.

전문 용어 ‘lactic acid bacterium(유산균)’은 유구균종,유산간상균종, 연쇄상구균종,소구균종,더블 차별간상균종과 화이트 벤터 박테리균종으로 구성한 조합중에서 정선한 세균이다. 동시에 이 종류에 속하는 임의의 종류의 단위도 포함된다(예를 들면 종,아종,미생물 군체).

전문용어 ‘Lactococcus(유구균)’보통 유구균의 종류를 가리킴과 동시에 이 종류에 속하는 임의의 분류의 단위도 포함된다(예를 들면 종, 아종, 미생물 군체). 예를 들어 설명하면 유구균에는 그리스시 유구균,유산유구균, 생선유구균,유산유구 간상균과 메리토오스유구균 또는 그중의 임의의 아종과 미생물 군체를 포함된다.

본 발명에서 설명한 것은 유구균은 바로 유산유구균이고 유산유구균유지방 아종,유산유구균월시 아종, 유산유구균유산 아종,유산유구균더블 아세틸아종을 포함되어 있다고 한정하지 않는다.

본 발명을 충분히 표현한 것은 유산유구균이 바로 유산유구균유지방 아종 또는 유산유구균유산아종이거나 유산유구균유산아종 및 그의 모든 미생물 군체를 포함한다. 예를 들면 SK11유산유구균유지방 아종 또는 MG1363 유산유구균유산 아종이다.

또 다른 표현을 통하여 냉동건조세균은 재조합핵산의 하나 또는 여러 개의 개방암호 읽기 액자를 포함하고 표현산물(폴리펩티드 더 아미노산)을 번역할 수 있고 효능도 불어 넣을 수 있다(특히 사람이나 동물의 치료에서).

한정하지 않고 전형적인 특수 용도에서 위에 설명한 발명중의 재조합핵산의 하나 또는 여러 개의 개방암호읽기 액자는 항원과/ 비백신치료활성폴리펩티드를 번역할 수 있다고 체현하였다.

여기에서 사용한 전문용어 ‘antigen(항원)’은 생물체에 들어가 면역응답을 일으키는 외래물질을 가리키고(특히 인체와 동물 체내의 관리할 수 있는 항원) 체액면역응답과/또는 세포 면역응답을 포함하고 해당한 상품과 통합할 수 있다. 예를 들면 면역응답능력을 가진 항체나 T세포 등이 있다. 때문에 우선 선택한 실례에서 항원은 생긴 생리반응을 관리하는 면역계통능력을 갖추어야 한다.

본 발명에 의하면 항원은 인류 또는 동물의 체내에서 효능을 가진 면역응답 폴리펩티드 더아미노산에서 생긴것이다. 예를 들면 병원체, 바이러스,원핵 또는 진핵 병원체, 비생리담백질, 엘레르기 항원(면역내성을 일으킨다) 등이 있다.

전문 용어’a non-vaccinogenic therapeutically active polupeptide(비백신치료활성폴리펩티드)’는 일반적으로 인류와 동물의 주체 폴리펩티드 더아미노산을 가리킨다. 이 자체는 면역응답을 일으킬 수 없지만 같은 치료효과를 얻을 수 있다. 때문에 폴리펩티드더아미노산의 효능은 생물체 자신의 천연생물기능으로 특수한 치료효과를 가졌고 생물체의 면역성과/또는 면역보호능력의 항원을 통해 효효능 가진 것이 아니라는 것을 추정할 수 있다. 그래서 비 배백신치료활성폴리펩티드는 생물활성형식을 표현하거나 최소한 숙주세포의 생물활성을 석방하는 형식으로 전화하여야 한다. 더욱 취할 수 있는 것은 위에서 설명한 폴리펩티드더아미노산의 생물활성형식은 그의 원래 형태와 같은 또는 매우 비슷한 이등 또는 삼등 형식을 나타날 수도 있다.

이와 동시에 비백신치료활성폴리펩티드의 가장 좋은 것은 독성이 없거나 병을 일으키지 않는 것이다.

우선적으로 선택되는 점에서 비백신치료활성폴리펩티드는 인체 또는 동물에서 올 수 있고 인류과 동물을 관리하는 같은 분류단위를 갖고 있을 수도 있다.

적당한 비백신치료활성폴리펩티드의 비한정성실례는 국부 또는 체계의 중요한 기능성을 가지고 있어야 한다. 예를 들면 국부 또는 전신 신진대사의 내분비활동에 영향주는 폴리펩티드더아미노산, 면역조혈체계의 세표활동을 조절하는 생물활성폴리펩티드,체내의 정상세포 과 종양세포의 생존율,성장성,종의 분화또는 상처와 감염으로 인한 급성기연성반응의 면역조절과 유발기능에 양향주는 하나 또는 여러 개의 생물활성폴리펩티드; 목표세포의 촉진인자를 통해 세포와 조직감염의 내성 또는 상피세포의 번식을 강화하고 상처유합을 촉진하는 하나 또는 여러 개의 생물활성폴리펩티드; 체내세포를 통해 전송과 생산성분을 조절하는 하나 또는 여러 개의 생물활성폴리펩티드가 있다.

이러한 폴리펩티드더아미노산의 구체적인 셈풀에는 한정없이 다음과 같이 포함되어 있다.

인슐린,성장호르몬,칼슘제압제,황체촉진호르몬,갑상방선호르몬,성장호르몬억업제, 갑상선촉진호르몬, 혈관활성 장폴리펩티드, 세포인자(예를 들면IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10,IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 부터 IL-32까지의 임의의 세포인자, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFNs, EPO,G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL) TNF세포인자족(예를 들면 TNFa, TNFb, CD40, CD27 혹은FAS배함기) IL-1세포인자족, 성섬유세포성장인자족, 혈소판파생성장인자, 륜화성장인자, 신경성장인자, 상피성장인자가족세포인자 과 인슐린제압에 관한 세포인자등이 있다. 혹은 이 치료활성폴리펩티드는 위의 문장에서 정의한 치료활성폴리펩티드의 수용체 또는 항체로 될수 있다. 이런 폴리펩티드더아미노산에 적용하는 더욱 구체적인 셈풀을 다음과 같이 열거하겠다. 예를 들면 WO 96/11277,14 페이지,1-30 줄(인용의 형식으로 문장에 삽입), WO97/14806, 12페이지의 1줄 부터 13페이지의 27 줄(인용의 형식으로 문장에 삽입),US5,559,007, 제 8컬럼의 31줄 부터 제 9컬럼의 9줄까지(인용의 형식으로 문장에 삽입)이 있다.

때문에 이 점에서 표현하듯이 위에 설명한 항원은 면역응답을 일으키거나 보호할 수 있고 위에 설술한 비백신치료활성폴리펩티드는 인류 혹은 동물체내에서 효과를 일으킨 후 재조합핵산은 인체혹은 동물체내의 항원과/ 또는 비백신치료활성폴리펩티드를 코딩 할 수 있다.

특별한 것은 WO 97/14806은 항원과 자극인자면역응답 사이는 세포의 공통 표현이라고 제시하였다. 예를 들면 백혈구 IL, IL-2 혹은 IL-6등이 있다. 때문에 이번 유산균 발명에서도 이런 공통표현을 신중히 고려해야 한다.

더 나아가서 본 발명에 의하여 개방암호읽기 액자의 기능에는 폴리펩티드더아미노산이 ORF 에 의해 번역될 때 코딩분비신호시스템도 같이 진행된다는 것도 포함된다. 이러면 폴리펩티드더아미노산이 숙주세포에서의 분비활동에 유리하여 단절과 전달에 도움이 된다.

보통 분비신호시스템은 약 16 내지 35개의 아미노산기로 표시하고 지방질더블막의 소수아미노산을 포함하며 숙주세포중에서 분렬된 담백질 혹은 펩타이드의 동반담백질 또는 폴리펩티드시스템의 분비활동에 도움된다. 더욱 타당한 것은 숙주세포중에서 매우 활약한 분비신호시스템은 위에 서술한 신호시스템의 핵산의 사용에 도움이 된다. 예를 들면 세균숙주세포 혹은 유산균 혹은 유구균 혹은 유구유산균이 있다.

숙주세포에서 활약하고 있는 분비신호시스템을 아트라고 하고 전형적인 유산균신호시스템에는 usp45(US 5,559,007 를 참고)과 기타가 포함되어 있다. Perez-Martinez 등 저자,1992년,<분자유선학과 게놈학>234,401-11; Sibakov 등 저자,1991년, <응용과 환경미생물학> 57권(2기),341-8를 참조하십시오. 더욱 타당한 것은 신호시스템은 발기인과 ORF 사이에 위치한다. 즉 신호시스템은 발기인시스템의 3’에 위치하고 비례상에서 폴리펩티드더아미노산중의 ORF보다 앞서다. 진일보적으로 체현한 것은 신호시스템은 아미노산 시스템을 코딩한다는 것이다.

MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA (usp45).

다른 한편으로는 냉동건조세균의 형성에서 재조합핵산의 캐리어를 포함한다.

앞의 문장에서 사용한 ‘vector(캐리어)’는 일종의 핵산분자를 가리키고 핵산단락에 삽입 또는 복사 즉 증식할 수 있다. 때문에 한 캐리어에는 보통 하나 또는 여러 개의 독특한 효소제한성위치를 포함하며 확정한 숙주 또는 매개체유기체 안에서 자체 복사하여 클론시스템을 재생하게 한다. 한 캐리어에서 플레스미스,파지, 파지파생캐리어,PAC, BAC과 선형핵산(예를 들면 DNA 등이 있다)을 포함하지만 한정하지는 않는다.(Sambrook 등 지음,1989년, 오스트리아,1992년을 참조)

재조합핵산 또는 캐리어의 형성은 숙주세포의 염색체에서 일어나 자신의 본원을 통해 게놈DNA 에 자체복사 또는 재통합을 더 잘 할 수 있다. 마지막 상황하에 하나 또는 여러 개의 핵산은 하나의 종합체일 수 도 있고 단체복사의 재통합이 염색체의 어느 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 혹은 앞에 설명했듯이 사전에 확정한 위치는 될수록 하나여야 한다. 으뜸으로 치는 실례는 유산중의 thyA 위치이다(예를 들면 유산유구균).

다른 한편으로 본 발명에서 제공한 방법로는 냉동건조세균내부의 재조합핵산내에서 하나 또는 여러 개의 ORF를 구성하여 인류 또는 동물의 수요에 충족시키고 앞에 서술한 핵산을 통해 전환한 세균은 인체와 동물에 좋은 치료효과를 가지고 있다.

동물중의 대부분은 포유류 동물이다. 예를 들면 : 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 쥐, 말, 소, 젖소과 같은 가축류, 역축, 동물원 동물, 스포츠동물, 애완동물과 실험용동물; 유인원, 원숭이, 검은 성성이과 같은 영장류동물; 개,늑대와 같은 견과동물; 고양이, 사자, 호랑이과 같은 고양잇과 동물; 말, 당나귀, 얼룩말과 같은 말과 동물; 젖소, 돼지, 양과 같은 식용동물; 노루, 기린과 같은 유제류동물; 쥐, 햄스터,기니피그 과 같은 동물등이 있다.

여기에 사용한 전문 용어 ‘치료’(‘treat’or ‘treatment’)는 약물치료 혹은 예방방법을 가리킨다. 어느 쪽이든 모두 불필요한 생리개변 또는 생리 질병을 제어하거나 늦춘다. 치료가 필요한 사람과 동물은 특정한 조건하에 치료이득을 얻은 단체를 포함한다.

전문 용어 ‘herapeutically effective amount(치료유효성)’는 치료성물질 또는 혼합물을 가리킨다. 그들은 질병를 치료하는 효과가 있고 예를 들면 인축질병에 예정한 국부 또는 전신의 치료작용을 도달해야 한다. 예를 들면 한 개의 유효치료의 세균 단체 최소로 1개, 10²개, 10³개, 10⁴ 10⁵개, 10⁶ 개, 10⁷개, 10⁸ 개, 10⁹개, 10¹⁰개, 10¹¹개, 10¹²개, 10¹³개, 10¹⁴개 혹은 10¹⁵개 또는 더 많은 세포로 구성되었다. 즉 한번약물치료 혹은 여러번 약물치료에 필요한 세균이다.

이번 발명에서의 냉동건조세균은 따로 또는 동시에 한 개 또는 여러개의 활성화합물에 사용할 수 있다. 후자는 앞에 서술한 냉동건조세균의 사용되기 전과 사용후 혹은 동시 사용할 때 쓸 수 있다.

많은 중요한 항원과/또는 치료활성폴리펩티드의 공개는 아주 유리한 것이다. 이는 이번 발명의 강제동자에 의해 개선하는 것을 촉진할 수 있다. 아래과 같은 실례가 있다(이 실례뿐만 아니다). 세균이 만든 전송에 필요한 클로버 펩타이드은 소화도질병(WO 01/02570 을 참조)을 치료할 수 있고 백혈구 IL는 결장염의 치료에 사용하고 특히 IL-10을(WO 00/23471를 참조), 치료한다. 백신의 항원( WO 97/14806를 참조)인 GLP-2와 해당 류사물은 결장증,클로은병,골다공증의 치료에 사용한다. 화학요법에서도 또한 암치료에 보조작용을 한다. 냉동건조세균의 이런한 발명은 치료중의 응용상상을 진일보로 발전하게 할 것이다.

발견에 의해 효과 있는 펩타이드를 전달하는 것을 통해 진일보로 인류과 동물의 치료가능한 질병종류의 비한제성실례를 들을 수 있다.

장염,클론질병,궤양성결장염(치유가능, IL-lra혹은 IL-10혹은 클리버 펩타이드)

자체면역질환:건선,류마티스관절염,홍반루푸스(치유가능,IL-lra혹은IL-10);

신경계통질환:조기 알츠하이머병,파킨슨증,루게릭병(치유가능, 대뇌친화신경인자와 섬유친화신경인자);암(치유가능,IL-1, 미생물군체 자극인자 혹은 IL-W); 공다공증(치유가능,전환성장인자f3);당뇨병(치유가능, 인슐린)심혈관질환(치유가능, 조직섬유플라스민섬유);동맥경화(치유가능, 예를 들면 세포인자와 세포인자길항물);형우병(치유가능, 예를 들면 응고 인자); 퇴행성간질병(치유가능, 예를 들면 간세포성장인자 혹은 IL-a); 페질병?낭성섬유증(치유가능, 예를 들면 a항트립신프로 테아제); 비만증; 병원체감연 예를 들면 여과성독균 혹은 세균감염(치유가능, 앞에 설명한 임의의 성분혹은 병원균)등을 포함한다.

진일보로 얘기하면 본 발명은 재조합핵산 또는 앞 문장에 제시한 매개체에게 제약 성분을 제공하였다. 여기에는 본 발명에서 만든 냉동건조세균이 포함되여 있고 전환여부를 불문한다.

뿐만 아니라 이 제제는 치료용도에서는 많은 량의 냉동건조세균(본 발명에서 만든 세균)과 약물친화보균자를 포함한다. 예를 들면 한 개 또는 여러 개의 약물매개체물질 또는 식품첨가제,완충제,보균제,부형제,안정제등이 포함된다. ‘약물친화’란 여기에서는 약물중의 다른 원료랑 겸용을 의미하고 복욕자한테 부작용이 일어나지 않는다. 본 발명에서 만든 냉동건조세균는 복용할 수 있는 캡슐,정제, 과립형또는 분말을 만들 수 있다.

또는 본 발명에 의하면 냉동건조세균은 준비된 적당한 매개체에 넣어야 하고 물현탁액에서 보존해야 함다. 또는 본 발명을 사용하기 전에는 잠시 적합한 매개체에 보관해야 한다.

내복하는 시용,로섹위산억제의 내복제구조는 제정할 수 있고 주세포의 방출량을 통제하는 조건에서는 화합물도 포함한다. 때문에 방출량이 통제된 예상 담백질도 해독할 수 있다. 예를 들면 내복제에 얇은 한층의 항해산제를 발라서 위에서의 용해를 중단하고 장안에서의 해체, 용해과 흡수를 허용하고 위를 통과하는 데 유리하다.

내복제의 설계는 숙주세포와 재조합단백질의 방출을 느릴수 있다. 예를 들면 통제석방,완만 석방, 장기간 석방, 지속적인 석방등이 있다. 이런 제형은 보통 전토형과 부형제의 결합이고 예를 들면 지방 친화형, 중합체,셀룰로오스형,난용형,확장형이 있다. 통제 석방제제는 다른 전송환경에서도 사용할 수 잇다. 예를 들면 소장내의 전송, 결장내의 전송, 생물점부체 또는 살하선의 전송과 기관지내의 전송이 있다. 이 약의 모든 성분이 직장 또는 질의 질병에 사용 했을 때 의약제제는 항문좌약과 유제로 만든다. 이러한 실례에서 숙주세포는 피질을 포함한 일반적인 액세서리에 현탁하고 있다. 앞에 제시한 모든 가상(중세기대학)은 많은 유명한 학자에 의해 인용되였다. 예를 들면 Hansel 등 지음,1990년 <제약제량창과 약물전송계통> 제5판,월리엄과 월킨스 출판사; Chien 지음,1992년,<신형약물전달>, 제2판,M,Dekker,1989,년,신형약물전달,J.Wiley &Sons 출판사; Cazzaniga 등 지음,1994년,<내복완만계통이 결장에 대한 특정한 전달>, J.Pharm 출판사등이 있다.

뿐만 아니라 관장약은 직장질병에 사용되어 있다. 관장제란 직장질병약물액체제제라고 한다. 관장제는 보통 단일 제제용기에 사용되고 한 개 또는 여러 개의 활성물질인 물 또는 글리세린 또는 PEG 등 기타 적당한 용제에 용해 또는 분해한다.

이와 같이 선호한 체현중에서 이러한 약물에 의해 숙주세포의 재조합코딩이 필요한 유전자는 점막을 통해 인체 또는 동물몸에 실험하여 구강,비강, 직장, 질 또는 기관지 내벽등 구체적인 경로를 통해 한가지 이상적인 처방상태를 만들어낸다. 숙주세포에 대한 약물사용량은 일부요인에 따라 변하며 그중 세포유형과 치료에 필요한 질병유형, 부근의 코딩유전자와 약물결로등이 있다.

때문에 정확한 사용량은 발명마다 정할 수 없지만 이러한 영역에서의 기술과 현재 발명의 또 다른 무장이란 것은 불 보듯 뻔한 일이다. 이 사용랑은 여러가지 방안을 통해 검증할 수 있다. 혈청재조합단백질의 농도를 측정한 후 널리 알려진 방법?ELISA와 Biacore을 통해 예정된 세포의 수량을 관리한다(실례참조). 운동에너지 구성과 반감기의 교부재조합단백질을 분석하여 석주세보의 전화를 위해 정확한 범위확정에 충분한 정보를 제공한다.

구체적으로 설명한다면 냉동건조세균이 이러한 약물이 서술한 항원에 의해 만들어지면 이러한 약물도 한 가지 백신을 제공해준다.

전문 용어 ‘vaccine(백신)’이란 의학적으로 한 가지 접수할 수 있는 성분으로써 이는 인체 또는 동물체내에서 효과적인 복용략에 도달한 후 백신내의 항체추진면역원이 체내의 면역력을 생산시킨다.

이 백신은 핵산전화한 숙주세포 또는 발명의 매개체와 더 많은 량의 선택가능한 액세서리를 포함한다. 이러한 백신은 다른 보조성분을 가질 수도 있고 즉 면역반응을 증강시키는 항원화합물이다. 보조제에는 완전과 불완전프랜드보조제,사포닌,수산화알류미늄등이 포함되어 있고 계면 활성제로는 혈액 레시틴, 블록 공중합체, 폴리 알코올, 음이온, 펩시틴, 오일 또는 탄화수소의 유액등이 있으며 인체에 유용한 광물젤라틴보조제-비시지(bacille Calmetle 비시지)와 짧은 막대기형간상균이 포함될 수 있다.

본 발명의 냥동건조유산균은 식품공업에 사용할 수 있고 일반적으로 식품첨가제 또는 특별한 발효제로 사용된다. 예를 들어 요구르트발효제 혹은 치즈발효제로 쓰인다. 일반적으로 이러한 성분중의 세균은 한 가지 고정형식에 집중하여 냉동,건조 혹은 냉동건조가 있으며 보통 한 개의 활세포농도가 있으며 이는 최소한 10CFU/g이다. 예를 들면 10<5><6>　CFU/ G，10<7>　CFU/ G，10<8>　CFU/ G，10<10>　CFU/ G，10<11>　CFU/ G，10<12>의 성분이다. 이러한 성문은 전통첨가제인 효소체취물 ,당,비타미등 영양물질이 함유될 수도 있다.

본 발명에서는 여러 식품상품의 냉동건조유산균을 만드는 한 가지 방법을 제공하였다. 예를 들면 우유,비 저온살균법을 사용한 우유, 육류, 면, 술과 식물재료, 야채, 과일 또는 사료작물등이 있다. 앞의 문장에서 가리킨 ‘우유’는 모든 우유 또는 우유성분?우유, 인유, 수우유, 염소우유,이러한 우유로 만든 유제품혹은 유청을 가리킨다. 냉동건저유산균의 독특한 우세는 바로 높은 생존능력과 장기간의 저장용량이다. 발효제 수량의 증가는 활세포수를 보다 많이 증가하였고 최소로 10<3>CFU/g,10　CFU/ G<4>,10<5>　CFU/ G, 10<6>CFU/ G, 10　CFU/ G, 10<7>CFU/ G, 10<8> 　CFU/ G, 10<9>　CFU/ G, 10<10>　CFU/ G, 10<11>CFU/ G, 10<12>/G의 식용생산품의 초기재료이다.

본 발명중에는 화합물을 안정시키는 냉동건조유산균이 포함되어 있다. 이는 제조식품,동물사료의 발효제와 상품의 향기에 중요한 역할을 하고 있다.

실시예

아래과 같은 실험세목을 통해 본 발명을 더잘 이해할 수 있을 것이다. 뒷 문장에서 서술한 본 발명의 설명성 해석은 이런 면에서의 전문 인사한테 더욱 인기있을 것이다. 이런한 실례들은 전문인사더러 더욱 특별한 구현을 떠오르게 한다. 기타 유산균 예를 들면 유산균종,유산간상균,연구균종, 이중 산기 간상균종,백연주 균종과 이 부류에 속한 임의의 분류단위를 포함한다(예를 들면 종,아종, 미생물 군체).

실시예 1: 글루칸, 글루탐산 나트륨과 폴리알콜의 합성물이 냉동건조기간과24시간 보호 대책이 없는 해볕에 쪼이는 기간의 안정효과(25℃/35% RH.)

sAGX0037 유산유구균 균주는 5L의 발효기에서 성장하여 800μM의 티미딘을 함유한 정화수로 2번 씻은 후 10배로 농축한다. 농축한 세균은 냉동보호제 혼합물과 1:1비례로 혼합한다. 마지막에 얻은 처방을 35개의 유리병에 평균분배하여 각각의 유리병에 2ml씩 넣는다. 평균온도가 10℃인 조건하에 생물반응 부터 유리병에 넣는 시간까지 8시간 걸린다. 다른 처방의 최종농도 즉 세포농도는 표 1를 참조하십시오. 유리병에 넣은 후 고체 이산화탄소 고체로 냉동건조스프레이 모양으로 냉동한다.

표1. 세포현탁액을 넣은 후의 냉동건조제차방합성물 세포현탁액중에서의 세포의 건조 중량은 33g/L 또는 3.3%이다.

냉동건조케이크가 강한 해볕에 쪼인후의 생존율을 측정하기위해 유리병 3개를 냉동건조과 24저장 (25℃ 와 35% RH )한 후 바로 세포생존수를 측정하였다.

sAGX0037 유구유간균규주의 생존율 분석결과는 냉동건조셈플의 세포생존수와 해볕에 쪼이는 샘플에 의해 결정한다. 이 결과에서 전분 가수분해물(글루칸 500), 글루탐산 나트륨과 폴리 알콜(예:마니톨)(코드 D에서 표명하듯이)의 화합물은 24시간의 보호대책이 없는 저장기간(25℃ 와 35% RH)에 냉동건조유산유구균을 보호했다고 증명하였다.

글루 탐산 나트륨, 소르비톨과 글루칸을 포함되어 있지만 유명한 냉동보호제(예:프코오스,설탕(처방코드 A,B,C))와 혼합한 화합물은 성공적으로 냉동건조후의 세포생존수는 처방코드 D의 표준에 도달하였다(> 1 x 10E+11 CFU/g). 짧은 시간 해볕에 쪼이는 연구에서 전분가수 분해물과 글루 탐산염과/또는 폴리알콜혼합물만 함유한 처방 D는 아무 보호 대책도 없는 저장조건하에 냉동건조한후의 유산유구균을 24시간 보호할 수 있다（25℃와 35% RH).

설탕처방(코드E)에 비해 정선한 화합물(D)는 냉동건조유산균이 저장기간에서 안정성을 가진 ‘황금준칙’을 확보하였다. 동시에 그는 이러한 실험중에서 유일하게 단기간 해볕 쪼인 후（25℃ /35% RH） 세포생존수량（> 1 x 10E+11 CFU/g）이 안정한 혼합물이다.

단기간 해볕 쪼이는 동안 아무런 안정제도 넣지 않을 때 생존한 세균을 발견하지 못했다. 수치 1과 처방코드 F에서 알아 볼 수 있다.

실시예2 : 글루칸 , 글루탐산 나트륨과 폴리 알콜의 합성물이 냉동건조기간과 24시간 단기간 해볕 쪼이는 기간의 안정효과（25℃/35% RH）.

sAGX0037 유산유구균균주의 전진배양기를 7L 연속파문반응부(CSTR)에 넣는다.5L인 M17c 배양기를 포함한다(성분은 표2로 열거).

표2: M17c 발효배양기 성분

생물반응기의 온도는 30℃로 하고 pH수치는 7에 유지해야 한다(5M NH₄OH 첨가). 반죽속도는 200rpm으로 설정한다. 발효기를 4℃로 냉각하는 것을 통해 포도당을 소모하였다. 포도당이 소모할 때 쯤되면 발효과정도 따라 끝난다. ‘발효마침’실험은 건균량을 측정하는데 사용한다. 측정이 끝나면 3.5L의 발효배양기는 농축되고 1400츠 2500kDa 진공섬유 여과기로 초려법/투려법으로 씻는다.

모든 3.5L 배양기을 약 10배정도 농축한 다음 5L 대플라스크안에 정화수를 넣은 후 여과하는데 사용한다. 여과하는 동안 분석 침투로 유산농도를 측정한다. 유산농도가 5-10g/L에 도달하면 여과과정이 종료된다.

농축과 여과가 끝난 후 세균세포현탁액을 13등분해서 다른 냉동건조제에 넣는다(표3 참조). 냉동건조제랑 세포현탁액을 혼합한 후 혼합물을 25개 유리병에 넣어서 냉동건조한다(최종체적은 2ml).

표3: 세포현탁액을 넣은 후의 냉동건조제처방화합물 세포현탁액중의 세포의 건조무게는 70g/L

내동건조케이크가 강한 해볕에 쪼이는 조건(25℃ 와35% RH). 하에서의 생존율을 측정하기 위하여(다음과 같은 과정을 제정한다[예:캡슐을 채워넣다]) 3개 유리병을 냉동건조하고 24 저장한후 즉시 꺼내서 살아 있는 세포수를 측정한다.

sAGX0037유산유구균 균주의 생존율의 분석결과는 냉동건조 샘풀의 살아 있는 세포수와 공기중에 드러낸 샘풀에 의해 결정한다. 그 결과에서 전분가수분해물(글루칸500),폴리알콜(예:마니톨과/ 또는 소르비톨)과 글루탐산나트륨(코드D1 참조)의 합성물은 냉동건조후에 많은 량의 세포들이 되살아났고(예:> 3 E+11 CFU/g) 아무 보호 대책이 없는 24시간의 저장기간에도 냉동건조한후의 유산유구균세균들도 안정상태였으며 많은 량의 세포들이 되살아났다(>　2　E+11 CFU/g).

비록 처방코드A1, A2, B1, C1 와 C2(글루탐산나트륨혹은 소르비톨과 글루칸,유명한 냉동보호제인 푸코오스와 설탕을 함유한 합성물)는 성공적으로 냉동건조후의 활세포수량을 즉시 처방코드D1의 기준에 도달하게 하였다. 처방 D1와D2는 단기간 해볕 쪼이는 연구에서 아무 보호대책도 없는 24시간 저장조건 (25℃ 와 35% RH)하에서도 냉동건조후의 유산유구균을 안정시켰다고 뚜렷이 증명하였다.

설탕처방(코드E1)과 비교하면 3가지 냉동보호제로 구성한 혼합물은 냉동건조유산균이 저장기간에 안정성의 ‘황금법칙’을 가지게금 확보하였다. 이와 동시에 이는 모든 실례중에서 유일하게 단기간해볕 쪼인（25℃/35% RH） 후 활세포수량（> 2 x 10E+11 CFU/g）이 안정한 혼합물이다.

단기간 해볕 쪼이는 실험에서 글루탐산나트륨을 따로 세균에 넣으 면 생존한 세균을 찾을 수 없다.수치 2와 처방코드F2에서 증명하였다.

실시예3 : 글루칸 ,글루탐산나트륨과 소르비톨의 화합물이 냉동건조기간과 보 호대책없이 4시간 과 24시간 해볕 쪼이는 실험(25℃/35% RH )에서의 안정효과.

sAGX0037유산유구균 균주의 예배양기(100ml)를 5L M17c배양기를 포함한 7L 연속믹서반응장치(CSTR)에 넣는다. 생물반응기는 온도를 30℃에 하고 pH수치를 7에 유지한다(5M NH₄OH을 첨가하는 것을 통해 유지). 믹서 속도는 200rpm로 설정하고 발효기를 통해 4℃로 냉각시키며 포도당농도가 0.5g/L로 낯추면 발효과정을 종료한다. ‘발효종료’실험은 건조균수량(DCW)의 측정에 사용한다. 일단 측정이 끝나면 3.5L의 발효배양기는 농축되고 1400츠 2500kDa의 진공섬유여과기로 초려법/투려법으로 씻는다.

전체의 3.5L 배양기가 약10배로 농축된후 5L의 대용량병은 정화수를 담은 병으로 대체하여 투려를 진행한다. 투려기간에서 분석침투로 유산의 농도를 측정한다. 일단 유산농도가 5-10g/L에 도달하면 투려과정을 종료한다.

세포현탁액과 다른 냉동건조제를 혼합한 후 합성물은 표4에서 제시한다. 냉동건조제와 현탁액을 혼합한 후 무균의 상태에서 각각의 혼합물을 다른 냉동건조용기(55ml등분)에 평균분배한다. 등분한 후 용기를 플랫에 놓고 -70℃의 농동박스에 넣어서 냉동건조시킨다. 냉동건호하는 과정에서 2가지 측정온도로는 각각 25℃와 35℃의 선반온도이다.

표4: 세포 현탁액을 넣은 후의 냉동건조제합성물 처방

sAGX0037유구유산균 균주의 생존율(수치 3)의 분석결과는 냉동건조샘풀의 활세포수량과 공기중에 드러낸 샘풀에 의해 결정한다. 이 결과에서 전분가수분해물(글루칸500),폴리 알코올(예:마니톨과/또는 소르비톨)과 글루탐산나트륨의 합성물이 냉동건조한 후 많은 량의 세포를 되살렸고(예: >　6　E+11　CFU/g) 또한 아무 보호대책이 없이 4시간과 24시간 해볕에 쪼이는 동안 (25℃/35% RH)냉동건조한 후의 유구유산균은 안정하였으며 많은 량의 세포가 되살아났다. 해볕에 쪼이는 실험이 끝난 후에도 많은 량의 안정한 활세포들이 관측되었다. 해볕에 4시간, 24시간 쪼인 후 되살아난 세포수는 각각 > 6 E+11 CFU/g , >　5　E+11 CFU/g이다.

표 4a: 냉동건조제 처방이 냉동건조유구유산균에서의 효과

실시예4 : 덱스트린,글루탐산나트륨과 소르비톨의 합성물이 냉동건조하는 동안과 다른 저장조건하에서의 장기간 저장에서의 안정효과

200L 규모의 sAGX0037유구유산균균주를 공업발효한 후 저축한 균체를 농축하여 각각 초려법/투려법을 사용하여 정화수로 씻는다. 유산농도가 5g/L (55 mmol/L)로 내려갈때 투려과정을 종료시킨다. 초려과 투려 기간 용기 겉부분은 물로 4℃로 냉각시킨다.

아래의 냉동건조 절차를 참고하여 UF/DF과정후의 균체량에 정선한 냉동건조제용액을 첨가하여 세균의 안정성을 보장한다. 최종적인 냉동건조제용액은 전분가수분해물(옥수수전분의 덱스트린에서 추출), 글루탐산염과 폴리 알코올(소르비톨)로 구성하였다(표5).

표5: 냉동건조제 처방성분

첨가한 냉동건조제 용액이 필요한 무게는 약 17.0kg 세포현탁액과 4.8kg냉동건조제 용액이며 최후로 21.8 kg 세포혼탁액을 만들어야 한다. 설정한 후 큰 용량의 냉동건조쟁반에 넣고 검증과 검사를 통해 냉동건조를 진행한다. 냉동건조쟁반은 냉동박스의 선반에 놓고 -50℃까지 냉동한다. 총 냉동시간은 약 9시간이다.

냉동건조과정이 끝나면 박스내의 기압이 내려간다. 첫번째 건조는 부단히 선반온도를 증가하는 것으로 진행하며(각각-22℃, -10℃, 20℃, 25℃,비탈길 모양) 최종선반온도는 35℃이다. 첫번째 건조가 끝나면 기압상승테스트를 통해 이 단계의 종료를 보장한다. 만약 기압이 상승하지 못했다면 두번째 단계의 건조를 진행해야 한다. 총 냉동건조시간은 약 93시간이다.

냉동건조링크가 끝나면 건조한 무균여과된 질소(0.22㎛막구멍을 통해 선별)를 통해 냉동박스의 압력을 가한다. 쟁반을 내리고 18-26℃&30-70% RH 반통풍의 은박지봉투안에 넣는다.

그 다음 냉동건조 조각을 온도가 19-23℃,<20% RH의 100.000급 현장에 약 1시간 방치하고 균형한후 인공으로 분말로 만들어 선별한다(410　㎛). 선별한 후 폴리에틸렌 봉지에 넣어 수동으로 분말과 최종냉동건조후의 원료약을 혼합한 다음(Sag×0037유구유산균과 냉동건조제)분석과 안정성 측정에 사용한다.

이러한 샘풀을 500mg인 폴리에틸렌봉투/은박봉투에 넣어 저장온도가 -20±5 ℃, at 5±3℃, 25±2℃, 60±5% RH의 환경하에 12개월 측정한다. 수치 4에서 증명한듯이 분말에서 활페포수는 현저하게 감소하였다. -20℃와5℃의 온도하에서 저장한 냉동건조세포는 1년 저장하는 동안 90% 넘는 원시활세포수량이 보존되였고 CFU 농도에 도달하여 최대 >　5　x　10E+11 CFU/g이다. 25℃,60% RH의 환경하에 활세포수는 조금만 감소되었지만 1년저장한 후, CFU농도는 여전히 매우 높고 최대 > 3 ×　10E+11 CFU/g이다.

이러한 자료에서 증명한 듯이 전분가수분해물(옥수수전분의 텍스트린),글루탐산염과 폴리 알코올(예:소르비톨)로 구성한 냉동건조제 합성물로 안정한 냉동건조유산균분말을 만들 수 있고 그더러 높은 생존율과 장기간 안정성을 가지게 한다.

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Claims

전분가수분해물과 글루탐산염 및/또는 폴리 알코올을 포함하는, 냉동건조유산균의 생존율 및 안정성을 향상시키기 위한 안정화 화합물의 배합물.
제 1 항에 있어서,
- 전분가수분해물의 양이 약 2.0% 내지 10%(w/v)이고;
- 글루탐산염의 양은 약 2.0% 내지 10%(w/v)이며;
- 폴리 알코올의 양은 약 5.0% 내지 30%(w/v)인
배합물.
제 1 항 또는 2 항에 있어서, 글루탐산염이 글루탐산나트륨인 안정화 화합물의 배합물.
제 1 항 내지 3 항중 어느 한항에 있어서, 폴리 알코올이 소르비톨 또는 마니톨인 안정화 화합물의 배합물.
제 1 항 내지 4 항중 어느 한항에 있어서, 전분가수분해물이 덱스트란인 안정화 화합물의 배합물.
제 1 항 내지 5 항중 어느 한항에 따른 안정화 화합물의 배합물이 사용되는, 유산균의 냉동건조방법.
제 1 항 내지 5 항중 어느 한항에 따른 안정화 화합물의 배합물을 추가로 포함하는 냉동건조유산균.
제 7 항에 있어서, 세균과 다른 재조합핵산을 하나 이상 추가로 포함하는 냉동건조유산균.
제 7 항 또는 8 항에 있어서, 약물 또는 식품원료로 사용하기 위한, 냉동건조유산균.
제 7 항 또는 8 항에 있어서, 식품응용 또는 식품가공에 사용하기 위한, 냉동건조유산균.
제 10 항에 있어서, 식품 또는 동물 사료 제조용 스타터 배양성분 또는 향료 제조용 배양물 형태인 냉동건조유산균.
유산균이 유산균종, 유산간균종, 연구균종, 소구균종, 폴란드러종 및 화이트연구균종으로 구성된 세균중에서 선택되는, 제 1 항 내지 5 항중 어느 한항에 따른 안정화 화합물의 배합물 또는 제 6 항에 따른 냉동건조유산균의 방법 또는 제 7 항 내지 10 항중 어느 한항에 따른 냉동건조세균.