CN104758976A

CN104758976A - 负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶及制备方法

Info

Publication number: CN104758976A
Application number: CN201410007732.3A
Authority: CN
Inventors: 李国栋; 汪益涵; 黄青山; 陆婉英
Original assignee: SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; SHANGHAI GAOKE BIO-ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; SHANGHAI GAOKE BIO-ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明公开了一种负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶及制备方法，负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的大分子蛋白类药物组成，用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，包括如下重量百分含量的组分：海藻酸钠0.4～10%，聚乙烯醇1～20%，联剂0.1～1.0%，pH调节剂0.05～1.0%，交联调节剂0.05～1.0%，水余量。本发明解决了目前水凝胶敷料高强度、工艺简单、无有毒残留三者不可兼得的问题，并使其中载入的大分子蛋白类药物保持良好的稳定性。从而提供一种无毒无刺激性、制备工艺简单、强度较高、所载蛋白类药物稳定性好的水凝胶敷料。

Description

负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶及制备方法

技术领域

本发明涉及一种负载蛋白类药物的水凝胶及其制备方法。

背景技术

1962年，George Winter教授首次以动物实验证实，在湿性环境下，伤口愈合速度较干性快一倍。由此水凝胶敷料应运而生。在为伤口愈合提供适宜湿度的同时，水凝胶敷料还能起到吸收伤口渗液、隔绝外界细菌、并避免摩擦，减少疼痛的作用。与传统敷料相比，透明的水凝胶敷料更加便于观察伤口情况。

目前，水凝胶常用的制备方法有辐射法、化学交联法、物理交联法和冻融法等。化学法最为常用，但通常会残余未反应单体、交联剂和引发剂等，而多数交联剂和引发剂本身具有刺激性和细胞毒性，纯化和处理过程又较为复杂。辐射法少有毒性残留的问题，在制备水凝胶的同时能够完成产品消毒。但该方法对设备要求高，制备的产品机械强度较小，因而限制了其应用。冻融法制得的水凝胶产品具有强度高的优点，但同时透明度较低。物理交联法常用多价金属离子如Ca²⁺、P⁴⁺、Al³⁺离子等进行交联，毒性较低或没有毒性，后期不需要进行纯化处理。但该方法在材料选择范围小，制得的水凝胶强度较低，具有局限性。单一的材料和交联方法常有局限性，而将两种或两种以上的材料和交联方法相互结合，则能最大限度发挥其各自的优点，取长补短，制备出性能更优的水凝胶产品。

已有研究表明，一些蛋白类抗菌药物如溶葡萄球菌酶、溶菌酶、抗菌肽，以及一些生长因子如表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VGEF）成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-α（TGF-α），转化生长因子-β（TGF-β），人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）胰岛素样生长因子（IGF）及血小板衍生生长因子（PDGF）等对伤口的愈合具有明显的促进作用。但蛋白类大分子药物遇水稳定性变差，一般只能以冻干粉形式保存，临使用时再加水溶解用于伤口。这样的给药方式操作上较为繁琐，且需要多次给药，增加病人痛苦。而将药物载入水凝胶，利用其本身具有的缓释作用使药物在伤口部位长时间保持稳定的浓度，不仅能提高患者用药时的顺应性，对伤口愈合速度也会有所提高。

但水凝胶由于其较高的含水量，在载入蛋白类大分子药物时存在稳定性方面的问题。因此市售水凝胶敷料一般以不载药或仅仅载入银离子、纳米银等极为稳定的抗菌剂为主。如果蛋白类大分子药物在水凝胶中的稳定性问题得以解决，水凝胶的应用范围将变得更为广阔。

发明内容

本发明的目的是公开一种负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶及制备方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明首先涉及一种用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，包括如下重量百分含量的组分：

海藻酸钠0.4～10%

聚乙烯醇1～20%

交联剂0.1～1.0%

pH调节剂0.05～1.0%

交联调节剂0.05～1.0%

水余量。

所述的海藻酸钠分子量在32000～250000之间，所述的聚乙烯醇型号为PVA-105、PVA-117、PVA-124中的一种或几种。

所述交联剂为甘氨酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、磷酸氢钙或氯化钙中的一种或几种；

所述pH调节剂为柠檬酸、柠檬酸钠、冰醋酸、醋酸钠、马来酸、马来酸钠或盐酸中的一种或几种；

所述交联调节剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸四钠、柠檬酸或柠檬酸钠中的一种或几种；

所述的负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由所述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的大分子蛋白类药物组成；

所述蛋白类药物包覆材料选自半合成脂肪酸甘油酯、蜂蜡、硬脂酸、十六醇或十八醇；

所述半合成脂肪酸甘油酯可采用成都泸天化科森有限责任公司生产的L34或L36型半合成脂肪酸甘油酯。

以所述水凝胶制剂的总重量计，所述的蛋白类药物包覆材料0.001～2%，大分子蛋白类药物的含量为0.0001%～2%；

所述的大分子蛋白类药物包括生长因子类药物：如表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VGEF）成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-α（TGF-α），转化生长因子-β（TGF-β），人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）胰岛素样生长因子（IGF）及血小板衍生生长因子（PDGF）等；细菌抑制类药物：溶菌酶，溶葡萄球菌酶，抗菌肽等。所述的大分子蛋白类药物包括以上所述药物的一种或几种。

所述负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

（1）将蛋白类药物包覆材料加热熔融，加入所述大分子蛋白类药物，搅拌混合，降温至凝固，冷冻，粉碎，过筛，获得载含蛋白类药物温敏性微粒；

（2）将海藻酸钠加水溶胀得溶胶A，水的重量为海藻酸钠的10～100倍；将聚乙烯醇加水溶胀得溶胶B，水的重量为聚乙烯醇的3～30倍；

（3）于溶胶A中加入交联剂和步骤（1）的产物，混匀，获得溶胶AA；溶胶B中加入交联调节剂，以pH调节剂调节pH值至4～6之间，获得溶胶BB；

然后将溶胶AA和溶胶BB混合，注入模具或涂于背衬上；

待水凝胶凝固后，置于-10℃～-40℃下放置3～15天进行交联反应，即得所述的可控释放大分子蛋白类药物的水凝胶制剂；

本发明以物理交联和冻融法相结合的方式，制备获得了一种可缓释药物的双网络水凝胶敷料，在不引入有毒有刺激性交联剂的前提下使敷料达到一定的强度。同时采用温敏材料对大分子蛋白类药物进行包覆处理，使其在水凝胶中保持稳定，只在体温条件下进行释放。解决了目前水凝胶敷料高强度、工艺简单、无有毒残留三者不可兼得的问题，并使其中载入的大分子蛋白类药物保持良好的稳定性。从而提供一种无毒无刺激性、制备工艺简单、强度较高、所载蛋白类药物稳定性好的水凝胶敷料。

附图说明

图1为载重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF双网络水凝胶累积释放曲线。

具体实施方式

实施例1

组成和配比：（重量）

用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由如下重量百分比的组分组成：海藻酸钠0.4%，聚乙烯醇（PVA-124）20%，磷酸氢钙0.1%，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对0.05%，乙二胺四乙酸二钠0.05%，余量为纯化水。

负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由上述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的重组溶葡萄球菌酶组成，以所述负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶的总重量计，重组溶葡萄球菌酶含量为0.001%；温敏材料为半合成脂肪酸甘油酯（L36），重量含量为0.001%；

配制：

（1）将半合成脂肪酸甘油酯加热熔融，加入重组溶葡萄球菌酶，混匀，搅拌下降温至凝固；

（2）将步骤（1）所得固体冷冻粉碎，过筛，所得粉末为包覆后的药物；

（3）将海藻酸钠加125重量倍的水溶胀得A；

（4）将聚乙烯醇加2.5重量倍的水溶胀得B；

（5）于A中加入磷酸氢钙和步骤（2）已包覆的药物，混匀获得AA；于B中加入乙二胺四乙酸二钠，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对，获得BB；

（6）将AA和BB混匀，注入模具或涂于背衬上；待水凝胶基本凝固后，置于-10℃下放置3日进行交联反应；取出水凝胶，放置至室温，即得成品。

实施例2

组成和配比：

用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶：由如下重量百分比的组分组成：海藻酸钠10%，聚乙烯醇（PVA-105）1%，甘氨酸铝0.5%，醋酸-醋酸钠缓冲对0.2%，乙二胺四乙酸0.2%，余量为纯化水。

负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由上述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和重组溶葡萄球菌酶组成，人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）重量含量为0.01%。，重组溶葡萄球菌酶含量为0.01%，温敏材料为硬脂酸，重量含量为1%；

配制：

（1）将硬脂酸加热熔融，加入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组溶葡萄球菌酶，混匀，搅拌下降温至凝固；

（3）将海藻酸钠加5倍的水溶胀得A；

（4）将聚乙烯醇加50倍的水溶胀得B；

（5）于A中加入甘氨酸铝和步骤（2）已包覆的药物，混匀获得AA；于B中加入乙二胺四乙酸，醋酸-醋酸钠缓冲对，获得BB；

（6）将AA和BB混匀，注入模具或涂于背衬上；待水凝胶基本凝固后，置于-20℃下放置15日进行交联反应；取出水凝胶，放置至室温，即得成品。

实施例3

组成和配比：

用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶：由如下重量百分比的组分组成：海藻酸钠5%，聚乙烯醇（PVA-117）10%，碳酸钙1%，马来酸-马来酸钠缓冲对1%，乙二胺四乙酸四钠1%，余量为纯化水。

负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由上述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的溶菌酶和重组溶葡萄球菌酶组成，溶菌酶重量含量为0.04%，重组溶葡萄球菌酶含量为0.04%；温敏材料为半合成脂肪酸甘油酯（L34），重量含量为2%；

配制：

（1）将半合成脂肪酸甘油酯（L34）加热熔融，加入溶菌酶和重组溶葡萄球菌酶，混匀，搅拌下降温至凝固；

（3）将海藻酸钠加10倍的水溶胀得A；

（4）将聚乙烯醇加5倍的水溶胀得B；

（5）于A中加入碳酸钙和步骤（2）已包覆的药物，混匀获得AA；于B中加入乙二胺四乙酸四钠，缓冲对，获得BB；

（6）将AA和BB混匀，注入模具或涂于背衬上；待水凝胶基本凝固后，置于-40℃下放置10日进行交联反应；取出水凝胶，放置至室温，即得成品。

实施例4

组成和配比：

用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶：海藻酸钠5%，聚乙烯醇（PVA-124）10%，磷酸氢钙1%，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对1%，乙二胺四乙酸二钠1%，余量为纯化水；

负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，由上述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的（重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF）组成，溶菌酶重量含量为0.02%，GM-CSF为0.02%，温敏材料为半合成脂肪酸甘油酯（L36），含量为2%；

2、配制

a)将半合成脂肪酸甘油酯2g加热熔解，加入0.02g重组溶葡萄球菌酶和0.02gGM-CSF，混匀，搅拌下降温至凝固；

b）将a步骤所得固体冷冻粉碎，过筛，所得粉末为包覆后的药物。

c）称取海藻酸钠5g，加水39.98g溶胀得A；

d）称取聚乙烯醇10g，加水39.98g溶胀得B；

e）于A中加入磷酸氢钙1g和已包覆的药物，混匀；B中加入乙二胺四乙酸二钠1g，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲对1g调节pH值至4～6之间；

f）将A、B混匀，注入模具或涂于背衬上；

g）待水凝胶基本凝固后，置于-40℃下放置10日进行交联反应；

h）取出水凝胶，放置至室温，即得成品。

实施例5

稳定性实验

1、实验器材

重组溶葡萄球菌酶标准品（90U/mL）；色源底物KNR—PG，用0.2mol/LGly-NaOH缓冲液（pH10.0）1:5（m/v）悬浊液备用；0.2mol/LGly-NaOH缓冲液备用（pH10.0）；0.05mol/LTris-HCL稀释液（pH7.5）；

2、实验方法

取实施例1、2、3的载重组溶葡萄球菌酶双网络水凝胶，真空干燥，粉碎后于37℃水浴释放。取水溶液以水稀释成适当浓度，滤过后待以表2顺序加入试剂及样品。

表1重组溶葡萄球菌酶活性测定方法

10000rpm离心10min，取上清液595nm处以0号管为空白对照测定吸光度，比色皿的光径为1cm。

根据测得的吸光度A值及相对应的标准酶浓度C（U/ml），绘制标准曲线：A=KC+B

其中K为标准曲线的斜率，B为标准曲线的截距，A为吸光度，C为酶的浓度（U/ml）。

3、实验结果

从表2可以看出载重组溶葡萄球菌酶双网络水凝胶在25℃存放24个月后的酶活性没有发生明显变化

表2 25℃存放24个月后载重组溶葡萄球菌酶双网络水凝胶的酶活定结果

实施例6载溶葡萄球菌酶双网络水凝胶的体外药效学实验

1、实验器材

实验菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）；大肠杆菌（ATCC 11229）；磷酸盐缓冲溶液（PBS0.03mol/L pH7.2）

1、实验方法

取实施例1、实施例2、实施例3制备的水凝胶敷料各1g，于37℃10ml水中释放。分别于1、2、4、8、24、48、120小时取样并更换释放介质，所取水溶液待测。

将实验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成0.5麦氏比浊标准的菌悬液，用MH肉汤将上述菌悬液进行1：100稀释。将水凝胶释放所得水溶液以1：1的比例与菌悬液混合。置37℃培养18～24小时，观察澄清度。

2、实验结果

表3各配方载重组溶葡萄球菌酶双网络水凝胶体外抑菌效果

由表3可以看出，各配方载重组溶葡萄球菌酶双网络水凝胶在5日内均可以有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。

实施例7载重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF双网络水凝胶体外释放实验

1.实验方法

取实施例4制备的水凝胶敷料1g，于37℃10ml水中释放。分别于1、2、4、8、12、16、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264小时取样，以色源底物法测定重组溶葡萄球菌酶含量，Elisa法测定GM-CSF含量。

3、实验结果

由图1可见，载重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF双网络水凝胶中所载的重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF能够持续稳定释放200小时以上，可以满足临床要求。

实施例8载重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF双网络水凝胶体内药效学实验

1.实验方法

在新西兰大白兔背部造深二度烧伤模型后接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），三天后三组动物分别给予实施例6制备的载重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF双网络水凝胶，空白双网络水凝胶和生理盐水。分别于给药后0、3、7、14天测定伤口金葡菌量，并于3天、1周、2周对伤口进行观察。

2.实验结果

表4结果显示，接种MRSA菌株到伤口三天后给予GL/Dex-GMA-Gtn-NPs/CC在第二周时在伤口处已经检测不到细菌；而其他组细菌量还在8log10CFU/ml以上。

表4三组动物不同时间点的伤口菌量(log10CFU/mL)

*与生理盐水组比较有显著性差异（p<0.05）.

a未见有MRSA检出

试验结果显示，新西兰大白兔烧伤MRSA感染创面经载重组溶葡萄球菌酶和GM-CSF双网络水凝胶治疗后，创面中的感染细菌快速消除，创面愈合加快。

Claims

1.用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，其特征在于，包括如下重量百分含量的组分：

海藻酸钠0.4～10%

聚乙烯醇1～20%

交联剂0.1～1.0%

pH调节剂0.05～1.0%

交联调节剂0.05～1.0%

水余量。

2.根据权利要求1所述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，其特征在于，所述的海藻酸钠分子量在32000～250000之间，所述的聚乙烯醇型号为PVA-105、PVA-117、PVA-124中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，其特征在于，所述交联剂为甘氨酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、磷酸氢钙或氯化钙中的一种或几种；

所述交联调节剂为乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸四钠、柠檬酸或柠檬酸钠中的一种或几种。

4.负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，其特征在于，由权利要求1～3任一项所述的用于负载温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶和以温敏材料包覆的大分子蛋白类药物组成。

5.根据权利要求4所述的负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，其特征在于，所述包覆材料选自半合成脂肪酸甘油酯、蜂蜡、硬脂酸、十六醇或十八醇。

6.根据权利要求4或5所述的负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶，其特征在于，以所述水凝胶制剂的总重量计，所述的蛋白类药物包覆材料0.001～2%，大分子蛋白类药物的含量为0.0001%～2%；

所述的大分子蛋白类药物包括生长因子类药物：如表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VGEF）成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-α（TGF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）胰岛素样生长因子（IGF）或血小板衍生生长因子（PDGF）中的一种以上。

7.根据权利要求4～6任一项所述的负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

然后将溶胶AA和溶胶BB混合，注入模具或涂于背衬上；

待水凝胶凝固后，置于-10℃～-40℃下放置3～15天进行交联反应，即得所述的负载了温敏性微粒蛋白类药物的双网络水凝胶。