KR20120017498A

KR20120017498A - 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120017498A
Application number: KR1020100080095A
Authority: KR
Inventors: 윤봉식; 이인경
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2012-02-29
Also published as: KR101351406B1

Abstract

본 발명은 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii) 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii) 유래의 폴리페놀 추출물에는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물이 함유되어 있으며, 항동맥경화 활성을 나타내는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 바우미 상황버섯 폴리페놀 추출물 및 이 추출물에 함유되어있는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

Description

바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물 {A composition for athero-sclerosis comprising the polyphenol extracts from Phellinus baumii}

본 발명은 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화 활성이 우수하여 동맥경화증의 치료 및 예방을 위한 식품조성물 또는 약학조성물로서 유용한 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii) 추출물 및 이 추출물에서 분리된 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

스트레스, 과식, 공해 등에 의한 성인병이 증가됨에 따라 동맥경화증 등의 혈관장애 질환이 크게 증가되고 있다. 콜레스테롤의 증가, 특히 저밀도 지질단백질 (LDL)-콜레스테롤의 증가는 죽상동맥경화증과 관련된 질병들의 원인으로 인식되고 있다. 이러한 질병들을 예방하기 위하여 콜레스테롤의 흡수를 억제하고 생합성을 저해하여 혈장 저밀도 지질단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL)의 양을 감소시키려는 시도가 있었다[Principles in Biochemistry, lipid biosynthesis, 770-817, 3rd Edition, 2000 Worth Publishers, New York; Steinberg, N. Engl. J. Med., 1989, 320, 915-924].

최근에는 죽상동맥경화증 (atherosclerosis)의 요인으로 혈액 내의 LDL 산화물의 생성이 주요관심의 대상이 되고 있으며[Circulation, 1995, 91, 2488-2496; Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1997, 17, 3338-3346], 특히 LDL이 과도한 산화를 통해 구조적으로 변형되어 생성된 HM-LDL (highly modified LDL)이 대식세포 (macrophage)로 유입되어 거품 세포 (foam cell)를 생성한다는 사실이 밝혀짐에 따라 LDL 과산화물 (peroxide)의 생성요인과 그의 제거에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 혈관벽 내에 플라그 (plaque) 형성과 파열은 심근경색 발병의 주요한 요인이 되며, 동맥 경화는 혈관 벽의 손상에 대한 만성 염증과정으로서, 손상기작보다는 오히려 방어기작으로 제시되고 있다.

프로부콜 (Probucol), N,N'-디페닐렌디아민 (N,N'-diphenylenediamine), 페놀계 합성 항산화제인 BHA (butylated hydroxyanisol)와 BHT (butylated hydroxy toluene) 등의 종래 고지혈증 치료제는 LDL 콜레스테롤을 감소시키고 산화정도를 약화시키며 병변 형성을 감소시키는 항산화력은 인정되나 투여에 따른 부작용이 많이 발생되어 사용이 제한되고 있다. 따라서, 고지혈증이나 동맥경화 환자에 있어서 지질강하제와 함께 LDL 항산화제의 병행투여 요법에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이에 따라 부작용이 적고 항산화력이 우수한 항산화제의 개발이 현실적으로 요구되고 있다.

식용버섯의 약리효과에 대해서도 지금까지 여러 분야에서 발표되어 왔으며, 고령화 사회를 맞이하게 된 현대에 이르러 먹으면서 건강을 증진시킨다고 하는 일석이조인 버섯식이에 의하여 이룰 수 있는 역할이 크게 기대되고 있다.

수백만 년 동안 버섯은 바이러스와 박테리아 등의 침입자들을 막아내기 위해

체내에서 방어 물질들을 생산하여, 체내의 독성물질을 해독시키면서 환경에 적응 하여왔다.

지금까지 알려진 약용 버섯들로부터, 이들이 생산하는 2차 대사산물인 이른바 방어 물질은 인류에게 수 천년동안 안전하면서도 효과적인 의약품으로 알려져 왔다.

특히, 수 천 종에 이르는 버섯 균류들은 독특하며 다양한 화합물들을 생산하는 것으로 알려져 있어 신약개발을 위한 좋은 소재로 이용할 수 있을 것이다.

하지만 아직까지 버섯으로부터의 천연물 연구는 다른 미생물에 비해 저조한 편이며 특히 식용버섯 외에 영지, 표고, 차가버섯 등 전통 약용버섯에 대한 정확한 성분 및 함량분석 및 이들이 나타내는 효능에 대해서는 아직 명확히 연구된 바가 없어, 버섯을 소재로 한 천연약물의 개발은 미비한 상태이다.

본 발명은 상기의 문제를 해결하기 위하여 항동맥경화 활성을 나타내는 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물 및 이 추출물에 함유되어 있는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물을 유효성분으로 함유하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 바우미 상황버섯 유래의 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 활성화합물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 활성화합물은 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물에서 분리된 것이 바람직하다.

상기 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 활성화합물은 인터푼진 A (Interfungin A), 바우민 (Baumin=피비211(Pb211)), 다발리아락톤 (Davallialactone), 히스피딘 (Hispidin), 히폴로민 B (Hypholomine B), 펠리그리딘 D (Phelligridin D) 및 이노스카빈 A (Inoscavin A)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

또한 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 포함하는 식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 의해, 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 식품 조성물 또는 약학 조성물로 사용된다.

또한, 상기 추출물에 함유되어 있는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물도 동맥경화와 관련된 심혈관계 질환의 치료 및 예방을 위한 식품 조성물 또는 약학 조성물로 사용하기도 한다.

도 1은 상황버섯 폴리페놀군의 조추출물 조제과정을 나타낸다.
도 2는 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii) 폴리페놀 추출물에 함유되어 있
는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 7개 화합물의 화학식을 나타낸 도면이다.
도 3은 Interfungin A 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼 b: 탄소핵자기공명스펙트럼
도 4는 Baumin (=Pb211) 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼 b: 탄소핵자기공명스펙트럼
도 5는 Davallialactone 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼 b: 탄소핵자기공명스펙트럼
도 6은 Hispidin 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼 b: 탄소핵자기공명스펙트럼
도 7은 Hypholomine B 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼 b: 탄소핵자기공명스펙트럼
도 8은 Phelligridin D 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼
도 9는 Inoscavin A 화합물을 나타낸 도면이다.
a:수소핵자기공명스펙트럼 b: 탄소핵자기공명스펙트럼
도 10은 7종의 폴리페놀 화합물의 Fenton 반응 저해활성을 나타낸다 (1. Baumin, 2. davallialactone, 3. hispidin, 4. hypholomine B, 5. interfungin A, 6. Inoscavin A, 7. phelligrin D, 8. BHA, 9. Trolox, 10. DFO)
도 11은 CAS 분석 (CAS assay)에서 철분 킬레이터 (iron chelator)의 존재를 나타내는 것으로 청색에서 핑크색으로의 색의 변화를 나타낸다.
도 12는 7종의 폴리페놀 화합물의 철 킬레이트화 (iron chelation) 활성을 나타낸다.
도 13은 바우미 상황버섯의 메탄올 추출물의 에틸 아세테이트의 용해 분획의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다 (1. Interfungin A; 2. Davallialacton 3. Hypholomine B)
도 14는 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 체중을 나타낸다. 대조군과의 상당한 차이는 p<0.05에서 이다.
도 15는 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 혈장 지질의 레벨을 나타낸다.
도 16은 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 혈장 사이토카인의 레벨을 나타낸다.
도 17은 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 대종맥에서의 사이토카인 mRNA 발현을 나타낸다.
도 18은 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 부착분자 (adhesion molecule) mRNA 발현을 나타낸다.
도 19는 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 대동맥동에서 지질축적을 나타낸다 (Oil-red O 염색, x40).
도 20은 ApoE-/-마우스에서 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물의 8주간 매일 투여에 따른 전 대동맥에서 지질축적을 나타낸다.

본 발명자들은 천연물질을 이용하여 동맥경화와 관련된 심혈관계 질환의 치료 및 예방을 위한 기능성 식품, 또는 식품첨가물, 또는 약학조성물을 개발하기 위해 여러 연구를 한 결과, 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii) 폴리페놀 추출물이 항동맥경화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

바우미 상황버섯 (Phellinus baumii)은 일명 장수 상황버섯이라 일컫는 것으로써, 야생의 자연산 상황버섯의 일종으로서 단백 다당체를 가장 많이 함유하고 있으며 번식이 잘되지 않는 희귀한 담자균류의 다년생 버섯 중에 하나이다.

이러한 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii)은 최근 인공재배가 가능하고 1~2년만 지나면 수확을 할 수 있어 많은 농가에서 재배를 하고 있는 추세로, 바우미 상황버섯에 0.10~0.16%의 베티글루칸 성분을 함유하고 있는 것으로 나타나 NK (Natural Killer)세포와 인체면역 활성화 효과가 있다고 보고된 바 있다.

또한 본 발명의 일실시예에서는 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물에서 분리된 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 활성화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기와 같은 효능들을 나타내는 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii)의 항동맥경화 효과를 나타내는 주요성분들을 확인한 결과, 스티릴파이론 (styrylpyrone)계열의 화합물들이 분리되었다.

상기 분리된 화합물들은 구조분석을 통하여 화학구조를 확인한 결과 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물인 인터푼진 A (Interfungin A), 바우민 (Baumin=피비211(Pb211)), 다발리아락톤 (Davallialactone), 히스피딘 (Hispidin), 히폴로민 B (Hypholomine B), 펠리그리딘 D (Phelligridin D) 및 이노스카빈 A (Inoscavin A) 등 총 7개의 화합물이 주성분으로 이루어져 있음을 확인하였다. 이들 이외에도 스티릴파이론 (styrylpyrone)계열의 폴리페놀 화합물이 함유되어 있으나 미량의 성분으로 함유되어 통상의 방법으로는 분리할 수 없었다. 따라서 상기 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 활성화합물으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

특히, 상기 7개의 화합물들은 바우미 상황버섯 (Phellinus baumii) 에서는 처음으로 분리된 화합물이었다.

따라서, 본 발명에서는 바우미 상황버섯 폴리페놀 추출물의 항동맥경화 효과 및 추출물에 함유되어있는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 화합물을 지표물질로 하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명인 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명이 특징으로 하는 바우미 상황버섯 폴리페놀 추출물과 이 추출물로부터 활성물질을 분리하기 위해서는 바우미 상황버섯을 알콜류, 아세테이트류, 에테르류, 아세톤류, 탄화수소류 등 중에서 선택된 유기용매에 의하여 추출, 물의 분배, 컬럼 크로마토그라피 등 버섯성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수 있다.

이때, 바우미 상황버섯을 그대로 사용하거나 또는, 버섯 자실체 및 균사체 양액을 사용하여 추출하기도 하며, 조 추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 바우미 상황버섯 폴리페놀 추출물과 이 추출물에 함유되어 있는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 7개의 화합물을 효율적으로 분리할 수 있는 바람직한 방법은 다음과 같다.

1) 바우미 상황버섯 추출물을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 및 탄소수 1 내지 10의 지방족 탄화수소 중에서 선택된 용매로 추출하는 과정, 2) 상기 용매 추출물을 헥산 및 에틸아세테이트 용매를 사용하여 분배 추출하여 폴리페놀 분획을 획득하는 과정, 3) 상기 폴리페놀 추출액을 클로로포름-메탄올 용리액을 사용하여실리카젤 컬럼 크로마토그래피하는 과정, 4) 상기 용출액을 메탄올을 사용하여 세 파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피하는 과정 또는 상기 용출액을 40 ~60 % 메탄올을 사용하여 분취용 고속 액체 크로마토그래피 (preparative HPLC)를 실시하여 화합물을 각각 분리 수득하는 과정으로 이루어진다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물에 함유되어 있는 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 7개의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물도 식품 조성물 또는 약학 조성물로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

특히, 본 발명의 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물 및 이 추출물에서 분리된 스티릴파이론 (styrylpyrone) 화합물은 동맥경화 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 함유될 시, 조성물 전체중량 대비 0.0001 ~ 10.0 중량 %로 함유되며, 바람직하게는 0.1 ~ 10.0 중량 % 함유되는 것을 특징으로 한다.

상기 유효성분의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 항동맥경화 효과가 거의 나타나지 않으며, 10 중량 % 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하면서, 제형상의 안정 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

또한, 본 발명의 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물 및 이 추출물에분리된 스티릴파이론 (styrylpyrone) 화합물을 약학적 조성물로 이용할 시, 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있고, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있고, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물을 투여하기 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도,불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물 및 이 추출물에 분리된 스티릴파이론 (styrylpyrone) 화합물을 식품 조성물은 건강을 위한 식품, 음료, 또는 음료첨가제로 사용할 수 있으며, 상기 조성물은 식품 총 중량에 대하여 0.01 % 내지 10 중량%로 물에 혼합하여 항산화 효과를 목적으로 한 기능성 음료 또는 상기 조성 성분을 건조 분말화하여 충진한 연질 또는 경질 캡슐제의 형태로 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 항동맥경화 효과를 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 과자류, 차, 비타민 복합제, 건강기능 식품류 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 상황버섯 ( 바우미종 , Phellinus baumii ) 폴리페놀군의 동물효능 검정을 위한 조추출물의 확보

농가에서 재배되고 있는 상황버섯인 바우미종으로부터 분리한 항산화 폴리페놀군의 동맥경화 예방 및 치료효과를 검증하기 위하여 폴리페놀군 조추출물을 제조하였다. 금산 약초시장에서 구입한 1 kg의 국내산 상황버섯을 메탄올로 24시간동안 homogenizer로 저어주면서 추출하였다. 추출액을 감압건조한 후 hexane으로 분배 추출하여 유지성분을 제거하고, 남은 물층은 ethyl acetate로 재차 분배 추출하였다. Ethyl acetate 층은 감압 건조하고 건조물을 갈아 분말로 만들어 조추출물 50 g을 제조하였다 (도 1).

< 실시예 2> 상황버섯 ( Phellinus baumii )으로부터 분리한 styrylpyrone 계 폴리페놀 화합물의 항산화 활성

상기의 조추출물로부터 7종의 styrylpyrone계 폴리페놀 화합물의 화학구조 및 이들의 ABTS radical, DPPH radical, superoxide radical에 대한 소거 활성은 이미 보고된 바 있다. 본 연구에서는 이들의 항산화활성에 대한 작용기전을 규명하기 위하여 Fenton reaction 저해 및 iron chelation 활성을 측정하였다.

1. 폴리페놀 화합물의 DNA single strand breakage 저해활성

Fenton chemistry는 의약품, 식품 및 환경 분야에서 중요한 연구 테마로 많은 연구가 진행되어 왔다. 그 이유는 과산화수소가 포함된 반응계에서 iron은 Fenton 반응을 촉매 하여 강력한 산화제인 hydroxyl radical을 생성시키기 때문이다. 그러므로 Fenton 반응을 저해하는 화합물은 hydroxyl radical을 소거 할 수 있고 또는 반응성이 큰 iron을 chelation 하여, Fenton 반응이 진행되지 못하게 한다. Fenton 반응 저해 활성은 iron과 과산화수소 존재 하에서 DNA single strand breakage (SSB) 방법을 이용하였다. 저해 활성 결과는 도 10에 나타내었다.

그 결과 대부분의 화합물은 30 μM에서 Fenton 반응을 저해하여 DNA를 보호하였으며, hispidin은 타 화합물에 비하여 약한 활성을 나타내었다. 2년차에서 보고된 활성 결과에서는 phelligridin D는 활성을 거의 나타내지 않았고, hispidin은 강한활성을 나타내었다. 상반된 결과가 나온 이유는 화합물의 순도 때문인 것으로 추정되었다. 이번 연구에서는 실험에 이용된 7종의 화합물에 대하여 재정제를 통하여 순도를 높인 후 재차 실험을 실시한 것이다. 이들 화합물은 iron chelator로 사용되고 있는 DFO와 유사한 활성을 나타내었다. 그러나 항산화제인 BHA와 trolox는 Fenton 반응을 저해하지 못하였다. 이같은 결과로부터 본 화합물들은 free radical scavenging 활성과 Fenton 반응의 저해 활성을 모두 나타내는 것으로 추정할 수 있었다.

2. 폴리페놀 화합물의 iron chelation 활성

바우미 상황버섯으로부터 분리한 styrylpyrone계 폴리페놀 화합물의 Fenton 반응 억제 기전을 규명하기 위하여 iron chelation activity를 측정하였다. 측정방법은 Schwyn과 Neilands가 개발한 방법을 이용하였다. 즉 철을 함유한 메탈 적정 시약인 CAS (Chrome azurol S)에 화합물을 반응시켜 철을 chelation하는 능력을 측정하는 것으로, 주로 미생물의 siderophore 활성을 측정하기 위하여 이용되는 방법이다. CAS assay는 siderophore를 함유하는 추출물에서는 CAS 용액의 색이 푸른색에서 핑크색으로 변한다. 따라서 이들 색의 변화를 630 nm에서 측정하였다. Iron chelation 활성은 다음의 식 Iron chelation activity (%) = [1 (Abs (sample) Abs (negative control))/(Abs (positive control) Abs (negative control))] x 100으로 계산하였다 (도 11참조).

그 결과, hypholomine B와 interfungin A는 대조구로 사용한 DFO (iron chelator)와 유사한 활성을 나타내어 iron chelation과 hydroxyl radical의 두 가지 활성을 모두 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나 free radical scavenging 활성에서 가장 강력한 항산화 활성을 나타내었던 신규 화합물 baumin과 davallialactone은 iron chelation 활성이 높게 나타나지 않아 radical을 소거하는 활성으로 인해 Fenton 반응이 억제되는 것으로 유추할 수 있었다. 또한 이는 화학 구조적으로 매우 유사하나 davallialactone과 비교하여 낮은 항산화 활성을 나타낸 baumin이 iron chelation 활성에 있어서도 davallialactone보다 약한 활성을 나타내어 위와 같은 유추를 가능하게 하였다. Fenton 반응은 iron을 매개로 지질의 과산화를 유발한다. 흥미롭게도 inoscavin A는 지질의 산화를 억제하는 지질과산화 저해제로 보고된 바 있다. Inoscavin A가 iron chelation 활성을 나타내는 것으로부터 지질과산화 억제기전이 iron chelation에 의한 Fenton 반응의 제어로서 추정할 수 있었다 (도 12참조).

< 실시예 3> 상황버섯 ( Phellinus baumii ) 추출물의 quality control ( QC )을 위한 지표성분 선정 및 간편 분석방법 확립

1. 지표성분의 선정

상황버섯의 항산화 폴리페놀군 조추출물로부터 QC를 위한 지표성분을 설정하였다. 지표성분은 상황버섯의 주요 항산화 활성성분인 interfungin A, davallialactone 및 hypholomine B로 선정하였으며, 이들 화합물은 상황버섯 바우미종을 특징할 수 있을 뿐만 아니라 생물활성에 있어서도 주요 활성성분이다. 따라서 이들 성분을 QC를 위한 지표성분으로 선정하였다 (도 13참조).

2. 간편 분석방법 확립

상기의 선정된 지표성분 검출을 통하여 상황버섯의 폴리페놀군 조추출물의 QC를 위한 HPLC 간편 분석 방법을 확립하였다. 즉 조추출물을 10 mg/ml의 농도로 만들어 분석용 column을 이용하여 HPLC를 수행하며, 지표성분을 간편하게 분석할 수 있는 HPLC 설정 조건은 다음과 같다. 컬럼 (Column: 역상컬럼(150 x 4.6 mm; Cosmosil, Nacalai tesque, Japan)), 이동상 (Mobile phase: A linear gradient solvent system (용매 A, 5% (v/v) 메탄올, 0.04% (v/v) TFA ; 용매 B, 메탄올): 02 분, 20% B; 210 분, 2045% B; 10-20 분, 45% B; 2025 분, 70% B; 2532 분, 70% B; 3236 분, 100% B; 3640 분, 100% B; 4043 분, 20% B), 유속 (Flow rate : 1 ml/min)

< 실시예 4> 상황버섯 ( Phellinus baumii ) 폴리페놀 추출물의 동맥경화 관련 in vivo 효능 검정

1. 연구 방법

1) ApoE 결핍 마우스를 이용한 동맥경화 유도, 상황버섯 폴리페놀 추출물의 투여 및 체중, 식이섭취량 측정

일반적으로 ApoE 결핍 마우스는 정상식이에서도 혈장 콜레스테롤 수치가 400~500 mg/dl에 도달하며, 주령이 증가함에 따라 자발적으로 동맥경화가 발생하는 특징을 가지고 있다. 본 연구에서는 이와 같은 8주령의 수컷 ApoE-/- 마우스를 각 군당 동물수는 10마리씩 무작위로 배정하고 온도 22±1℃, 습도 50±5% 및 12시간 주기의 명암으로 조절되는 SPF (specific pathogen free)시설에서 사육하면서, 1.25% cholesterol이 함유된 동맥경화식이 (Dyets #102571, USA)를 섭취시켰다. 군 분류 전 적응 기간 동안 모든 마우스에게 동맥경화식이를 섭취시켰으며, 군은 총 4군으로 나누어 정상 식이군을 제외하고 나머지 세 군에는 동맥경화식이를 섭취시키면서, 실험군에는 상황버섯으로부터 유래된 폴리페놀 추출물을 2가지 농도로 1일 1회 경구로 직접 투여하고, 대조군에는 vehicle (1% DMSO, 0.1% Tween80)을 투여하였다 (표 1 참조).

상황버섯 폴리페놀 추출물의 항동맥경화 효능 검정을 위한 동물실험군

실험동물	성별	주령	투여시료	투여경로(횟수)
ApoE-/- 마우스(n=5)		8주	정상식이+Vehilce (1% DMSO, 0.1% Tween 80)	경구투여 (1일 1회)
"	"	"	동맥경화식이+Vehicle (1% DMSO, 0.1% Tween 80)	"
"	"	"	동맥경화식이+버섯 유래 추출물 (500 /) in Vehicle	"
"	"	"	동맥경화식이+버섯 유래 추출물 (300 /) in Vehicle	"

2) 동맥경화 유도 ApoE 결핍 마우스의 혈장 지질 및 사이토카인 분석

상황버섯 폴리페놀 추출물을 8주차까지 투여한 후, 혈액을 채취하여 10,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 혈장 내 triglyceride (TG)과 total cholesterol (TC) 성분에 대한 분석은 상업적인 kit (Asan Inc., Korea)를 사용하여 효소법에 의하여 측정하였다. 혈장 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β) 농도는 multiplexed bead-based assay (Bio Medical Science Co., Ltd, Korea)를 통해 측정하였다.

3) 동맥경화 유도 ApoE 결핍 마우스 대동맥의 Total RNA 조제 및 cDNA 합성 대동맥에서 염증관련인자 및 세포부착분자들의 발현을 분석하기 위하여, 상황버섯 폴리페놀 추출물을 8주 동안 투여한 후, 5마리의 대동맥을 pooling하여 Trizol reagent에 담근 후 tissue homogenizer를 이용하여 빙냉상태에서 균질화하였다. 균질화한 조직을 microcentrifuge tube에 옮기고 chloroform을 넣은 후 15초 동안 위 아래로 강하게 흔들고 3분 동안 실온에 방치하였다. 4℃에서 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하면 층이 나뉘어지는데 그 중 상층액을 다른 tube로 옮겨 70% 에탄올을 첨가한 후 잘 섞어주고 이 중 일부를 column에 옮겨 8,000 g에서 15초 동안 원심 분리하였다. RW1, RPE buffer를 순서대로 넣어 8,000 g에서 15초 동안 원심 분리하여 얻은 pellet을 새로운 tube에 RNase free water로 녹여 RNA를 추출하였다. RNA의 양은 nanodrop을 사용하여 260 nm와 280 nm에서 농도와 순도를 정량하였다. cDNA는 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 reaction mix 4ul, reverse transcriptase 1ul, nuclease-free water에 RNA template 1 ug을 넣어 총 볼륨이 20 ul가 되게 한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분 동안 반응시켜 합성하였다.

4) 동맥경화 유도 ApoE 결핍 마우스의 대동맥에서 mRNA 발현 분석

적정 농도로 희석한 cDNA 2 ul, SYBR Green supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 5 ul, 10 pmol의 primer 각각 1 ul, dH₂O로 최종 부피 10 ul로 맞춘 다음 real-time PCR (Bioneer, Korea)를 실시하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분, [95℃에서 10초 (denaturation), 60℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 30초 (extension)] × 50 cycle로 맞추어 실시간으로 변화하는 형광의 양상을 관찰하여 얻어진 Ct 값을 18S RNA의 Ct 값으로 표준화하였다.

5) 동맥경화 유도 ApoE 결핍 마우스의 병리조직학적 분석

상황버섯 폴리페놀 추출물의 8주간 투여에 따른 병리조직학적인 변화를 관찰하기 위하여 각 군당 5 마리씩 혈액을 채취하고 ether로 마취한 후, PBS로 심장관류를 실시하였다. 각각의 동물에 대한 부검을 실시하여 심장과 대동맥활을 얻었다. 심장은 OCT compound로 포매하고 동결절편을 시행한 후 냉동실에서 하루 동안 보관하였다가 10% neutral buffered formalin에 1시간 동안 고정하여 oil-red O 염색을 하여 지질 침착정도를 관찰하였다. 대동맥활은 24시간 이상 10% neutral buffered formalin에 고정하고 동맥 주변의 지방을 제거한 후, 바늘로 고정하여 심장과 마찬가지로 oil-red O 염색을 시행하였다.

2. 연구 결과

1) 체중 및 식이 섭취량 측정

동맥경화식이 유도 동물모델에서 상황버섯 폴리페놀 추출물을 두 가지 농도로 1일 1회 경구로 8주 동안 투여하면서 체중 및 식이섭취량 변화를 측정하였다 (도 14참조). 체중의 경우, 실험 마지막 주인 8주차의 체중이 정상 식이를 섭취시킨 정상대조군에서 27.8±3.3 g, 동맥경화식이를 섭취시킨 대조군에서 22.9±3.3 g, 상황버섯 폴리페놀 추출물 투여군인 PB300 또는 PB500군에서 각각 23.4±2.8 g, 22.4±2.5 g으로 나타나 동맥경화식이를 섭취시킨 세 군 (control군, PB300군, PB500군)간에 차이를 보이지 않았으나 정상식이를 섭취시킨 대조군에서 투여 2주차부터 동맥경화식이를 먹인 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다 (Student t-test, p< 0.05). 식이섭취량 또한 정상식이를 섭취시킨 군에서 동맥경화를 섭취시킨 군들 보다 증가하는 경향을 보였다.

2) 혈액 지질 측정

동맥경화식이 유도 동물모델에서 상황버섯 폴리페놀 추출물을 두 가지 농도로 1일 1회 경구로 8주 동안 투여한 후, 혈액을 채취하여 혈액 내 지질성분에 대한 분석을 시행하였다 (도 15참조). 혈중 콜레스테롤의 경우, 동맥경화식이를 먹이지 않은 정상식이군 (Normal)에서 469.8±26.3 mg/dl로 정상식이를 섭취시켜도 ApoE 결핍 마우스의 혈중 콜레스테롤 농도가 높은 것을 관찰할 수 있었으며, 동맥경화식이 대조군 (Control)에서 1378.6±70.2 mg/dl로 정상식이군 보다 3배 가까이 혈중 콜레스테롤 농도가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 혈중 콜레스테롤 농도의 증가는 상황버섯 폴리페놀 추출물을 투여한 PB300 및 PB500군에서 각각 1356.2±48.7 mg/dl, 1311.4±61.4 mg/dl로 약간 감소되었으나 유의한 수준은 아니었다. 한편, 혈중 중성지방의 농도 또한 동맥경화를 섭취시킨 대조군 (132.4±3.5 mg/dl)에서 정상식이군 (67.5±11.7 mg/dl)보다 현저하게 증가하였고, 이러한 증가는 상황버섯 폴리페놀 추출물의 투여 (PB300: 113.8±15.4 mg/dl, PB500: 91.4±15.0 mg/dl)로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 혈중 지질의 감소는 상황버섯 폴리페놀 추출물을 500 mg/kg의 농도로 투여하였을 때 더 효과적인 것을 관찰할 수 있었다 (Tukey-Kramer test, p< 0.05).

3) 혈액 내 염증관련 사이토카인 측정

동맥경화식이 유도 동물모델에서 상황버섯 폴리페놀 추출물을 두 가지 농도로 1일 1회 경구로 8주 동안 투여한 후, 혈액을 채취하여 혈액 내 사이토카인 (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6)에 대한 분석을 시행하였다 (도 16참조). 혈장 IL-1beta의 농도는 세 군 간에 차이가 없는 반면, TNF-alpha의 농도는 동맥경화식이를 먹인 대조군에서 4.54±0.05 pg/ml, 상황버섯 폴리페놀 추출물을 300 mg/kg의 농도로 투여한 PB300군에서 4.73±0.8 pg/ml, 500 mg/kg의 농도로 투여한 PB500군에서 2.41±0.25 pg/ml로 PB500군에서 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다 (Tukey-Kramer test, p< 0.05). 비록 유의한 수준은 아니었지만, IL-6의 경우도 마찬가지로 동맥경화식이 대조군 (7.32±1.72 pg/ml)과 PB300군 (7.99±1.44 pg/ml) 보다 PB500군 (4.99±1.0 pg/ml)에서 사이토카인 농도가 감소된 것을 관찰할 수 있었다.

4) 대동맥에서 동맥경화 관련 사이토카인들의 mRNA 발현 분석

동맥경화식이 유도 동물모델에서 상황버섯 폴리페놀 추출물을 두 가지 농도로 1일 1회 경구로 8주 동안 투여한 후, 대동맥 내 염증관련 사이토카인 (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6)의 발현을 비교하기 위하여 real-time PCR 분석을 시행하였다 (도 17참조). 그 결과, ApoE 결핍 마우스에 정상식이를 공급한 대조군에서는 염증관련 사이토카인의 발현이 현저하게 억제되어 있는 반면, 동맥경화식이를 섭취시킨 군에서는 사이토카인의 발현이 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 염증관련 사이토카인 발현의 증가는 혈중 사이토카인의 농도 결과와 일치하게 PB300군에서는 전혀 개선되지 않았으나, PB500군에서는 유의하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Tukey-Kramer test, p< 0.05).

5) 대동맥에서 동맥경화 관련 부착분자 ( adhesion molecules )들의 mRNA 발현 분석

만성적인 동맥경화식이의 섭취는 고콜레스테롤 염증을 유발하고, 혈관내피세포벽에 ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) 등과 같은 부착분자들의 발현이 증가하게 된다. 따라서, 본 연구에서는 동맥경화식이 유도 동물모델에 상황버섯 폴리페놀 추출물을 두 가지 농도로 1일 1회 경구로 8주 동안 투여한 후, 대동맥 내 부착분자들 (ICAM-1, VCAM-1)의 발현을 비교하기 위하여 real-time PCR 분석을 시행하였다 (도 18참조). ApoE 결핍 마우스에 정상식이를 공급한 대조군에서는 부착분자들의 발현이 현저하게 억제되어 있는 반면, 동맥경화식이를 섭취시킨 군에서는 그 발현이 유의하게 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 부착분자들의 발현 증가는 PB500군에서는 유의하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Tukey-Kramer test, p< 0.05).

6) 대동맥동 ( aortic sinus )의 oil - red O 염색

동맥경화 유도 동물모델에서 상황버섯 폴리페놀 추출물을 두 가지 농도로 1일 1회 경구로 8주 동안 투여한 후 심장 내 지질 침착을 oil-red O 염색에 의하여 분석하였다. 심장의 대동맥동 (aortic sinus) 내 지방 침착의 정도가 apoE 결핍 마우스에 정상식이를 섭취시킨 대조군에서 가장 낮았으며, 동맥경화식이를 섭취시킨 대조군에서 현저하게 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 상황버섯 폴리페놀 추출물을 투여한 두 군에서 동맥경화식이 대조군보다 다소 감소된 것을 확인할 수 있었으며 (도 19참조), 이러한 감소는 농산 버섯 유래 추출물을 500 mg/kg의 농도로 투여한 PB500군에서 더 큰 것으로 보이며, 상황버섯 폴리페놀 추출물이 동맥경화 개선에 도움을 줄 것으로 사료된다.

7) 대동맥 궁의 병리조직학적 관찰

복부동맥을 포함한 대동맥벽의 oil-red O 염색을 통하여 대동맥 내 지질 축적 정도를 비교한 결과에서는 동맥경화식이를 섭취시킨 대조군과 비교하여 상황버섯 폴리페놀 추출물을 500 mg/kg 농도로 투여한 군에서 붉은색으로 착색되는 정도가 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 20참조). 이와 같은 결과는 이미지 분석프로그램을 활용하여 전체면적 대비 oil-red O에 의하여 붉은색으로 염색된 면적에 대한 비율로 산출하였을 때에 더욱 뚜렷하게 확인되었다. 이상의 결과로 보아, 상황버섯 폴리페놀 추출물의 투여가 동맥경화 유도 ApoE 결핍 마우스 모델에서 동맥경화를 억제하는 효과가 있다는 것을 암시하는 결과로서 판단되었다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 또는 치료용 조성물.
바우미 상황버섯 유래의 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 활성화합물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 활성화합물은 바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물에서 분리된 것을 특징으로 하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 스티릴파이론 (styrylpyrone) 계열의 활성화합물은 인터푼진 A (Interfungin A), 바우민 (Baumin=피비211(Pb211)), 다발리아락톤 (Davallialactone), 히스피딘 (Hispidin), 히폴로민 B (Hypholomine B), 펠리그리딘 D (Phelligridin D) 및 이노스카빈 A (Inoscavin A)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물.
바우미 상황버섯 유래의 폴리페놀 추출물을 포함하는 식품 조성물.