KR20110139473A

KR20110139473A - 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110139473A
Application number: KR1020100059589A
Authority: KR
Inventors: 마진열; 심기석; 이지혜; 이윤희; 엄영란; 이재훈
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2011-12-29
Also published as: CN103037882A; WO2011162523A3; WO2011162523A2; CN103037882B; KR101252639B1

Abstract

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 쌍화탕 또는 쌍화탕에 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 쌍화탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것이다. 본 발명의 쌍화탕 또는 쌍화탕 유산균 발효물을 포함하는 조성물은 파골세포 분화 및 관련 유전자 발현의 억제 효과가 뛰어나고, 생체내 실험에서 골밀도 증가 효과를 가지므로, 골다공증의 예방 및/또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Ssanghwatang and Fermentation Product Thereof with Lactic Acid Bacteria}

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하며, 골다공증 예방 및/또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.

생물의 뼈조직은 조골세포에 의한 조직의 형성과 파골세포에 의한 조직의 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 평형 상태를 유지하고 있다. 골다공증은 조골세포와 파골세포의 평형이 무너져 골 흡수가 골 형성보다 항진됨으로서 유발되는 질병으로, 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지게 되며, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있는데, 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬의 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 골다공증은 정도의 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없이 나타나는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 골다공증은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 첫째는 원인불명(idiopathic)의 골다공증, 둘째는 폐경기 이후 여성호르몬 부족에 의해 나타나는 타입 Ⅰ 골다공증, 셋째는 고령화된 노인층의 남녀에게 발견되는 타입 Ⅱ 골다공증이다.

현재 사용되고 있는 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐 계통의 물질로서, 이들은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 따라서, 콩 및 콩 가공품 등 식품에 함유된 제니스테인(genistein)이나 다이드제인(daidzein) 등의 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 응용하여 장기간 복용할 수 있고 상대적으로 부작용이 적은 골다공증 예방 및 치료제를 개발하고자 많은 연구가 진행 중이다.

식물성 호르몬인 피토에스토로겐은 생체이용률은 비교적 낮으나 에스트로겐 수용체-α (ER-α) 및 에스트로겐 수용체-β (ER-β)에 대한 친화력이 좋고 유방암 등의 부작용이 적어 골다공증 치료제인 E2의 대체 의약품으로 각광받고 있다. 피토에스트로겐으로 알려진 물질로는 다이드제인, 제니스테인, 포르모노네틴(formononetin), 비오카닌 A (biochanin A) 등의 이소플라본(isoflanone)류 화합물, 쿠메스트롤(coumestrol) 등의 쿠메스탄(coumestan)류 화합물, 엔테로락톤(enterolactone) 등의 리그난(lignan)계 화합물 및 엔테로디올(enterodiol) 등의 페놀(phenol)계 화합물이 있다. 상기 화합물들 중 당 화합물은 장내 박테리아의 β-글루코시다제(glucosidase) 또는 위산에 의해 가수분해되어 결국 비배당체 형태인 유리(free) 이소플라본으로 흡수된다.

한편, 쌍화탕은 쌍화산(雙和散)이라고도 하며, 이중탕(理中湯)에 사물탕(四物湯)을 합한 피로 회복에 대한 처방으로 동의보감 잡병편(雜病篇) 허로(虛勞)의 항에 기술되어 있다. 쌍화탕은 심력이 피로하고 기, 혈이 모두 손상되었거나, 큰 병 후 허로하고 기가 모자라며 땀이 나는 경우 등에 사용한다. 쌍화탕을 구성하고 있는 한약재는 백작약, 숙지황, 황기, 당귀, 천궁, 계피, 감초, 생강, 대추이며 탕약으로 조제하여 복용한다.

쌍화탕 구성 한약재들의 성분별 효능을 살펴보면, 계피는 비, 위장의 기능을 활성화시키므로 소화기가 차서 소화장애가 있거나, 복부가 차서 일어나는 복통, 설사 등에 널리 이용되며 당귀는 피를 원활히 순환하게 해주는 혈액순환 촉진과 항암효과 및 혈압강하작용, 진통, 경련억제, 대장운동촉진을 통한 변비개선, 어혈제거 등의 효과가 강한 것으로 알려져 있다. 백작약은 신경이나 근의 과도한 긴장을 누그러뜨려 통증을 멈추게 하거나, 보혈 및 진통의 효능을 갖고 숙지황은 혈을 보하는 약이며 황기는 인삼과 더불어 대표적인 기를 보하는 약재로 식은땀을 그치게 하고 종기 등을 치료한다. 천궁은 혈액순환을 돕고 통증을 가라앉히는 진통효과가 있어 두통에도 자주 응용되며, 간장의 기능을 활성화시켜 주는 효능과 더불어 빈혈에 적용하면 조혈작용을 하는 것으로 알려져 있고 건강은 주로 소화불량, 구토, 설사 치료와 혈액순환을 촉진시키기 위해 사용하며, 대추는 위장을 튼튼히 하고 경맥을 도와서 그 부족을 보하며, 속을 편안하게 하고 비장을 보하고 진액과 기운 부족을 낫게 하며 온갖 약의 성질을 조화한다고 알려져 있다.

한약재에 미생물을 첨가하여 발효시켜 인간에 유용한 물질을 얻는 기술로는 한약재의 중탕 착즙액에 성장이 좋고 풍미가 우수한 유산균을 선발하여 혼합 배양, 발효시킴으로서 정장작용의 시너지 효과를 얻는 기술(대한민국 등록특허 제185619호), 곡물과 한약재 일부를 선별하여 발효한 메주콩을 이용하여 저온 속성 기법으로 원료 전부를 발효시켜 각 원료가 소유하고 있는 고유성질을 그대로 유지하고 효과를 배가시킨 기술(대한민국 공개특허 제2004-0078030호) 등의 예가 있으나, 쌍화탕 발효 약재와 관련하여 알려진 문헌은 거의 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 쌍화탕을 제조한 후, 이를 유산균을 이용하여 다시 발효시킨 발효물을 제조하였으며, 상기 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물이 종래 보고된 바 없는 뛰어난 골다공증 예방 또는 치료 효과를 보인다는 사실을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.

본 발명은 쌍화탕 또는 이의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 쌍화탕은 백작약, 숙지황, 황기, 당귀, 천궁, 계피, 감초, 생강 및 대추를 추출하여 제조되는 한방 제제로서, 백작약 10 중량부에 대하여, 숙지황 4 내지 6 중량부, 황기 4 내지 6 중량부, 당귀 4 내지 6 중량부, 천궁 4 내지 6 중량부, 계피 2 내지 5 중량부, 감초 2 내지 5 중량부, 생강 1 내지 3 중량부 및 대추 1 내지 4 중량부의 비율로 생약 혼합물을 제조한 후 추출하는 것이 바람직하다. 추출용매로는 물을 사용하는 것이 일반적이지만, 필요에 따라 물 이외에 다른 유기용매를 사용해도 무방하다. 사용될 수 있는 유기용매로는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 아세톤, 또는 이의 수용액 등을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 "쌍화탕"은 상기 약재 혼합물을 물을 이용하여 추출한 것뿐만 아니라 물 이외의 다른 유기용매를 이용하여 추출한 것을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 쌍화탕의 유산균 발효물(이하, "쌍화탕 발효물"이라 약칭하기도 함)을 제조하기 위해서는, 먼저 상기와 같은 생약 혼합물에 2∼15배량의 물을 가한 후 70 내지 100℃에서 열수 추출한 수추출물을 제조한다. 상기 추출물을 냉각한 뒤 유산균을 시료 중량의 0.5 내지 5 중량%, 바람직하게는 1 중량%로 접종하고, 20 내지 40℃, 바람직하게는 37℃에서 24 내지 52시간, 바람직하게는 48시간 발효시킴으로써 본 발명의 쌍화탕 발효물이 제조된다. 추출용매로 물 이외의 다른 유기용매를 이용하여 제조된 쌍화탕 추출물로 상기 쌍화탕 발효물을 제조할 경우에는, 먼저 상기 추출물을 건조한 후 물에 희석시키고, 여기에 유산균을 접종한 후 발효시키는 것이 바람직하다.

상기에서, 유산균으로는 분리균주 또는 시판중인 다양한 유산균을 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 락토바실러스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코커스 및 락토코커스 속(屬)의 미생물이 제한없이 사용될 수 있고, 이중에서 락토바실러스 속의 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 아밀로필루스(L. amylophilus), 락토바실러스 쿠르바투스(L. curvatus), 락토바실러스 콘푸수스(L. confusus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis) 및 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)와 같은 다양한 종류의 유산균을 사용하여 본 발명의 쌍화탕 발효물을 제조하였다(실시예 1 참조). 그러나, 사용될 수 있는 유산균이 상기 예시된 유산균에 한정되는 것은 아니며, 유산균 배양 배지 역시 각각의 유산균에 맞게 MRS (Man-Rogosa-Sharpe), 락토오스, M17 및 APT 배지(Asparagine Enrichment Broth)로 부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 쌍화탕은 직접 제조하거나 시판되는 상품을 구입하여 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 쌍화탕 또는 이의 발효물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 골다공증 예방 또는 치료 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃를 추가로 첨가할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물의 인체 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 정도 등에 따라 적절히 선택되며, 성인에게 10∼300 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 20∼100 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 5 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 처리하면 파골세포 분화 관련 마커인 TRAP 활성과, 다핵성 파골세포의 형성이 유의성 있게 감소할 뿐만 아니라(도 1 참조), 대표적인 파골세포 분화 관련 유전자의 발현도 유의성 있게 감소한다(표 2 참조). 또한, 다양한 유산균 발효물을 이용한 구현예에 따르면, 본 발명의 쌍화탕 발효물은 전반적으로 파골세포 분화 관련 마커인 TRAP 활성을 감소시키고, 특히 높은 농도에서 그 효과가 현저하게 나타나며, 다핵성 파골세포의 형성도 유의성 있게 감소시킨다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 쌍화탕 발효물 투여에 의한 이상 증상이나 사망 동물은 관찰되지 않는다. 쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여시 난소적출로 증가된 체중을 변화시키지 않았고(도 3 참조), 다른 장기들의 무게 변화도 나타내지 않는다(표 4 참조). 아울러, 생화학 분석기를 사용하여 각 군의 동물의 혈청을 분석한 결과, 쌍화탕 발효물 투여군에서는 난소 적출로 인해 증가된 트리글리세라이드 농도가 유의성 있게 감소되는 효과가 있다(표 5 참조).

아울러, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 난소 적출로 유발된 골밀도 감소 모델에서, 쌍화탕 및 쌍화탕 발효물 투여시 난소적출로 감소하는 대퇴골의 골밀도를 증가시키는 경향을 나타내고(표 6 참조), 조직 분석에서는 현저한 뼈지주 감소가 개선되는 경향을 나타낸다(도 4 참조).

또한, 본 발명은 쌍화탕 또는 쌍화탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 완화용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 쌍화탕 또는 쌍화탕의 유산균 발효물은 골다공증 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있으며, 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물이 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물은 여러 한의학 처방들, 예를 들면, 가감속명탕(加減續命湯), 갈근(葛根), 갈근귤피탕(葛根橘皮湯), 갈근맥문동산(葛根麥門冬散), 갈근죽여탕(葛根竹茹湯), 갈근탕(葛根湯), 갈근해기탕(葛根解肌湯), 갈출탕(葛朮湯), 갈황환(葛黃丸), 지각자산(枳殼煮散), 당귀백출탕(當歸白朮湯), 맥문동음자(麥門冬飮子), 발운탕(撥雲湯), 방풍탕(防風湯), 백출산(白朮散), 사물해기탕(四物解肌湯), 사위탕(瀉胃湯), 산종궤견탕(散腫潰堅湯), 삼두해정탕, 삼양탕(三陽湯), 생갈근즙(生葛根汁), 소풍순기탕(疏風順氣湯), 승마갈근탕(升麻葛根湯), 승마부자탕 (升麻附子湯), 승마위풍탕(升麻胃風湯), 승양보위탕(升陽補胃湯), 시호승마탕(柴胡升麻湯), 시호조경탕(柴胡調經湯), 신달탕(腎疸湯), 신선불취단(神仙不醉丹), 신성산(神聖散), 신효명목탕(神效明目湯), 십신탕(十神湯), 여택통기탕(麗澤通氣湯), 연교승마탕(連翹升麻湯), 영선제통음(靈仙除痛飮), 옥설탕(沃雪湯), 온폐탕(溫肺湯), 익기총명탕(益氣聰明湯), 익지화중탕(益智和中湯), 인삼청기산(人蔘淸肌散), 인진사황탕(茵蔯瀉黃湯), 일보일발단(一補一發丹), 자음청위환(滋陰淸胃丸), 전생활혈탕(全生活血湯), 정력산(散), 조중탕(調中湯), 지갈탕(止渴湯), 지유산(地楡散), 진교승마탕(秦교升麻湯), 청양탕(淸陽湯), 청열해기탕(淸熱解肌湯), 충화순기탕(沖和順氣湯), 취향보설(醉鄕寶屑), 통치백물독일방(通治百物毒一方), 평위지유탕(平胃地楡湯), 평혈음(平血飮), 해백물독일방(解百物毒一方), 해소주독일방(解燒酒毒一方), 해약중독(解藥中毒), 해주화독산(解酒化毒散), 해채소독일방(解菜蔬毒一方), 해파두독방(解巴豆毒方), 홍설통중산(紅雪通中散) 등에도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01∼0.04 g, 바람직하게는 약 0.02∼0.03 g 이다.

상기 외에도 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 100 중량부 당 0.01∼0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물은 파골세포 분화 및 관련 유전자 발현의 억제 효과가 뛰어나고, 생체내 실험에서 골밀도 증가 효과를 가지므로, 골다공증의 예방 및/또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 각각 RAW264.7 세포에서 RANKL (Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)에 의해 유도된 TRAP 활성(A)과 TRAP-양성 다핵화 파골세포의 형성에 미치는 쌍화탕 및 락토바실러스 퍼멘텀(NRRL (Norther Regional Research Laboratory, ARS Culture Collection, US Department of Agriculture, Peoria, Ill, USA) B4524)에 의해 발효된 쌍화탕 발효물의 효과(B)를 보여주는 그래프 및 사진이다.
도 2는 다양한 유산균에 의해 발효된 쌍화탕 발효물이 RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도된 TRAP 활성(A)과 TRAP-양성 다핵화 파골세포의 형성에 미치는 효과(B)를 보여주는 그래프이다. S: 쌍화탕의 열수 추출 샘플, S-con: 쌍화탕의 발효 전 멸균 샘플, S658: 락토바실러스 가세리(NCFB (National Collection of Food Bacteria, Reading, United Kingdom) 2233) 발효물, S692: 락토바실러스 카세이(KFRI #692)) 발효물, S-127: 락토바실러스 카세이(KCTC 2180) 발효물, S-144: 락토바실러스 플란타룸(ATCC 8014) 발효물, S-150: 락토바실러스 애시도필루스(ATCC 4356) 발효물, S-161: 락토바실러스 아밀로필루스(NRRL B-4437) 발효물, S-166: 락토바실러스 쿠르바투스(NRRL B-4562) 발효물, S-217: 락토바실러스 애시도필루스(KCTC 3168) 발효물, S-227: 락토바실러스 콘푸수스(IH 14005) 발효물, S-239: 락토바실러스 브레비스(IH 14003) 발효물, S-402: 락토바실러스 플란타룸(ATCC 8014) 발효물, S-744: 비피도박테리움 브레베(ATCC 15700) 발효물, GM: 성장배지, RANLK: 파골세포 분화 유도 사이토카인, LY294002: 파골세포 분화 억제제.
도 3은 쌍화탕 및 쌍화탕 발효물 투여 동안에 난소적출 랫트의 체중 변화를 보여주는 그래프이다. C; 대조군, NC; 음성 대조군, SHT; 쌍화탕 투여군, SFT; 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 투여군.
도 4는 랫트에서 대퇴골(A) 및 자궁(B)의 조직형태학적 분석 결과를 보여주는 사진이다. C; 대조군, NC; 음성 대조군, SHT; 쌍화탕 투여군, SFT; 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 투여군.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 쌍화탕의 유산균 발효물 제조

상기 쌍화탕은 백작약, 숙지황, 황기, 당귀, 천궁, 계피, 감초, 생강 및 대추를 추출하여 제조되는 한방 제제로서 1첩을 기준으로 하여 50첩을 제조하여 실험에 사용하였다. 1첩 양으로는 백작약 9.37 g, 숙지황 3.75 g, 황기 3.75 g, 당귀 3.75 g, 천궁 3.75 g, 계피 2.81 g, 감초 2.81 g, 생강 1.49 g 및 대추 2.0 g의 비율로 생약 혼합물을 제조한 후 추출한다. 총 한약재 50첩의 함량은 1,674 g으로 이의 10배량인 16.74 ℓ의 증류수에 넣어 150분간 열탕 추출한 후(한국, 경서추출기 cosmos-600), 표준 시험용 체(standard testing sieve, Aperture 500 ㎛와 150 ㎛)를 이용하여 탕제를 여과하여 쌍화탕을 제조하였다. 또한, 여과한 탕제에 1% 볼륨(v/v)의 유산균(1-5×10⁸ CFU/㎖)을 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 발효시킨 뒤 상기 표준 시험용 체로 여과하여 쌍화탕의 유산균 발효물을 제조하였다. 발효 한약재는 동결 건조한 후 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다. 유산균 발효물의 제조에 사용된 유산균은 다음과 같다: 락토바실러스 퍼멘텀(NRRL B-4524), 락토바실러스 가세리(NCFB 2233), 락토바실러스 카세이(KCTC 2180, KFRI #692), 락토바실러스 플란타룸(ATCC 8014), 락토바실러스 애시도필루스(ATCC 4356, KCTC 3168), 락토바실러스 아밀로필루스(NRRL B-4437), 락토바실러스 쿠르바투스(NRRL B-4562), 락토바실러스 콘푸수스(IH 14005), 락토바실러스 브레비스(IH 14003) 및 비피도박테리움 브레베(ATCC 15700).

실시예 2. 쌍화탕과 발효 쌍화탕의 파골세포 분화에 대한 효과

RAW264.7 세포는 RANKL 처리시 파골세포 분화의 마커인 TRAP 활성의 증가를 보이며 파골세포로 분화한다(Minkin C. Calcif Tissue Int. 1982 34(3): 285-90; Hsu H, et al., 1999, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96, 35403545). 실시예 1에서 제조한 쌍화탕(SHT)과 쌍화탕 유산균 발효물(SFT)이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, RAW264.7 세포를 1×10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 3일 동안 25-200 ㎍/㎖ 농도로 쌍화탕과 쌍화탕 발효물을 처리하였다. 이때, 배양 배지로 분화 유도 인자인 RANKL(100 ng/㎖)을 함유한 a-MEM 배지(10% FBS)를 사용하였다.

시험 물질 처리 4일째에 TRAP 활성을 측정하였고, TRAP 양성의 다핵성 파골세포 형성을 확인하는 TRAP 염색을 실시한 후, 현미경으로 다핵성 파골세포를 확인하였다. 이를 위하여, 파골세포를 10% 포르말린에서 10분간 그리고 에탄올/아세톤(1:1, v/v) 혼합 용매로 1분간 고정시킨 후, 염색 키트(Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A, Sigma, MO)를 사용하여 염색하였다. 분화된 다핵성 파골세포는 DP 콘트롤러가 장착된 현미경(Olympus Optical Co. Ltd., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. TRAP 활성 측정을 위하여, 상기에서 고정한 파골세포가 든 96-웰 플레이트에 10 mM 나트륨 타르타레이트, 5 mM p-니트로페닐설포네이트(Sigma, MO)가 들어간 시트레이트 버퍼(50 mM, pH 4.6)를 첨가한 후 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 이 효소 반응액을 동일량의 0.1 N NaOH와 혼합한 후, 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 대조군 대비 %로 환산하여 나타내었다.

그 결과, 쌍화탕 및 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 발효물은 200 ㎍/㎖ 농도에서 TRAP 활성을 유의성 있게 감소시켰다(도 1의 A, p<0.01). 또한, 쌍화탕과 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 발효물 처리시 다핵성 파골세포의 형성이 감소하는 것이 TRAP 염색으로 확인되었다(도 1의 B). 아울러, 다양한 유산균에 의해 발효된 쌍화탕 발효물을 이용한 실험 결과, 본 발명의 쌍화탕 발효물은 전반적으로 TRAP 활성을 감소시켰으며, 특히 100 ㎍/㎖ 농도에서 그 효과가 현저하였다(도 2의 A, p<0.01). 또한, 락토바실러스 아밀로필루스에 의해 발효된 쌍화탕 발효물 처리시 다핵성 파골세포의 형성이 감소하는 것이 TRAP 염색으로 확인되었다(도 2의 B).

실시예 3. 쌍화탕에 의한 파골세포 분화 관련 유전자의 발현

TRAP, c-Src 및 cathepsin K 유전자는 파골세포의 분화와 골흡수 기능에 필수적인 유전자들로 파골세포 분화시 발현이 증가된다고 알려져 있다(Hsu H, et al., 1999, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96, 35403545). 따라서, TRAP 염색과 활성을 억제하는 쌍화탕이 상기 세 가지 유전자의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. 이를 위하여, RANKL 처리하고 24시간 후에 TRIzol(Invitrogen, Inc. NY, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 파골세포 분화 관련 유전자에 특이적인 프라이머는 온라인 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 디자인하였으며(Rozen and Skaletsky, 2000), 각 유전자에 대한 프라이머로는 하기 표 1에 나타낸 전방(forward) 및 후방(reverse) 프라이머쌍을 사용하였다. cDNA의 합성은 2 ㎍의 총 RNA, 1 μM의 oligo-dT₁₈ primer 및 10 unit의 RNase inhibitor RNasin (Promega, WI, USA)와 Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen, CA)를 이용하여 합성하였다. SYBR 그린-계 정량 PCR 증폭은 50배 희석한 cDNA와 20 p㏖의 프라이머를 Brilliant SYBR Green Master Mix (Stratagene, CA)와 혼합한 후, Stratagene Mx3000P Real-Time PCR system을 이용하여 수행하였다. PCR 프로그램은 다음과 같다. 폴리머라제 활성을 위해 95℃에서 10분간 유지한 후, 94℃에서 40초(변성), 60℃에서 40초(어닐링) 및 72℃에서 1분(연장)을 40회 반복 수행하였다. 이후, 95℃에서 1분, 55℃에서 30초 및 95℃에서 30초간 유지하여 생성된 PCR 산물의 온도 해리 곡선(temperature dissociation curves, 'melting curves'라 하기도 함)을 작성하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, PCR 데이터는 2^-△△ ^CT 방법에 따라 분석하였다(Livak and Schmittgen, 2001). 이때, GAPDH를 PCR의 대조군으로 사용하였고, GAPDH-normalized 2^-△△ ^CT 데이터를 Student's t-test로 분석한 후, p<0.05를 유의성 있는 차이로 판정하였다.

그 결과, RANKL 처리시 상기 세 가지 유전자의 발현이 모두 급격하게 증가되었지만, 쌍화탕 처리군(200 ㎍/㎖)의 경우에는 c-Src 및 cathepsin K 유전자의 발현을 유의성 있게 감소시켰다(p<0.05, 표 2).

유전자	전방 프라이머(5'->3')	서열 번호	후방 프라이머(5'->3')	서열 번호
TRAP	ACACAGTGATGCTGTGTGGCAACTC	1	CCAGAGGCTTCCACATATATGATGG	2
c-Src	CCAGGCTGAGGAGTGGTACT	3	CAGCTTGCGGATCTTGTAGT	4
Cathepsin K	GGCCAACTCAAGAAGAAAAC	5	GTGCTTGCTTCCCTTCTGG	6
GAPDH	AACTTTGGCATTGTGGAAGG	7	ACACATTGGGGGTAGGAACA	8

RAW264.7 세포에서 RANKL에 의해 유도된 파골세포 특이적 유전자의 mRNA 발현에 쌍화탕이 미치는 영향

	TRAP	c-Src	Cathepsin K
RANKL 미처리	1.09±0.61	1.01±0.08	1.10±0.66
RANKL 처리	1.97±0.01	3.14±0.15^*	19150.28±281.57^*
RANKL+SHT (200 ㎍/㎖)	1.64±0.08	0.75±0.10^*#	4512.74±2397.99^*#

^* p<0.05, RANKL 미처리 군과 현저하게 차이가 남.

^# p<0.05, RANKL 처리 군과 현저하게 차이가 남.

실시예 4. 난소적출 랫트의 장기와 혈액 생화학적 지표에 쌍화탕 및 쌍화탕 발효물이 미치는 영향

파골세포의 형성을 억제하는 쌍화탕과 쌍화탕 발효물의 골다공증 억제 효능을 검증하기 위하여, 12주 동안 난소 적출 랫트 모델에 쌍화탕과 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 발효물을 경구 투여하였다. 구체적으로, 9주령의 암컷 랫트(오리엔트, 서울, 한국)를 사용하여 실험을 수행하였으며, 동물 입수 시 외관을 육안으로 검사한 후, 7일간 동물실에서 순화시키고 난소 적출술을 시행하였다. 난소 적출 7일 후, 군을 분리하여 건강한 동물 중 36마리를 선별하여 실험에 사용하였다. 각 실험군은 하기 표 3에 나타낸 바에 따라 분류하였다. 순화 기간 중 건강한 동물의 체중을 측정한 후, 5 g 간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물을 선택하였다. 이렇게 선택한 동물을 9마리씩 순위화한 체중을 바탕으로 균등한 체중이 되도록 무작위적으로 분배하였다. 동물의 개체 식별로 피모의 색소 염색법과 개체식별카드 표시법을 실시하였다. 각각의 시험물질은 일일 임상용량(15 ㎖/㎏, 2회/일)을 기준으로 투여하였으며, 배부피부 고정법으로 실험동물을 고정하고 경구투여용 일회용 존데(Fujigami, Japan)와 주사관을 이용하여 위 내에 강제 경구 투여하였다. 쌍화탕 발효물의 투여양은 발효로 인한 수율 변화로 쌍화탕보다 약 2% 많은 양이 투여되었다. 대조군(C군) 및 음성대조군(NC군)은 동일 용량의 증류수를 투여하였다.

그 결과, 투여 기간 중 쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여에 의한 이상 증상이나 사망 동물은 관찰되지 않았으며, 각 주령의 체중 변화에서 쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여 1주부터 SHT 투여군, SFT 투여군 및 NC군의 체중이 C군에 비해 유의하게 증가되었다 (p<0.01). 그러나, NC군과 비교하여 SHT와 SFT 투여군에서 체중 변화는 관찰되지 않았다(도 3).

12주 동안 쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여 후 각 동물에서 적출한 자궁, 뇌, 갑상선, 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 부신에서 육안적 이상은 관찰되지 않았다. 또한, C군과 비교하여 NC군의 자궁 무게는 약 84% 유의성 있는 감소를 보였고(p<0.01), 쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여로 인한 자궁 무게의 변화는 없었다. 또한, 각 군간 다른 장기들의 무게 차이는 나타나지 않았다(표 4).

생화학 분석기를 사용하여 각 군의 동물의 혈청을 분석한 결과, C군과 비교하여 NC군에서 트리글리세라이드 농도가 유의성 있게 증가하였다(p<0.05). NC군과 비교할 때, SFT 투여군에서 총 콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤이 유의성 있게 증가하였으나, 트리글리세라이드 농도는 유의성 있게 감소하였다(p<0.05)(표 5).

분류명	실험군	동물의 수	처리 (㎖/㎏)	투여량 (㎎/㎏/일)
C	대조군	9	15	-
NC	난소적출 랫트	9	15	-
SHT	쌍화탕을 투여한 난소적출 랫트	9	15	534
SFT	락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕을 투여한 난소적출 랫트	9	15	546

C; 대조군, NC; 음성 대조군, SHT; 쌍화탕 투여군, SFT; 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 투여군

쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여 12주 후의 장기의 무게(n=9, 단위: g)

	C	NC	SHT	SFT
자궁	0.69±0.21	0.11^a±0.02	0.10^a±0.02	0.11^a±0.02
뇌	1.98±0.10	2.00±0.10	1.97±0.08	2.00±0.10
뇌하수체	0.0164±0.0031	0.0134±0.0016	0.0125±0.0019	0.013±0.0017
폐	1.50±0.15	1.14±0.14	1.54±0.30	1.50±0.14
심장	1.14±0.11	1.10±0.10	1.18±0.12	1.17±0.14
간	8.71±0.72	8.17±1.11	8.96±0.99	9.10±0.51
비장	0.66±0.14	0.63±0.07	0.68±0.12	0.71±0.11
신장(왼쪽)	1.07±0.11	0.96±0.10	1.04±0.14	1.08±0.07
신장(오른쪽)	1.07±0.12	0.95±0.11	1.03±0.10	1.06±0.05
부신(왼쪽)	0.04±0.01	0.03±0.01	0.03±0.01	0.03±0.01
부신(오른쪽)	0.03±0.01	0.02±0.01	0.03±0.01	0.03±0.01

값은 평균±S.D.로 나타냄.

^a p<0.01, C와 현저하게 차이가 남.

쌍화탕과 쌍화탕 발효물 투여 12주 후 난소적출 랫트 혈청의 생화학적 지표(n=9)

	C	NC	SHT	SFT
AST(U/L)	43.09±13.79	42.86±9.39	33.96±6.46	36.37±10.37
ALT(U/L)	120.88±31.08	120.94±29.77	102.79±15.27	112.13±15.68
ALP(U/L)	171.11±73.20	176.68±56.37	178.46±35.85	206.99±61.27
총 콜레스테롤 (㎎/㎗)	107.78±27.81	118.56±10.42	137.67±27.75	145.00^b±30.40
HDL-콜레스테롤 (㎎/㎗)	34.81±6.61	37.20±1.99	41.22±5.69	38.66±3.99
LDL-콜레스테롤 (㎎/㎗)	6.98±2.09	7.79±0.98	9.33±1.83	10.86^b±2.97
트리글리세라이드 (㎎/㎗)	58.00±21.33	81.80^a±19.74	77.71±31.85	54.14^b±18.60
포스페이트(㎎/㎗)	8.79±0.87	8.66±1.04	8.97±1.12	9.02±0.78
칼슘(㎎/㎗)	11.98±0.81	11.59±0.43	11.63±0.48	11.63±0.33

값은 평균±S.D.로 나타냄.

^a p<0.05, C와 현저하게 차이가 남.

^b p<0.05, NC와 현저하게 차이가 남.

실시예 5. 난소 적출 랫트의 골밀도와 뼈지주에 쌍화탕과 쌍화탕 발효물이 미치는 영향

난소 적출로 유발된 골밀도 감소에 대한 쌍화탕과 쌍화탕 발효물의 효과를 확인하기 위하여 12주 동안 쌍화탕과 락토바실러스 퍼멘텀에 의해 발효된 쌍화탕 발효물을 경구 투여한 후 흉골과 대퇴골의 골밀도(bone mineral density, BMD)를 측정하였다. 이를 위하여, 동물 부검 시 우측 대퇴골을 적출하여 근육을 제거하고 10% 포르말린에 7일간 고정하였다. 골밀도는 포르말린을 제거한 후 Dual energy X-ray Absorption (LUNAR Corp., Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다. 적출한 대퇴골을 10% 포르말린에 고정한 후 포름산으로 탈회시키고, 70% 알코올에서 100% 알코올과 아세톤에 이르는 단계별 탈수과정을 거쳐 자일렌으로 함수하고 파라핀 포매를 시행하였다. 파라핀 포매된 골조직을 3 ㎛ 두께로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(hematoxyline & eosin, H&E) 염색을 실시하였다. 광학현미경(Nikon eclipse 80i, Nikon, Japan)으로 조직을 관찰한 후 골소주(trabeculae)의 뼈지주 소실 정도를 분석하였다.

그 결과, C군에 비해 난소 적출한 NC군은 유의한 수준의 흉골과 대퇴골의 BMD 감소를 보였다(p<0.01). 또한, NC군과 비교하여 SHT 투여군에서는 난소 적출로 감소하는 대퇴골의 BMD가 유의성 있게 증가하였고(p<0.05), SFT 투여군에서는 대퇴골의 BMD가 증가하는 경향을 보였지만 통계적 유의성은 없었다(표 6).

조직 분석에서 C군에선 정상적인 대퇴골의 골소주와 골수 내 지방 축적이 보였고, NC군에선 현저한 뼈지주 감소와 골수 내 지방 축적 증가가 관찰되었다(도 4의 A). 그러나, SHT 투여군과 SFT 투여군에서 현저한 뼈지주 감소가 미약하게 개선되는 경향을 보였다. 또한, 자궁의 조직 분석에서 C군에서는 정상적인 자궁 조직이 관찰되었으나 NC군에서 자궁 위축이 보였고, 쌍화탕이나 쌍화탕 발효물 투여로 위축된 자궁에 변화는 관찰되지 않았다(도 4의 B).

난소적출 랫트에서 BMD에 대한 쌍화탕과 쌍화탕 발효물의 효과(n=9)

	C	NC	SHT	SFT
흉골(g/㎠)	0.062±0.002	0.054^a±0.003	0.054±0.003	0.055±0.002
대퇴골(g/㎠)	0.238±0.015	0.208^a±0.010	0.223^b±0.009	0.213±0.007

값은 평균±S.D.로 나타냄.

^a p<0.01, C와 현저하게 차이가 남.

^b p<0.05, NC와 현저하게 차이가 남.

제조예 1: 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 포함하는 약학적 조성물의 제조

<1-1> 시럽제의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 실시예 1에서 제조한 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 분말, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성 성분은 다음과 같다.

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물··················· 2 g

사카린 ·························· 0.8 g

당···························· 25.4 g

글리세린 ························· 8.0 g

향미료·························· 0.04 g

에탄올 ·························· 4.0 g

소르브산 ························· 0.4 g

증류수··························· 정량

<1-2> 정제의 제조

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 상기 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물·················· 250 g

락토오스 ························ 175.9 g

감자전분 ························· 180 g

콜로이드성 규산 ······················ 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ························· 160 g

활석···························· 50 g

스테아르산 마그네슘····················· 5 g

제조예 2: 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 함유하는 건강식품의 제조

<2-1> 식품의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 20∼95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 0.2∼1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 0.5∼5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 0.1∼5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 5∼10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

<2-2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5∼10%, 구연산 0.05∼0.3%, 카라멜 0.005∼0.02%, 비타민 C 0.1∼1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79∼94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85∼98℃에서 20∼180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5∼0.82%를 주입하여 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채주스의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

4. 과일주스의 제조

쌍화탕 또는 쌍화탕 발효물 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Ssanghwatang and Fermentation Product Thereof with Lactic Acid Bacteria <130> 2010-dpa-0061 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TRAP <400> 1 acacagtgat gctgtgtggc aactc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TRAP <400> 2 ccagaggctt ccacatatat gatgg 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for c-Src <400> 3 ccaggctgag gagtggtact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for c-Src <400> 4 cagcttgcgg atcttgtagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Cathepsin K <400> 5 ggccaactca agaagaaaac 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Cathepsin K <400> 6 gtgcttgctt cccttctgg 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 7 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 8 acacattggg ggtaggaaca 20

Claims

백작약, 숙지황, 황기, 당귀, 천궁, 계피, 감초, 생강 및 대추를 포함하는 생약 혼합물에 물 또는 유기용매를 가한 후 추출하여 제조되는 쌍화탕, 또는 상기 쌍화탕에 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 쌍화탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 쌍화탕은 백작약 10 중량부에 대하여, 숙지황 4 내지 6 중량부, 황기 4 내지 6 중량부, 당귀 4 내지 6 중량부, 천궁 4 내지 6 중량부, 계피 2 내지 5 중량부, 감초 2 내지 5 중량부, 생강 1 내지 3 중량부 및 대추 1 내지 4 중량부를 포함하는 생약 혼합물에 물 또는 유기용매를 가한 후 추출하여 제조되는 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올, 아세톤 및 이의 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코카스 및 락토코커스 속(屬)의 미생물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필루스, 락토바실러스 아밀로필루스, 락토바실러스 쿠르바투스, 락토바실러스 콘푸수스, 락토바실러스 브레비스 및 비피도박테리움 브레베로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1, 청구항 4 및 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유산균은 시료 중량의 0.5 내지 5 중량%의 양으로 접종하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1, 청구항 4 및 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유산균은 20 내지 40℃의 온도에서 24 내지 52시간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
백작약, 숙지황, 황기, 당귀, 천궁, 계피, 감초, 생강 및 대추를 포함하는 생약 혼합물에 물 또는 유기용매를 가한 후 추출하여 쌍화탕을 제조하고, 상기 쌍화탕에 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 쌍화탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 개선용 건강식품.