KR20110128785A - Ｒａｄ9와 선택적으로 상호작용하는 화합물들의 스크리닝방법 - Google Patents

Ｒａｄ9와 선택적으로 상호작용하는 화합물들의 스크리닝방법 Download PDF

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페데리코 엠. 고메즈
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매그나켐 인터내셔널 레버러토리즈 아이엔씨
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Abstract

특히 시큐로라이드(Securolide)에서, 락톤 구조를 갖는 화학식 Ia-Ie로 표시되는 천연 및 합성 화합물, 또는 그 대사체들은 hrad9 유전자 및/또는 이로써 인코딩된 단백질 또는 이 단백질을 포함하는 복합체, 및/또는 p53 유전자 및/또는 이로써 인코딩된 단백질을 표적하는 효과적인 항-종양 화합물인 것으로 판별되었다. 시큐로라이드는 Rad9 변종 효모 균주들에 행해진 연구들에 기초하여 hRad9의 변종들에 관해 세포선택적이다. 시큐로라이드는 암세포 내의 변종 hRad9와 상호작용하여 세포자살을 유발하는 DNA 병변들을 생성하는 것으로 보인다. 연구들은 흑색종, 백혈병, 유방암, 폐암, 난소암, 결장암, 식도암, 간암, 및 림프암과 같은 증식 이상을 치료하고 암과 관련된 고통을 완화하는데 유용하다는 것을 증명하고 있다. 암 및 선택적으로는 이와 관련된 고통을 치료하는데 효과적인 다른 화합물들 또한, 예를 들어, Rad9 및/또는 p53 결핍 변종 효모를 사용하는 분석 방법으로 효능에 관해 스크리닝함으로써 동일한 분석 방법을 사용하여 식별될 수도 있다.

Description

ＲＡＤ9와 선택적으로 상호작용하는 화합물들의 스크리닝방법{METHOD FOR SCREENING FOR COMPOUNDS SELECTIVELY INTERACTING WITH RAD9}
본 발명은 일반적으로 항암 화합물들에 대한 표적들 및 이의 스크리닝방법들의 분야에 관한 것이다.
관련출원
본 특허출원은 David Terrero에 의해 2008년 10월 24일에 출원되고 발명의 명칭이 "Method for Screening for Compounds Selectively Interacting with RAD9"인 U.S.S.N. 61/108,224호에 대한 우선권을 주장한다.
많은 화합물들이 암 치료를 위해 공지되어 있다. 대부분은 DNA 복제 또는 세포 증식의 억제를 통해 작용하며, 일반적으로 형질변환된 세포에 특이적인 것은 아니다. 비록 특이성이 표적성 리간드(targeting ligand)들을 사용함으로써 부여되며, 종양 세포 상의 특이적인 수용체에 결합함에도 불구하고, 일반적으로, 대부분의 항-종양 화합물들은 더 느리게 복제하는 일반 세포들에 비해 더 빠르게 증식하는 종양 세포를 더 많이 사멸시키기 때문에 효과적이다.
일반 세포들이 아닌 종양 세포들에 세포독성적인 더 선택적인 화합물을 갖는 것이 더 바람직할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 선택적 항-종양 활성을 보이는 화합물들의 식별방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 인체 내의 hRad9 유전자의 표적화를 통해 항-종양 활성을 보이는 새로운 종류의 화합물을 제공하는 것이다.
특히 시큐로라이드(Securolide)에서, 락톤 구조를 갖는 화학식 Ia-Ie로 표시되는 천연 및 합성 화합물, 또는 그 대사체들은 hrad9 유전자 및/또는 이로써 인코딩된 단백질 또는 이 단백질을 포함하는 복합체, 및/또는 p53 유전자 및/또는 이로써 인코딩된 단백질을 표적하는 매우 효과적인 항-종양 화합물인 것으로 판별되었다. 시큐로라이드는 Rad9 변종 효모 균주들에 행해진 연구들에 기초하여 hRad9의 변종들에 관해 세포선택적이다. 시큐로라이드는 암세포 내의 변종 hRad9와 상호작용하여 세포자살을 유발하는 DNA 병변들을 생성하는 것으로 보인다. 연구들은 흑색종, 백혈병, 유방암, 폐암, 난소암, 결장암, 식도암, 간암, 및 림프암과 같은 증식 이상을 치료하고 암과 관련된 고통을 완화하는데 유용하다는 것을 증명하고 있다. 암 및 선택적으로는 이와 관련된 고통을 치료하는데 효과적인 다른 화합물들 또한, 예를 들어, Rad9 결핍 변종 효모를 사용하는 분석 방법으로 효능에 관해 스크리닝함으로써 시큐로라이드의 작용 메커니즘을 증명하는데 사용되었던 것과 동일한 분석 방법을 사용하여 식별될 수도 있다.
용어 정의
여기에서 사용되고 있는 "알킬"은 포화 또는 불포화 지방족기들을 지칭하며, 직선-사슬형 알킬기, 알케닐기, 또는 알키닐기, 분지-사슬형 알킬기, 알케닐기, 또는 알키닐기, 사이클로알킬기, 사이클로알케닐기, 또는 사이클로(지환식(alicyclic))알키닐기, 알킬 치환 사이클로알킬기, 사이클로알케닐기, 또는 사이클로알키닐기, 사이클로알킬 치환 알킬기, 알케닐기, 또는 알키닐기를 포함한다. 달리 표시되어 있지 않다면, 직선 사슬형 또는 분지 사슬형 알킬은 그 주사슬(backbone) 내에 30개 이상의 탄소원자를 갖는데 (예를 들어, 직선 사슬형의 경우 C1-C30, 분지 사슬형의 경우 C3-C30), 바람직하게는 20개 이하 또는 10개 이하, 더 바람직하게는 6개 이하, 가장 바람직하게는 5개 이하의 탄소를 갖는다. 알킬이 불포화되어 있는 경우, 알킬 사슬은 일반적으로 2 내지 30개의 탄소들을 그 사슬 내에 갖는데, 바람직하게는 그 사슬 내에서 2 내지 20개의 탄소 또는 2 내지 10개의 탄소, 더 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소, 가장 바람직하게는 2 내지 5개의 탄소를 갖는다. 이와 같이, 선호되는 사이클로알킬들은 그들의 고리 구조에 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있는데, 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원소, 가장 바람직하게는 5, 6, 또는 7개의 탄소를 갖는다. 포화된 탄화수소 라디칼들의 예시들은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2차 부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 및 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸의 동족체(homolog) 및 이성질체를 포함한다. 불포화 알킬기의 예시들은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-및 3-프로피닐, 및 3-부티닐을 포함한다.
"알킬"이라는 용어는 헤테로알킬 뿐 아니라 탄화수소 라디칼의 하나 이상의 탄소 원자에서 하나 이상의 치환물을 포함한다. 적합한 치환물은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드와 같은 할로겐 원소들; 수산기; -NR1R2, 여기서, R1 및 R2는 독립적인 수소, 알킬, 아릴이고, 질소 원자는 선택적으로 쿼터나이징(quaternixed)됨; -SR, 여기서, R은 수소, 알킬, 아릴임; -CN; -NO2; -COOH; 카르복실레이트;-COR, -COOR, 또는 -CONR2, 여기서, R은 수소, 알킬, 또는 아릴; 아자이드, 아르알킬, 알콕실, 이미노, 포스포네이트, 포스피네이트, 실릴, 에테르, 술포닐, 술포나미도, 헤테로사이클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 부위들, --CF3; -CN; -NCOCOCH2CH2; -NCOCOCHCH; -NCS; 및 이들의 조합을 포함한다.
여기에 사용된 "아릴"은 C5-C10-원 방향족, 헤테로사이클릭, 축합 방향족, 축합 헤테로사이클릭, 이방향족, 또는 이헤테로사이클릭(bihetereocyclic) 고리 시스템이라고 지칭된다. 여기에 사용된 "아릴"은 광의로 정의되며, 예를 들어, 벤젠, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘 등과 같이 0부터 4개까지의 헤테로원자들을 포함할 수도 있는 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 및 10-원 단일-고리 방향족기들을 포함한다. 고리 구조 내에 헤테로원자들을 갖는 이들 아릴기들은 또한 "아릴 헤테로사이클" 또는 "헤테로방향족"으로 지칭될 수도 있다. 방향족 고리들은 하나 이상의 고리 위치에서, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 할로겐, 아자이드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 히드록실, 알콕실, 아미노 (또는 쿼터나이징된 아미노), 니트로, 술피하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르볼실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 술포닐, 술폰아미도, 케톤, 알데히드, 에스테르, 헤테로사이클릭, 방향족 또는 헤테로방향족 부위들, --CF3, --CN, 및 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 치환물로 치환될 수도 있다.
"아릴"이라는 용어는 2개 이상의 탄소들이 2개의 인접 고리(즉, 축합 고리)에서 공통되는 2개 이상의 사이클릭 고리들을 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하며, 여기서, 이 고리들 중 적어도 하나는 방향족이며, 예를 들어, 다른 사이클릭 고리 또는 고리들은 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 및/또는 헤테로사이클일 수 있다. 헤테로사이클릭 고리들은 이들로 제한되는 것은 아니지만, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티오푸라닐, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸리닐, 카르바졸릴, 4aH-카르바졸릴, 카르볼리닐, 크로마닐, 크로메닐, 시놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 디하이드로푸로[2,3-b]테트라하이드로푸란, 푸라닐, 푸라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이사티노일, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 메틸렌디옥시페닐, 모르폴리닐, 나프틸리디닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥신돌릴, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페노옥사티닐, 페노옥사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 피페로닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸닐, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 및 산테닐을 포함한다. 고리들 중 하나 이상은 "아릴"에 관해 상기 정의된 같이 치환될 수 있다.
"알케닐" 및 "알키닐"이라는 용어는 상술한 알킬과 길이 및 가능한 치환이 유사한 불포화 지방족기를 지칭하지만, 적어도 하나의 2중 또는 3중 결합을 각각 포함한다.
여기에 사용된 "헤테로알킬"이라는 용어는 직선 또는 가지 사슬, 또는 사이클릭 탄소-포함 라디칼들 및 이들의 조합을 지칭하며, 적어도 하나의 헤테로원자를 포함한다. 적절한 헤테로원자들은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, O, N, Si, P, 및 S를 포함하며, 여기서 질소, 인, 황 원자들은 선택적으로 산화되며, 질소 헤테로원자는 선택적으로 쿼터나이징된다. 헤테로알킬은 알킬기에 관해 상기 정의한 바와 같이 치환될 수 있다.
"알콕시", "알킬아미노", 및 "일킬티오"는 각각 산소 원자, 아미노기, 또는 황 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착되는 알킬기를 지칭하는데 사용된다.
여기에 사용되는 "알킬아릴"은 아릴기로 치환된 알킬기(예를 들어, 방향족기 또는 헤테로 방향족기)라고 지칭된다.
여기에 사용되는 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릭"은 3 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 5 내지 6개의 고리원자를 포함하는 1사이클릭 또는 2사이클릭의 고리 탄소 또는 질소를 통해 부착되는 사이클릭 라디칼을 지칭하며, 이는 비-퍼옥시드 산소, 황, 및 N(Y)로 구성되는 그룹으로부터 각각 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자들 및 탄소로 구성되는데, 여기서 Y는 부존재하거나 H, O, (C1-10)알킬, 페닐 또는 벤질이며, 선택적으로 1 내지 3개의 2중 결합을 포함하고 선택적으로 하나 이상의 치환물로 치환된다. 헤테로사이클릭 고리의 예시들은 이들로 제한되는 것은 아니지만, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티오푸라닐, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸리닐, 카르바졸릴, 4aH-카르바졸릴, 카르볼리닐, 크로마닐, 크로메닐, 시놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 디하이드로푸로[2,3-b]테트라하이드로푸란, 푸라닐, 푸라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이사티노일, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 메틸렌디옥시페닐, 모르폴리닐, 나프틸리디닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥세파닐, 옥세타닐, 옥신돌릴, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페노옥사티닐, 페노옥사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 피페로닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸닐, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 및 산테닐을 포함한다. 헤테로사이클릭기들은 알킬 및 아릴에 관해 상기 정의된 바와 같이 하나 이상의 치환물들로 선택적으로 치환될 수 있다.
여기에 사용되는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 지칭한다.
작용 메커니즘
세포 주기 체크포인트는 셀 사이클 이벤트의 정확한 순서를 조절하는데, 이로써 딸세포(dauther cell)에게 유전체(genome)의 완벽한 복사본들을 분배하는 것을 보장한다(Hartwell, L.& Weinert. T., Science 246, 629-634, 1989). 체크포인트에서의 결점들은 암발생에 주요한 기여 요인인 유전적 불안정성을 초래하는데, 이는 결점 있는 체크포인트들을 갖는 세포들은 손상받거나 불완전한 복제 DNA를 갖는 체세포 분열로 진행되기 때문이다(Hartwell, L.H. & Kastan, M.B., Science 266, 1821-1828, 1995; Nojima, H. Hum. Cell 10, 221-230, 1997)
Sacchatomyces cerevisiae라는 효모 및 Schizosaccharomyces라는 효모에 대한 분자적 및 유전적 연구들은 S-G2/M 체크포인트에 요구되는 유전자들의 복잡한 네크워크를 확인하였다(Weinert, T., Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 185-193, 1998). 분열 효모(fission yeast)에서, 6개의 비필수 체크포인트 Rad 단백질인 Hus1, Rad1, Rad3, Rad9, Rad17, 및 Rad26의 그룹은 분열 효모 체크포인트 캐스케이드(cascade)의 감각 기구(sensory machinery)들을 구성한다 (Humphrey, T., Mutat. Res. 451, 211-226, 2000). 이들 단백질은 UV 및 감마선에 의해 발생되는 DNA 손상 또는 하이드로옥시우레아와 같은 화합물에 의한 DNA 합성 억제에 응답하는 세포 주기 정지(cell cycle arrest)에 필요하다(Humphrey, T., Mutat. Res. 451, 211-226, 2000). 이들 단백질은 진화하는 동안에 매우 잘 보존되어 왔으며, 관련 단백질들은 인간을 포함하여 다른 많은 진핵생물에서 발견되고 있다(Venclovas, C.& Thelen, M.P. Nucleic Acids Res. 28, 2481-2493, 2000). 이들 체크포인트 rad 단백질들의 인간 유사체들은 hHus1, hRad1, hRad3, hRad9, 및 hRad17이라고 지칭된다. Rad26은 인간에게서 동족체를 갖지 않는다.
hRad9은 9-1-1-복합체라고 지칭되는 안정한 복합체에서 hRad1 및 hHus1과 상호작용한다(Burtelow 등., J. Biol. Chem., 276, 25903-25909, 2001). 9-1-1 복합체의 각각의 멤버 및 복제 연속성 인자 증식 세포 핵 항원(proliferating cell nuclear antigen; PCNA)의 구조적 상동성은 9-1-1 복합체가 DNA 수선 동안에 복제 관련 PCNA-종속 기능들을 대체한다는 가설에 이르게 했다(Caspari 등, Mol. Cell. Biol., 20, 1254-1262, 2000). DNA 복제 동안, PCNA 호모트리머(homotrimer)는 DNA 위에 고리 형상의 활주 클램프(sliding clamp)를 형성하고 DNA 폴리머라제의 연속성이 증가되도록 작용한다. 9-1-1/PCNA 모델은 hRad9, hRad1, 및 hHus1 각각이 hRad17과 상호작용하는 것을 관측함으로서 지지되고 있으며, 이는 PCNA를 DNA 상으로 로딩하는데 필요한 단백질인 복제 인자 C의 서브유닛들에 대한 확장된 상동성을 공유한다(Mossi, R, 및 Hubscher, U., Eur. J. Biochem., 254, 209-216, 1998). 또한, 추가 연구들은 DNA 손상이 hRad9과 hRad1의 초인산화(hyperphosphorylation) 뿐 아니라 9-1-1 복합체와 염색질의 연관(association)을 초래한다는 것을 보여 주었다. 이로부터, 손상 자리에서 9-1-1을 DNA 상으로 hRad17-종속 로딩하는 것은 다중-발현 체크포인트 응답을 조정할 수 있다는 모델이 부상하고 있다(St. Onge 등., J. Biol. Chem., 276, 41898-41905, 2001).
생체 분자의 시험관 내(in vitro) 연구들 및 실험적 모델들은 4,5-디하이드로-3-메틸렌-2[3H]푸라논, "시큐로라이드"가 세포내 구조와 결합하여 이상 세포들의 성장을 방지하는 내인성 면역 조절자들을 트리거링한다. 시큐로라이드는 Rad9 변종 효모 균주의 세포사를 초래한다. 이 데이터에 기초하여, 시큐로라이드는 암 세포 내의 변종 hRad9와 상호작용하여 세포자살을 유발시키는 DNA 병변들을 생성하는 것으로 이해되고 있다. Saccharomyces cereviseae의 변종 균주를 포함하는 생물학적 검정(bioassay)들은 변종 균주보다 구체적으로 rad9 유전자에만 세포독성을 보였다. 이는 시큐로라이드가 불안정한 유전체들에서 선택적인 세포독성을 갖는다는 것을 제안하고 있다. 인간의 임상 시험은 시험관 내 검정들이 암 및 다른 질병들의 치료에 효능이 있다는 것을 예견하고 있으며, 여기에는 종래의 항암 화학요법 및 방사선 치료에 실패한 유방암 및 전립선암 환자를 포함한다.
S. cereviseae에서 손상된 DNA는 셀 주기 수선 체크포인트 단백질로 알려진 유전자 rad9을 활성화시켜서, 손상이 발생한 후의 셀 주기를 정지시킨다. Rad9은 또한 프로-아포토시스(세포자살)을 촉진하고 세포 분열을 억제할 수도 있다. 생물학적 검정들은 시큐로라이드가 rad9을 통해 손상된 DNA에 대한 손실(injury)들을 일으키는 원인이라는 것을 보여준다. Hrad9는 인간 종양 세포에서 rad9의 동족체이다. 시큐로라이드가 다른 타입의 효모들에서는 rad9 변종에 대해 세포독성을 갖기 때문에, 시큐로라이드는 인체에서 hrad9을 표적화하여 악성 세포들의 유전체들을 불안정화할 것으로 기대된다.
p53 유전자는 종약 억제 유전자인데, 다시 말해, 그 활성은 종양들의 형성을 막는다. 인간이 부모로부터 p53 유전자의 단 하나의 기능적 복제본만을 물려받는다면, 이들은 암에 걸리기 쉬우며, 성인기 초기에 다양한 조직들에서 독립적인 여러 종양들이 대개 발생한다. 이러한 조건은 드물며, 리프라우메니 증후군(Li-Fraumeni Syndrome)이라고 알려져 있다. 다만, p53에서의 변종들은 대부분의 종양 타입들에서 발견되고 있고, 그래서 종양 형성을 초래하는 분자 이벤트의 복잡한 네트워크에 기여한다.
p53 유전자는 17번 염색체로 매핑된다. 세포에서, p53 단백질은 DNA를 결합하는데, 다른 유전자를 차례로 자극하여 세포 분할-자극 단백질(cdk2)과 상호작용하는 p21이라고 불리는 단백질을 생성한다. p21은 cdk2와 복합체를 형성하는 경우 세포는 세포 분할의 다음 스테이지를 경험할 수 없다. 변종 p53은 더 이상 효과적인 방법으로 DNA를 결합하지 않을 수 있으며, 그 결과, p21 단백질은 세포 분할을 위한 "멈춤 신호"로 작용하는데 이용될 수 없게 된다. 따라서, 세포들은 제어불가능하게 분할하여 종양을 형성한다.
p53 유전자는 무수한 스트레트 타입들에 반응하여 활성화되는데, 여기에는 이들로 제한되는 것은 아니지만, (UV, IR 또는 수소 퍼옥사이드와 같은 화학약제에 의해 유발되는) DNA 손상, 산화적 스트레스(oxidative stress), 삼투압 충격, 리보뉴클레오티드 결핍, 및 조절되지 않는 암유전자 발현을 포함한다. 이 활성은 2개의 주요한 이벤트에 의해 표지된다. 첫째, p53 단백질의 반감기가 극단적으로 상승하여, 스트레스받는 세포 내에서 빠르게 p53이 축적되게 한다. 둘째, 형태 변화(conformational change)는 p53이 이들 세포 내에서 전사 조절자로서 활성 역할을 맡도록 강제한다. p53의 활성을 이끄는 매우 중요한 이벤트는 N-말단 도메인(terminal domain)의 인산화이다. N-말단 전사적 활성 도메인은 많은 수의 인산화 자리들을 포함하며, 단백질 키나제 도입성 스트레스 신호들을 위한 주표적으로 고려될 수 있다.
p53의 이러한 전사적 활성 도메인을 표적으로 하는 단백질 키나제는 크게 2개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫번째 단백질 키나제 그룹은 MAPK 패밀리(JNK1-3, ERK1-2, p38 MAPK)에 속하는데, 이는 막 손상, 산화적 스트레스, 삼투압 충격, 및 열 충격 등과 같은 여러 타입의 스트레스에 응답하는 것으로 알려져 있다. 두번째 단백질 키나제 그룹(ART, ATM, CHK1 및 CHK2, DNA-PK, CAK)은 유전체 무결성 체크포인트, 즉, 유전독성 스트레스에 의해 발생되는 DNA 손상의 일부 형성을 탐지하고 응답하는 분자적 캐스케이드(molecular cascade)와 관련되어 있다. 암유전자 또한 p53 활성을 자극하며, 이는 단백질 p14ARF에 의해 중개된다.
스트레스받지 않은 세포에서, p53 레벨은 p53의 계속적인 분해를 통해 낮게 유지된다. Mdm2라고 불리는 단백질(또는 인간에서 HDM2라고 지칭됨)은 p53에 결합되어, 그 활성을 막고, 핵으로부터 세포질(cytosol)로 이를 운반한다. 또한, Mdm2는 유비퀴틴 리가제(ubiquitin ligage)로서 작용하며, 유비퀴틴을 p53에 공유 결합하여, 프로테아좀(proteasome)에 의한 분해를 위해 p53에 표지한다. 다만, p53의 유비퀴틸레이션은 가역적이다. 유비퀴틴 특이적 프로테아제, USP7(또는 HAUSP)는 p53에서 떨어지도록 유비퀴틴을 절단할 수 있으며, 이로써 프로테아좀-종속 분해로부터 보호할 수 있다. 이는 p53이 암유전자의 인설트(insult)에 응답하여 안정화되는 하나의 수단이다.
상술한 단백질 키나제에 의한 p53의 N-말단의 인산화는 Mdm2-결합을 방해한다. Pin1과 같은 다른 단백질들이 p53에 리크루팅되어, p53에서 형태 변화를 유발시키는데, 이는 Mdm2-결합을 훨씬 더 많이 방지한다. 인산화는 또한, p53의 카르복시-말단을 아세틸화하는 p300 또는 PCAF와 같은 전사적 보조 활성제의 결합에 대비하여, p53의 DNA 결합 도메인을 노출하고, 이것이 특이 유전자들을 활성화하거나 억제하게 한다. Sirt1 및 Sirt7과 같은 디아세틸라제 효소는 p53을 탈아세틸화하고, 아포토시스의 억제를 유발한다. 일부 암유전자들은 또한, MDM2에 결합되어 그 활성을 억제하는 단백질의 전사를 자극할 수 있다.
분석 시스템들
Rad9 및/또는 p53 변종 효모 세포주들에서의 선택적 세포 사멸을 유도하는데 있어서 시큐로라이드(Securolide)의 효능 연구들은 야생형 세포주 또는 동물 모델들과 비교하여 Rad9 및/또는 p53 변종 세포주들에서 세포 사멸을 선택적으로 유도하는 다른 화합물들에 대한 스크리닝을 위해 세포주들을 사용하는 개연성을 보여주고 있다. 적절한 세포주들 및 동물 모델들은 상용 구입가능하거나 일상적인 노력으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 버지니아주 마나사스 시 20108 소재 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC)는 효모의 일부 Rad9 변종 균주들(카탈로그 번호 90731; 90730; 74154, 4003576, 4023576 및 4033576)을 수록하고 있다. 상동 클론된 RAD9을 포함하는 제브라피쉬는 카탈로그 번호 10169289로 ATCC로부터 구입가능하다. 또한, RAD9 및/또는 p53을 포함하는 다양한 결함들뿐만 아니라 정상 세포들에 비하여 세포 사멸을 유도하는 화합물들에 대한 스크리닝을 위해 사용될 수도 있는 RAD9 및/또는 p53을 포함하는 복합체의 다른 측면들을 갖는 효모 균주들에 관한 과학 발간물도 수없이 많다. 정상 세포들, 특히 포유류 세포들은 조작되어 분석시 사용을 위해 hRAD9 및/또는 p53 유전자로 돌연변이들을 유도할 수 있다. 인간 호모로그 마우스 및 생주들에 대한 유전자들과 함께 NCBI 데이터 베이스에 수록되어 있다. (LocusID 5883).
돌연변이는 바람직하게는 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의하여 유도된다. 부위 돌연변이유발은 돌연변이가 하나의 DNA 분자에서 지정된 자리에서 발생되는 분자 생물학 기법이다. 일반적으로, 부위 돌연변이유발은 야생형 유전자 서열이 알려질 것을 요구한다. 원하는 돌연변이를 포함하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 상보성 야생형 유전자 서열과 결합하는 염기쌍 수소에 의하여 부착된다. 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 오리지날(주형) 가닥에 상보적인 새로운 DNA 가닥의 시험관 내 합성을 위한 프라이머로 사용된다. DNA의 새롭게 합성된 가닥은 상기 프라이머와 여기에 통합된 원하는 돌연변이를 갖는다. 한 쌍의 프라이머와 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 새롭게 발생된 DNA 분자를 증폭시키고 새로운 DNA의 또 다른 조작을 가능하게 하기에 충분한 카피들을 생성하는 것이 가능하다. 통상적으로, 돌연변이된 DNA는 제한 효소들과 DNA 리가아제를 이용하여 발현 벡터로 삽입된다. 이후, 상기 발현 벡터는 통상적으로 돌연변이된 단백질의 합성을 위한 유전자 주형으로 사용될 수 있는 세포로 삽입된다. 이후, 상기 돌연변이된 단백질의 생물학적 활성은 야생형 단백질의 생물학적 활성과 비교될 수 있다.
분석
바람직한 일 실시예에서, 활성 여부에 대해 스크리닝되는 화합물이 정상 세포들(즉, Rad9 및/또는 p53 유전자에서 돌연변이를 포함하는 체크포인트(checkpoint) 단백질 복합체에서 결핍을 가지지 않는) 및 비정상 세포들(즉, 단백질들 또는 단백질들을 인코딩하는 유전자들 중 하나 이상에서, Rad9 및/또는 p53을 포함하는 체크포인트 단백질 복합체에서 돌연변이 또는 비활성을 갖는) 양쪽 모두에 첨가된다. 이후, 정상 세포들에 비하여 비정상 세포들에서 세포 사멸을 유발하는 그러한 화합물들은 종양 세포들, 박테리아 세포들 및 바이러스 감염된 세포들과 같은 특이적인 세포 유형들에 대항하는 일반적인 세포독성과 활성을 시험하는 다른 분석들에서 스크리닝된다.
화합물
인간에 있어서 hRad9 및/또는 p53 유전자의 선택적인 표적화를 통한 항-종양 활성을 보일 수 있는 적당한 화합물들은 다음을 포함한다:
Figure pct00001
식 Ia
여기서, 독립적으로 취한 R1 내지 R6 또는 함께 취한 R3 내지 R6는 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자들인 임의의 수의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 그룹핑들이며, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자를 포함한다. R1 내지 R6은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
R1 내지 R6은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로, 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 아록시, 치환된 아록시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 시아노, 이소시아노, 치환된 이소시아노, 카르보닐, 치환된 카르보닐, 카르복실, 치환된 카르복실, 아미노, 치환된 아미노, 아미도, 치환된 아미도, 설포닐, 치환된 설포닐, 술폰산, 포스포릴, 치환된 포스포릴, 포스포닐, 치환된 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C1 내지 C20 사이클릭, 치환된 C1 내지 C20 사이클릭, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드기로부터 선택된다;
Z는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다; 그리고
X는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다.
다른 실시예에서, 화합물은 다음과 같은 화학적 구조를 갖는다:
Figure pct00002
식 Ib
여기서, 독립적으로 취한 R1 내지 R7 또는 함께 취한 R3 내지 R6는 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자들인 임의의 수의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 그룹핑들일 수 있고, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자를 포함하며, 대표적인 R1 내지 R6 그룹핑들은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로, 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 아록시, 치환된 아록시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 시아노, 이소시아노, 치환된 이소시아노, 카르보닐, 치환된 카르보닐, 카르복실, 치환된 카르복실, 아미노, 치환된 아미노, 아미도, 치환된 아미도, 설포닐, 치환된 설포닐, 술폰산, 포스포릴, 치환된 포스포릴, 포스포닐, 치환된 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C1 내지 C20 사이클릭, 치환된 C1 내지 C20 사이클릭, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드기이다.
X는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다; 그리고
Z는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다.
Z'은 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 1 내지 8 개의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 조성물일 수 있으며, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 알파-메틸렌기를 갖는 락톤류는 하기와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00003
식 Ic
여기서, 독립적으로 취한 R1 내지 R9 또는 함께 취한 R5 및 R6는 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자들인 임의의 수의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 그룹핑들일 수 있고, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자를 포함하며, 대표적인 R1 내지 R6 그룹핑들은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로, 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 아록시, 치환된 아록시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 시아노, 이소시아노, 치환된 이소시아노, 카르보닐, 치환된 카르보닐, 카르복실, 치환된 카르복실, 아미노, 치환된 아미노, 아미도, 치환된 아미도, 설포닐, 치환된 설포닐, 술폰산, 포스포릴, 치환된 포스포릴, 포스포닐, 치환된 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C1 내지 C20 사이클릭, 치환된 C1 내지 C20 사이클릭, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드기이다;
독립적으로 취한 Y1, Y2 및 Y3 또는 함께 취한 Y1 및 Y2는 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자들인 임의의 수의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 그룹핑들일 수 있고, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자를 포함하며, 대표적인 R1 내지 R6 그룹핑들은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로, 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 아록시, 치환된 아록시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 시아노, 이소시아노, 치환된 이소시아노, 카르보닐, 치환된 카르보닐, 카르복실, 치환된 카르복실, 아미노, 치환된 아미노, 아미도, 치환된 아미도, 설포닐, 치환된 설포닐, 술폰산, 포스포릴, 치환된 포스포릴, 포스포닐, 치환된 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C1 내지 C20 사이클릭, 치환된 C1 내지 C20 사이클릭, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드기이다;
Z는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다; 그리고
X는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다.
일 실시예에서, 락톤은 아래의 구조를 갖는 알파-메틸렌-락톤 (1)인 시큐로라이드이다:
Figure pct00004
다른 실시예에서, 에스테르는 아래의 구조에서 나타난 바와 같은 α-메틸렌-γ-히드록시-부타노에이트 (2)이다:
또 다른 실시예에서, 락톤은 아래의 구조를 갖는 바이사이클릭(bicyclic) 화합물이다:
Figure pct00005
다른 적당한 화합물들은 다음을 포함할 수 있다:
Figure pct00006
식 Id
여기서, 독립적으로 취한 R1 내지 R4는 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자들인 임의의 수의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 그룹핑들일 수 있고, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자를 포함하며, 대표적인 R1 내지 R4 그룹핑들은 H, 알킬, 치환된 알킬, 알릴, 치환된 알릴, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로, 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 아록시, 치환된 아록시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 시아노, 이소시아노, 치환된 이소시아노, 카르보닐, 치환된 카르보닐, 카르복실, 치환된 카르복실, 아미노, 치환된 아미노, 아미도, 치환된 아미도, 설포닐, 치환된 설포닐, 술폰산, 포스포릴, 치환된 포스포릴, 포스포닐, 치환된 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C1 내지 C20 사이클릭, 치환된 C1 내지 C20 사이클릭, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드기이다;
X는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다; 그리고
Z는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다.
또 다른 실시예에서, 알파-메틸렌기를 갖는 락톤류는 아래에 보는 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00007
식 Ie
여기서, 독립적으로 취한 R1 내지 R4는 수소 원자, 할로겐 원자, 히드록실기 또는 바람직하게는 1 내지 8 개의 탄소 원자들인 임의의 수의 탄소 원자들을 포함하는 임의의 다른 유기 그룹핑들일 수 있고, 선택적으로는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자를 포함하며, 대표적인 R1 내지 R4 그룹핑들은 알킬, 알릴, 치환된 알킬, 알케닐, 알릴, 치환된 알릴, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 페닐, 치환된 페닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 할로, 히드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알록시, 페녹시, 치환된 페녹시, 아록시, 치환된 아록시, 알킬티오, 치환된 알킬티오, 페닐티오, 치환된 페닐티오, 아릴티오, 치환된 아릴티오, 시아노, 이소시아노, 치환된 이소시아노, 카르보닐, 치환된 카르보닐, 카르복실, 치환된 카르복실, 아미노, 치환된 아미노, 아미도, 치환된 아미도, 설포닐, 치환된 설포닐, 술폰산, 포스포릴, 치환된 포스포릴, 포스포닐, 치환된 포스포닐, 폴리아릴, 치환된 폴리아릴, C1 내지 C20 사이클릭, 치환된 C1 내지 C20 사이클릭, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드기이다;
Z는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다; 그리고
X는 산소, 황 또는 선형, 분지 또는 사이클릭 구조 식들인 질소 그룹핑과 같은 헤테로원자이다.
또한, 적당한 화합물들은 상술한 화합물들의 대사체들, 상술한 화합물들의 입체이성질체들, 그 약학적으로 허용가능한 염류 및 그 조합들을 포함한다.
대표적인 락톤류는 표 I에 수록되어 있다:
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
식 Ia 내지 Ie의 화합물들의 약학적으로 허용가능한 산 부가염류는 자유 염기의 용액 또는 분산액을 약 하나의 화학적 당량의 약학적으로 허용가능한 염으로 처리하여 종래 방식으로 제조될 수 있다. 종래 사용된 농축 및 재결정 기법들은 염을 분리하는데 사용될 수 있다.
산기를 포함하는 화합물들의 약학적으로 허용가능한 염기 부가염류는 산을 예컨대, 약 하나의 화학적 당량의 염기와의 반응에 의해 종래 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명은 아래의 비한정 실시예를 참조를 통해 더 이해할 수 있을 것이다.
실시예 1
사카로마이세스 세레비시아 ( Saccharomyces Cereviseae ) 상에서 시큐로라이드를 사용한 생물학적 검정종양/암 세포에서의 DNA와 유사한 DNA를 갖는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces Cereviseae)의 한 세트의 변종 균주들 상에서 밀리리터당 1에서 100 마이크로그램 사이의 농도로 시큐로라이드(LMSV-6)를 사용하여 고체 배지에서 생물학적 검정을 수행하였다. 시큐로라이드는 변종 균주들, 구체적으로는 rad9 유전자상에서만 뚜렷한 세포독성 활성을 보였다. 이는 시큐로라이드가 불안정한 유전체들을 갖는 세포들에 선택적인 세포독성을 갖는다는 것을 시사한다.

Claims (18)

  1. Rad9을 포함하는 세포 사이클 체크포인트(checkpoint) 단백질 복합체 또는 상기 복합체에서 단백질을 인코딩하는 유전자에서 하나 이상의 돌연변이들을 갖는 세포들을 제공하는 단계;
    스크리닝되는 화합물을 상기 세포들에 첨가하는 단계; 및
    상기 화합물이 상기 세포들 중 일부 또는 모두를 사멸하거나 상기 세포들 중 일부 또는 모두에서 세포자살을 유도하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 약학적으로 활성인 화합물에 대한 스크리닝방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포들은 효모 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포들은 포유류 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포들은 동물 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포들은 종양 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 Rad9를 포함하는 세포 사이클 체크포인트 단백질 복합체에서 돌연변이를 갖지 않는 정상 세포들에 상기 화합물을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포들은 상기 Rad9 유전자에 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포들은 비활성 또는 활성이 더 적은 Rad9 단백질을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 6 항의 방법에 의하여 확인되는 약학적으로 허용가능한 화합물.
  10. 단백질 p53 또는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자에서 하나 이상의 돌연변이들을 갖는 세포들을 제공하는 단계;
    스크리닝되는 화합물을 상기 세포들에 첨가하는 단계; 및
    상기 화합물이 상기 세포들 중 일부 또는 모두를 사멸하거나 상기 세포들 중 일부 또는 모두에서 세포자살을 유도하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 약학적으로 활성인 화합물에 대한 스크리닝방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포들은 효모 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포들은 포유류 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포들은 동물 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포들은 종양 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 p53 단백질에서 돌연변이를 갖지 않는 정상 세포들에 상기 화합물을 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포들은 상기 p53 유전자에서 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포들은 비활성 또는 활성이 더 적은 p53 단백질을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 10 항 또는 제 15 항의 방법에 의하여 확인되는 약학적으로 허용가능한 화합물.
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