KR20110119141A

KR20110119141A - 옻나무로부터 분리된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 제１형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 및 이를 포함하는 건강식품

Info

Publication number: KR20110119141A
Application number: KR1020100038667A
Authority: KR
Inventors: 박병현; 박진우; 송미영; 김윤철; 정길생
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-26
Filing date: 2010-04-26
Publication date: 2011-11-02
Also published as: KR101159442B1

Abstract

본 발명은 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 제1형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물, 및 이를 포함하는 건강식품에 관한 것이다.
상기 설퍼레틴을 제1형 당뇨병 질환에 이용함으로서, 지속적인 인슐린 투여가 필요한 제1형 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있다는 장점과, 옻나무와 같은 천연물질로부터 정제함으로써, 부작용 우려를 피할 수 있다.
그러므로, 제1형 당뇨병을 예방 또는 치료함으로써, 환자의 건강에 기여할 수 있으며, 당뇨병과 관련된 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

옻나무로부터 분리된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 제１형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 및 이를 포함하는 건강식품{Composition comprising isolated sulfuretin from Rhus verniciflura for preventing and treating insulin dependent diabetes mellitus, food comprising thereof}

본 발명은 옻나무로부터 분리된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 제1형 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 및 이를 포함하는 건강식품에 관한 것이다.

제1형 당뇨병(Insulin Dependent Diabetes Mellitus, IDDM)은 췌장 랑게르한스 섬에서 인슐린을 분비하는 β-세포의 파괴로 인하여 나타나는 자가면역질환(autoimmune disease)으로, 생성 초기에 췌장 랑게르한스 섬 주위로 면역세포들이 침습하여 IL-1β와 IFN-γ와 같은 사이토카인(cytokine)을 분비하게 된다. 분비된 사이토카인은 췌장 β-세포에 작용하여 iNOS의 발현을 증가시키고 이로 인한 산화질소(NO) 생성의 증가는 췌장 β-세포 파괴의 주 매개체로서 알려져 있다.

당뇨병이 발병한 환자는 정상인에 비해 실명, 만성 신부전, 말단 조직의 괴사에 따른 사지절단, 심근경색, 뇌졸중 등의 질환을 적게는 2.5배에서 높게는 20배까지 높은 발병율을 보인다.

현재 제1형 당뇨병의 치료를 위해 인슐린 요법, 췌장이식, 췌도세포 이식 등이 시도되고 있다. 하지만 췌장 이식의 경우 높은 수술 합병증 및 수술 후 관리의 어려움 등이 있으며, 췌도 이식의 경우 이식 후 낮은 생존율이 주요 문제가 되고 있다. 따라서 제 1형 당뇨병의 병태생리의 규명 및 이의 예방은 매우 중요하다.

옻나무(Rhus verniciflura)는 옻나무과의 낙엽교목으로 원산지는 중국이며 원래 사람의 손길로 재배하던 나무였으나 야생목으로 변화하였다. 옛부터 옻이 식용과 약용으로 되어 왔고 어혈제거, 구충, 위장질환, 여의 생리불순 등 민간요법에 이를 이용하는 처방이 전래되고 있다. 우리나라에서는 여름철 보신용으로 옻나무의 수피와 가지를 옻닭, 옻오리 등에 사용하고 있다. 최근에 이루어진 연구결과를 보면 옻나무의 주성분은 크게 우루시올과 플라보노이드로 나뉘는데, 옻나무의 수피 및 목부에서 추출된 플라보노이드 성분이 혈관형성 억제작용을 나타내어 암세포의 증식 및 전이를 억제하고 암세포를 정상세포로의 분화를 유도하는 항암효과가 확인되었고 항산화, 숙취해소 및 위염억제효과도 있다는 것이 밝혀졌다. 특히, 옻나무의 목질부에는 다량의 플라보노이드가 함유되어 있으며, 그 중에서도 설퍼레틴(Sulfuretin)이라는 플라보노이드가 숙취에 좋다는 것이 보고되었다.

본 발명의 목적은 옻나무에서 추출된 플라보노이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있는 다양한 용도를 제공하고자 한다.

위와 같은 과제를 달성하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 조성물은 옻나무에서 분리된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 제1형 당뇨병 예방 및 치료를 위한 것이다.

상기 제1형 당뇨병의 예방 및 치료는 사이토카인에 의한 면역반응을 억제하여 췌장의 β-세포를 보호하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 옻나무에서 분리 및 정제된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 NF-κB 활성 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 옻나무에서 분리 및 정제된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 iNOS 발현 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 옻나무에서 분리 및 정제된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 옻나무에서 분리된 설퍼레틴은 제1형 당뇨병 유발과 관련된 iNOS의 발현과 NF-κB의 활성을 억제함으로서, 췌장세포의 파괴를 방지할 수 있는 효과가 있음을 보였다. 제1형 당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨병으로서, 인슐린의 지속적인 투여가 필요하다는 문제점이 있다. 그러나, 상기 설퍼레틴을 제1형 당뇨병 질환에 이용함으로서, 지속적인 인슐린 투여가 필요한 제1형 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있다는 장점과, 옻나무와 같은 천연물로부터 분리정제한 설퍼레틴을 사용함으로써 부작용을 줄일 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 조성물은 제1형 당뇨병을 예방 또는 치료함으로써, 환자의 건강에 기여할 수 있으며, 당뇨병과 관련된 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 옻나무 심재로부터 분리한 설퍼레틴을 순수하게 분리 정제하여 구조를 밝히고 (도 (a)), HPLC를 통해 정제의 순수성을 표시 (도 (b))한 것이다.
도 2는 본 발명의 설퍼레틴이 사이토카인에 의해 유발되는 세포생존율 감소(도 (a)), 아질산염 생성(도 (b)), iNOS 발현 증가(도 (c)) 등이 개선될 수 있음을 보인 결과이다.
도 3은 본 발명의 설퍼레틴이 사이토카인에 의해 제1형 당뇨병과 관련된 NF-κB의 활성화를 억제할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 설퍼레틴을 췌도에 직접 처리하여, 사이토카인에 의한 세포보호효과를 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 설퍼레틴이 혈중 글루코오스 및 인슐린 농도에 어떠한 영향을 끼치는 것인지 보여주는 동물실험 결과이다.

본 발명자는 제1형 당뇨병 예방 또는 치료를 위한 천연물질을 연구하던 중, 설퍼레틴이 세포신호전달에 관여하는 단백질인 NF-κB의 활성을 억제하고, 세포신호전달물질인 산화질소를 생성시키는 iNOS의 발현을 억제하여 췌장의 랑게르한스 섬 β-세포를 보호하여 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

당뇨병에는 인슐린 의존성 당뇨병(이하, 제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존성 당뇨병(이하, 제2형 당뇨병)으로 나뉜다. 상기 제1형 당뇨병은 췌장의 β-세포가 면역세포의 공격을 받아 파괴되어, 인슐린이 생성되지 않는 질환을 말한다. 상세하게는, 췌장의 랑게르한스 섬 주위로 면역세포들이 침투하고, 침투한 면역세포는 IL-1β와 IFN-γ와 같은 사이토카인(cytokine)을 분비하게 된다. 분비된 사이토카인은 랑게르한스 섬내에 있는 β-세포에 작용하여 NF-κB를 활성화시키고, 활성화된 NF-κB는 세포핵으로 이동하여 특정 유전자를 조절하여, iNOS의 발현을 촉진하게 된다. 발현이 증가된 iNOS로 인해, 산화질소의 생성을 촉진하게 되는데, 일반적으로 산화질소는 항산화 물질이라고 알려져 있으며, 혈관순환계에서는 혈관을 확장시켜주는 이완제라 잘 알려져 있다. 그러나, 산화질소가 β-세포의 내부에서 과 생산되면, β-세포의 파괴 기전을 활성화시킨다.

본 발명의 설퍼레틴은 NF-κB 신호 전달이 활성화되는 것을 억제하고, iNOS의 발현을 억제하여 랑게르한스 섬에 있는 β-세포를 보호하고, 결과적으로 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있다.

상기 당뇨병 예방 및 치료를 위한 조성물은 상기 설퍼레틴을 단독 유효성분으로 포함하거나, 해당 질병 유효 치료 성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있고, 이외 제형 형태, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다.

상기 당뇨병 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 설퍼레틴을 0.1 중량% 내지 99 중량%, 바람직하게는 1 내지 50 중량% 포함될 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

또한, 상기 당뇨병 예방 및 치료용 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.

구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅셀제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 조성물을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 설퍼레틴을 포함하는 식품을 제공한다. 본 명세서에서 식품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 통상의 식품, 음료, 식품 첨가제, 음료 첨가제, 건강기능성 식품 등을 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영-유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예를 들어 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어 말토스, 수크로스 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 언급한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12 g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 항균 조성물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12g이다.

본 발명의 식품은 상기 설퍼레틴을 전체 식품 중량의 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 20 중량%의 양으로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 10 g, 바람직하게는 0.1 내지 5g의 비율로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 설퍼레틴의 제조

설퍼레틴을 제조하는 방법은 건조된 옻나무 심재(1 ㎏)를 메탄올로 2시간 동안 가열추출 하여 메탄올 추출물 37.78 g을 얻었다. 메탄올 추출물을 물에 녹인 후 핵산, 에틸아세테이트 순으로 용액-용액 분배법(partition)을 이용하여, 그 중 에틸아세테이트 분획물 8.71 g을 얻었다. 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 핵산 : 아세톤 = 3 : 1 비율 용매를 사용한 실리카겔(silica gel C.C.) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 2개 분획을 획득하였다. 그 중 2번째 분획 660 mg을 50% MeOH 용매를 사용한 역상의 중압 액체 크로마토그래피(MPLC, 컬럼: ODS-S-50 B, 120 Å, 50 ㎛)를 이용하여 설퍼레틴 55 mg을 얻었다.

실험예 1: 세포 독성의 측정

설퍼레틴의 세포 독성을 알아보기 위하여, MTT 방법을 통해 측정하였다. MTT 방법은 췌장 β-세포주인 RIN-세포를 96-웰 세포배양 용기에 1×10⁵ 세포수/㎖씩 분주하여 24 시간 세포배양 용기에 부착시키고, 안정화된 RIN-세포에 설퍼레틴을 48 시간 처리하여 0.5 ㎎/㎖ MTT[3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]와 1시간 반응시켰다. 생존 세포가 MTT로부터 생성한 보라색 불용성 포마잔(formazan)은 DMSO로 용해하여 570 nm 파장에서 엘라이자 측정기로 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2(a)에 나타내었다.

도 2(a)에 나타낸 바와 같이, 세포에 IL-1β와 IFN-γ를 처리하면 세포의 생존율이 감소하지만, 설퍼레틴으로 전처리하면 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 산화질소( nitric oxide , NO ) 농도 측정

RIN-세포(5×10⁵ 세포수/웰)에 IL-1β, IFN-γ 또는 설퍼레틴을 처리한 후에 산화질소 산화물인 아질사염(NO2-)의 농도를 측정하였다. 배지 100 ㎕에 그리에스(Griess) 시약을 동량 섞어 상온에서 10분간 반응시킨 후 E-MAX를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. NO² ^- 농도는 구입한 아질산염을 표준으로 사용하여 환산하였다. 그 결과를 도 2(b)에 나타내었다.

도 2(b)에 나타낸 바와 같이, RIN-세포에 IL-1β와 IFN-γ를 48시간 처리하면 산화질소 생성이 유의하게 증가하였지만, 설퍼레틴을 전처리했을 때 상기 사이토카인에 의한 산화질소 생성이 감소하였다.

실험예 3: 설퍼레틴에 의한 iNOS 의 단백질 발현 감소

RIN-세포(5×10⁶ 세포수/웰)에 IL-1β, IFN-γ 혹은 설퍼레틴을 전처리한 후에 포집된 세포를 세포파쇄용액과 4 ℃에서 30분 반응시킨 후, 30 ㎍의 단백질을 두 배의 샘플 버퍼(5 mM EDTA, 4% sodium dodesyl sulfate (SDS), 20% glycerol, 200 mM Tris, pH 6.8, 0.06% bromophenol blue)와 혼합 후, 100 ℃에서 3분 가열하여 단백질 변성을 유도하고 10% 겔에서 SDS-PAGE(sodium dodesyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 시행하였다.

전기영동을 마친 겔의 단백질은 semi-dry electrotransfer system(0.8 mA/㎠)을 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시킨 다음, 5% 탈지유(skim milk)와 상온에서 1시간 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. 일차항체는 TBS-T에 1:1,000으로 희석하여 니트로셀룰로스 멤브레인과 상온에서 24시간 반응시키고 TBS-T로 10분 3번 세척한 후, 이차항체(horseradish peroxidase-conjugated IgG)를 반응시켰다. 발현된 단백질양은 Chemi-doc image 분석기(Bio-Rad, UK)를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 2(c)에 나타내었다.

도 2(c)에 나타난 바와 같이, 사이토카인을 처리하였을 때 iNOS의 단백질 및 mRNA 양이 유의성 있게 증가하였고, 설퍼레틴 전처리에 의해 대조군 수준으로 iNOS 발현이 억제되었다. 이 결과는 설퍼레틴의 세포 보호 효과는 iNOS 발현 억제를 통해 일어남을 알 수 있었다.

실험예 4: NF -κB의 활성측정

전사인자 활성을 측정하기 위해 먼저 설퍼레틴을 전처리한 후, RIN-세포 또는 췌장 랑게르한스 섬에 사이토카인을 처리한 후 핵 추출물을 모았다. 세포는 저삼투압 용해용액(0.2 mM PMSF, 10 ㎍/㎖ aprotinin, 20 μM pepstatin A, 0.1 mM antipapain)으로 10분 얼음에서 팽창시켜 최종적으로 Nonidet P-40을 0.1% 되게 처리한 후 2,500 rpm에서 원심분리하여 핵단백질만을 모았다.

NF-κB의 활성측정은 NF-κB의 공통결합부위(consensus binding site)를 가진 올리고뉴클레오타이드 프로브(5'-CCG GCC GGT TAA CAG AGG GGG CTT TCC GAG-3')를 10 mM Tis-HCL 용액(pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT 함유)에 희석한 후 85℃에서 5분 어닐링한 후 100 ng을 Rediprime kit(Amersham, England)을 이용하여 ³²P를 부착시켰다. 방사선 동위원소가 부착된 프로브는 5~10 ㎍의 핵단백질과 실온에서 30분 반응시킨 후 냉온실에서 4% 폴리아크릴 아미드 겔에 전기영동하였다. 이 겔은 건조 후 Ras-3000 이미지 분석기(Fuji Film, Japan)를 이용하여 NF-κB 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, RIN-세포에 사이토카인을 처리하였을 때 DNA 결합(도 3(a))과 핵 속의 p50, p65 서브유닛(도 3(b))의 양이 증가하였다. 또한, 사이토카인은 세포질 내의 IkBα의 양을 감소시켰다. 반면, 설퍼레틴을 전처리하면 사이토카인에 의한 NF-kB 활성은 차단되었다.

랑게르한스 섬을 이용한 실험에서도 RIN-세포에서와 마찬가지로 설퍼레틴은 사이토카인에 의한 NF-κB 활성을 억제하였다(도 3(c)).

실험예 5: 설퍼레틴에 의한 인슐린 분비능 유지

랑게르한스 섬에 사이토카인 또는 설퍼레틴을 24시간 동안 처리한 후 3 mM D-글루코오스가 포함된 Krebs-Ringer 중탄산염 버퍼(25 mM Hepes, 115 mM NaCl, 24 mM NaHCO₃, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2.5 mM CaCl₂, 0.1% BSA)로 3번 세척한 후 5.5 mM 또는 20 mM D-글루코오스에 30분간 노출시킨 후 분비된 인슐린 양을 엘라이자 측정기(Molecular Device, USA)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4(a) 및 (b)에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 랑게르한스 섬을 사이토카인으로 24시간 처리하면 산화질소 생성과 iNOS 발현이 증가하였다(도 4(a)). 사이토카인은 또한 글루코오스 유발 인슐린 분비를 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다(도 4(b)). 상기 결과로 미루어보아, 설퍼레틴을 전처리하면 사이토카인에 의한 산화질소 생성, iNOS 발현 증가 및 인슐린 분비능 감소가 차단됨을 알 수 있었다.

실험예 6: 설퍼레틴에 의한 스트렙토조토신 유발 당뇨병 억제

5~6 주령의 ICR 마우스(20 마리)에 대하여 당뇨병을 유발시키기 위해, 1회 스트렙토조토신(80 mg/ 체중(kg); 0.2 ㎖)을 sodium citrate buffer(pH 4.0)에 녹여 복강내 주사하였다. 또한 설퍼레틴의 효과를 관찰하기 위해 마우스에게 스트렙토조토신을 주사하기 전에 설퍼레틴을 3 일간 40 μg/kg/day 씩 복강내로 주사하였다.

참조로, 마우스는 다음과 같이 4 군으로 나누어 실험을 수행하였다:　1) 아무것도 처리하지 않은 대조군, 2) 스트렙토조토신 처리군, 3) 설퍼레틴만 처리군, 4) 설퍼레틴 + 스트렙토조토신 처리군 (n=5, 각 군). 처음 스트렙토조토신을 처리한 날을 첫째날로 정의하였다. 대조군은 시트레이트 버퍼만 투여하였다.

6 일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 튜브에 보관하여 인슐린과 글루코오스 농도를 측정하였다. 글루코오스 농도는 글루코오스 옥시데이즈(glucose oxidase) 방법(Sigma)을 통해 측정하였고, 인슐린 농도는 radioimmunoassay kit(Linco Research)를 통해 측정하였다. 동물 실험에 관한 모든 사항은 전북대학교 실험동물위원회(Institutional Animal Care and Use Committee at Chonbuk National University)의 승인을 얻은 후 시행하였다. 상기 결과는 도 5(a)에 나타내었다.

도 5(a)는 설퍼레틴에 의한 혈중 포도당 및 인슐린 농도를 측정한 결과를 도시한 도면으로서, 설퍼레틴을 미리 투여한 쥐의 경우 혈중 글루코오스 농도의 증가가 유의하게 감소하였다. 또한, 인슐린 농도는 스트렙토조토신 처리에 의해 당뇨가 유발된 쥐와 비교했을 때 유의하게 더 높았다.

실험예 7: 췌장 조직의 면역염색

면역염색을 위해, DAKO Envision system(DAKO)을 이용하였다. 췌장을 떼어서 즉시 고정액(10% formalin solution in 0.1 M PBS)에 넣은 후 4 시간 후에 0.1 M PBS로 세척하였다. 파라핀으로 블록을 만든 후, 4 ㎛ 두께로 잘라 절편을 만들었다. 탈 파라핀화 과정을 거친 후에 Protein Block Serum-Free(DAKO)로 실온에서 10 분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. 2 시간 동안 실온에서 인슐린에 대한 항체 (Santa Cruz Biochemicals) 반응시켜 면역염색을 실시하였다. 그 결과를 도 5(b) 및 (c)에 나타내었다.

도 5(b)는 설퍼레틴의 항당뇨 효과를 면역조직화학적으로 확인한 결과를 도시한 도면으로서, 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 랑게르한스 섬과 주위 조직의 형태를 관찰하였으며, 인슐린을 사용한 면역세포화학법으로 랑게르한스 섬내의 β-세포 손상을 구체적으로 살펴보았다.

당뇨병 유발 마우스의 경우 랑게르한스 섬의 퇴행성 변화를 관찰할 수 있었다. 또한 면역세포화학(immunohistochemistry)법에 의한 결과의 경우에도 인슐린을 발현하는 β-세포가 현저하게 감소함을 볼 수 있었다. 그러나 설퍼레틴을 전처리한 경우 스트렙토조토신 유발 랑게르한스 섬의 파괴를 막을 수 있었고, 인슐린을 발현하는 β-세포가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 5(c)는 췌장에서 스트렙토조토신 처리에 의해 NF-kB 활성이 증가함을 보여준다. 설퍼레틴을 복강내 주사를 통해 전처리하였을 경우 RIN-세포, 랑게르한스 섬의 경우와 마찬가지로 스트렙토조토신에 의한 NF-kB의 활성을 억제함을 관찰하였다. 이상을 통해 NF-kB 활성은 사이토카인, 스트렙토조토신에 의한 췌장 베타세포 손상 모두에 있어서 중요한 기전임을 알 수 있었다.

제조예 1: 정제

하기의 조성에 따라, 통상의 정제 제조방법으로 각각 제제화하였다.

1-1. 정제 조성물

설퍼레틴 500.0 mg

유당 500.0 mg

탈크 5.0 mg

마그네슘 스테아레이트 1.0 mg

1-2. 정제 조성물

설퍼레틴 50.0 mg

유당 50.0 mg

탈크 0.5 mg

마그네슘 스테아레이트 0.1 mg

제제예 2: 캡슐제

하기의 조성에 따라, 다음과 같은 방법으로 캡슐제를 제조하였다.

설퍼레틴을 체질하여 부형제와 혼합한 후, 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 제조하였다.

2-1. 캡슐제 조성물

설퍼레틴 500.0 ㎎

전분 1500 10.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 100.0 ㎎

2-2. 캡슐제 조성물

설퍼레틴 50.0 ㎎

전분 1500 1.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 10.0 ㎎

제제예 3: 시럽제

하기의 조성에 따라, 다음과 같은 방법으로 시럽제를 제조하였다.

먼저 정제수에 백당을 용해시켰다. 파라옥시벤조에이트, 파라옥시프로필- 벤조에이트 및 설퍼레틴을 가하여 60℃에서 용해시킨 후 냉각하고, 정제수를 가하여 150 ㎖로 만들었다.

3-1. 시럽제 조성물

설퍼레틴 5.0 g

백당 95.1 g

파라옥시벤조에이트 80.0 ㎎

파라옥시프로필벤조에이트 16.0 ㎎

정제수 150 ㎖

제제예 4: 액제

하기의 성분을 통상의 액제 제제방법으로 제제화하고, 갈색병에 충전하여 액제를 제조하였다.

4-1. 액제 조성물

설퍼레틴 500.0 mg

이성화당 20.0 g

산화방지제 5.0 mg

메틸 파라벤조산 2.0 mg

정제수 100.0 ㎖

제제예 5. 산제

하기의 성분을 통상의 산제의 제조방법으로 혼합하고, 봉지에 넣어 밀봉한 후 산제를 제조하였다.

5-1. 산제 조성물

설퍼레틴 50.0 mg

유당 100.0 mg

탈크 5.0 mg

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims

옻나무에서 분리된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 제1형 당뇨병 예방 및 치료를 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1형 당뇨병의 예방 및 치료는 사이토카인에 의한 면역반응을 억제하여 췌장의 β-세포를 보호하는 것을 특징으로 하는 조성물.
옻나무에서 분리 및 정제된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 NF-κB 활성 억제제.
옻나무에서 분리 및 정제된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 iNOS 발현 억제제.
옻나무에서 분리 및 정제된 설퍼레틴을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방용 건강식품.