KR20110112916A - 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 녹차씨의 껍질로부터 수득한 용매 추출 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 녹차씨 껍질 추출물은 염증 유발 물질인 산화질소, PGE2 및 iNOS의 생성을 저해하는 활성이 있고, 항산화 효소계인 GSH, 카탈라제 및 SOD의 단백질 발현을 증가시켜 산화적 스트레스를 감소시키는 활성이 있을 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 없어 체내에 안정한 특징이 있으므로 산화적 스트레스 및 염증으로 유발되는 피부 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 피부 외용 조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising green tea seed coater extract having anti-oxidative or anti-inflammatory activity}

본 발명은 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 산화적 스트레스로 인한 피부 노화 또는 피부 염증을 예방 및 개선할 수 있는 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

염증이란 외부 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻하며, 염증을 유발하는 원인으로는 외상, 상, 동상 등에 의한 물리적 요인과 화학물질에 의한 화학적 요인, 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있고, 이 외에도 혈관이나 호르몬 불균형에 의해서도 염증이 유발된다. 염증이 발생하면 외부 자극으로 손상된 세포들이 분비한 여러 화학 매개 물질에 의해 혈관 확장이 일어나고, 투과성이 높아짐에 따라 항체, 보체, 혈장, 식균 세포들이 염증부위로 몰려들게 되는데 이러한 현상이 홍반의 원인이 된다.

한편, 우리 인체는 외부 환경과 밀접하게 접하고 있고 자외선이나 환경 오염에 의해 화학 물질, 세제, 꽃가루 등에 노출로 인해 쉽게 민감성을 띈다. 이러한 외부 환경에 의해 노출된 피부는 활성 산소나 프리라디칼이 발생되고 발생된 활성 산소와 프리라디칼은 정상적인 세포 조직이나 세포막을 공격하여 세포가 파괴되고 피부는 결국 염증 (inflammation)을 일으키게 된다. 염증화된 (inflammated) 조직은 피부에 생리학적 메카니즘에 의해 단백질이나 유전자 물질 등을 파괴하여 주름 등을 형성하는 피부 노화가 일어난다.

피부 노화를 설명하는 이론은 여러 가지가 있으나, 그 중에서도 체내외의 여러 가지 원인에 의해서 발생되는 자유라디칼, 즉 활성산소에 의해서 피부가 노화된다는 자유라디칼 이론이 가장 타당성이 있는 이론으로 받아들여지고 있다.

프리 라디칼의 생성 원인을 보면 외적으로는 자외선, 공해, 합성세제 등이며, 내부적 요인으로는 염증, 세포 파괴, 심리적 스트레스 등이 있다. 최근 자외선(UV-B 및 UV-A)에 의한 피부 세포 손상의 주 원인은 역시 활성 산소이며, 이는 태양광선 노출시 피부에서 생성되어 피부 단백질의 변성 및 지질의 과산화를 통하며, 피부염 및 광발암 등을 일으킬 수 있다고 보고되어 있다.

또한, 생체 피부 세포가 노령화 되면서 피부 세포 중의 과산화물의 수치가 급격히 증가하는데, 활성산소에 의해 세포 또는 세포막의 구성성분이 과산화물질로 되고 단백질 손상이 일어난다면 세포 또는 세포막은 기능을 원활히 수행할 수 없게 된다.

따라서 이들의 기능적, 구조적 손상으로 인해 주름이 생기게 되며 이들로 인해 노화가 촉진되며, 동시에 프리라디칼에 의해 손상된 세포나 조직을 치유하기 위해 염증이 유발된다. 이러한 염증은 해로운 주위 환경 즉, 세균과 같은 외부 이물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응이나, 이들의 작용은 때로는 인접해 있는 조직 세포와 비세포 성분들에게도 해로운 손상을 일으키기도 한다. 따라서 적절한 조건하에서는 염증은 초기 상태가 지난 후에는 정상기능을 되찾게 되지만, 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나 계속해서 만들어지면, 결과적으로 만성염증이 일어나게 되어서 더욱더 심각한 조직의 손상을 가져온다. 따라서 과다 염증에 의해 유발되는 단백질 분해 효소들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 결합조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라 나아가 빠른 피부 노화를 초래하게 된다. 그러므로 활성산소를 억제하는 항산화 활성 및 항염 활성은 피부노화 화장료에 중요한 요소라 할 수 있다.

이러한 이유로 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열인 예방적 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스무테이즈(Superoxide dismutase), 카탈레이즈 (Catalase), 글루타티온페록시데이즈(Glutathioneperoxidase) 등과 같은 항산화효소와 천연항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성 항산화제인 부틸히드록시아니졸(t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸히드록시톨루엔(3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT)등 많은 항산화제가 알려져 있으나, 항산화 효소는 나이가 들어서 늙어감에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 감소되며, 이들은 대부분 합성품으로서 장기간 인간의 피부에 적용할 경우 안전성이 문제화되므로 사용이 제한되는 문제점이 있다.

그러므로 피부에 대한 안정성이 우수하고 효력이 강한 천연 항산화제 및 항염제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 사람 피부에 대한 안정성이 우수하고 항산화 및 항염 활성이 우수한 원료를 천연식물로부터 수득하기 위해 연구하던 중, 녹차씨 껍질로부터 수득한 추출물이 우수한 항산화 활성 및 항염 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 녹차씨 껍질은 녹차씨의 외껍질일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 녹차씨 껍질 분말에 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 10 % 중량으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프 및 린스로 이루어진 군 중에서 선택된 제형을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 녹차씨 껍질 추출물은 염증 유발 물질인 산화질소, PGE2 및 iNOS의 생성을 저해하는 활성이 있고, 항산화 효소계인 GSH, 카탈라제 및 SOD의 단백질 발현을 증가시켜 산화적 스트레스를 감소시키는 활성이 있을 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 없어 체내에 안정한 특징이 있으므로 산화적 스트레스 및 염증으로 유발되는 피부 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 피부 외용 조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 녹차씨 껍질 분획에 각 용매를 첨가하여 녹차씨 껍질의 용매분획 추출물을 수득한 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질 분획 추출물과 열수추출물의 세포독성을 처리 농도별로 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질 분획 추출물과 열수추출물의 산화질소(NO, Nitric oxide) 생성 억제 효과를 처리 농도별로 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질 분획 추출물과 열수추출물의 총항산화능을 처리 농도별로 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 분획층의 세포독성을 각 처리 농도별 세포생존율의 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 분획층의 산화질소 억제능을 각 처리 농도별로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트층의 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성량을 각 처리 농도별로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트층의 TNF-α 생성량을 각 처리 농도별로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트층의 처리 농도에 따른 일산화질소 합성효소(iNOS, Nitric oxide synthase)의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마크로파지(Macrophage) 세포계에서 본 발명의 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트층의 처리 농도에 따른 항산화 효소계의 단백질 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 마크로파지(Macrophage) 세포계에 본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트층을 각 농도별로 처리하고, 총한산화능 및 글루타티온(GSH, gluthathione)의 수준을 비교하여 나타낸 그래프이다.

본 발명은 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

녹차는 천연기능성 물질 중 항산화능이 우수한 물질로 알려지면서 최근 관심의 대상이 되고 있는 식품 중의 하나이다. 녹차에는 폴리페놀성 화합물인 카테킨을 비롯한 다수의 성분이 함유되어 있으며, 여러 가지 약리작용이 뛰어나고 특히 항산화성이 우수하여 생체 내외의 스트레스에 의해 발생되는 유리기를 제거하는 기능이 있다고 알려져 있다(Kim MJ, et al, Nutrition Research, 22, pp733-744, 2002; Rhee SJ, et al, Kor. J. Gerontol., 8, pp49-55, 1998).

또한, 녹차의 항산화 작용에 대한 연구로는 나카야마(Nakayama)의 연구(Nakayama T., University of Shizuoka, Japan, 7, pp1991-1993, 1994)에서 카테킨의 폴리페놀 구조들이 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)에 의한 세포독성(cytotoxicity)을 억제하는 효과가 있다고 하였고, 지질 과산화 초기단계에서 단일종 산소(singlet oxygen)와 유리기 제거 역할로 플라보노이드가 효과적이라고 보고한 바 있으며, 그 외에도 성인병예방이나 후천성 면역결핍증 바이러스의 생육억제, 충치억제, 콜레스테롤 억제작용 등의 생리활성 효과가 뛰어난 것으로 알려진 바 있다.

한편, 이러한 녹차는 약리적 효능 및 기호성이 매우 우수함에도 불구하고 녹차잎을 직접 말려서 용기 또는 티백(Tea Bag)에 담아 파는 것 외에는 다양한 제품들은 개발되지 않고 있다.

또한, 녹차씨의 경우, 예로부터 천식과 뇌명, 만성 위장약, 산후회복, 수술 후의 빠른 상처 치유 등에 효과가 있어 민간요법이나 한방 치료에 사용되고 있으며, 수량이 많고 기름이 풍부하여 중국 등지에서는 일부 식용으로 이용되고 있다. 그러나 녹차씨 껍질에 대한 연구는 아직까지 거의 없는 실정이며, 대부분이 버려지고 있어 녹차씨 껍질의 생리활성 기능을 확인한다면 그 이용가치가 충분할 것으로 예상된다. 사료된다.

이에 본 발명에서는 녹차씨 껍질이 가지고 있는 생리활성을 규명함으로써 녹차씨 껍질로부터 수득한 추출물이 항산화 및 항염 활성이 매우 우수하다는 사실을 최초로 확인하였다.

따라서 본 발명은 녹차씨 껍질의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 녹차씨는 시중에서 판매되고 있는 녹차씨라면 모두 사용가능하며, 상기 녹차씨의 껍질은 녹차씨를 둘러싸고 있는 껍질 부분을 의미하는 것으로서 바람직하게는 녹차씨의 외껍질일 수 있다.

더욱 바람직하게는 녹차씨로부터 외껍질을 수득한 후, 이를 깨끗하게 세척하고 45~55℃의 온도에서 2일~4일간 건조시킨 후, 분쇄하여 분말화한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 녹차씨의 껍질로부터 추출물을 수득하는 방법은 상기 분말화한 녹차씨의 외껍질 분말을 당업계에 공지된 천연물로부터 추출물을 수득하는 방법이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 상기 녹차씨 껍질 분말에 물 또는 유기용매를 첨가하여 녹차씨 껍질의 추출물을 수득할 수 있는데, 상기 물 또는 유기용매의 첨가는 녹차씨 껍질 분말 중량의 약 5 내지 15배, 바람직하게는 약 8 내지 12배의 양으로 첨가할 수 있다.

또한, 상기 물 또는 유기용매를 첨가하여 녹차씨 껍질 분말로부터 추출물을 수득하는 방법은 당업계에 공지된 추출법인 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 75~105℃의 온도에서 2~6시간 동안 열수추출 또는 환류냉각 추출방법을 이용하여 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후 감압농축하여 수득할 수 있다.

상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 녹차씨 외껍질 분말에 10배의 증류수를 가해 100℃의 온도에서 4시간 동안 열수 추출하여 녹차씨 껍질 추출물을 수득하였으며, 또한, 녹차씨 외껍질 분말에 10배의 에탄올을 가해 80℃의 온도에서 4시간 동안 환류 추출한 다음 감압여과 하여 에탄올 추출물을 수득하였고, 이후 상기 에탄올 추출물에 증류수와 석유에테르를 가해 물층과 석유 에테르층을 각각 분획화 한 다음, 다시 상기 물층에 에틸아세테이트를 가해 물층과 에틸아세테이트층으로 분획화한 후, 다시 상기 물층에 부탄올을 가해 물층과 부탄올층으로 분확회하였다. 이때 각 단계별 용매처리에 의한 분획화는 2번씩 반복 수행하였고, 상기 일실시예에 따라 본 발명의 녹차씨 껍질 추출 분획물의 제조과정은 도 1에 나타내었다.

한편, 상기와 같이 본 발명에 따라 녹차씨 껍질로부터 물 또는 용매처리에 의해 수득한 녹차씨 껍질 추출물은 항산화 활성이 우수한 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 제조된 녹차씨 껍질의 각 분획 추출물에 함유된 총 페놀의 함량 및 트롤록스(trolox)의 당량을 측정한 결과, 열수추출물, 에탄올 분획물, 석유에테르 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 모두 항산화능이 있는 것으로 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획 및 열수추출물의 경우, 총 페놀 함량이 가장 높은 것으로 나타났으며, 총 항산화능은 열수추출물, 부탄올 및 물 분획층이 다른 분획층에 비해 우수한 것으로 나타났다(표 3 및 표 4 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 녹차씨 껍질로부터 수득한 각 분획추출물에 대해 LPS에 의한 산화적 스트레스로 발생하는 산화질소의 생성능 억제 정도를 분석한 결과, 모든 분획추출물이 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획의 경우 다른 분획에 비해 IC₅₀값이 80.11로서 가장 높은 억제율을 보였다(도 3, 도 6 및 표 5 참조).

염증은 앞서 기술한 바와 같이 LPS(lipopolysaccharide), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 유해한 자극이 인체 면역체계를 과도하게 항진시킬 경우, 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질을 과도하게 유도하여 염증질환이 유발되는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명에서 제조한 녹차씨의 껍질 분획물들은 항염 활성이 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 녹차씨 껍질로부터 수득한 각 분획추출물 중에서 에틸아세테이트 분획에 대한 항산화 활성 및 항염 활성을 보다 다양한 방법으로 조사하였는데, 먼저, 에틸아세테이트 분획의 항염 활성 정도를 측정하기 위해 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 분획을 각 농도별로 대식세포에 처리한 후, LPS 처리에 따른 염증 유발인자, 즉 PGE2 및 TNF-a의 생성량과 iNOS의 발현양을 조사하였다.

그 결과, 에틸아세테이트 분획추출물은 농도 의존적으로 PGE2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 것으로 나타난 반면, TNF-a의 생성량에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 7 내지 도 9 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 녹차씨 껍질로부터 수득한 추출물, 특히 에틸아세테이트 추출분획은 PGE2, NO 및 iNOS의 발현을 억제하는 작용을 통해 염증반응을 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 분획에 대한 항산화 활성 조사를 위해 대식세포에 상기 분획을 농도별로 처리한 후, LPS로 산화적 스트레스를 유도한 다음, 총 항산화능 및 항산화 영양소의 수준을 측정하였는데, 그 결과, 총 항산화능은 에틸아세테이트 분획을 처리하지 않은 대조군에 비해 처리한 군이 유의적으로 높게 나타났으며, 항산화 영양소인 GSH의 수준 또한 에틸아세테이트 분획을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 증가한 것으로 나타났다(도 11 참조).

한편, 생체 내에는 여러 가지 원인에 의하여 발생하는 활성 산소종을 제거하는 항산화계가 존재하는데, 이들은 크게 세포질과 미토콘드리아의 항산화계로 나뉜다. 세포질 항산화 기작은 세포 내에서 발생된 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)은 구리/아연 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(Cu/Zn superoxide dismutase, SOD) 또는 망간 SOD등에 의해 독성이 높은 과산화수소 및 지질 과산화물(lipid peroxide)을 생성시킨다. 생성된 과산화수소는 이후 카탈라아제(catalase)에 의해 물로 최종적으로 환원되는 단계를 거치게 되는데, 이때 카탈라아제(catalase) 효소의 활성화에는 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form)가 필수적으로 요구된다. 또한, 과산화수소 및 지질 과산화물들은 카탈라아제의 작용 이 외에도 환원형 글루타치온인 GSH를 환원제로 사용하는 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase)에 의해서도 물로 환원이 되게 된다. 이때, 생성되는 산화형 글루타치온인 GSSG는 항상 글루타치온 환원효소(glutathione reductase)의 작용에 의해 GSH로 재생되어진다.

따라서 이와 같이 세포 내에서 항산화계 효소들의 발현 또는 작용을 활성화 시킬 경우, 활성 산소종에 의한 산화적 스트레스를 억제할 수 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 분획에 대해 항산화 효소계인 GSH, Mn-SOD 및 카탈라제의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 웨스턴 블럿을 수행하였는데 그 결과, 에틸아세테이트 분획을 처리한 군의 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 항산화 효소계인 카탈라제, Mn-SOD 및 GSH-red의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 10 참조).

따라서 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물은 염증생성을 억제하며, 동시에 산화적 스트레스에 대한 보호 작용이 우수한 특징이 있다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 녹차씨 껍질 추출물이 체내에 안정한지를 조사하였는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면, 녹차씨 껍질의 각 분획추출물인 에탄올 추출물, 석유에테르 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 부탄올 추출물, 물 분획추출물 및 열수추출물을 대식세포에 농도별로 처리한 후, 세포 생존율을 측정한 결과, 모든 추출물이 세포독성이 없는 것으로 나타났다(도 2 참조).

상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물이 세포에 독성을 유발하지 않고 다른 부작용을 초래하지 않으므로 체내에서 매우 안정적이라는 사실을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 조성물은 산화적 스트레스로 유발되는 피부노화 및 피부 염증을 개선시킬 수 있는 화장료 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 녹차씨 껍질 추출물을 0.1 내지 10 % 중량으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물은 피부의 노화방지 및 주름개선 등 피부 개선 효과를 위한 화장품 또는 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유효성분인 녹차씨 껍질 추출물 이외에도 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 일 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 포함할 수 있다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

상기 유용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤)일 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등)들도 포함할 수 있다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

또한, 상기 고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴일 수 있으며, 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등)일 수 있으며, 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질일 수 있고, tm핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스일 수 있으며, 또한, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 혼합되는 다른 성분들도 포함할 수 있다.

이외에도 첨가할 수 있는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

나아가 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프 또는 린스의 제형으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

녹차씨 껍질 추출물의 제조

<1-1> 녹차씨 껍질의 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 제조

녹차씨 껍질은 일송제다(Korea)로부터 구입한 것을 사용하였으며, 외껍질을 시료로 사용하였다. 녹차씨의 외껍질은 깨끗하게 세척하고 50℃의 온도에서 3일간 열풍 건조하여 40 메쉬로 분말화한 후, 이를 추출물의 원료로 사용하였다.

먼저, 열수추출물은 상기 제조된 녹차씨 외껍질 분말의 10배에 해당하는 증류수를 가해 100℃에서 4시간 동안 환류추출을 수행한 후, 원심분리(1,500 rpm, 15분)한 다음, 감압 여과하여 동결 건조하여 녹차씨 껍질의 열수 추출물을 수득하였다.

또한, 에탄올 추출물은 상기 제조된 녹차씨 외껍질 분말의 10배에 해당하는 에탄올을 가해 80℃에서 4시간 동안 환류 추출하여 감압여과한 후 증발건조기를 사용하여 건조하여 수득하였다. 이때 상기 과정을 통해 녹차씨 껍질의 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 회수율은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.

녹차씨 껍질의 에탄올 추출물과 열수 추출물의 회수율

	GTSC
Hot water	10.49%
Ethanol	3.644%

GTSC; green tea seed coater

<1-2> 녹차씨 껍질로부터 용매 추출 분획물의 제조

녹차씨 껍질의 용매추출 분획물은 상기 <1-1>에서 수득한 에탄올 추출물을 대상으로 각각의 유기용매를 순차적으로 처리하고 이로부터 각 용매추출 분획물을 수득하였는데, 그 과정은 다음과 같다. 즉, 상기 <1-1>에서 제조한 에탄올 추출물(EtOH) 10g에 증류수 500 mL을 가해 용해시킨 후 석유에테르(PE) 500 mL을 가하여 혼합한 후 PE층인 상층액을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였고(PE 분획), 남은 물층에 다시 에틸아세테이트(EtOAC) 500 mL을 가하여 혼합한 후 상층액인 에틸아세테이트 층을 회수하였으며 이와 같은 방법으로 2회 반복수행하여 에틸아세테이트 분획을 추출하였다. 이후, 다시 남은 물층에 부탄올(BuOH) 500 mL을 가하여 혼합한 후 상층액인 부탄올 층을 회수하였고, 이와 같은 방법으로 2회 반복 수행하여 부탄올 층을 추출하였으며, 남은 물층은 물분획물로 사용하였다. 또한, 상기 녹차씨 껍질의 에탄올 추출물로부터 녹차씨 껍질의 용매 분획추출물을 제조하는 과정은 도 1에 나타내었고, 최종 물 분획은 동결 건조하였으며, 나머지 모든 분획층은 증발기를 사용하여 건조시켜 이를 다음의 실험을 위한 시료로 사용하였으며, 각각 분획층의 수율은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.

녹차씨 껍질 추출물의 회수량

	GTSC
Ethanol extract	10.0g
PE	2.499g
EtOAC	3.365g
BuOH	2.355g
H2O	0.668g

GTSC; green tea seed coater

실시예 2>

녹차씨 껍질 추출물의 항산화능 분석

상기 실시예 1에서 수득한 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물 및 각 용매 분획물에 대한 항산화 활성을 총 페놀 함량 및 트롤록스(trolox) 당량을 측정하여 분석하였다. 즉, 실시예 1에서 수득한 각 분획물 시료의 총 페놀 함량은 Folin-Dennis법(AOAC. 1985. Official method of analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed. Chemists, Washington D. C.)으로 측정하였으며, 이를 위해 각 추출물 200μL에 50% Folin-Ciocalteu 시약 1 mL과 7.5% Na₂CO₃ 용액 800 μL을 가한 후 암소에서 45분간 방치하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 표준물질로는 갈릭산을 사용하였다.

또한, 총 항산화능의 측정은 상기 <1-1> 및 <1-2>의 추출물 및 분획물을 대상으로 trolox equivalent antioxidant capacity(TAEC)로 Erel의 방법(Erel C et al. 2004, A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free radical reaction. Clinical Biochem 37, 112-119.)을 사용하여 2,2‘-azino-bis-(3-ethybenzthiazoline -6-sulfonic acid (ABTS, Sigma) radical cation decolorization 분석을 통해 조사하였다. 이후, 7mM ABTS 용액을 제조하고 TAEC는 2.45 mM potassium persulfate를 혼합한 후 암소에서 16 시간 방치하여 ABTS⁺ 스탁용액을 제조하였다. 이후, 상기 ABTS⁺ 스탁용액을 PBS 용액(5 mM, pH 7.4)으로 희석한 다음, 734 nm에서 흡광도가 0.70이 되도록 조정하여 50μL의 각 시료를 첨가한 후 혼합하여 30 ℃에서 정확히 1분과 6분 후에 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 trolox를 농도별로 조제하여 사용하였다. 각 시료의 총 항산화능은 trolox equivalent로 표시하였다. 또한, 통계분석은 SPSS 수프트웨어를 사용하였으며 모든 결과는 mean± SE로 표시하였고, ANOVA 와 Duncan's multiple range test로 군 간에 유의성을 p <0.05에서 검정하였다. 결과는 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.

녹차씨 껍질 추출물의 총항산화능 Trolox equivalent(mM)

Extract	GTSC
EtOH	4.57
PE	4.51
EtOAC	4.58
BuOH	4.65
H2O	4.63
HW	4.99

GTSC; green tea seed coater

녹차씨 껍질 추출물의 총 페놀함량(갈릭산)

	GTSC (mg/100 mg extracts)
EtOH	5.889±0.156b
PE	3.124±0.166c
EtOAC	7.306±0.284a
BuOH	1.444±0.075d
H2O	1.192±0.034d
HW	7.228±0.431a

GTSC; green tea seed coater

그 결과, 녹차씨 껍질 추출물의 항산화능은 상기 표 3에 기재된 바와 같이, 각 추출분획은 항산화능을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 열수추출물(HW)이 항산화능이 가장 높은 것으로 나타났으나 각 분획추추물 간에 큰 차이는 보이지 않았다.

또한, 각 추출물 100 mg 당 총 페놀의 함량을 측정한 결과, 상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트 분획 및 열수추출물이 7.306± 0.284 mg 및 7.228± 0.431 mg으로 가장 높은 것으로 나타났고, 반면, 이에 비해 부탄올 층BuOH층(1.444± 0.075 mg) 및 물 분획층(1.192± 0.034 mg)은 다른 분획물에 비해 낮은 수준을 보였다.

< 실시예 3>

본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물의 항산화 및 항염 활성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 수득한 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출분획물들에 대해 항산화 및 항염 활성이 있는지를 조사하기 위해 RAW 274.6 macrophage 세포주를 대상으로 세포독성, 산화질소(NO) 생성량 및 총 항산화능을 측정하였다. 상기 측정을 위해 사용한 RAW 274.6 macrophage 세포주는 ATCC에서 구입하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 10% FBS와 2mM L-glutamine이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 이후 세포를 24-웰 플레이트(4×10⁵ cells/well)와 100mm 디쉬(5× 10⁶ cells/dish)에 분주하여 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한 후, 농도별로 조제한 시료를 처리하여 2시간 배양한 다음, 산화적 손상을 유발하기 위해 LPS(1 ㎍/mL)를 첨가하고 20시간 다시 배양하여 실험에 이용하였다. 이때 대조군으로는 LPS를 처리하지 않은 것을 음성대조군으로 사용하였고, LPS를 처리한 군을 양성대조군으로 사용하였다. 또한, 상기 세포주에 처리한 시료의 농도는, 즉, 녹차씨 껍질 분획 추출물은 에탄올 추출물의 경우, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ㎍/mL이 되도록 세포에 처리하였고, 석유에테르 추출물은 50, 75, 100, 150, 200 ㎍/mL이 되도록, 에틸아세테이트 추출물은 25, 50, 75, 100, 125 ㎍/mL이 되도록, 부탄올 및 물 분획추출물은 각각 100, 200, 300, 400, 500 ㎍/mL이 되도록, 열수 추출물은 100, 200, 300, 400 ㎍/mL이 되도록 처리하였다.

<3-1> 세포 독성 효과

본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물의 세포 독성 효과는 MTT 어세이를 통한 세포 생존률 측정을 통해 분석하였는데, 즉, 상기 기술된 조건으로 각 추출물이 첨가된 RAW 274.6 macrophage 세포주의 배지를 제거하고, 1 ㎎/ mL 농도가 되도록 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 첨가한 다음, 4 시간 동안 배양하였다. 이후, 시간 후 살아있는 세포에서 미토콘드리아 탈수소효소(dehydrogenases)에 의해 MTT가 포르마잔 시약의 결정으로 전환되면, 여기에 DMSO 150 μL를 첨가하여 세포에서 상기 시약을 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더기로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포생존율은 대조군에 대한 흡광도 값으로 나눈 백분율로 나타내었다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 녹차씨 껍질의 용매분획 추출물과 열수추출물의 세포독성은 석유에테르 층만이 150 μg/mL의 농도에서 세포독성을 나타내는 것으로 보였을 뿐, 그 외 다른 분획층은 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명에서 수득한 녹차씨 껍질의추출물들은 세포에 부작용을 초래하지 않아 안정하다는 것을 알 수 있었다.

<3-2> 산화질소 생성 억제능 측정

산화질소(NO) 생성 정도는 Green 등의 방법(Green LC, Wagner DA, Glogowski J, et al. 1982. Analysis of nitrate, nitrite, and [15^N]nitrate in biological fluids. Anal Biochem 126 : 131-138.)으로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 질산염의 양을 측정하여 분석하였다. 즉, 상기 기술된 바와 같이 각 추출분획이 처리된 세포 배양액에서 100 μL의 배지 상등액에 50 μL의 1% 설파닐아미드(5% phosphoric acid에 용해된 sulphanilamide) 와 50μL의 0.1% 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드(naphthylenediamine dihydrochloride)를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 처리한 것을 사용하였으며, 결과를 도 3 및 하기 표 5에 나타내었다.

대식 세포계에서 녹차씨껍질 추출물의 NO IC₅₀ 값

	EtOH	PE	EtOAC	BuOH	H2O	HW
IC50 (μg)	104.39	136.27	80.11	542.50	840.00	324.06

그 결과, LPS로 인한 산화적 스트레스에서 발생하는 NO의 생성능은 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출물들을 농도별로 처리한 군의 경우, 농도 의존적으로 세포내에서 NO의 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 표 5에 나타낸 바와 같이, 각 분획물 모두 NO 억제능이 있는 것으로 나타났고, 특히 에틸아세테이트 층이 IC₅₀ 값이 80.11로 가장 낮은 값을 보여 NO 억제능이 가장 우수하다는 사실을 알 수 있었다.

<3-3> 총 항산화능 분석

총 항산화능은 Erel의 방법(Erel C et al. 2004, A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free radical reaction. Clinical Biochem 37, 112-119)에 따라 측정하였는데, 즉, 7 mM ABTS 용액을 제조하고 2.45 mM potassium persulfate를 혼합한 후 암소에서 16시간 방치하여 ABTS⁺ 스탁 용액을 조제하였다. ABTS⁺ 스탁 용액을 PBS (5 mM, pH 7.4)으로 희석하여 734 nm에서 흡광도가 0.70이 되도록 조정한 다음, 10 ㎕의 시료(즉, 본 발명에 따른 녹차씨 껍질 추출 분획물)를 대식세포인 RAW 274.6 macrophage에 첨가한 후 30℃에서 정확히 1분과 6분 후에 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 trolox를 농도별로 조제하여 사용하였으며 각 시료의 총 항산화능은 trolox 당량으로 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 녹차씨 껍질 추출분획물을 처리한 경우, 상기 추출분획물을 처리하지 않은 경우에 비해 항산화능이 증가하는 것으로 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 처리한 추출물의 농도 의존적으로 항산화능이 증가하는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획물에 대한 항산화 및 항염증 활성 분석

녹차씨 껍질의 각 용매 추출 분획물에 대하여 상기 실시예들을 통해 항산화 및 항염 활성을 분석한 결과, 에틸아세테이트 분획이 다른 분획들에 비해 보다 우수한 효과가 있음을 확인함으로써 에틸아세테이트 분획에 다음과 같은 실험들을 통해 상기 결과를 보다 확실히 확인하였다. 이때 하기 실시예들은 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 RAW 274.6 macrophage 세포주를 대상으로 각 농도별 에틸아세테이트 추출분획을 처리한 세포들을 사용하였다.

<4-1> 에틸아세테이트 분획물의 세포 생존율 측정

본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획을 대상으로 세포 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해 상기 실시예 <3-1>에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 에틸아세테이트 분획 처리에 따른 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획을 125㎍/mL이 되도록 처리한 경우에서도 세포 독성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획은 세포에 대해 매우 안정하다는 사실을 알 수 있었다.

<4-2> 염증 억제능 측정

염증 억제는 측정은 본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획을 RAW 274.6 macrophage 세포주에 농도별로 처리한 다음, 세포내에서 산화질소의 생성량, PGE2의 생성량 및 TNF-a의 양을 측정함을 통해 조사하였는데, 상기 산화질소의 생성량은 상기 <3-2>의 방법에 따라 수행하였고, PGE2 생성량은 PGE2 분석키트(R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA)를 사용하여 ELISA 분석을 통해 조사하였으며, TNF-α 생성 측정은 TNF-α 분석 키트(R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA)사용하여 ELISA 분석을 통해 조사하였다.

그 결과, 에틸아세테이트 추출물 처리에 따른 NO 생성량은 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 LPS 처리에 의한 산화적 스트레스로 발생되는 NO 생성을 녹차씨껍질의 에틸아세테이트 추출물이 현저하게 감소시킨다는 것을 알 수 있었다(도 6 참조).

또한, 대식 세포에서 산화적 스트레스에 의한 염증생성 물질인 PGE2의 수준은 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 녹차씨껍질의 에틸아세테이트 추출물을 처리한 경우가 PGE2의 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, 억제 정도는 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다.

또한, TNF-α 생성량은 에틸아세테이트 추출물을 25~125 μg/mL 농도로 처리한 경우, 대조군에 비해 현저한 차이는 보이지 않았으며 유사한 수준을 보였다(도 8 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획물은 산화적 스트레스에 의해 발생하는 산화질소 및 PGE2의 생성량은 감소시키는 반면, TNF-α의 생성량에는 큰 영향을 미치지 않는다는 사실을 알 수 있었다.

<4-3> iNOS 유전자 및 항산화 효소계 유전자의 발현에 미치는 영향 측정

본 발명에 따른 녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획물을 LPS에 의해 산화 스트레스가 유도된 대식 세포에 처리하였을 경우, 염증관련 단백질들의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 다음과 같이 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이를 위해 먼저, 세포로부터 단백질을 분리하기 위해 PROPREP^TM 단백질 추출용액(iNtRON Biotechnology) 방법에 의해 수행하였는데, 100 mm dish (5×10⁶ cells/dish)로부터 배양액을 제거하고 미리 준비해 둔 차가운 PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 후, 1 mL 차가운 PBS (pH 7.4)를 넣어 세포를 수집한다. 이를 4℃에서 원심분리 (12,000 rpm, 20초)하여 상층을 제거하고, 세포 용해를 위해 400 μL PROPREP을 넣고 -20℃에서 10~20분간 incubation시킨 후 4℃에서 원심분리 (12,000 rpm, 5분)를 하여 세포 추출 상등액(total protein)을 얻었다. 이후, 세포 추출 상등액을 Bradford법(Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Ann Biochem 72: 248-254.)으로 단백질 정량 후 단백질 농도를 결정한 다음, 30㎍을 10% SDS-PAGE에서 전기영동 하였고, nitrocellulose 막으로 단백질들을 이동시킨 다음, TBS/T [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20]으로 헹군 후, 2시간 동안 5% 블록킹 용액(5% BSA, 5% nonfat dried milk in TBST)으로 블록킹 하였다. 이후, 항산화 효소계 단백질의 발현을 결정하기 위한 일차 항체(catalase antibody, GSH-red antibody, GSH-px antibody, Abcam)와 염증 관련 단백질 발현을 결정하기 위한 일차 항체(iNOS antibody, COX-2 antibody, TNF-α antibody, Actin antibody, Santa Cruz Biotechnology)를 1:1,000으로 블록킹 용액에 희석하여 밤새 반응시키고, TBS/T로 3번 헹군 후 alkaline phosphatase로 결합된 goat anti-mouse immunoglobulin G (IgG) 이차 항체를 블록킹 용액에 1:2,000으로 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium color development substrate (Promega)로 발색시키거나 X-ray 필름 (Amersham Hyperfilm^TM ECL)에 20X LumiGLO (R) reagent and 20X Peroxide (Cell Signaling)로 발광시켜 현상하였다.

그 결과, 녹차씨껍질의 에틸아세테이트 층은 염증생성 전사인자인 iNOS의 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제시키는 활성이 있는 것으로 나타났고(도 9 참조), 항산화 효소계의 단백질 발현 정도는 녹차씨 껍질 추출물을 처리한 군이 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 이러한 증가는 특히 추출물을 75 μg/mL 이상 처리 시 나타났다. 또한, GSH-red의 단백질 발현은 녹차씨껍질 추출물을 75 μg/mL 농도로 처리하였을 때 현저하게 증가하여 가장 높은 수준을 보였으나 100 μg/mL 이상 처리시에는 감소하는 경향을 보였고, Mn-SOD의 단백질 발현 정도는 농도 의존적으로 증가하여 대조군에 비해 녹차씨껍질 추출물을 처리한 모든 군에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(도 10 참조).

<4-4> 에틸아세테이트 분획의 총 항산화능 및 항산화 영양소의 수준측정

녹차씨 껍질의 에틸아세테이트 추출분획에 대한 항산화 효과를 확인하기 위하여 항산화 영양소인 gluthathione(GSH) 함량은 Tietze의 방법(Tietze F. 1969. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissue. Anal Biochem 27: 502-522.)을 다소 수정하여 측정하였다. 즉, 세포 배지를 제거한 후 차가운 PBS로 3번 정도 씻어 PBS 1mL 첨가하여 세포를 떼어낸 후, 튜브에 담아 세포의 수를 측정하였고, 일정량의 세포를 취해서 얼음 위에서 초음파 처리하여(2× 5초)하여 세포를 용해시켰다. 이후 원심분리(4500 rpm, 10분)하여 상등액 400㎕를 취해 100㎕ 5% SSA와 섞어 다시 원심분리(4500 rpm, 5분)하여 GSH 함량을 분석하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 녹차씨껍질의 에틸아세테이트 추출물의 총 항산화능은 대조군에 비해 유의적으로 높은 수준인 것으로 나타났으며, GSH 수준은 LPS로 산화적 스트레스를 유발한 군이 산화적 스트레스를 유발하지 않은 군에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 녹차씨껍질 의 에틸아세테이트 추출물을 처리한 군의 경우, 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 모든 군에서 GSH의 수준이 증가하는 것으로 나타났고 증가 정도는 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다.

따라서 산화적 스트레스를 유발시킨 대식세포에서 본 발명에 따른 녹차씨껍질의 추출물 처리는 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시켜 산화적 스트레스를 경감시키는 효과가 있다는 사실을 확인하였다.

나아가 하기에는 본 발명의 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 하는 것이다.

< 제제예 1> 유연 화장수

< 제제예 2> 영양화장수

< 제제예 3> 영양크림

< 제제예 4> 에센스

< 제제예 5> 친수성 연고제의 제조

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 녹차씨 껍질은 녹차씨의 외껍질인 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 녹차씨 껍질 분말에 물 또는 유기용매를 첨가하여 가용 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 10 % 중량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프 및 린스로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물.

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