KR20130062113A - 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 피부외용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형개 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β, IL-6, IL-8), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), NO 저해활성 및 COX-2, iNOS의 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방에 피부외용 약학조성물 또는 화장료조성물로서 사용할 수 있다.

Description

형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 피부외용 조성물 {A topical composition comprising the extract of Schizonepta tenuifolia as an active ingredient for preventing and treating inflammatory disease}

본 발명은 형개(Carthamus tinctorius seed) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물 또는 화장료조성물에 관한 것이다.

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현대사회에서는 보다 건강하게 살아가고자 하는 욕구에 따라 질병을 치료하거나 예방할 수 있는 다양한 물질을 탐색하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그중에서도 천연물을 이용하여 다양한 생리활성을 탐색하고, 유효성분을 분리 정제하여 그 성분의 생화학적 기능을 규명하고 약효를 과학적으로 검증하고자 하는 연구에 집중되고 있다(1). Oxidative stress는 수많은 생리학적 병리학적 현상에서 중요한 역할을 하는데 oxidative stress에 수반되는 활성 산소종 (reactive oxygen species; ROS)으로서 oxygen(¹O₂), superoxide (O₂-), hydroxy radical (HO), hydrogen peroxide (H2O2)등이 있으며, 이러한 활성 산소종들은 염증 반응에 관여한다(2). 염증은 cytokine 및 다양한 염증인자들의 생성 등에 의해서 조절되는 복합적인 과정을 통해 일어난다. 반복적인 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면 염증관련 세포에서 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)과 활성 질소종(reactive nitrogen species; RNS)이 과다 생성됨으로써 염증성 관련 질환이 유발된다(3). 염증 과정 중에는 많은 양의 염증유도 cytokines, nitric oxide(NO) 그리고 prostaglandin E₂(PGE₂)가 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해 생성되며(4), 포유세포에서 NO는 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS(eNOS) 그리고 iNOS 세가지 형태의 NOS에 의해 합성된다. nNOS와 eNOS는 세포 내에 항상 존재하지만, iNOS는 interferon-γ, lipopolysacchatide(LPS) 그리고 다양한 염증유발 사이토카인에 노출되는 경우에만 발현된다(5-6).

활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide(NO)는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있다(7). 일반적으로 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 병리학적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다. iNOS는 평소에는 세포내 존재하지 않으나 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하였으며, 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 촉지시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. NO는 염증과 암의 발생에 관여하였으며(8-9), iNOS의 발현은 NF-kB 활성으로 유되되며, 이는 macrophage에서 LPS나 cytokine에 의해 염증성 매개물들이 과잉 생산되는 중요한 메카니즘이 된다(10).

다수의 염증 억제 약물들의 작용기전에 따라 prostagladin 합성 억제를 나타내며 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다. Arachidonic acid를 PGE₂로 전화시키는 효소로 COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판을 형성, 위벽보호, 신장 기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하였다. 많은 염증 억제 약물들의 작용 기전은 prostaglandin 합성 억제를 나타내며, 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다(11).

형개는 사초과(Cyperaceae)에 속하는 다년생 초본으로서 한국 남부 및 제주도에 자생하며, 그 성분으로는 피넨 (pinene), 캄펜(campene), 1,8-시네올(cineol), 리모넨(limonene), 등의 정유 성분을 함유한 것으로 진통작용, 항균작용이 알려져 있다(12).

따라서 본 연구에서는 생리활성 탐색연구의 일환으로 경북지역 약용식물 형개를 선정하여 대식세포(macrophage cell)라인인 Raw 세포를 이용하여 항염증 효과를 검토한 결과, 강력한 항염증 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

상기 형개 추출물은 피부외용 약학조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

본원에서 정의되는 형개는 바람직하게는, 한국산 형개, 보다 바람직하게는 경북 청송지역 재배산 형개임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 바람직하게는 물 또는 50% 내지 90% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 형개 추출물을 함유한 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 사용이 가능하다.

본원에서 정의되는 염증성 질환은 바람직하게는 아토피, 습진, 알레르기, 비염 등의 피부염증 질환, 보다 바람직하게는 아토피, 습진, 알레르기, 비염을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 형개 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 형개를 세척 후, 음건하여 추출 1시간 내지 30시간, 바람직하게는 5시간 내지 25시간 전에 건조된 형개 건조중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁내지 C₄의 저급알코올의 극성 용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 50% 내지 90% 에탄올로, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 약 10℃ 내지 50℃에서 1일 내지 30일간, 바람직하게는 5일 내지 15일간, 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 추출하여 얻어진 여액을 감압여과, 농축 및 동결 건조하여 형개 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 형개 추출물을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 형개 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 형개 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 형개 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β, IL-6, IL-8), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), NO 저해활성 및 COX-2, iNOS의 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 형개 추출물은 피부염증 개선 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5 %중량, 보다 바람직하게는 0.01-3%중량로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 형개 추출물이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 형개 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β, IL-6, IL-8), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), NO 저해활성 및 COX-2, iNOS의 생성을 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방에 피부외용 약학조성물 또는 화장료조성물로서 사용할 수 있다.

도 1은 시료들의 대식세포(Raw264.7)에 대한 세포 생존율을 나타낸 도이며 (개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 2는 시료들의 대식세포(Raw264.7)에서 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이며 (개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 3는 시료들의 TNF-α 생성에 미치는 저해효과를 나타낸 도이며 (개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 4는 시료들의 IL -1β 생성에 미치는 저해효과를 나타낸 도이며 (개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 5는 시료들의 PGE ₂ 생성에 미치는 저해효과를 나타낸 도이며 (개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 6는 시료들의 IL -8 생성에 미치는 저해효과를 나타낸 도이며 (개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 7는 시료들의 LPS-활성화 대식세포(Raw264.7)에서 iNOS 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 도이며 (세포를 시료 50 ㎍/ml 함유 배지에서 24시간 배양하고 개개 시료에서의 iNOS 단백질 발현 수준을 β-actin 향으로 정상화하고 개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함);
도 8는 시료들의 LPS-활성화 대식세포(Raw264.7)에서 COX -2 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 도이다 (세포를 시료 50 ㎍/ml 함유 배지에서 24시간 배양하고 개개 시료에서의 COX-2단백질 발현 수준을 β-actin 향으로 정상화하고 개개 수치는 평균 ± SD(n≥3)으로 표시함).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시료 추출

경북 청송군에서 재배된 형개(Schizonepta tenuifolia, 500 g)를 70% 에탄올을 가하여 상온에서 3일간 3회 추출한 다음 여과지(Whatman No. 3, Maidstone, England)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압농축기(UT-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압 농축하였다. 상기 농축된 추출물은 동결 건조기(Labconco freeze dryer, 77500 model, Kansas City, MI, USA)로 동결 건조한 후에 형개 에탄올 추출물(이하 “ST-EtoH”라 명명함) 48.05 g수율 9.61%)을 수득하였으며, 냉동고에 보관하며 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

참고예 1. 실험 준비

1-1. 시약 및 기기

항염증효능 검정에 상용된 시약은 lipopolysaccharide (LPS)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정에 사용된 Raw 264.7 cells은 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포 생존율 측정 시약은 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co.(Grand Island, USA) 및 Haemacytometer (Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며, 3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2 cayman (Ann arbor, MI, USA), β-actin과 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjantibody (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-1β, IL-6와 IL-8의 ELISA kit는 Pierce endogen (Rockford, IL., USA)에서 구입하였다. 또한 Band density는 Gel doc (Amersham Pharmacia, England)기기를 사용하였다.

1-2. 세포 배양

Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입한 뮤린마우스 대식세포 주(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7을 Michikawa등(13)의 방법에 따라 배양 세포에 0.25% trypsin 용액을 희석 처리한 후 세포를 분리한 다음에 DuLbeco's modified eagle’s medium(DMEM) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)과 1% penicillin/streptomycin(100U/ml)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에 적응시켜 배양하였다.

실험예 1. MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 세포생존율을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(14).

RAW 264.7 세포를 96well plate에 1× 10⁴cells/well이 되게 0.18ml 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02ml 첨가한 후에 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 0.02ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:EtOH (1:1) 0.15ml를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 하기 수학식 1에 따라 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

상기 실험 결과, 형개 추출물에 의한 세포 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과 도 1에 나타내었다. 형개 추출물은 10, 100, 250 ㎍/ml의 농도에서 100%의 높은 생존율을 나타내었으며, 대조군과 비교하였을 때도 세포 독성을 나타내지는 않았다.

이에 ELISA kit, western blot의 실험에서 50 ㎍/ml농도를 사용하여 실험을 진행하였다.

실험예 2. 형개 추출물의 Nitric Oxide 생성량 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 NO 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (15).

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent(Sigma No. G4410, USA)를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 5 x 10⁴ cells/㎖로 조절한 후에 12 well plate에 접종하고, 5% CO₂ incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 1 ㎍/ml의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 1, 10, 100 ㎍/ml의 시료 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 상기 griess 시약과 반응 시킨 후에 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.

Raw 264.7 cell의 NO생성정도를 측정하기 위하여 경북 약용 작물인 형개 70% 에탄올 추출물을 10, 50 ㎍/ml농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 실험 결과, LPS를 처리한 대조군에 비해 NO생성량 10 ㎍/ml농도에서 형개가 83%의 효과를 보여줬으며, 50 ㎍/ml농도에서도 형개 추출물이 40%의 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 3. 형개 추출물의 PGE ₂ 생성량 측정 및 Cytokine assay ( TNF -α, IL -1β, IL -6, IL -8)

상기 실시예에서 얻은 시료의 전염증 인자들 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(16).

세포 배양액 내의 PGE₂ 양을 측정은 commercial competitive enzyme immuno assay kit를 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 실험하였다.

세포에 형개 추출물을 전처리 하고 100ng/㎖의 LPS(Sigma No. L6636, USA)를 처리한다. 18시간 후 세포 배양액을 얻어 PGE₂ 측정에 사용한다. 배양액을 goat anti-mouse로 coating된 96-well plate에 각각 100㎕씩 loading하고, 여기에 primary antibody solution 50㎕와 PGE₂ conjugate 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 세척완충액으로 4회 세척하고 기질 용액을 200㎕씩 처리하여 5~20분간 반응시킨 후, 50㎕의 정지용 용액(stop solution)을 처리한 후에 450nm에서 흡광도를 측정한다.

배양된 세포에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8을 측정한다. 즉 anti-human TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 capture 단클론 항체를 96 well plate에 각각 2㎍/ml로 코팅하고 4℃에서 12시간 동안 반응시킨다. 코팅 후 비특이성 반응을 막기 위해서 10% FBS를 함유한 PBS (phosphate buffered saline)로 구성된 차단용액(blocking solution)을 첨가하여 37℃에서 2시간 반응한다. 다시 0.05% tween 20을 함유한 PBS인 세척용 완충액(washing buffer)로 4회씩 세척한 후에 표준이 되는 재조합 단백질 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8을 적절한 농도로 계대 희석하여 준비하고, 배양 상등액을 희석하여 각 웰에 100㎕씩 넣어 37℃에서 2시간 반응 시킨다. 다시 세척완충액으로 4회씩 세척한 후 biotinylated anti-human TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8을 차단용액을 이용하여 300 ng/ml의 농도로 희석한 후에 각 웰에 100㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 다시 세척 완충액으로 4회 세척한 후에 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate enzyme을 2.5㎍/ml 농도로 각 웰에 처리한 다음 37℃에서 30분간 반응한 후 4회 세척한다. 기질액을 각 웰에 50㎕씩 가하여 20분간 발색을 유도한 다음 2 N 황산을 이용하여 반응을 멈추고 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8의 단백질 양을 측정한다.

형개 추출물이 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 prostagladin E₂와 전염증성 시토킨(pro-inflammatory cytokine)의 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성을 측정하였다. 경북 약용작물인 형개 추출물 50 ㎍/ml 농도를 처리하여 PGE₂와 시토킨들(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 발현을 측정한 결과를 도 3∼6와 같이 나타내었다.

LPS를 처리한 PGE₂ 저해활성 측정에서 형개 추출물의 저해 활성은 26%로 우수한 저해 활성을 나타내었고, 시토킨들 (TNF-α, IL-1β, IL-6)의 경우에도 탁월한 저해 효과를 나타내었으며, 특히 IL-1β에서 형개 47%로 뛰어난 저해활성 효과를 확인하였다.

실험예 4. 외부자극으로부터의 세포내 색소침착 및 염증관련 단백질 발현 양상 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 외부자극으로부터의 염증관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (16).

염증관련 단백질들인 iNOS, COX-2 단백질의 양을 측정하였다. 각 세포주(cell line)를 이용하여 배양 접시(culture dish)에 배양한 뒤에 시료 처리를 한 다음에 24시간 후에 PBS로 세척한 후 원심분리하여 세포를 수집하고, RIPA buffer(Sigma No. R0278, USA)를 사용하여 세포 용해물 (cell lysate)을 제조한다. 세포 용해물에 함유된 단백질의 양은 BCA(Bicinchoninic acid) kit(Thermo Scientific No. 23225, USA)으로 측정한다.

단백질 20㎍을 10% polyacrylamide를 함유한 SDS-PAGE(Sigma, USA)로 분리하고 PVDF membrane으로 electroblot(GE Healthcare EPS 301, USA) 120 V에서 1시간을 실시하였다. 이어 PVDF membrane을 5% skim milk(Becton and Dickinson Company No. 232100, USA)에서 1시간동안 방치한 뒤에 1차 항체(primary antibody)에서 4℃에서 하룻밤 배양한다. 다시 TBST(Sigma, USA)로 세 번 세척한 뒤 2차 항체(secondary antibody)를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척하고 ECL kit(Amersham Pharmacia #RPN2109D2, Biotech)와 반응시켜 LAS 4000 chemiluinescence detection system (LAS 4000, Fuji, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 및 정량을 하였다.

Raw 264.7 cell에 LPS (1 ㎍/ml)를 사용하여 NO생성을 유도한 후 경북 약용작물 형개 추출물을 50 ㎍/ml농도로 처리하였을 때 COX-2 단백질 발현은 도 8과 같이 낮게 발현되었다. 이상의 결과들을 토대로 형개 추출물이 LPS에 유도된 대식세포에서 염증인자인 NO와 PGE₂ 그리고 이 염증인자들의 합성효소인 iNOS, COX-2, 염증성 cytokines의 과발현을 억제함으로 염증반응을 억제함으로써 염증 예방 물질로 사용될 수 있으리라 기대한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다.

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

Claims (8)

1. 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 피부외용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 형개 추출물은 피부외용 약학조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형임을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 형개는 한국산 형개임을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 염증성 질환은 피부염증 질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
7. 형개 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선을 위한 화장료 조성물.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   

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