KR20110104937A - 방향족 술폰산 화합물을 이용한 신규 클리어 네이티브 전기 영동법 - Google Patents

방향족 술폰산 화합물을 이용한 신규 클리어 네이티브 전기 영동법 Download PDF

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다께시 무라따
소 이와따
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도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
시즈오까껭 고리쯔다이가꾸호징
고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 단백질의 전기 영동용 시약, 상기 시약을 포함하는 전기 영동용 겔/버퍼 조성물, 및 이들을 이용한 단백질의 분리 방법 및 전기 영동용 키트를 제공한다.

Description

방향족 술폰산 화합물을 이용한 신규 클리어 네이티브 전기 영동법{NOVEL CLEAR NATIVE ELECTROPHORESIS METHOD UTILIZING AROMATIC SULFONIC ACID COMPOUND}
본 발명은 주로 전기 영동용 시약, 전기 영동용 조성물, 전기 영동용 키트 및 단백질의 분리 방법에 관한 것이다.
현재, 막 단백질 및 초분자 복합체의 분자량이나 회합 상태를, 천연의 상태나 효소 활성을 유지한 채로 조사하는 방법으로서, 블루 네이티브(Blue-Native) 전기 영동법이 다용되고 있다. 이 방법은 채거(Schagger) 등에 의해 개발되어(비특허문헌 1 참조), 마이너스 전하를 갖는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue, 이하 「CBB」) G250이 단백질에 결합하는 것을 이용하여, 단백질의 토탈의 전하를 마이너스로 치우치게 하고, 미세한 메쉬 구조를 갖는 아크릴아미드 겔 중의 단백질에 전압을 걸어, 분자의 크기에 따라서 분리하는 방법이다. 그러나, 전기 영동용 버퍼가 CBB G250 유래의 청색을 나타내고 있기 때문에, 단백질 시료를 겔에 첨가하는 조작이 불편하다. 또한, 영동 후의 겔은 CBB G250 유래의 청색을 나타내고 있기 때문에, GFP 융합 단백질을 겔 중에서 영동한 경우, GFP를 이용한 형광 검출하는 것에는 적합하지 않았다.
최근 들어, 비티그(Wittig) 등에 의해, 계면 활성제의 1종으로서 마이너스 전하를 갖는 데옥시콜산(DOC)을 이용한 클리어 네이티브(Clear Native) 전기 영동법이 보고되었다(비특허문헌 2 참조). DOC는 무색이기 때문에, 투명한 상태에서 네이티브 전기 영동을 행할 수는 있다. 그러나, 어느 종류의 단백질의 경우에는 천연 상태에서는 있을 수 없는 다량체를 형성하게 되는 등의 문제가 있었다.
Anal. Biochem. 1991 Dec 199(2) 223-231 Mol. Cell Proteomics, 2007 Jul 6(7) 1215-1225
본 발명은 고차 구조나 복합체 구조를 유지한 채로 전체적으로 마이너스 전하를 띤 상태에서 단백질의 영동 분리를 행할 수 있고, 또한 투명한 상태에서 전기 영동을 행할 수 있는, 단백질의 전기 영동용 시약, 전기 영동용 조성물, 및 이들을 이용한 단백질의 분리 방법 및 전기 영동용 키트를 제공하는 것을 주된 과제로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하는 것을 주된 목적으로 하여 예의 검토를 거듭한 결과, 특정한 화합물이 가시광의 파장 영역에 흡수가 거의 없고, 또한 블루 네이티브 전기 영동법과 거의 동일한 전기 영동 패턴을 얻는 것을 가능하게 하는 것을 발견하고, 더욱 예의 검토를 거듭하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기의 사항에 관한 것이다.
항 1. 중성의 전기 영동 완충액 중에서 단백질과 결합하여 분자 전체가 마이너스로 대전된 복합체를 형성할 수 있으며 실질적으로 무색인 적어도 1종의 화합물을 포함하는 전기 영동용 시약.
항 2. 상기 화합물이 적어도 1개의 아릴술폰산 부분을 갖는 항 1에 기재된 전기 영동용 시약.
항 3. 중성의 전기 영동 완충액 중에서 단백질과 결합하여 분자 전체가 마이너스로 대전된 복합체를 형성할 수 있으며 실질적으로 무색인 적어도 1종의 화합물을 포함하고, 상기 화합물이 하기 화학식 (I)로 표시되는 항 1 또는 항 2에 기재된 전기 영동용 시약.
Figure pct00001
(식 중, R은 수소 원자, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 카르복실 또는 NR1R2를 나타내고,
R'는 수소 원자, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 카르복실 또는 NR3R4를 나타내고,
R"는 수소 원자, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 카르복실 또는 NR5R6을 나타내고,
R1, R2, R3, R4, R5, R6은 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 시클로알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타내고,
Ra, Rb, Rc는 동일 또는 상이하며, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 의미하고,
n1, n2, n3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 4의 정수를 나타내고,
Z는 수소 원자, 할로겐 원자, OH, 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, SH, 알킬티오, 알킬, 아미노(NH2), 모노알킬아미노, 디알킬아미노 또는 아실아미노를 나타내되,
다만, 화학식 (I)의 화합물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 SO3H 또는 그의 염을 가짐)
항 4. 하기 화학식 (Ia)로 표시되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약.
Figure pct00002
(식 중, R1, R3, R5는 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 시클로알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타내고,
Ra, Rb, Rc, R2a, R4a, R6a는 동일 또는 상이하며, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 나타내고,
n1, n2, n3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 4의 정수를 나타내고,
m1, m2, m3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 5의 정수를 나타내되,
다만, 화학식 (Ia)의 화합물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 SO3H 또는 그의 염을 가지며, R1, R3, R5,
Figure pct00003
중의 1 내지 6개는 SO3H 또는 그의 염을 치환기로서 갖는 아릴 또는 아르알킬을 나타냄)
항 5. 하기 화학식 (Ib)로 표시되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약.
Figure pct00004
(식 중, R1, R3, R5는 동일 또는 상이하며, 수소 원자, C1 -4 알킬, 치환될 수도 있는 페닐 또는 치환될 수도 있는 벤질을 나타내고,
Ra, Rc는 동일 또는 상이하며, 수소 원자 또는 메틸이고,
R2b, R2c는 한쪽이 수소 원자이며, 다른쪽이 SO2NR9R10, SO3H 또는 그의 염을 나타내고,
R4b, R4c는 한쪽이 수소 원자이며, 다른쪽이 알콕시를 나타내고,
R6b, R6c는 한쪽이 수소 원자이며, 다른쪽이 SO2NR9R10, SO3H 또는 그의 염을 나타내고,
R9, R10은 수소 또는 알킬을 나타내되,
다만, R2b, R2c, R6b, R6c 중 1개 또는 2개는 SO3H 또는 그의 염을 나타냄)
항 6. 하기 화학식 (Ic)로 표시되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약.
Figure pct00005
(식 중, Ra, Rc는 동일 또는 상이하며, 수소 원자 또는 메틸이고,
R2b, R6b는 SO3H 또는 그의 염을 나타냄)
항 7. 전기 영동용 겔과 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약을 포함하는 전기 영동용 겔 조성물.
항 8. 전기 영동용 버퍼와 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약을 포함하는 전기 영동용 버퍼 조성물.
항 9. 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약을 단백질 샘플 및/또는 전기 영동용 버퍼에 첨가하여 단백질의 클리어 네이티브 전기 영동을 행하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리 방법.
항 10. 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약, 항 7에 기재된 전기 영동용 겔 조성물, 항 8에 기재된 전기 영동용 버퍼 조성물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 전기 영동용 키트.
항 11. 하기 화학식 (Ig), (Ih) 중 어느 하나로 표시되는 화합물.
Figure pct00006
(식 중, M은 수소 원자, 수용성의 염을 형성하는 금속 또는 N(R8)4 (R8은 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 알콕시알킬, 히드록시알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타냄)를 나타냄)
본 발명의 전기 영동용 시약 및 조성물에 따르면, 투명한 상태에서 전기 영동을 행할 수 있고, 또한 고차 구조나 복합체 구조를 유지한 채로, 전체적으로 마이너스 전하를 띤 상태에서 단백질의 영동 분리를 행할 수 있다.
본 발명의 전기 영동용 시약은 실질적으로 무색이기 때문에, 전기 영동 후에 탈색을 할 필요가 없고, 직접 은 염색 등에 의해 단백질을 매우 고감도로 검출할 수 있어, 블루 네이티브 전기 영동법보다도 훨씬 고감도인 특징을 갖는다.
도 1은 화합물 (Ig) 및 CBB G250의 가시 흡수 스펙트럼의 측정 결과를 도시한다. 종축은 흡광도(absorbance), 횡축은 파장(단위 nm)을 나타낸다. 도 1의 실선은 0.0167 mg/ml CBB G250 용액의 측정 결과를 도시한다. 도 1의 점선은 1 mg/ml 화합물 (Ig) 용액의 측정 결과를 도시한다.
도 2는 다양한 단백질에 대해서 블루 네이티브 PAGE(이하, 「BN-PAGE」) 및 클리어 네이티브 PAGE(이하, 「CN-PAGE」)를 행하고, 전기 영동 패턴을 대비한 결과를 도시한다. 도 2의 좌측은 BN-PAGE에서의 패턴을 나타낸다. 도 2의 우측은 CN-PAGE에서의 패턴을 나타낸다. 도 2의 횡축의 수치는 단백질의 종류에 따라서 붙인 레인 번호로서, 1: 티로글로불린(Thyroglobulin: 669 kDa), 2: 페리틴(Ferritin: 440 kDa), 3: 알돌라아제(Aldolase: 158 kDa), 4: 콘알부민(Conalbumin: 75 kDa), 5: 오브알부민(Ovalbumin: 43 kDa), 6: 탄산 탈수 효소(Carbonic Anhydrase: 29 kDa), 7: 리보뉴클레아제 A(RNase A: 13.7 kDa), 8: 일산화질소 환원 효소(NOR: 68.5 kDa), 9: 밴드3(Band3: 55 kDa(110 kDa))), 10: 아데노신 수용체 A2a(A2a: 33 kDa)를 나타낸다. 1 내지 7은 가용성 단백질(Soluble proteins)이고, 8 내지 10은 막 단백질(Membrane proteins)이다.
도 3은 단백질 시료와 EGFP와의 융합체에 있어서의 CN-PAGE 후의 형광 검출 및 CBB 염색의 결과를 도시한다. 도 3의 좌측(겔 중 형광(In-gel fluorescence))은 CN-PAGE 후의 겔에 대해서 형광 촬영을 행하여 검출한 결과를 도시한다. 도 3의 우측은 CN-PAGE 후의 겔에 대해서 CBB 염색에 의해 검출한 결과를 도시한다. 레인 1은 마커, 레인 2는 EGFP, 레인 3은 도데실말토시드(DDM)로 가용화한 막 단백질-EGFP 융합체발현 막 분획의 결과를 도시한다.
도 4는 β-갈락토시다아제를 이용하여 BN-PAGE 또는 CN-PAGE를 행하고, 영동 후의 겔 중에서 효소 활성을 검출한 결과를 도시한다. 도 4의 좌측은 BN-PAGE의 결과를 도시한다. 도 4의 우측은 CN-PAGE의 결과를 도시한다.
도 5는 막 단백질(NOR) 및 수용성 단백질(BSA)을 단백질 시료로서, CN-PAGE 후, 은 염색을 행한 결과를 도시한다. 도 5의 (A)는 NOR 시료의 결과를 도시한다. 도 5의 (B)는 BSA 시료의 결과를 도시한다. 도 5의 종축은 분자량(kDa)를 나타낸다. 도 5의 횡축은 전기 영동시킨 단백질의 양에 따라서 붙인 레인의 번호를 나타낸다. 좌측으로부터, M: 마커, 1: 1000 ng, 2: 500 ng, 3: 100 ng, 4: 50 ng, 5: 10 ng, 6: 5 ng, 7: 1 ng, 8: 0.5 ng, 9: 0.1 ng이다.
본 발명에서 사용하는 전기 영동용 시약은 실질적으로 무색의 화합물을 포함하고, 이 화합물은 단백질의 소수성 부분과 결합하는 아릴 부분(aryl moiety)과, 중성의 수용액 중에서 음이온을 형성하는 SO3H 또는 그의 염을 갖는다. 수용액 중에서 상기 화합물을 단백질과 공존시키면 전체로서 음이온성의 복합체를 형성한다.
바람직한 실시 형태에서, 전기 영동용 시약에 포함되는 화합물은 적어도 1개의 아릴술폰산 부분(aryl sulfonate moiety)을 갖는다. 상기 화합물은 또한 적어도 1개의 아릴아미노 부분(aryl amino moiety)을 가질 수 있다.
Figure pct00007
(식 중, Rd, Re는 동일 또는 상이하며, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 나타내고,
R7은 수소 원자, 알킬, 시클로알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타내고,
n4는 0 내지 4의 정수를 나타내고, n5는 0 내지 5의 정수를 나타내고,
M은 수소 원자 또는 수용성의 염을 형성하는 금속, 특히 Na, K, Li, Cs 등의 알칼리 금속, 또는 N(R8)4 (R8은 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 알콕시알킬, 히드록시알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타냄)로 표시되는 4급 암모늄을 나타냄)
또한, 상기는 아릴이 페닐인 아릴술폰산 부분(aryl sulfonate moiety), 아릴아미노 부분(aryl amino moiety)을 예시하고 있지만, 아릴이 나프틸, 플루오레닐, 안트릴, 비페닐릴, 테트라히드로나프틸, 크로마닐, 2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐, 인다닐, 플루오레닐 및 페난트릴 등의 페닐 이외의 기인 아릴술폰산 부분(aryl sulfonate moiety), 아릴아미노 부분(aryl amino moiety)도 당연히 본 발명에 포함된다.
메틸렌디옥시(-O-CH2-O-)는 인접하는 2개의 치환기가 합쳐져서 형성된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 상기 화합물은 화학식 (I)로 표시된다.
Figure pct00008
(식 중, R, R', R", Ra, Rb, Rc, n1, n2, n3 및 Z는 상기에 정의되는 바와 같음)
또한 바람직한 실시 형태에서, 상기 화합물은 화학식 (I')로 표시된다.
Figure pct00009
(식 중, R, R3, R4, R5, R6, Ra, Rb, Rc, n1, n2, n3 및 Z는 상기에 정의되는 바와 같음)
본 명세서에 있어서, 「할로겐 원자」란 불소, 염소, 브롬, 요오드를 의미하고, 불소, 염소, 브롬이 바람직하다.
「알킬」로서는, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데실 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -10 알킬, 바람직하게는 C1 -6 알킬, 보다 바람직하게는 C1-4 알킬을 들 수 있다. 특히 바람직한 알킬은 메틸 또는 에틸이다.
「시클로알킬」로서는, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸 등의 C3 -7 시클로알킬을 들 수 있다.
「히드록시알킬」로서는, 예를 들면, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 히드록시n-프로필, 히드록시이소프로필, 히드록시n-부틸, 히드록시이소부틸, 히드록시 tert-부틸 등의 OH를 1개 갖는 C1 -4 알킬을 들 수 있다.
「알콕시알킬」로서는, 예를 들면, 메톡시메틸, 메톡시에틸, 에톡시메틸, 에톡시에틸 등의 C1 -4 알콕시 C1 -4 알킬을 들 수 있다.
「아릴」로서는, 5 또는 6원의 방향족 탄화수소환을 포함하는 단환 또는 다환계를 의미하고, 구체예로서는 페닐, 나프틸, 플루오레닐, 안트릴, 비페닐릴, 테트라히드로나프틸, 크로마닐, 2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐, 인다닐, 플루오레닐 및 페난트릴을 들 수 있다.
「아르알킬」로서는, 상기한 아릴로 치환된 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1-4 알킬을 의미하고, 구체적으로는 벤질, 1-페닐에틸, 2-페닐에틸, 1-페닐프로필, 2-페닐프로필, 3-페닐프로필, 나프틸메틸 등을 들 수 있다.
「알케닐」로서는, 이중 결합을 적어도 1개 갖는 것을 의미하고, 예를 들면 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 2-메틸-2-프로페닐, 이소프로페닐, 1-, 2- 또는 3-부테닐, 2-, 3- 또는 4-펜테닐, 2-메틸-2-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 5-헥세닐, 1-시클로펜테닐, 1-시클로헥세닐, 3-메틸-3-부테닐 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C2-10 알케닐, 바람직하게는 C2 -6 알케닐, 보다 바람직하게는 C2 -4 알케닐을 들 수 있다.
「알키닐」로서는, 3중 결합을 적어도 1개 갖는 것을 의미하고, 예를 들면 에티닐, 1- 또는 2-프로피닐, 1-, 2- 또는 3-부티닐, 1-메틸-2-프로피닐 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C2 -10 알키닐, 바람직하게는 C2 -6 알키닐, 보다 바람직하게는 C2 -4 알키닐을 들 수 있다.
「알콕시」로서는, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 이소펜틸옥시 및 헥실옥시 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -6 알콕시를 들 수 있다.
「모노알킬아미노」로서는, 예를 들면 메틸아미노, 에틸아미노, n-프로필아미노, 이소프로필아미노, n-부틸아미노, 이소부틸아미노, tert-부틸아미노, n-펜틸아미노, 이소펜틸아미노, 헥실아미노 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 모노 C1 -6 알킬아미노를 들 수 있다.
「디알킬아미노」로서는, 예를 들면 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디n-프로필아미노, 디이소프로필아미노, 디n-부틸아미노, 디이소부틸아미노, 디tert-부틸아미노, 디n-펜틸아미노, 디이소펜틸아미노, 디헥실아미노 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 디C1 -6 알킬아미노를 들 수 있다.
「알콕시카르보닐아미노」로서는, 메톡시카르보닐아미노, 에톡시카르보닐아미노, 프로폭시카르보닐아미노, 이소프로폭시카르보닐아미노, 부톡시카르보닐아미노, 이소부톡시카르보닐아미노, tert-부톡시카르보닐아미노, 펜틸옥시카르보닐아미노, 이소펜틸옥시카르보닐아미노 및 헥실옥시카르보닐아미노 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -6 알콕시카르보닐아미노를 들 수 있다.
「모노알킬카르바모일」로서는, 메틸카르바모일, 에틸카르바모일, n-프로필카르바모일, 이소프로필카르바모일, n-부틸카르바모일, 이소부틸카르바모일, tert-부틸카르바모일, n-펜틸카르바모일, 이소펜틸카르바모일, 헥실카르바모일 등의 C1 -6 알킬모노카르바모일을 들 수 있다.
「디알킬카르바모일」로서는, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 디n-프로필카르바모일, 디이소프로필카르바모일, 디n-부틸카르바모일, 디이소부틸카르바모일, 디tert-부틸카르바모일, 디n-펜틸카르바모일, 디이소펜틸카르바모일, 디헥실카르바모일 등의 디 C1 -6 알킬카르바모일을 들 수 있다.
「모노알킬술파모일」로서는, 메틸술파모일, 에틸술파모일, n-프로필술파모일, 이소프로필술파모일, n-부틸술파모일, 이소부틸술파모일, tert-부틸술파모일, n-펜틸술파모일, 이소펜틸술파모일, 헥실술파모일 등의 C1 -6 알킬모노술파모일을 들 수 있다.
「디알킬술파모일」로서는, 디메틸술파모일, 디에틸술파모일, 디n-프로필술파모일, 디이소프로필술파모일, 디n-부틸술파모일, 디이소부틸술파모일, 디tert-부틸술파모일, 디n-펜틸술파모일, 디이소펜틸술파모일, 디헥실술파모일 등의 디 C1 -6 알킬술파모일을 들 수 있다.
「알킬술포닐아미노」로서는, 메틸술포닐아미노, 에틸술포닐아미노, n-프로필술포닐아미노, 이소프로필술포닐아미노, n-부틸술포닐아미노, 이소부틸술포닐아미노, tert-부틸술포닐아미노, n-펜틸술포닐아미노, 이소펜틸술포닐아미노, 헥실술포닐아미노 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -6 알킬술포닐아미노를 들 수 있다.
「알콕시카르보닐」로서는, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 프로폭시카르보닐, 이소프로폭시카르보닐, 부톡시카르보닐, 이소부톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 펜틸옥시카르보닐, 이소펜틸옥시카르보닐 및 헥실옥시카르보닐 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -6 알콕시카르보닐을 들 수 있다.
「모노아릴아미노」로서는, 페닐아미노, 나프틸아미노, 플루오레닐아미노, 안트릴아미노, 비페닐릴아미노, 테트라히드로나프틸아미노, 크로마닐아미노, 2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐아미노, 인다닐아미노, 플루오레닐아미노 및 페난트릴아미노를 들 수 있다.
「디아릴아미노」로서는, 디페닐아미노, 디나프틸아미노, 디플루오레닐아미노, 디안트릴아미노, 디비페닐릴아미노, 디테트라히드로나프틸아미노, 디크로마닐아미노, 디(2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐)아미노, 디인다닐아미노, 디플루오레닐아미노 및 디페난트릴아미노를 들 수 있다.
「모노아르알킬아미노」로서는, 벤질아미노, 1-페닐에틸아미노, 2-페닐에틸아미노, 1-페닐프로필아미노, 2-페닐프로필아미노, 3-페닐프로필아미노, 나프틸메틸아미노를 들 수 있다.
「디아르알킬아미노」로서는, 디벤질아미노, 디페네틸아미노, 디프로필아미노, 디나프틸메틸아미노를 들 수 있다.
「알킬카르보닐옥시」로서는, 메틸카르보닐옥시, 에틸카르보닐옥시, n-프로필카르보닐옥시, 이소프로필카르보닐옥시, n-부틸카르보닐옥시, 이소부틸카르보닐옥시, tert-부틸카르보닐옥시, n-펜틸카르보닐옥시, 이소펜틸카르보닐옥시, 헥실카르보닐옥시 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -6 알킬카르보닐옥시를 들 수 있다.
「아릴카르보닐옥시」로서는, 페닐카르보닐옥시, 나프틸카르보닐옥시, 플루오레닐카르보닐옥시, 안트릴카르보닐옥시, 비페닐릴카르보닐옥시, 테트라히드로나프틸카르보닐옥시, 크로마닐카르보닐옥시, 2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐카르보닐옥시, 인다닐카르보닐옥시, 플루오레닐카르보닐옥시 및 페난트릴카르보닐옥시를 들 수 있다.
「아릴옥시」로서는, 페닐옥시, 나프틸옥시, 플루오레닐옥시, 안트릴옥시, 비페닐릴옥시, 테트라히드로나프틸옥시, 크로마닐옥시, 2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐옥시, 인다닐옥시, 플루오레닐옥시 및 페난트릴옥시를 들 수 있다.
「아실아미노」로서는, 포르밀아미노, 아세틸아미노, 프로피오닐아미노, 부티릴아미노 등의 C1 -6 알카노일아미노, 벤조일아미노 등의 아릴카르보닐아미노를 들 수 있다.
알킬카르보닐옥시의 구체예로서는 메틸카르보닐옥시, 에틸카르보닐옥시, n-프로필카르보닐옥시, 이소프로필카르보닐옥시, n-부틸카르보닐옥시, 이소부틸카르보닐옥시, tert-부틸카르보닐옥시, n-펜틸카르보닐옥시, 이소펜틸카르보닐옥시, 헥실카르보닐옥시 등의 C1 -6 알킬카르보닐옥시를 들 수 있다.
아릴카르보닐옥시의 구체예로서는 페닐카르보닐옥시, 나프틸카르보닐옥시, 플루오레닐카르보닐옥시, 안트릴카르보닐옥시, 비페닐릴카르보닐옥시, 테트라히드로나프틸카르보닐옥시, 크로마닐카르보닐옥시, 2,3-디히드로-1,4-디옥사나프탈레닐카르보닐옥시, 인다닐카르보닐옥시, 플루오레닐카르보닐옥시 및 페난트릴카르보닐옥시를 들 수 있다.
알킬티오로서는, 메틸티오, 에틸티오, n-프로필티오, 이소프로필티오, n-부틸티오, 이소부틸티오, tert-부틸티오, n-펜틸티오, 이소펜틸티오, 헥실티오 등의 직쇄상, 분지쇄상 또는 환상의 C1 -6 알킬티오를 들 수 있다.
치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬의 치환기로서는, 할로겐 원자, 알킬, 알콕시, SO3H 또는 그의 염, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 들 수 있고, 이들 치환기를 1 내지 4개, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개가질 수도 있다.
n1, n2, n3, m1, m2, m3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 4, 바람직하게는 0 내지 3, 보다 바람직하게는 0, 1 또는 2의 정수를 나타낸다.
R1, R2, R3, R4, R5, R6 중, 1 내지 6개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 1 내지 2개는 SO3H 또는 그의 염을 치환기로서 갖는 아릴 또는 아르알킬을 나타낸다.
SO3H의 염으로서는, SO3H의 수용성염이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 SO3M(M은 수소 원자 또는 수용성의 염을 형성하는 금속, 특히 Na, K, Li, Cs 등의 알칼리 금속, 또는 N(R8)4 (R8은 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 알콕시알킬, 히드록시알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타냄)로 표시되는 암모늄임)으로 표시되는 술폰산염을 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 적어도 1개의 SO3H(술포기) 또는 그의 염을 치환기로서 갖는다. 이것은, 술포기에 의해 본 발명의 화합물이 단백질과 결합하여 전체의 전하를 음성으로 하여 전기 영동하기 때문이다. 종래의 블루 네이티브 전기 영동법에서 이용되고 있는 CBB G250, CBB R250 등의 색소는 술포기를 2개 갖지만, 암모늄 양이온을 분자 내에 갖기 때문에 분자 전체로서 1가의 마이너스 전하를 갖는다. 본 발명의 화합물은 분자 전체로서 적어도 1가의 마이너스 전하를 갖는다. 본 발명의 화합물이 분자 내에 암모늄 이온 등의 양이온을 갖지 않는 경우, SO3H 또는 그의 염(1 내지 6개)은 2개 이상일 수도 있지만, 1개라도 충분하다. CBB G250, CBB R250을 환원하여 제조되는, 본 발명의 화합물 (Ig), (Ih)는 2개의 SO3H 또는 그의 염을 갖고, 수용액 중에서 2가의 음이온으로서 존재한다. 이와 같이, 2가 또는 다가의 음이온으로서 존재하는 경우, 강한 마이너스 전하 때문에 단백질의 종류 또는 전기 영동의 조건에 따라서는 서브 유닛의 해리나 삼차 구조의 부분적인 파괴가 발생할 수 있다. 이 때문에, 적어도 1개의 술포기를, 전하를 갖지 않는 관능기, 예를 들면 수소 원자, 수산기(OH), 술파모일(-SO2NH2), 모노 또는 디알킬술파모일 등으로 바꿈으로써 마이너스 전하를 1가로 하여, 단백질에 대한 작용을 마일드하게 하여 단백질의 구조를 유지하도록 할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 화합물은 (Ig), (Ih) 외에 화합물 (Ii), (Ij), (Ik), (Il)을 들 수 있다.
Figure pct00010
(식 중, R9, R10은 동일 또는 상이하며, 수소 원자 또는 알킬을 나타냄)
CBB 등의 복수의 술포기를 갖는 색소 화합물을 환원하여 무색의 본 발명의 화합물로 변환하는 경우, 예를 들면 1개의 술포기가 치환될 수도 있는 술폰아미드 등의 전하를 갖지 않고 수용성/극성을 갖는 다른 기로 치환함으로써 원래의 색소 화합물과 동일한 단백질과의 결합성, 수용성 등을 유지하면서, 색소 화합물과 동일한 전하를 갖는 무색 화합물로 유도할 수 있다.
상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물은 일반적인 화학 합성 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 구체적인 합성법을 이하의 반응식 1에 예시한다.
<반응식 1>
Figure pct00011
Figure pct00012
(식 중, R, R', R", R1, R2, R3, R4, R5, R6, Ra, Rb, Rc, n1, n2, n3 및 Z는 상기에 정의되는 바와 같음)
본 발명의 화합물 (I)은 반응식 1의 (a1)에 표시된 바와 같이, 알데히드 (1)과 화합물 (2), 화합물 (3)을 반응시킴으로써, 1단계로 합성할 수 있다.
반응은 화합물 (1) 1몰에 대하여, 화합물 (2)과 화합물 (3)을 각각 1몰 정도, 황산을 촉매량으로부터 과잉량 사용하여, 용매의 존재 하, 60 내지 150℃에서 5 내지 96시간 반응시킴으로써 유리하게 진행한다. 화합물 (2)과 화합물 (3)은 동일한 것이 바람직하다. 화합물 (2)과 화합물 (3)이 상이한 경우, 알데히드 (1)에 대하여 화합물 (2)이 2분자 반응한 화합물, 화합물 (3)이 2분자 반응한 화합물, 화합물 (2)과 화합물 (3)이 1분자씩 반응한 화합물이 생길 수 있고, 이들을 컬럼 크로마토그래피, 재결정, 용매 추출, 분취 HPLC 등의 통상의 분리 수단에 의해 분리함으로써 화학식 (I)의 화합물이 각각 얻어진다. 용매로서는, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올, 테트라히드로푸란, 디옥산, 1,2-디메톡시에탄, 디글라임 등의 에테르 등을 들 수 있다.
본 발명의 Z=H의 화합물 (I")은 반응식 1의 (a2)에 표시된 바와 같이, 알데히드 (1a)와 화합물 (2), 화합물 (3)을 반응시킴으로써, 1단계로 합성할 수 있고, 이 화합물에 1) 할로겐화(Halogenation) 및 필요에 따라서 2) 할로겐 원자의 다른 관능기로의 치환 반응(Substitution)에 의해 수소 원자 이외의 Z를 도입함으로써 화학식 (I)의 화합물을 얻을 수 있다. 할로겐화는 F2, Cl2, Br2, I2 등의 할로겐 분자, N-브로모숙신이미드, N-클로로숙신이미드 등의 할로겐화제와 반응시킴으로써 실시된다. Z=할로겐 원자의 화합물과, 수산화나트륨 등의 알칼리 금속수산화물, (알킬)-OH, (알킬)-COOH, (아릴)-COOH, (아릴)-OH, (알킬)-SH, 암모니아, (알킬)-NH2, (알킬)2-NH 등의 화합물과, 필요에 따라서 트리에틸아민, 피리딘 등의 염기의 존재 하에 반응시킴으로써, Z=OH, 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, SH, 알킬티오, 알킬, 아미노(NH2), 모노알킬아미노, 디알킬아미노의 화합물을 얻을 수 있다. Z=아미노기의 화합물과 아실클로라이드 등의 산무수물을 반응시킴으로써, Z=아실아미노의 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물 (Id)는 반응식 1의 (b)에 표시된 바와 같이, 알데히드 (1b)와 화합물 (2b), 화합물 (3b)를 용매 및 황산의 존재 하에 반응시킴으로써, 마찬가지로 1단계로 합성할 수 있다. 반응은 알데히드 (1b) 1몰에 대하여, 화합물 (2b)과 화합물 (3b)를 각각 1몰 정도, 황산을 촉매량으로부터 과잉량 사용하여, 용매의 존재 하, 60 내지 150℃에서 5 내지 96시간 반응시킴으로써 유리하게 진행한다.
다음으로, 화합물 (Id)는 진한 황산, 발연황산 등의 술폰화제의 존재 하에 실온으로부터 40℃ 정도의 온도에서 1 내지 48시간 반응시킴으로써 술폰산 화합물 (Ie)로 유도할 수 있다. 다음으로, 아세트산, HCl의 존재 하에 MnO2로 화합물 (Ie)를 산화함으로써 화합물 (IIa)로 하고, 이것을 HNR1R2와 반응시켜 화학식 (IIb)의 화합물로 한다. 화합물 (IIb)를 또한 NaCNBH3 등의 환원제로 환원함으로써 화합물 (If)를 얻을 수 있다.
화합물 (If)는 상기와 마찬가지로 하여 Z기를 도입함으로써 화합물 (If')로 변환할 수 있다. 화합물 (Ie)는 아세트산, HCl을 용매로서 이용하여, 당량으로부터 과잉량의 MnO2와 실온 정도의 온도에서 1 내지 24시간 반응시킴으로써 화합물 (IIa)를 얻을 수 있다. 화합물 (IIa) 1몰을 메탄올 등의 알코올, 염화메틸렌 등의 염소화탄화수소 등의 용매 중, 1몰로부터 과잉량의 HNR1R2와 반응시킴으로써 화합물 (IIb)를 얻을 수 있다. 화합물 (IIb) 1몰에 대하여, 메탄올 등의 알코올 중, 1당량으로부터 과잉량의 NaCNBH3 등의 환원제로 환원함으로써 화합물 (If)를 얻을 수 있다.
또는, 화합물 (IIa), (IIb)나, CBB계의 염료를 포함하는 하기의 부분 구조
Figure pct00013
(식 중, Ar은 동일 또는 상이하며, 치환될 수도 있는 아릴기를 나타내고, R5, R6은 상기에 정의되는 바와 같고, Rf는 동일 또는 상이하며, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 나타내고, n4는 0 내지 4의 정수를 나타내고, Ar, R5, R6, Rf는 전체로서 1 내지 6개의 SO3H 또는 그의 염을 갖는 것이 바람직함)
를 갖는 산성 염료(술포기 또는 그의 염을 1 내지 6개 갖는 염료)를 원료로 하고, 이것을 필요에 따라서 유도체화하고, NaCNBH3 등의 환원제로 환원함으로써, 실질적으로 무색인 이하의 부분 구조
Figure pct00014
(식 중, Ar, R5, R6, Rf, n4는 상기에 정의되는 바와 같음)
를 갖는 본 발명의 화합물을 얻을 수 있다.
또는, 하기의 화합물
Figure pct00015
(식 중, Ra, Rb, n1, n2는 상기에 정의되는 바와 같고, Rf, Rg는 한쪽이 수소 원자이고 다른쪽이 치환될 수도 있는 아릴술폰산을 나타내거나, 또는 Rf와 Rg가 합쳐져서 술포기를 갖는 방향족 또는 헤테로 방향족기를 나타냄)을 본 발명의 전기 영동용 시약으로서 사용할 수도 있다. 치환될 수도 있는 아릴술폰산으로서는, 치환될 수도 있는 벤젠술폰산, 치환될 수도 있는 나프탈렌술폰산, 치환될 수도 있는 안트라센술폰산, 치환될 수도 있는 페난트렌술폰산, 치환될 수도 있는 플루오렌술폰산, 치환될 수도 있는 인단술폰산, 치환될 수도 있는 인덴술폰산, 치환될 수도 있는 테트랄린술폰산, 치환될 수도 있는 아세나프텐술폰산을 들 수 있다. 술포기를 갖는 치환될 수도 있는 방향족기로서는, 술포기를 갖는 치환될 수도 있는 (인덴, 인단, 테트랄린, 플루오렌)을 들 수 있다. 술포기를 갖는 치환될 수도 있는 헤테로 방향족기로서는, 술포기를 갖는 치환될 수도 있는 (벤조푸란, 벤조피란, 크산텐, 크로멘, 이소벤조푸라논, 인돌린, 이소인돌린)을 들 수 있다. 구체적인 화합물을 이하에 나타내었다.
Figure pct00016
(식 중, Ra, Rb, n1, n2, M은 상기에 정의되는 바와 같고, Rh, Ri는 동일 또는 상이하며, 술포기(SO3H) 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 나타내고, n5, n6은 각각 0 내지 4의 정수를 나타냄)
환원에 의해 본 발명의 화합물이 얻어지는 산성 염료로서는, CBB R150, CBB G250, CBB R250, CBB R350이 바람직하다.
예를 들면, 화학식 (Ig), (Ih)로 표시되는 화합물은 시판되고 있는 CBB G250 또는 CBB R250을 통상법에 따라서 환원함으로써 얻을 수 있다. 화학식 (Ia)로 표시되는 화합물은 CBB G250 또는 CBB R250와 동일한 합성법에 의해 CBB 화합물 (IIc)를 합성하고, 이것을 환원제로 환원함으로써 용이하게 얻을 수 있다(반응식 2 참조).
<반응식 2>
Figure pct00017
(식 중, R1, R3, R5, Ra, Rb, Rc, R2a, R4a, R6a, n1, n2, n3, m1, m2, m3은 상기에 정의되는 바와 같음)
환원은 용매 중, 시아노수소화붕소나트륨, 수소화붕소나트륨, LiAlH4 등의 환원제의 존재 하에서 행할 수 있다. 용매로서는, 메탄올, 에탄올 등의 알코올을 들 수 있다. 환원 반응은 화학식 (IIc)의 화합물 1몰에 대하여, 환원제를 1몰로부터 과잉량 사용하고, 0℃ 내지 용매의 비등하는 온도에서 30분 내지 24시간 반응시킴으로써 유리하게 진행한다.
본 발명의 바람직한 화합물의 구조를 이하에 나타내었다.
Figure pct00018
(식 중, M은 수소 원자 또는 수용성의 염을 나타냄)
본 발명의 화합물 (I)은 단백질 결합능을 갖는다. 한편에, 화합물 (I)은 가시광의 흡수를 거의 나타내지 않기 때문에, 거의 무색이다. 이들 성질로부터, 염기성의 등전점을 갖는 단백질이나 막 단백질 등의 단백질에 있어서도 가시광 흡수를 부가하지 않고 마이너스 전하를 부여하는 것이 가능하다.
또한, 화합물 (I)은 물에의 용해도가 높고, 취급이 용이하다.
또한, SDS 등의 단백질 변성 작용이 강한 계면 활성제와 달리, 단백질의 분자 표면에 비교적 약하게 결합하기 때문에, 단백질의 고차 구조나 다량체 단백질의 회합 상태를 변화시키는 일이 없다.
이러한 특성으로부터, 화합물 (I)은 단백질을 천연의 상태에서 전기 영동할 수 있고, 또한 전기 영동 후의 겔을 무색 투명으로 하는 전기 영동용 시약(클리어 네이티브 전기 영동용 시약)으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 전기 영동용 시약은 적어도 1종의 화합물 (I)을 포함할 수도 있고, 화합물 (I)을 전기 영동용 겔에 배합한 전기 영동용 겔 조성물, 전기 영동용 버퍼(캐소드 버퍼, 애노드 버퍼), 겔 제작용 버퍼, 샘플 버퍼 등에 화합물 (I)을 배합한 전기 영동용 버퍼 조성물일 수도 있다.
전기 영동용 겔로서는, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔, 아가로스 겔, 덱스트란 겔 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명은 전기 영동용 겔이 폴리아크릴아미드 겔인 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 바람직하게 이용된다.
겔은 일정 농도 겔일 수도 있고, 농도 구배 겔일 수도 있다.
예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔의 경우, 4-16％의 농도 구배 겔이나 5-20％ 농도 구배 겔, 또는 8％의 일정 농도 겔이나 12％의 일정 농도 겔을 사용할 수 있다. 일반적으로는 일정 농도 겔보다는 농도 구배 겔 쪽이 밴드가 샤프하다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「％」는 특별한 언급이 없는 한 「w/v(％)」를 의미한다.
전기 영동용 버퍼(샘플 버퍼)로서는, 공지된 블루 네이티브 전기 영동에 있어서의 샘플 버퍼와 동일한 것을 사용할 수 있지만, 통상, pH가 6 내지 8 정도이고, 염 농도가 0.3 M 이하 정도인 것이 이용된다. 예를 들면, 100 mM 이미다졸 pH 7.0, 100 mM NaCl, 1％ 도데실말토시드, 20％ 글리세롤, 1％ 화합물 (I)의 조성의 것, 또는 20 mM 헤페스(Hepes) pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1％ 도데실말토시드, 20％ 글리세롤, 0.1％ 화합물 (I)의 조성의 것 등을 사용할 수 있다. 전기 영동용 버퍼(캐소드 버퍼, 애노드 버퍼), 겔 제작용 버퍼도 마찬가지로 공지된 블루 네이티브 전기 영동에 사용하는 버퍼를 그대로 사용할 수 있다. 예를 들면 음극 버퍼로서는 50 mM 트리신(Tricine), 7.5 mM 이미다졸(pH 7.0), 0.02％ 화합물 (I), 양극 버퍼로서는 25 mM 이미다졸(pH 7.0) 등을 들 수 있다.
본 발명의 시약에는, 단백질의 용해성의 향상이나 안정화 등 목적에 따라서 다른 성분을 첨가할 수도 있다.
다른 성분으로서는, 예를 들면, 가용화제나 디술피드 결합 환원 시약 등을 들 수 있다. 가용화제로서는, n-도데실-β-D-말토시드(DDM), 디기토닌 등을 들 수 있다. 이들 가용화제는 화합물 (I)과 단백질과의 결합을 저해하지 않고 용해성을 높일 수 있다. 또한, 디술피드 결합 환원 시약으로서는, 디티오트레이톨이나 2-머캅토에탄올 등을 들 수 있다.
본 발명의 단백질의 분리 방법은 상기 전기 영동용 시약 또는 전기 영동용 조성물을 이용하여 전기 영동함으로써 단백질을 분리하는 방법이다.
본 발명의 전기 영동용 시약 또는 조성물에 포함되는 화합물 (I)이 복합체나 단백질의 고차 구조를 부수지 않고 단백질에 결합하고, 분자 전체를 마이너스로 대전하고, 단백질을 천연의 구조를 유지한 상태에서 양극 방향으로 영동하여, 단백질을 분리하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 분리 방법에 있어서, 대상이 되는 단백질의 시료(검체)는 해석 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 단백질의 종류로서는, 효소, 막 단백질, 항체 등을 들 수 있다. 복합체를 형성한 단백질일 수도 있다.
또한 단백질의 분자량도 해석 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 통상 20,000 내지 1,500,000 달톤 정도, 특히, 50,000 내지 1,000,000 달톤 정도이다.
또한, 시료는 단백질의 정제 용액일 수도 있고, 또한 세포 파쇄액, 세포막 가용화액 등일 수도 있다.
또한, 시료는 1종의 단백질을 포함하는 것일 수도 있고, 2종 이상의 단백질을 포함하는 것일 수도 있다. 예를 들면, 상호 작용할 것이라고 생각되는 2종 이상의 단백질을 함유하는 용액을 시료로 할 수도 있다.
또한, 시료는 전기 영동하기 전에 전처리를 행할 수도 있다. 전처리로서는, 원심 조작이나 필터 여과에 의해 큰 응집체를 제거하는 조작이나, SYPRO 오렌지 등의 단백질 형광 표지화 처리 등을 들 수 있다.
상기 시료를 본 발명의 전기 영동용 시약 또는 조성물을 이용하여 전기 영동용 샘플로 제조한다.
샘플의 제조는 공지된 방법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 화합물 (I)과 샘플 버퍼를 포함하는 버퍼 조성물에 상기 단백질 시료를 혼합하여 샘플을 제조할 수도 있다. 또한, 단백질 시료를 가용화시킨 버퍼에 화합물 (I)을 포함하는 전기 영동용 시약을 첨가하고, 또한 필요에 따라서 글리세롤 등의 다른 성분을 첨가하여 샘플을 제조할 수도 있다.
샘플 중의 단백질 농도는 전기 영동 후의 염색 방법이나 검출 방법에 따라서 다르고 일의적으로 설정할 수 없지만, CBB 염색에 의해 검출하는 경우, 통상 0.5 내지 20 μg/well 정도, 특히, 1 내지 10 μg/well 정도이다. 또한 형광 단백질 융합체를 제작하여, 단백질의 형광을 검출하는 경우, 통상 0.05 μg 내지 1 μg/well, 특히 0.1 내지 0.5 μg/well 정도이다. 또한, 은 염색을 행하여 검출하는 경우, 통상 0.5 내지 100 ng/well, 특히 5 내지 50 ng/well 정도이다. 또한, 이들 농도는 1 well당의 용량을 20 μL 정도로서 나타내고 있다.
샘플 중의 화합물 (I)의 농도도 검출 방법 등에 따라서 적절히 설정되는데, 통상 0.02 내지 0.5％ 정도, 특히 0.05 내지 0.25％ 정도이다.
상기한 바와 같이 제조한 전기 영동용 샘플을 범용의 전기 영동용 장치를 이용하여 겔에 어플라이하고, 전기 영동시킴으로써, 단백질의 분리를 행할 수 있다.
전기 영동 장치로서는, 단백질의 전기 영동용으로서 공지된 것을 적절하게 사용할 수 있고, 예를 들면, 전기 영동조, 전기 영동용 유리판, 버퍼조, 스페이서, 콤(comb), 클립, 파워 서플라이, 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump) 등을 포함하는 일반적인 것을 사용할 수 있다.
전기 영동용 버퍼는 공지된 블루 네이티브 전기 영동에 의한 전기 영동에서 이용되고 있는 버퍼와 동일한 것을 사용할 수 있다.
예를 들면, 전기 영동용 버퍼로서는, 트리스-글리신 버퍼, 이미다졸-트리신 버퍼, 비스트리스-트리신 버퍼 등을 사용할 수 있다. 양극측과 음극측에서는 서로 다른 조성의 것을 이용한다.
구체적으로, 트리스-글리신 버퍼로서는,
캐소드 버퍼: 25 mM 트리스베이스, 192 mM 글리신, pH 8.5
애노드 버퍼: 25 mM 트리스베이스, 192 mM 글리신, pH 8.5
의 조성의 것을 들 수 있다.
이미다졸-트리신 버퍼로서는,
캐소드 버퍼: 7.5 mM 이미다졸, 50 mM 트리신, pH 7.0
애노드 버퍼: 25 mM 이미다졸, pH 7.0
의 조성의 것을 들 수 있다.
비스트리스-트리신 버퍼로서는,
캐소드 버퍼: 50 mM 비스-트리스, 50 mM 트리신, pH 6.8
애노드 버퍼: 50 mM 비스-트리스, 50 mM 트리신, pH 6.8
의 조성의 것을 들 수 있다.
각각의 캐소드 버퍼 중에는, 화합물 (I)을 통상 0.002 내지 0.02％ 정도, 특히 0.004 내지 0.01％ 정도 함유시킨다.
상기 이외의 전기 영동 조건도, 단백질이 천연의 상태를 유지한 채로 전기 영동할 수 있는 조건이면 특별히 한정되지 않으며, 시료의 종류나 해석의 목적 등에 따라서 적절하게 설정할 수 있다.
온도도 단백질의 종류 등에 따라서 적절하게 설정할 수 있는데, 일반적으로 낮은 온도에서 단백질은 보다 안정적으로 된다는 점에서, 통상은 4℃ 정도에서 전기 영동을 행한다.
전기 영동에 의해 샘플 중의 단백질은 천연의 상태를 유지한 채로 양극으로 당겨지고, 분자의 크기에 따라서 단백질의 분리가 행하여진다.
전기 영동 후에는, 단백질 밴드를 고정화하고 가시화하여, 단백질의 천연 상태에서의 크기나 순도, 상호 작용 등의 해석을 행할 수 있다.
전기 영동 후의 염색법에서는, 통상의 CBB 염색에 추가로, 은 염색이나 웨스턴 블로팅도 사용할 수 있다. 이에 따라, 수 나노그램 레벨의 미량의 시료에 있어서도, 단백질의 크기 또는 회합 상태 등을 높은 정밀도로 알 수 있다. 본 발명의 클리어 네이티브 전기 영동은 매우 고감도인 특징을 갖는다.
또한, 화합물 (I)을 이용한 전기 영동 후의 겔은 투명하기 때문에, 화합물 (I)의 세정을 행하지 않고 은 염색을 행할 수 있다.
또한, 화합물 (I)을 이용한 전기 영동 후의 겔은 투명하다는 점에서, 전기 영동 직후에 단백질에서 유래되는 발색 또는 형광을 검출할 수 있다. 예를 들면, GFP 등의 형광 단백질과 연구 대상이 되는 단백질과의 융합 단백질을 적절한 발현숙주에 의해 발현시키고, 키메라 형광 단백질을 포함하는 세포 파쇄 조추출액을 전기 영동하여, 정제하지 않고, 발현량, 회합 상태를 조사할 수 있다. 또한, 그대로 발색을 수반하는 효소 활성 측정을 행할 수도 있다. 발색을 수반하는 효소 활성 측정으로서는, 예를 들면, ATP 가수분해 반응, 퍼옥시다아제 반응, 갈락토시다아제 반응, 탈수소 효소 반응 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물 (I)을 이용한 전기 영동법과, SDS-PAGE 등의 다른 전기 영동 분리와 조합한 2차원 전기 영동도 가능하다. 예를 들면, 일차원째에서는, 본 발명의 화합물 (I)을 행하여 복합체를 형성한 상태에서 전기 영동을 행하고, 이차원째는 SDS-PAGE를 행하여 해리한 상태에서 전기 영동을 행하여, 복합체의 고차 구조와 폴리펩티드쇄에 관한 분석을 할 수 있다.
본 발명의 전기 영동용 시약 및 조성물을 필요에 따라서 각종 시약이나 전기 영동용 장치와 조합함으로써 전기 영동용 키트로 할 수도 있다.
예를 들면, 키트에는 상기 본 발명의 전기 영동용 시약, 전기 영동용 버퍼 조성물, 전기 영동용 겔 조성물 이외에, 분자량 마커, 발색 시약, 블로팅 버퍼, 블로팅막 등의 1종 또는 2종 이상을 포함시킬 수 있다.
또한, 키트에는, 전기 영동조, 전기 영동용 유리판, 버퍼조, 스페이서, 콤, 클립, 파워 서플라이, 또는 페리스탈틱 펌프 등의 일반적인 전기 영동용 장치 또는 부품을 1종 또는 2종 이상 구비하게 할 수도 있다.
본 발명의 전기 영동용 시약 및 조성물, 및 단백질의 분리 방법 및 전기 영동용 키트에는, 단백질의 전기 영동, 특히, 네이티브 전기 영동에 관한 공지된 기술을 필요에 따라서 부가할 수 있는 것이다.
본 발명에 따르면, 전기 영동 후의 겔이 무색 투명이기 때문에, 겔 중에 포함되는 유색 시약의 세정을 행하지 않고 은 염색이나 웨스턴 블로팅에 의한 검출이 가능하다.
또한, 전기 영동 직후의 겔이 투명하기 때문에, 단백질에서 유래되는 발색이나 형광의 검출을 그대로 행할 수 있다. 이에 따라, 조질 시료 중의 미량인 단백질이어도, 높은 정밀도로 해석을 행할 수 있다. 예를 들면, 대상이 되는 단백질을 GFP와의 융합체로 하고, GFP의 형광을 관찰함으로써, 전기 영동 직후에 그 회합 상태나 분자량을 높은 정밀도로 해석할 수 있다. 또한, 활성을 유지한 상태에서 전기 영동된 단백질의 효소 활성을 전기 영동 직후에 발색 반응에 의해 측정할 수도 있다.
또한, 캐소드 버퍼를 무색 투명의 것으로 할 수 있기 때문에, 샘플 웰에 단백질 시료가 확실히 로드되어 있는 가를 용이하게 확인할 수 있어, 샘플의 취급이나 전기 영동의 조작도 간편해진다.
이와 같이, 본 발명은 천연의 상태나 효소 활성을 유지한 채로의 상태의 단백질을, 간편하게 또한 높은 정밀도로 해석하는 수법을 제공하는 것으로서, 중요성이 높아지는 막 단백질이나 초분자 복합체 등의 해석 내지 그 응용 기술의 발전에 크게 기여하는 것이다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 자세히 설명하는데, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에서, 블루 네이티브 PAGE를 「BN-PAGE」라 하고, 클리어 네이티브 PAGE를 「CN-PAGE」라 한다.
또한, 이하에서는, 폴리아크릴아미드 전기 영동(PAGE)의 결과를 나타내지 만, 폴리아크릴아미드 이외의 전기 영동에 대하여 본 발명이 유효한 것은 물론이다.
실시예 1
1. 화학식 (Ig)로 표시되는 화합물의 제조
0℃에서, 벤젠메탄아미늄, N-[4-[[4-[(4-에톡시페닐)아미노]페닐][4-[에틸[(3-술포페닐)메틸]아미노]페닐]메틸렌]-2,5-시클로헥사디엔-1-일리덴]-N-에틸-3-술포-, 히드록시드, 분자내염, 모노나트륨염(Benzenemethanaminium, N-[4-[[4-[(4-ethoxyphenyl)amino]phenyl][4-[ethyl[(3-sulfophenyl)methyl]amino] phenyl]methylene]-2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethyl-3-sulfo-, hydroxide, inner salt, monosodium salt)(CBB G250) 12.0 g(14.1 mmol)에 메탄올 (60 mL), 시아노수소화붕소나트륨(sodium cyanoborohydride) 2.65 g(42.3 mmol)을 가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다.
반응액을 감압 하 농축한 후, 디에틸에테르와 메탄올의 혼합 용액으로부터 재결정함으로써 나트륨 3,3'-(4,4'-((4-(4-에톡시페닐아미노)페닐)메틸렌)비스(3-메틸-4,1-페닐렌))비스(에틸아잔디일)비스(메틸렌)디벤젠술포네이트(sodium3,3'-(4,4'-((4-(4-ethoxyphenylamino)phenyl)methylene)bis(3-methyl-4,1-phenylene))bis(ethylazanediyl)bis(methylene)dibenzenesulfonate) (이하, 화합물 (Ig)) 8.95 g(수율 73％)을 얻었다.
얻어진 화합물 (Ig)의 NMR에 의한 분석 결과를 이하에 나타내었다.
Figure pct00019
또한 상기 반응식을 하기에 나타내었다.
Figure pct00020
상기에서 얻어진 화합물 (Ig)를 이하에서 클리어 네이티브 전기 영동용 시약으로서 이용하였다.
2. 화합물 (Ig)의 흡광 스펙트럼
상기에서 얻어진 화합물 (Ig) 및 시판되고 있는 CBB G250(나카라이테스크 가부시끼가이샤)을 물에 용해하고, 분광 광도계(히타치(Hitachi) UV-2810)를 이용하여, 가시 흡수 스펙트럼을 측정하였다.
결과를 도 1에 도시하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 화합물 (Ig)는 582 nm 광의 흡수(CBB G250의 흡수극대)가 CBB G250에 비교하여 1,000배 감소하였다. 또한, 화합물 (Ig)의 1 mg/ml 수용액은 육안에서 거의 색을 나타내지 않았다.
3. 화합물 (Ig)를 이용한 CN-PAGE
겔 여과 분자량 마커(GE 헬스케어)와 3 종류의 막 단백질을 대상으로 하여, 화합물 (Ig)와 CBB G250을 이용한 네이티브 PAGE의 패턴의 비교를 행하였다.
전기 영동 조건을 이하에 나타내었다:
(1) 전기 영동 시스템
엑스셀 슈어락 미니 셀(Xcell SureLock mini cell) 및 파워이즈(PowerEase) 500 파워 서플라이(인비트로젠(Invitrogen)사)
(2) 캐소드 용액
(BN-PAGE)
50 mM 트리신, 7.5 mM 이미다졸, 및 0.02％(W/V) CBB G250(pH 7.0)
(CN-PAGE)
50 mM 트리신, 7.5 mM 이미다졸, 및 0.02％(W/V) 화합물 (Ig)(pH 7.0)
(3) 애노드 용액
25 mM 이미다졸(pH 7.0)
샘플은, BN-PAGE의 경우에는, 단백질 시료(20 μg)를, 50 mM 이미다졸, 50 mM NaCl, 0.5％ 도데실말토시드, 및 0.5％ CBB G250을 포함하는 용액에 용해하여 제조하였다. CN-PAGE의 경우에는, CBB G250 대신에 화합물 (Ig)를 이용하는 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 샘플을 제조하였다.
또한, 겔은 폴리아크릴아미드 겔(네이티브 PAGE TM 4-16％ 비스트리스 겔, 1.0 mm, 10웰, 인비트로젠사)을 이용하였다.
이하에서는, CBB G250을 이용한 네이티브 전기 영동을 블루 네이티브 PAGE(또는 BN-PAGE)라고도 칭한다. 또한 화합물 (Ig)를 이용한 네이티브 전기 영동을 클리어 네이티브 PAGE(또는 CN-PAGE)라고도 칭한다.
샘플을 웰에 로드하고, 150 V에서 1시간, 또한 250 V에서 1시간 전압을 인가하여, 전기 영동을 행하였다. 전기 영동 후, BN-PAGE의 경우에는 30％(V/V) 메탄올-10％(V/V) 아세트산 수용액으로 탈색하였다. 또 CN-PAGE의 경우에는 임페리얼 스테인(Imperial Stain)(피어스(Pierce) 제조)에 의해 염색하였다.
단백질 시료는 수용성 단백질(Soluble protein)로서, 티로글로불린(Thyroglobulin, 분자량 669 kDa), 페리틴(Ferritin, 분자량 440 kDa), 알돌라아제(Aldolase, 분자량 158 kDa), 콘알부민(Conalbumin, 분자량 75 kDa), 오브알부민(Ovalbumin, 분자량 43 kDa), 탄산 탈수 효소(Carbonic Anhydrase, 분자량 29 kDa), 리보뉴클레아제 A(RNase A, 분자량 13.7 kDa)를 이용하였다.
또한, 막 단백질(Membrane protein)로서 일산화질소 환원 효소(NOR, 분자량 68.5 kDa), 밴드3(Band3, 분자량 55 kDa(110 kDa)), 아데노신 수용체 A2a(A2a, 분자량 33 kDa)를 이용하였다.
결과를 도 2에 도시하였다.
도 2에 도시되는 바와 같이, CN-PAGE는 수용성 단백질, 막 단백질과 함께 BN-PAGE와 거의 동등한 패턴을 나타내었다.
이것으로부터, 화합물 (Ig)는 CBB G250와 같이 단백질에 결합하여, 전기 영동에 사용할 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한, BN-PAGE에서는, 캐소드 버퍼가 짙은 청색을 나타내기 때문에, 시료를 웰에 로드할 때에, 확실히 로드되어 있는지 어떤지, 웰로부터의 누설이 없는지 등의 판단이 곤란하였던 것에 비하여, CN-PAGE에서는, 캐소드 버퍼가 투명하기 때문에, 그와 같은 일이 없고, 시료의 겔에의 어플라이가 매우 간단하였다.
4. 겔 중 형광 검출
형광 단백질과 막 단백질의 융합 단백질을 형성하고, 화합물 (Ig)를 이용한 CN-PAGE를 행한 후, 형광 검출을 행하였다.
형광 단백질로서는 EGFP를 이용하였다. EGFP는 출아 효모를 숙주로 하여, EGFP 발현 플라스미드를 이용하여 발현시키고, Ni-NTA 슈퍼 플로우(퀴아겐사 제조)를 이용하여 정제하여 제조하였다.
또한, 융합 단백질은 아데노신 수용체 A2a와 EGFP와의 융합 단백질(이하, 막 단백질-EGFP 융합체)를 이용하였다. 막 단백질-EGFP 융합체는 출아 효모를 숙주로 하여, A2a-EGFP 융합체를 코드하는 플라스미드 DNA를 이용하여 발현시키고, 균체 회수 후, 유리 비드에 의해 균체를 파쇄하고, 초 원심에 의해 막 분획을 회수하여 제조하였다.
상기 제조한 EGFP(75 ng) 및 막 단백질-EGFP 융합체(약 50 ng)를 포함하는 출아 효모의 막 분획을 1％ 도데실말토시드로 가용화한 것을 화합물 (Ig)로 전기 영동하고, 전기 영동 후의 겔을 그대로 LAS-1000 플러스(후지 필름(주)사 제조)를 이용하여, 여기광 470 nm LED, 515 nm 저역 통과 형광 필터 촬영을 행하였다. 전기 영동 조건은 상기 3에 기재된 방법과 동일하게 하였다. 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, CBB 염색에서는 정제 EGFP는 약간 검출할 수 있는 정도인데, 형광 촬영에서는 명료하게 검출할 수 있었다. 막 단백질-GFP 융합체에 대해서도, CBB 염색에서는 다른 대량으로 존재하는 공잡 단백질에 가려져 밴드를 동정할 수 없지만, 형광 촬영에서는 분자량 및 회합 상태를 분명히 검출할 수 있었다. 통상, 단백질의 발현량이나 그 회합 상태를 조사하기 위해서는, 웨스턴 블로팅이나 정제, 겔 여과 등에 의한 번잡한 분석 조작이 필요하지만, 본 방법을 이용함으로써 매우 간단하게 단시간에 분석하는 것이 가능하게 되는 것을 알 수 있었다.
5. 겔 중 효소 활성 검출
대장균 유래 β-갈락토시다아제를 이용하여, BN-PAGE 및 CN-PAGE를 행하여, 겔 중에서의 효소 활성의 검출을 행하였다.
전기 영동은 상기 3의 조건과 동일로 하였다. 또한 전기 영동 후, 겔을 0.01％ 니트로블루테트라졸륨, PBS 중 0.05％ 엑스-갈(X-gal), pH 7.0으로 20분 인큐베이션함으로써 착색시켰다.
결과를 도 4에 도시하였다. 도 4의 좌측은 BN-PAGE 후의 겔을 나타낸다. 도 4의 우측은 CN-PAGE 후의 겔을 나타낸다. 어플라이한 β 갈락토시다아제의 양은 양 겔에서 동일하고, 우측의 레인으로부터 10 μg, 5 μg, 2.5 μg, 1.25 μg, 1 μg, 0.5 μg, 0.25 μg, 0.125 μg이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 어느쪽의 방법이어도 효소 활성을 유지하고 있는 것을 알 수 있다. 그러나, BN-PAGE에서는 CBB G250이 남기 때문에, 착색 밴드가 분명하게는 눈으로 볼 수 없지만, CN-PAGE에서는 명료하게 밴드를 볼 수 있다.
6. 은 염색
막 단백질 및 수용성 단백질을 단백질 시료로 하여, CN-PAGE를 행하고, 전기 영동 후, 은 염색을 행하였다.
막 단백질로서는, 녹농균 유래의 일산화질소 환원 효소(이하 「NOR」, 분자량 68.5 kDa)를 이용하였다. NOR은 녹농균을 배양하고, 집균 후, 초음파 파쇄에 의해 막 분획을 회수하고, 계면 활성제에 의한 가용화 후, 크로마토그래피에 의해 정제하여 제조하였다.
수용성 단백질로서는, 소 유래 혈청 알부민(BSA, 분자량 66 kDa, 시그마(Sigma)사 제조)을 이용하였다.
전기 영동 조건은 샘플 버퍼 중의 도데실말토시드를 0.02％, 및 화합물 (Ig)를 0.05％로 하고, 캐소드 버퍼 중의 화합물 (Ig)를 0.002％로 한 것 이외에는 상기 3에 기재된 조건과 동일로 하였다. 전기 영동 후의 은 염색은, 은 염색 II 키트 와코(와코 준야꾸 고교사 제조)를 이용하였다.
결과를 도 5에 도시하였다. 도 5의 (A)는 NOR 시료의 결과를 도시한다. 도 5의 (B)는 BSA 시료의 결과를 도시한다. 횡축의 M은 마커를 나타낸다. 또한, 전기 영동에 제공한 단백질의 양은 마커의 다음 레인부터 시작하여, 좌측으로부터 1000 ng, 500 ng, 100 ng, 50 ng, 10 ng, 5 ng, 1 ng, 0.5 ng, 0.1 ng이다.
도 5의 (A) 및 (B)에 도시된 바와 같이, 어느 쪽에 있어서도 0.5 ng 정도의 단백질량까지 밴드의 검출이 가능하였다. 이것으로부터, CN-PAGE는 전기 영동 직후의 은 염색도 가능하고, 적은 단백질 시료라도 분석을 할 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 5의 (B)에 있어서는, BSA 단량체(BSA monomer)의 밴드뿐만아니라, BSA 분자 사이의 상호 작용에 기인하는 몇개의 회합 상태로 이루어지는 밴드도 검출되었다.
이상의 결과로부터, 화합물 (I)을 이용한 클리어 네이티브 전기 영동법은 종래의 블루 네이티브 전기 영동법보다 취급이 간편하고 검출 감도가 우수한 것을 알 수 있었다. 또한, 형광 물질이나 은 염색을 이용한 고감도 검출이 가능하기 때문에, 미량의 단백질 시료에 있어서도 단백질의 크기나 발현량 등을 명료하게 검출할 수 있고, 또한 단백질간 상호 작용 등의 해석도 가능한 것을 알 수 있었다.

Claims (9)

  1. 중성의 전기 영동 완충액 중에서 단백질과 결합하여 분자 전체가 마이너스로 대전된 복합체를 형성할 수 있으며 실질적으로 무색인 적어도 1종의 화합물을 포함하고, 상기 화합물이 하기 화학식 (I)로 표시되는 전기 영동용 시약.
    Figure pct00021

    (식 중, R은 수소 원자, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 카르복실 또는 NR1R2를 나타내고,
    R'는 수소 원자, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 카르복실 또는 NR3R4를 나타내고,
    R"는 수소 원자, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 카르복실 또는 NR5R6을 나타내고,
    R1, R2, R3, R4, R5, R6은 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 시클로알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타내고,
    Ra, Rb, Rc는 동일 또는 상이하며, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 의미하고,
    n1, n2, n3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 4의 정수를 나타내고,
    Z는 수소 원자, 할로겐 원자, OH, 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, SH, 알킬티오, 알킬, 아미노(NH2), 모노알킬아미노, 디알킬아미노 또는 아실아미노를 나타내되,
    다만, 화학식 (I)의 화합물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 SO3H 또는 그의 염을 가짐)
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ia)로 표시되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 전기 영동용 시약.
    Figure pct00022

    (식 중, R1, R3, R5는 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 시클로알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타내고,
    Ra, Rb, Rc, R2a, R4a, R6a는 동일 또는 상이하며, SO3H 또는 그의 염, 할로겐 원자, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 메틸렌디옥시, 히드록시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 알콕시카르보닐아미노, 카르바모일, 모노 또는 디알킬카르바모일, 술파모일, 모노 또는 디알킬술파모일, 알킬술포닐아미노, 알콕시카르보닐, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 아릴옥시, 아실아미노 또는 카르복실을 나타내고,
    n1, n2, n3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 4의 정수를 나타내고,
    m1, m2, m3은 동일 또는 상이하며, 0 내지 5의 정수를 나타내되,
    다만, 화학식 (Ia)의 화합물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 SO3H 또는 그의 염을 가지며, R1, R3, R5,
    Figure pct00023
    중의 1 내지 6개는 SO3H 또는 그의 염을 치환기로서 갖는 아릴 또는 아르알킬을 나타냄)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 화학식 (Ib)로 표시되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 전기 영동용 시약.
    Figure pct00024

    (식 중, R1, R3, R5는 동일 또는 상이하며, 수소 원자, C1 -4 알킬, 치환될 수도 있는 페닐 또는 치환될 수도 있는 벤질을 나타내고,
    Ra, Rc는 동일 또는 상이하며, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R2b, R2c는 한쪽이 수소 원자이며, 다른쪽이 SO2NR9R10, SO3H 또는 그의 염을 나타내고,
    R4b, R4c는 한쪽이 수소 원자이며, 다른쪽이 알콕시를 나타내고,
    R6b, R6c는 한쪽이 수소 원자이며, 다른쪽이 SO2NR9R10, SO3H 또는 그의 염을 나타내고,
    R9, R10은 수소 또는 알킬을 나타내되,
    다만, R2b, R2c, R6b, R6c 중 1개 또는 2개는 SO3H 또는 그의 염을 나타냄)
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 (Ic)로 표시되는 적어도 1종의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 전기 영동용 시약.
    Figure pct00025

    (식 중, Ra, Rc는 동일 또는 상이하며, 수소 원자 또는 메틸이고,
    R2b, R6b는 SO3H 또는 그의 염을 나타냄)
  5. 전기 영동용 겔과 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약을 포함하는 전기 영동용 겔 조성물.
  6. 전기 영동용 버퍼와 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약을 포함하는 전기 영동용 버퍼 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약을 단백질 샘플 및/또는 전기 영동용 버퍼에 첨가하여 단백질의 클리어 네이티브(Clear Native) 전기 영동을 행하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 전기 영동용 시약, 제5항에 기재된 전기 영동용 겔 조성물, 제6항에 기재된 전기 영동용 버퍼 조성물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 전기 영동용 키트.
  9. 하기 화학식 (Ig), (Ih) 중 어느 하나로 표시되는 화합물.
    Figure pct00026

    (식 중, M은 수소 원자, 수용성의 염을 형성하는 금속 또는 N(R8)4 (R8은 동일 또는 상이하며, 수소 원자, 알킬, 알콕시알킬, 히드록시알킬, 치환될 수도 있는 아릴 또는 치환될 수도 있는 아르알킬을 나타냄)를 나타냄)
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