KR20110075020A

KR20110075020A - 사치환된 피리다진 헷지호그 경로 길항제

Info

Publication number: KR20110075020A
Application number: KR1020117011132A
Authority: KR
Inventors: 줄리아 마리 클레이; 필립 아써 힙스킨드; 다니엘 존 살; 윌슨 (니 타카쿠와), 타카코; 미셸 리 톰슨; 졸리 앤 바스티안
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2009-11-09
Publication date: 2011-07-05
Also published as: ES2446307T3; EP2358703A1; US20110178093A1; EP2358703B1; EA018372B1; MX2011005176A; AU2009314288B2; EA201170700A1; CA2743264C; JP5518088B2; CN102216292B; US8445493B2; CN102216292A; KR101335770B1; CA2743264A1; WO2010056620A1; AU2009314288A1; JP2012509265A; BRPI0921777A2

Abstract

본 발명은 암 치료에 유용한 신규 사치환된 피리다진 헷지호그 경로 길항제를 제공한다.

Description

사치환된 피리다진 헷지호그 경로 길항제 {TETRASUBSTITUTED PYRIDAZINES HEDGEHOG PATHWAY ANTAGONISTS}

본 발명은 헷지호그(Hedgehog) 경로 길항제, 보다 구체적으로 신규 사치환된 피리다진 및 그의 치료 용도에 관한 것이다. 헷지호그 (Hh) 신호전달 경로는 세포 분화 및 증식을 지시함으로써 배아 패턴 형성 및 성체 조직 유지에서 중요한 역할을 수행한다. 소닉 헷지호그 (Shh), 인디안 헷지호그 (Ihh) 및 데저트 헷지호그 (Dhh)를 포함하는 헷지호그 (Hh) 단백질 패밀리는 번역 후 변형, 예를 들어 자가촉매적 절단 및 콜레스테롤의 아미노-말단 펩티드로의 커플링을 수행하여 신호전달 활성을 보유하는 단편을 형성하는 분비성 당단백질이다. Hh는 12회-통과 막횡단 단백질 Ptch (Ptch1 및 Ptch2)에 결합하고, 이로써 스무슨드(Smoothened)(Smo)의 Ptch-매개 억제를 완화시킨다. Smo 활성화는 세포 증식, 세포 생존, 혈관신생 및 침입에 책임이 있는 Gli 전사 인자 (Gli1, Gli2 및 Gli3)의 안정화 및 Gli-의존성 유전자의 발현을 초래하는 일련의 세포내 사건을 일으킨다.

Hh 신호전달은, Shh 신호전달의 비정상적 활성화가 다양한 종양, 예를 들어 췌장암, 수모세포종, 기저 세포 암종, 소세포 폐암 및 전립선암의 형성을 야기한다는 발견에 근거하여, 최근에 상당한 관심을 불러일으켜 왔다. 스테로이드성 알카로이드 화합물 IP-609; 아미노프롤린 화합물 CUR61414; 및 2,4-이치환된 티아졸 화합물 JK18과 같은 여러 Hh 길항제가 당업계에 보고된 바 있다. WO2005033288은 헷지호그 길항제인 것으로 주장되는 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다. 유사하게, WO2008110611은 헷지호그 경로와 관련된 병리상태의 진단 및 치료와 관련된 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다.

강력한 헷지호그 경로 억제제, 특히 바람직한 약력학, 약동학 및 독성학 프로파일을 갖는 강력한 헷지호그 경로 억제제에 대한 요구가 여전히 존재한다. 본 발명은 이 경로의 강력한 길항제인 신규 사치환된 피리다진을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:

상기 식에서,

R¹은 수소, 플루오로 또는 시아노이고;

R² 및 R³은 독립적으로 메틸 또는 수소이다.

당업자라면, 본 발명의 화합물이 3급 아민 잔기를 포함하고, 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 제약상 허용되는 산 부가염 및 이들을 제조하기 위한 통상의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al ., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; [S.M. Berge, et al ., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, number 1, January 1977]을 참조한다.

본 발명의 구체적 실시양태는

(a) R¹이 수소이고;

(b) R² 및 R³ 중 하나가 수소이고, 다른 하나가 메틸인

화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 조합으로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 다양한 경로로 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 경구 또는 정맥내 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 이의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al ., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조한다.

본 발명은 또한 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서의 상기 질환의 치료 방법을 제공한다.

실제로 투여되는 화합물의 양은 치료할 상태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 비롯한 관련된 상황 하에서 의사에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 일일 투여량은 통상적으로 체중의 약 0.1 내지 약 5 mg/kg의 범위 내에 해당된다. 일부 경우에는 상기 언급한 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 훨씬 더 충분할 수 있지만, 다른 경우에는 훨씬 더 큰 용량이 사용될 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떤 방식으로든지 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

추가로, 본 발명은 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 특히, 이들 암은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

게다가, 본 발명은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료를 위한 활성 성분으로서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 당업계에 공지된 다양한 절차 뿐만 아니라, 하기 반응식, 제조예 및 실시예에 기재된 것에 따라 제조될 수 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 상이한 방식으로 조합되거나 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어, 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 제조할 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 당업자에게 일반적으로 쉽게 이용가능하다. 다른 것은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 공지된 구조적으로 유사한 화합물의 합성과 유사한 기술, 및 임의의 신규 절차를 비롯한 하기의 제조예 및 실시예에 기재된 절차에 따라 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 용어는 하기에 나타낸 의미를 갖는다: "boc" 또는 "t-boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하고; "EDCI"는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 지칭하고; "Et₂O"는 디에틸 에테르를 지칭하고; "HOBT"는 1-히드록시벤조트리아졸 수화물을 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 메틸술폭시드를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "SCX"는 강 양이온 교환을 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대하여 가능한 최대 억제 반응의 50％를 생성하는 작용제의 농도를 지칭한다.

반응식 1

화학식 I의 화합물은 반응식 1에 도시된 바와 같은 반응에 따라 제조될 수 있다.

반응식 1에서, 3,6-디클로로-4,5-디메틸피리다진 (1)은 친핵성 방향족 치환 반응 (SNAr)에서 모노-boc 보호된 치환된 피페라진 (2)으로 대체되어 화학식 3의 3-클로로-4,5-디메틸-6-(치환된) 피리다진을 제공한다. 예를 들어, 단계 1에서, 화학식 1에 있는 클로라이드를 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 유기 염기, 예컨대 디이소프로필에틸아민의 존재 하에서, 치환된 모노 boc 보호된 피페라진과 반응시킬 수 있다. 단계 2에서, 디메틸피리다진 (3) 상에 남아있는 클로라이드를 스즈끼-미야우라 교차 커플링 반응에서 페닐 보론산 (4)와 반응시켜 상응하는 4,5-디메틸-6-치환된 페닐피리다진-3-치환된 피페라진 (5)를 제공할 수 있다. 당업자는 이러한 교차-커플링 반응을 용이하게 하는 데 유용한 다양한 조건이 존재함을 인지할 것이다. 반응 조건은 적합한 용매, 예컨대 디옥산 또는 디옥산/물의 사용으로 이루어지고, 염기, 예컨대 불화세슘의 존재 하에 달성된다. 반응을 팔라듐 촉매, 예컨대 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드의 존재 하에 불활성 분위기 하에 온도 약 80-160℃에서 수행하여 화학식 5의 화합물을 제공한다. 아민을 표준 탈보호 방법으로 탈보호시킬 수 있다. 질소 보호기의 도입 및 제거 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)] 참조). 예를 들어, 화학식 5의 피페라진의 boc 탈보호는 산성 조건, 예컨대 염화수소 하에 적합한 용매, 예컨대 메탄올 또는 디옥산 중에서 달성되어 화학식 6의 화합물을 제공할 수 있다. 단계 4에서 아민의 아실화는 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민을 사용하고 약 90-110℃로 가열하면서 치환된 트리클로로에틸 카르바메이트 (7)을 사용하여 달성될 수 있다. 화학식 I의 화합물을 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 Et₂O 중 HCl을 첨가함으로써 염, 예컨대 HCl 염으로 전환시켜 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다.

치환된 트리클로로에틸 카르바메이트를 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 제조할 수 있다.

<반응식 2>

4,4-디플루오로시클로헥실아민 히드로클로라이드 (8)을 불활성 용매, 예컨대 디클로로메탄 중에서 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민을 사용하면서 2,2,2-트리클로로에틸 카르보노클로리데이트 (9)로 아실화시켜 단계 1에서 2,2,2-트리클로로에틸 4,4-디플루오로시클로헥실카르바메이트 (7)을 제공한다.

별법으로, 3,6-디클로로-4,5-디메틸피리다진을 벤질 에틸렌디아민으로 알킬화시킬 수 있고, 이것을 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 고리화된 피페라진으로 제조할 수 있다.

<반응식 3>

화학식 1에 있는 클로라이드를 반응식 3, 단계 1에서 나타낸 바와 같이 110-130℃에서 가열하면서 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 유기 염기, 예컨대 디이소프로필아민을 사용하면서 벤질에틸렌디아민 (10)으로 대체하여 화학식 11의 보호된 에틸렌디아민 피리다진을 제공할 수 있다. 두번째 클로라이드는 단계 2에 나타낸 보론산 (4)와 상기에 기재된 바와 같이 반응시켜 화학식 12의 화합물을 제공할 수 있다. 벤질 질소는 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민 및 적합한 커플링 시약, 예컨대 EDCI를 HOBT와 함께 사용하면서 2-클로로프로피온산 (13)으로 아실화시켜 단계 3에 나타낸 바와 같이 화학식 14의 화합물을 제공할 수 있다. 피리다진을 형성하기 위한 고리화는 불활성 용매, 예컨대 THF 중에서 수소화나트륨을 사용하여 달성하여 화학식 15의 화합물을 제공한다 (단계 4). 환원제, 예컨대 보란-메틸 술피드는 케톤을 환원시켜 화학식 16의 화합물을 제공한다 (단계 5). 예를 들어, 화학식 15의 화합물은 불활성 용매, 예컨대 THF 중에서 보란-메틸 술피드 착체로 처리할 수 있다. 혼합물을 40-60℃로 가열하여 화학식 16의 치환된 피페라진을 제공할 수 있다. 피페리진의 탈보호가 40-70 psi 수소 기체의 수소화 조건 하에서 촉매, 예컨대 10％ Pd/C을 사용하여 극성 용매, 예컨대 에탄올 중에서 달성되어 화학식 6의 화합물을 제공한다 (단계 6). 단계 7에서 아민의 아실화는 극성 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민을 사용하고 약 90-110℃로 가열하면서 치환된 트리클로로에틸 카르바메이트 (7)을 사용하여 달성하여 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있고, 이것을 염, 예컨대 Et₂O 중 HCl을 첨가하는 것과 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 HCl 염으로 전환시킬 수 있다.

하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시하고, 화학식 I의 화합물의 전형적인 합성을 나타내기 위해 제공된다. 본 발명의 화합물의 명칭은 일반적으로 켐드로우 울트라® 10.0에 의해 제공된다.

제조예 1

(S)-tert-부틸 4-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트

DMSO (30 mL) 중 1,4-디클로로-2,3-디메틸피리다진 (6.06 g, 34.2 mmol), (S)-2-메틸-피페라진-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (6.88 g, 34.4 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (30 ml, 172 mmol)의 혼합물을 120℃에서 5 일 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고 추가의 (S)-2-메틸-피페라진-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (3.74 g, 18.7 mmol)로 처리하고, 추가 2 일 동안 120℃에서의 가열을 재개하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고, H₂O 및 염수로 세척하였다. Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산 중 20→50％ EtOAc의 구배)로 정제하여 표제 화합물을 연황색 발포체로서 수득하였다 (7.36 g, 63％).

제조예 2

(S)-tert-부틸 4-(4,5-디메틸-6-페닐피리다진-3-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트

1,4-디옥산 (120 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (3.03 g, 8.87 mmol), 페닐보론산 (1.62 g, 13.3 mmol) 및 CsF (4.09 g, 26.9 mmol)의 N₂ 탈기된 혼합물을 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 (1.08 g, 1.32 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 밤새 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, EtOAc 및 H₂O 사이에 분배하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산 중 15→85％ EtOAc의 구배)로 정제하여 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다 (2.93 g, 86％).

본질적으로 제조예 2에 기재된 절차에 따라, 적절한 페닐보론산을 사용하여 하기 표의 치환된 디메틸 피리다진을 제조하였다.

제조예 5

(S)-4,5-디메틸-3-(3-메틸피페라진-1-일)-6-페닐피리다진

MeOH (20 mL) 중 (S)-tert-부틸 4-(4,5-디메틸-6-페닐피리다진-3-일)-2-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (2.93 g, 7.66 mmol)의 용액을 1,4-디옥산 중 4 M HCl (10 mL, 40.0 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH 중에 용해시키고, SCX 칼럼 (배리안, 10 g) 상에 부었다. 칼럼을 MeOH로 세정하였다. 목적 생성물을 2M NH₃/MeOH로 용리하였다. 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였다 (2.07 g, 95％).

본질적으로 제조예 5에 기재된 절차에 따라, 반응 시간 3 시간으로 적절한 boc-보호된 피페라진을 사용하고 MeOH 대신 1,4-디옥산을 용매로서 사용하여 하기 표의 보호된 피페라진을 제조하였다.

제조예 8

N1-벤질-N2-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)에탄-1,2-디아민

DMSO (78 mL) 중 3,6-디클로로-4,5-디메틸피리다진 (6.90 g, 39.0 mmol), N-벤질에틸렌디아민 (8.78 g, 58.5 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (25.2 g, 195 mmol)의 혼합물을 120℃에서 3 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, H₂O 내에 붓고, 혼합물을 Et₂O로 추출하였다. 유기 층을 H₂O로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 중 0→5％ 2 M NH₃/MeOH의 구배)를 사용하여 정제하여 표제 화합물을 밀랍성 고체로서 수득하였다 (6.41 g, 57％).

제조예 9

N1-벤질-N2-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)에탄-1,2-디아민

1,4-디옥산 (220 mL) 중 N1-벤질-N2-(6-클로로-4,5-디메틸피리다진-3-일)에탄-1,2-디아민 (6.40 g, 22.0 mmol), 4-플루오로페닐보론산 (9.24 g, 66.0 mmol) 및 CsF (10.0 g, 66.0 mmol)의 N₂ 탈기된 혼합물을 (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드 (2.70 g, 3.30 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 밤새 가열하였다. 냉각시키고, 포화 NaHCO₃ (aq) 및 EtOAc 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 중 0→6％ 2M NH₃/MeOH의 구배)로 정제하여 표제 화합물을 밀랍성 고체로서 수득하였다 (4.91 g, 64％).

제조예 10

(R)-N-벤질-2-클로로-N-(2-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일아미노)에틸)프로판아미드

CH₂Cl₂ (70 mL) 중 N1-벤질-N2-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)에탄-1,2-디아민 (4.90 g, 13.98 mmol)의 용액을 (R)-(+)-2-클로로프로피온산 (1.84 mL, 20.97 mmol), 트리에틸아민 (2.92 mL, 20.97 mmol), HOBT (3.21 g, 20.97 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (4.02 g, 20.97 mmol)로 순차적으로 처리하였다. 생성된 혼합물 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO₃으로 세척하였다. 수성 층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산 중 20％ EtOAc)로 정제하여 표제 화합물을 황색 발포체로서 수득하였다 (4.59 g, 74％).

제조예 11

1-벤질-4-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)-3-메틸피페라진-2-온

THF (104 mL) 중 (R)-N-벤질-2-클로로-N-(2-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일아미노)에틸)프로판아미드 (4.59 g, 10.4 mmol)의 0℃ 용액을 NaH (60％, 625 mg, 15.6 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, 추가의 NaH (60％, 208 mg, 5.20 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 하고, 3 일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 염수 및 EtOAc 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 중 0→2％ 2 M NH₃/MeOH의 구배)로 정제하여 표제 화합물을 백색 발포체로서 수득하였다 (3.64 g, 86％).

제조예 12

3-(4-벤질-2-메틸피페라진-1-일)-6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진

THF (70 mL) 중 1-벤질-4-(6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진-3-일)-3-메틸피페라진-2-온 (2.84 g, 7.02 mmol)의 용액을 보란-메틸 술피드 착체 (1.96 mL, 21.1 mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 적하 깔때기를 통해 MeOH (20 mL)를 첨가한 다음, 1,4-디옥산 중 4 M HCl (20 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 65℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 CH₂Cl₂ 및 포화 NaHCO₃ (aq) 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기 층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 중 0→3％ 2 M NH₃/MeOH의 구배)로 정제하여 표제 화합물을 밀랍성 고체로서 수득하였다 (2.45 g, 89％).

3-(4-벤질-2-메틸피페라진-1-일)-6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진의 이성질체를 키랄 크로마토그래피 (키랄셀 OJ-H, 유속 30 ml/분, 검출 225 nm, 6:4 MeOH:아세토니트릴)로 분리하였다. 제1 용리 피크, 이성질체 1: 99％ ee. 제2 용리 피크, 이성질체 2: 99％ ee.

제조예 15

3-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸-6-(2-메틸피페라진-1-일)피리다진

무수 EtOH (15 mL) 중 3-(4-벤질-2-메틸피페라진-1-일)-6-(4-플루오로페닐)-4,5-디메틸피리다진 (200 mg, 3.25 mmol)의 용액을 EtOH (5 mL)로 미리 습윤시킨 10％ Pd/C (46.8 mg)에 첨가하였다. 혼합물을 60 psi의 H₂로 가압시킨 파르 병에서 10 시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 용액을 SCX 칼럼 (배리안, 2 g)에 직접 적용하였다. 칼럼을 MeOH 및 CH₂Cl₂로 세정하였다. 생성물을 2 M NH₃/MeOH 및 CH₂Cl₂의 1:1 혼합물로 용리하였다. 용리액을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 회백색 발포체로서 수득하였다 (142 mg, 92％).

실시예 15에 기재된 절차에 따라, 적절한 보호된 아민을 사용하여 하기 표의 탈보호된 메틸을 제조하였다.

제조예 18

2,2,2-트리클로로에틸 4,4-디플루오로시클로헥실카르바메이트

CH₂Cl₂ (192 mL) 중 4,4-디플루오로시클로헥실아민 히드로클로라이드 (3.29 g, 19.2 mmol) 및 트리에틸아민 (5.88 mL, 42.2 mmol)의 0℃ 혼합물을 2,2,2-트리클로로에틸 카르보노클로리데이트 (2.91 mL, 21.1 mmol)로 적하 처리하였다. 1 시간 후, 반응 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 H₂O 및 CH₂Cl₂ 사이에 분배하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 회백색 고체로서 수득하였다 (5.75 g, 97％).

실시예 1

(S)-N-(4,4-디플루오로시클로헥실)-4-(4,5-디메틸-6-페닐피리다진-3-일)-2-메틸피페라진-1-카르복스아미드 히드로클로라이드

DMSO (5 ml) 중 (S)-4,5-디메틸-3-(3-메틸피페라진-1-일)-6-페닐피리다진 (199 mg, 0.70 mmol) 및 트리에틸아민 (0.30 ml, 2.15 mmol)의 혼합물을 2,2,2-트리클로로에틸 4,4-디플루오로시클로헥실카르바메이트 (341 mg, 1.10 mmol)로 처리하였다. 반응물을 100℃에서 4 일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 H₂O에 붓고, EtOAc로 세정하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 H₂O로 2회, 이어서 염수로 세척하였다. Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 중 0→10％ MeOH의 구배)로 정제하였다. 정제된 유리 염기를 MeOH (1 mL) 중에 용해시키고, Et₂O 중 1 M HCl (1 mL)로 처리하였다. 혼합물을 농축시켜 표제 화합물을 황색 발포체로서 수득하였다 (256 mg, 76％).

실시예 1에 기재된 절차에 따라, 적절한 피페라지닐피리다진을 사용하여 하기 표의 피페라지닐 우레아를 제조하였다.

생물학

헷지호그는 기저 세포 암종; 상부 위장관 암 (식도, 위, 췌장 및 담관); 전립선암; 유방암; 소세포 폐암; 비-소세포 폐암; B-세포 림프종; 다발성 골수종; 위암; 난소암; 결장직장암; 간암; 흑색종; 신장암; 및 뇌암과 같은 암에 대한 생존 인자로서 관련된 것으로 시사되어 왔다.

헷지호그 경로의 요소들은 암의 치료를 위한 잠재적 약물 표적이라고 주장되어 왔다. 수모세포종 종양으로부터 확립된 Daoy 세포주 (ATCC, HTB-186)는 Hh 리간드에 반응한다. 이들 세포를 외인성 첨가된 Shh-조건화 배지로 처리하는 경우, Hh 신호전달 경로가 활성화되어, Gli1의 발현의 증가를 야기한다. 익시아(corn lily) 베라트룸 칼리포르니쿰(Veratrum californicum)으로부터 단리된 알칼로이드인 시클로파민은 약한 헷지호그 길항제이고, Shh 자극에 반응하여 Gli1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 최근의 관찰은 시클로파민이 배양된 수모세포종 세포 및 동종이식편의 성장을 억제함을 시사한다. 이러한 Daoy 세포 모델 시스템을 이용하여, 헷지호그 신호전달 경로의 강력한 억제제를 확인할 수 있다. 본 발명의 화합물이 헷지호그 길항제이므로, 이들은 전술한 종양 유형의 치료에 적합하다.

생물학적 활성 IC₅₀의 측정

하기의 검정 프로토콜 및 그의 결과는 화합물의 유용성 및 효능, 및 본 발명의 방법을 추가로 증명한다. 기능적 검정은 본 발명의 화합물이 Shh 신호전달을 억제하는 능력을 나타낸다는 근거를 제공한다. 하기 검정에 사용된 모든 리간드, 용매 및 시약은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.

생물학적 활성은 Daoy 뉴런 암 세포에서의 기능적 검정을 이용하여 측정되며, bDNA (분지형 데옥시리보핵산) 검정 시스템 (파노믹스, 인크.(Panomics, Inc.), 캘리포니아주 프레몽트)를 통해 Gli1 리보핵산의 수준을 측정한다. Gli는 교모세포종 세포주에서 최초로 발견되었고, Shh 신호전달에 의해 활성화되는 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 코딩한다. 최대 반응은 조건화 배지 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포)를 사용하는 Daoy 세포에서 24 시간 동안 Gli1 전사를 유도한 다음, 자극된 Gli1 전사체의 양을 측정함으로써 수득하였다. 최소 반응은 조건화 배지 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정하게 발현하는 HEK-293 세포)로 자극된 Daoy 세포에서 24 시간 동안 대조군 화합물에 의해 억제된 Gli1 전사체의 양이다.

Daoy 세포에서 Gli1의 억제를 측정하기 위한 기능적 검정

bDNA 검정 시스템은 표적 리보핵산 (전사체)의 증폭을 허용하는 분지쇄 DNA의 기술을 활용한다. 이 기술은 표적 전사체와 복합체로서 혼성화하여 혼성화 신호를 증폭시키는 표적 전사체 [포획 익스텐더 (CE), 표지 익스텐더 (LE) 및 차단제 (BL)]의 특이성을 결정하는 합성 하이브리드인 짧은 Gli1-특이적 cDNA 프로브의 3가지 유형을 사용한다. 증폭 단계 동안 화학 발광성 기질의 첨가는 발광을 이용하는 검출을 허용한다.

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture collection)(ATCC)으로부터 입수한 Daoy 세포주는 Shh-반응성 인간 뉴런 종양 세포주이고, 섬유조직형성의 소뇌 수모세포종 종양, 생리학적으로 관련된 종양 세포주로부터 1985년에 확립되었다. Gli1 전사체 수준의 내인성 수준은 Daoy 세포에서는 낮지만, 인간 Shh를 안정하게 과다발현하는 세포 (hShh로 안정하게 형질감염된 HEK-293 세포주)로부터 획득한 조건화 배지를 사용하여 자극될 수 있다.

Daoy 세포는 조직 배양 T225-플라스크에서 0.1 nM 비-필수 아미노산 및 1 mM 나트륨 피루베이트를 포함하는 10％ 태아 소 혈청 (FBS)을 더한 최소 필수 배지 (MEM)를 함유하는 Daoy 성장 배지 중에서 전면배양으로 성장시켰다. 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 사용하여 T225-플라스크로부터 세포를 제거하고, 원심분리하고, 배지 중에 재현탁한 다음, 계수하였다.

이어서, Daoy 세포를 코스타 96 웰 투명 조직 배양 플레이트 내 성장 배지 중에 각 웰 당 50,000개의 세포를 시딩하고, 5％ 이산화탄소 (CO₂) 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 인산염 완충 염수 (PBS) 중에서 1회 세척하고, 이어서 Shh 조건화 배지 (Shh-CM) 100 ㎕를 첨가하여 Gli1 발현 수준을 자극하였다. 대조군 성장 배지-0.1％ FBS/DMEM (둘베코 변형 이글 배지)을 사용하여 최대 자극을 달성하기 위해 Shh-CM을 희석하였다. 이어서, Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포를 대략 1 μM 내지 0.1 nM 범위의 다양한 농도의 헷지호그 억제제로 처리하였다. 시험 화합물은 5％ CO₂ 하에 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.

Gli1 전사체의 측정은 제조사 (파노믹스, 인크.)에 의해 기재된 바와 같은 퀀티젠(Quantigene) 2.0 Gli1 검정을 이용하여 수행하였다. 프로테이나제 K를 포함하는 희석된 용해 혼합물 (DLM) 완충액을 제조하였다. 화합물과 함께 24 시간 인큐베이션한 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, DLM 180 ㎕를 세포에 첨가하였다. 용해 완충액을 함유하는 세포 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 30분 내지 45분 동안 두었다. 그 후, 생성된 세포 용해물을 5회 연화처리하였다. 제조사의 지시에 따라 프로브를 DLM 중에 희석시켜 Gli1 프로브를 함유하는 작업 프로브 세트를 제조한 다음, 작업 프로브 세트 20 ㎕를 Daoy 용해물 80 ㎕와 함께 bDNA 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 bDNA 플레이트를 처리하였다. 발광을 검출하는 퍼킨 엘머 엔비젼(Perkin Elmer Envision) 판독기 상에서 플레이트를 판독하여 신호를 정량화하였다. 발광 신호는 샘플 중에 존재하는 표적 전사체의 양에 직접적으로 비례하였다.

기능적 검정으로부터의 발광 신호 데이터는 시험관내 검정에 대한 IC₅₀을 계산하기 위해 사용하였다. 데이터는 최대 대조군 값 (Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포) 및 최소 대조군 값 (Shh-CM 및 억제 농도의 대조군 화합물, 1 μM의 N-(3-(1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-클로로페닐)-3,5-디메톡시벤즈아미드로 처리된 Daoy 세포)을 기준으로 계산하였다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트는 액티비티베이스 소프트웨어 프로그램 버전 5.3, 방정식 205 (Assay Guidance Manual Version 5.0, 2008, Eli Lilly and Company and NIH Chemical Genomics Center)를 사용하여 IC₅₀ 값을 생성하기 위해 사용하였다.

기재된 프로토콜에 따라, 본원에 예시된 본 발명의 화합물은 < 15 nM의 IC₅₀을 나타냈다. 예를 들어, 실시예 1의 화합물은 상기 기재된 검정에서 0.139 (n=3)의 표준 오차를 갖는 대략 1.26 nM의 IC₅₀을 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 화합물이 헷지호그 길항제이고, 그 자체로 항암제로서 유용하다는 증거를 제공한다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:

상기 식에서,
R¹은 수소, 플루오로 또는 시아노이고;
R² 및 R³은 독립적으로 메틸 또는 수소이다.
제1항에 있어서, R¹이 수소인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, R² 및 R³ 중 하나가 수소이고, 다른 하나가 메틸인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 수소이고, R²가 수소이고, R³이 메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함하는 제약 조성물.
뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암 또는 흑색종의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서의 상기 질환의 치료 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.