CN102216292A - 四取代的哒嗪hedgehog途径拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于治疗癌症的新的四取代的哒嗪hedgehog途径拮抗剂。

Description

四取代的哒嗪HEDGEHOG途径拮抗剂
本发明涉及Hedgehog途径拮抗剂，更具体而言，涉及新的四取代的哒嗪及其治疗用途。Hedgehog(Hh)信号传导途径通过指导细胞分化和增殖在胚胎模式形成和成人组织维护方面起重要的作用。包括SonicHedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)在内的Hedgehog(Hh)蛋白家族是经历翻译后修饰的分泌性糖蛋白，所述修饰包括自身催化性切割和将胆固醇与氨基端肽偶联以形成具有信号传导活性的片段。Hh与12次跨膜蛋白Ptch(Ptch1和Ptch2)结合，因而减轻Ptch介导的对Smoothened(Smo)的抑制。Smo活化触发一系列胞内事件，最终使Gli转录因子(Gli1、Gli2和Gli3)稳定并表达对细胞增殖、细胞存活、血管发生和侵袭负责的Gli依赖性基因。
最近，基于Shh信号传导的异常活化导致多种肿瘤、例如胰腺癌、成神经管细胞瘤、基底细胞瘤、小细胞肺癌和前列腺癌的形成的发现，Hh信号传导已引起人们相当大的兴趣。在本领域中已报道了某些Hh拮抗剂，例如甾体生物碱化合物IP-609；氨基脯氨酸化合物CUR61414；和2，4-二取代的噻唑化合物JK18。WO2005033288公开了某些被认为是hedgehog拮抗剂的1，4-二取代的酞嗪。类似地，WO2008110611公开了某些与诊断和治疗hedgehog途径相关病理学有关的1，4二取代的酞嗪化合物。
对有效的hedgehog途径抑制剂、特别是那些具有所需药效学、药动学和毒物学特性的hedgehog途径抑制剂仍存在需求。本发明提供了新的四取代的哒嗪，它们是这种途径的有效拮抗剂。
本发明提供了下式的化合物或其可药用盐：
Figure BDA0000061411500000011
其中：
R1是氢、氟或氰基；且
R2和R3独立地为甲基或氢。
本领域技术人员应理解，本发明的化合物包含叔胺部分并且能够与多种无机和有机酸反应以形成可药用酸加成盐。此类可药用酸加成盐和用于制备它们的常用方法为本领域所熟知。参见例如，P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES，SELECTION AND USE(VCHA/Wiley-VCH，2002)；S.M.Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，No.1，1977年1月。
本发明的具体实施方案包括式I化合物或其可药用盐，其中：
(a)R1是氢；和
(b)权利要求1或2的化合物，其中R2和R3中的一个是氢，另一个是甲基。
本发明还提供了药物组合物，其包含与可药用赋形剂、载体或稀释剂组合的式I化合物或其可药用盐。
本发明的化合物优选被配制成通过多种途径施用的药物组合物。优选，此类组合物用于口服或静脉内施用。此类药物组合物和用于制备它们的方法为本领域所熟知。参见例如REMINGTON：THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY(A.Gennaro等人编辑，第19版，MackPublishing Co.，1995)。
本发明还提供了治疗患者中的脑癌、基底细胞瘤、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、肾癌或黑素癌的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的式I化合物、或其可药用盐。
应理解的是，实际上所施用的化合物的量将由内科医师根据相关情况确定，包括待治疗的条件、所选的施用路径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、重量和响应、以及患者综合征的严重度。每天剂量通常落入约0.1至约5mg/kg体重的范围。在某些情况下，低于所述范围下限的剂量水平可以绰绰有余，而在其他情况下，也可以使用更大的剂量。因此，上述剂量范围不意欲以任何方式限制本发明的范围。本发明还提供了用作药物的式I化合物或其可药用盐。
此外，本发明提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。具体而言，所述癌症选自脑癌、基底细胞瘤、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、肾癌或黑素癌。
而且，本发明提供了药物组合物，其包含作为活性成分的式I化合物或其可药用盐，用于治疗脑癌、基底细胞瘤、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、肾癌或黑素癌。
式I化合物或其盐可通过本领域已知的多种方法以及在下面流程、制备例和实施例中所述的那些操作来制备。所述的每种路径的具体合成步骤可以以不同方式组合或结合不同流程的步骤，来制备式I化合物或其盐。
除非另有说明，否则取代基如上所定义。试剂和原料通常对本领域技术人员来说是容易可得的。其他试剂和原料可通过有机和杂环化学的标准技术、与已知结构相似化合物的合成类似的技术以及下面包括任何新操作的制备例和实施例中所述的操作来制备。
如本文所述，下面术语具有所示的含义：“boc”或“t-boc”是指叔丁氧基羰基；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“Et2O”是指乙醚；“HOBT”是指1-羟基苯并三唑水合物；“DMF”是指N，N-二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“MeOH”是指甲醇；“TFA”是指三氟乙酸；“SCX”是指强阳离子交换；和“IC50”是指产生对该活性剂来说可能的最大抑制反应的50％的活性剂的浓度。
流程1
Figure BDA0000061411500000041
可以根据流程1中所述的反应制备式I化合物。
在流程1中，在亲核芳香族取代反应(SNAr)中，用单-boc保护的取代的哌嗪(2)取代3，6-二氯-4，5-二甲基哒嗪(1)以提供式(3)的3-氯-4，5-二甲基-6-(取代的)哒嗪。例如，在步骤1中，可将(1)的氯在极性非质子溶剂如DMSO中、在有机碱如二异丙基乙胺存在下与取代的单boc保护的哌嗪反应。在步骤2中，在Suzuki-Miyaura交叉偶联反应中，可将二甲基哒嗪(3)上剩余的氯与苯基代硼酸(4)反应以得到相应的4，5-二甲基-6-取代的苯基哒嗪-3-取代的哌嗪(5)。熟练技术人员将认识到，有多种可用于促进此类交叉偶联反应的条件。反应条件利用适合的溶剂如二噁烷或二噁烷/水并且在碱如氟化铯存在下实现。反应在钯催化剂例如(1，1’-双(二苯基膦)二茂铁)氯化钯(II)存在下、在惰性气氛下、在约80-160℃的温度发生，以得到式(5)化合物。可通过标准脱保护方法将该胺脱保护。用于引入以及移除氮保护基团的方法为本领域所熟知(参见例如Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley and Sons，New York(1999))。例如，式(5)的哌嗪的boc脱保护可在酸性条件下如氯化氢、在适合的溶剂如甲醇或二噁烷中实现，从而得到式(6)化合物。步骤4中胺的酰化可以用取代的氨基甲酸三氯乙酯(7)、使用有机碱如三乙胺、在极性非质子溶剂如DMSO中并加热至约90-110℃来实现。可通过本领域已知的方法将式I化合物转化为盐例如HCl盐，例如加入Et2O中的HCl以得到式I化合物。
可以如流程2所示制备取代的氨基甲酸三氯乙酯。
流程2
Figure BDA0000061411500000051
步骤1中，在惰性溶剂如二氯甲烷中、使用有机碱如三乙胺，用氯甲酸2，2，2-三氯乙酯(9)酰化4，4-二氟环己胺盐酸盐(8)，以得到4，4-二氟环己基氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(7)。
可选地，可以用苄基乙二胺将3，6-二氯-4，5-二甲基哒嗪烷基化，而苄基乙二胺可被加工成环化哌嗪，如流程3所示。
流程3
Figure BDA0000061411500000052
如流程3步骤1所示，(1)的氯可以用苄基乙二胺(10)、使用有机碱如二异丙胺、在极性非质子溶剂如DMSO中、在110-130℃加热下取代，以得到保护的式(11)的乙二胺哒嗪。可如前所述将第二个氯与如步骤2所示的代硼酸(4)反应，以得到式(12)的化合物。使用有机碱如三乙胺和合适的偶联试剂如EDCI和HOBT、用2-氯丙酸(13)酰化苄基氮，以得到如步骤3所示的式(14)的化合物。步骤4中，在惰性溶剂如THF中用氢化钠实现环化以形成哒嗪，以得到式(15)化合物。步骤5中，还原剂例如硼烷-二甲硫醚还原酮得到式(16)化合物。例如，可用硼烷-二甲硫醚复合物在惰性溶剂如THF中处理式(15)化合物。可以将混合物加热至40-60℃，以得到式(16)的取代的哌嗪。步骤6中，在40-70psi氢气和催化剂如10％Pd/C的氢化条件下、使用极性溶剂如乙醇，实现哌嗪的脱保护，以得到式(6)化合物。步骤7中，可以在极性非质子溶剂如DMSO中、使用有机碱如三乙胺并且加热至约90-110℃，用取代的氨基甲酸三氯乙酯(7)实现胺的酰化，以得到式I化合物，其可通过本领域已知的方法、例如加入Et2O中的HCl转化成盐例如HCl盐。
提供下面制备例和实施例更详细地阐明本发明，这些制备例和实施例表示式I化合物的典型合成。本发明的化合物的名称一般通过ChemDraw
Figure BDA0000061411500000061
10.0提供。
制备例1
(S)-4-(6-氯-4，5-二甲基哒嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸-叔丁酯
Figure BDA0000061411500000062
在120℃、将1，4-二氯-2，3-二甲基哒嗪(6.06g，34.2mmol)、(S)-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(6.88g，34.4mmol)和二异丙基乙胺(30ml，172mmol)在DMSO(30mL)中的混合物加热5天。冷却，并用另外的(S)-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(3.74g，18.7mmol)处理混合物，在120℃重新开始加热另外2天。用EtOAc稀释反应混合物，并用H2O和盐水洗涤。经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(梯度为20～50％在己烷中的EtOAc)纯化残渣，得到为浅黄色泡沫的标题化合物(7.36g，63％)。ES/MSm/z(35Cl)341.0(M+1)。
制备例2
(S)-4-(4，5-二甲基-6-苯基哒嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
Figure BDA0000061411500000071
用(1，1’-双(二苯基膦)二茂铁)氯化钯(II)(1.08g，1.32mmol)处理经N2除气的(S)-4-(6-氯-4，5-二甲基哒嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(3.03g，8.87mmol)、苯基代硼酸(1.62g，13.3mmol)和CsF(4.09g，26.9mmol)在1，4-二噁烷(120mL)中的混合物。在95℃加热反应混合物过夜。冷却反应，在EtOAc与H2O之间分配。用盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(梯度为15～85％在己烷中的EtOAc)纯化残渣，得到为白色固体的标题化合物(2.93g，86％)。ES/MS m/z383.0(M+1)。
基本上按照制备例2中所述的操作，使用适当的苯基代硼酸，制备下表中的取代的二甲基哒嗪。
Figure BDA0000061411500000072
制备例5
(S)-4，5-二甲基-3-(3-甲基哌嗪-1-基)-6-苯基哒嗪
用4M在1，4-二噁烷中的HCl(10ml，40.0mmol)处理(S)-4-(4，5-二甲基-6-苯基哒嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.93g，7.66mmol)在MeOH(20mL)中的溶液。在环境温度搅拌反应混合物过夜。在减压下浓缩反应混合物。将残渣溶解在MeOH中，倒入SCX柱(Varian，10g)上。用MeOH漂洗柱子。用2M NH3/MeOH洗脱所需产物。在减压下浓缩，得到标题化合物(2.07g，95％)。ES/MS m/z 283.0(M+1)。
使用适当的boc-保护的哌嗪、反应时间为3小时以及使用1，4-二噁烷替代MeOH作为溶剂，基本上按照制备例5中所述的操作，制备下表中的脱保护的哌嗪。
Figure BDA0000061411500000082
制备例8
N1-苄基-N2-(6-氯-4，5-二甲基哒嗪-3-基)乙烷-1，2-二胺
Figure BDA0000061411500000083
在120℃、将3，6-二氯-4，5-二甲基哒嗪(6.90g，39.0mmol)、N-苄基乙二胺(8.78g，58.5mmol)和二异丙基乙胺(25.2g，195mmol)在DMSO(78mL)中的混合物加热3天。冷却反应混合物，倒入H2O中，用Et2O萃取混合物。用H2O洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。使用闪式硅胶层析法(梯度为0～5％2M NH3/MeOH在CH2Cl2中)纯化残渣，获得为蜡状固体的标题化合物(6.41g，57％)。ES/MS m/z 291.2(M+1)。
制备例9
N1-苄基-N2-(6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪-3-基)乙烷-1，2-二胺
Figure BDA0000061411500000091
用(1，1′-双(二苯基膦)二茂铁)氯化钯(II)(2.70g，3.30mmol)处理经N2脱气的N1-苄基-N2-(6-氯-4，5-二甲基哒嗪-3-基)乙烷-1，2-二胺(6.40g，22.0mmol)、4-氟苯基代硼酸(9.24g，66.0mmol)和CsF(10.0g，66.0mmol)在1，4-二噁烷(220mL)中的混合物。在95℃加热反应混合物过夜。冷却，在饱和NaHCO3(水溶液)和EtOAc之间分配。分离各层，用EtOAc萃取水层。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(梯度为0～6％2M NH3/MeOH在CH2Cl2中)纯化残渣，得到为蜡状固体的标题化合物(4.91g，64％)。ES/MS m/z 351.2(M+1)。
制备例10
(R)-N-苄基-2-氯-N-(2-(6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪-3-基氨基)乙基)丙酰胺
用(R)-(+)-2-氯丙酸(1.84ml，20.97mmol)、三乙胺(2.92ml，20.97mmol)、HOBT(3.21g，20.97mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.02g，20.97mmol)相继处理N1-苄基-N2-(6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪-3-基)乙烷-1，2-二胺(4.90g，13.98mmol)在CH2Cl2(70mL)中的溶液。在环境温度搅拌所得混合物过夜。用饱和NaHCO3水溶液洗涤反应混合物。用CH2Cl2萃取水层。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(20％在己烷中的EtOAc)纯化残渣，得到为黄色泡沫的标题化合物(4.59g，74％)。ES/MS m/z 441.2(M+1)。
制备例11
1-苄基-4-(6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪-3-基)-3-甲基哌嗪-2-酮
Figure BDA0000061411500000101
用NaH(60％，625mg，15.6mmol)处理0℃的(R)-N-苄基-2-氯-N-(2-(6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪-3-基氨基)乙基)丙酰胺(4.59g，10.4mmol)在THF(104mL)中的溶液。使反应混合物升温至环境温度，搅拌过夜。将反应冷却至0℃，用另外的NaH(60％，208mg，5.20mmol)。使反应混合物升温至环境温度，搅拌3天。在盐水与EtOAc之间分配反应混合物。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(梯度为0～2％2M NH3/MeOH在CH2Cl2中)纯化残渣，得到为白色泡沫的标题化合物(3.64g，86％)。ES/MS m/z 405.2(M+1)。
制备例12
3-(4-苄基-2-甲基哌嗪-1-基)-6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪
Figure BDA0000061411500000102
用硼烷-二甲硫醚复合物(1.96ml，21.1mmol)处理1-苄基-4-(6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪-3-基)-3-甲基哌嗪-2-酮(2.84g，7.02mmol)在THF(70mL)中的溶液。在50℃加热所得混合物2天。在冰浴中冷却反应混合物，通过滴液漏斗加入MeOH(20mL)，然后加入4M在1，4-二噁烷(20mL)中的HCl。在65℃加热所得混合物1小时。在减压下浓缩混合物。在CH2Cl2与饱和NaHCO3(水溶液)之间分配残渣。分离各层，用CH2Cl2萃取水层。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(梯度为0～3％2M NH3/MeOH在CH2Cl2中)纯化残渣，得到蜡状固体的标题化合物(2.45g，89％)。ES/MS m/z 391.2(M+1)。
通过手性层析法(Chiralcel OJ-H，流速30mL/min，检测225nm，6∶4MeOH∶乙腈)分离3-(4-苄基-2-甲基哌嗪-1-基)-6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪的异构体。第一洗脱峰，异构体1∶99％ee。第二洗脱峰，异构体2∶99％ee。
Figure BDA0000061411500000111
制备例15
3-(4-氟苯基)-4，5-二甲基-6-(2-甲基哌嗪-1-基)哒嗪
将3-(4-苄基-2-甲基哌嗪-1-基)-6-(4-氟苯基)-4，5-二甲基哒嗪(200mg，3.25mmol)在无水EtOH(15mL)中的溶液加至用EtOH(5mL)预先浸湿的10％Pd/C(46.8mg)。在用H2加压的60psi的Parr瓶中振摇混合物10小时。过滤反应混合物，将溶液直接施加至SCX柱(Varian，2g)。用MeOH和CH2Cl2漂洗柱子。用2M NH3/MeOH和CH2Cl2的1∶1混合物洗脱产物。在减压下浓缩洗脱液，得到为灰白色泡沫的标题化合物(142mg，92％)。ES/MS m/z 301.2(M+1)。
使用适当的经保护的胺，按照实施例15中所述的操作，制备下表中的脱保护的甲基哌嗪。
Figure BDA0000061411500000121
制备例18
4，4-二氟环己基氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯
用氯甲酸2，2，2-三氯乙酯(2.91ml，21.1mmol)逐滴处理0℃的4，4-二氟环己胺盐酸盐(3.29g，19.2mmol)和三乙胺(5.88ml，42.2mmol)在CH2Cl2(192mL)中的混合物。1小时后，使反应混合物升温至环境温度，搅拌过夜。在H2O与CH2Cl2之间分配反应混合物，分离各层。经Na2SO4干燥有机层，过滤，在减压下浓缩，得到为灰白色固体的标题化合物(5.75g，97％)。GC/MS m/z 35Cl 309(M+)。
实施例1
(S)-N-(4，4-二氟环己基)-4-(4，5-二甲基-6-苯基哒嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-甲酰胺盐酸盐
用4，4-二氟环己基氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(341mg，1.10mmol)处理(S)-4，5-二甲基-3-(3-甲基哌嗪-1-基)-6-苯基哒嗪(199mg，0.70mmol)和三乙胺(0.30ml，2.15mmol)在DMSO(5mL)中的混合物。在100℃加热反应4天。将反应混合物倒入H2O，用EtOAc漂洗。用EtOAc萃取混合物。用H2O、然后用盐水洗涤有机层两次。经Na2SO4干燥，在减压下浓缩。通过闪式硅胶层析法(梯度为0～10％在CH2Cl2中的MeOH)纯化所得残渣。在MeOH(1mL)中溶解纯化的游离碱，用1M在Et2O(1mL)中的HCl处理。浓缩混合物，提供为黄色泡沫的标题化合物(256mg，76％)。ES/MS m/z444.2(M+1)。
使用适当的哌嗪基哒嗪，基本上按照实施例1中所述的操作，制备下表中的哌嗪基脲。
Figure BDA0000061411500000131
Figure BDA0000061411500000141
生物学
Hedgehog已经牵涉作为下述癌症的存活因子：基底细胞癌；上胃肠道癌(食道癌、胃癌、胰腺癌和胆道癌)；前列腺癌；乳腺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；B细胞淋巴瘤；多发性骨髓瘤；胃癌；卵巢癌；结肠直肠癌；肝癌；黑素瘤；肾癌；和脑癌。
hedgehog途径的组成元件已被称为是用于治疗癌症的潜在药物靶。由成神经管细胞瘤(ATCC，HTB-186)确立的Daoy细胞系对Hh配体有响应。当这些细胞用外源添加的Shh条件培养基处理，Hh信号传导途径被激活，并导致Gli1的表达增加。环巴胺，从玉米百合加州藜芦(corn lily Veratrumcalifornicum)分离的生物碱，是一种弱的hedgehog拮抗剂并且已显示抑制Gli1响应于Shh刺激的表达。最近的观察表明，环巴胺抑制经培养的成神经管细胞瘤细胞和同种异体移植物的生长。使用Daoy细胞模型系统，可以鉴定hedgehog信号传导途径的有效抑制剂。由于本发明的化合物是hedgehog拮抗剂，所以它们适用于治疗前述的肿瘤类型。
生物活性IC 50 的测定
下面的测定方案及其结果进一步表明本发明的化合物和方法的用途和功效。功能测定提供了支持，即本发明化合物显示出抑制Shh信号传导的能力。在以下测定中所用的所有配体、溶剂和试剂从商业来源容易可得或可由本领域技术人员容易制备。
使用Daoy神经元癌细胞中的功能测定以及通过bDNA(支链脱氧核糖核酸)测定系统(Panomics公司，Fremont，CA)测量的Gli1核糖核酸水平确定生物活性。Gli最初在成胶质细胞瘤细胞系中发现并编码由Shh信号传导激活的锌指蛋白。通过用条件培养基(稳定表达重组Shh的人胚肾HEK-293细胞)诱导Gli1在Daoy细胞中的转录24小时，然后测量被激活的Gli1转录的量，从而获得最大响应。最小响应是在已被条件培养基(稳定表达重组Shh的人胚肾HEK-293细胞)刺激24小时的Daoy细胞中用对照化合物抑制的Gli1转录的量。
用于测量Gli1在Daoy细胞中的抑制的功能测定
bDNA测定系统采用支链DNA技术以容许靶核糖核酸(转录物)的扩增。该技术采用三种类型的合成杂交型短Gli1特异性cDNA探针，其确定靶转录物[捕获延伸物(CE)、指示延伸物(LE)和阻断物(BL)]的特异性，该探针类型与靶转录物一起杂交成复合物以扩增杂交信号。在扩增步骤期间添加致化学发光底物使得可以使用发光检测。
从American Type Culture collection(ATCC)获得的Daoy细胞系是Shh响应性人神经元肿瘤细胞系，其在1985年从促结缔组织增生的小脑髓母细胞瘤(cerebellar medullablastoma tumor)建立，是一种生理学相关的肿瘤细胞系。Gli1转录物的内源性水平在Daoy细胞中较低，但可通过使用取自稳定过表达人Shh的细胞(用hShh稳定转染的HEK-293细胞系)的条件培养基来刺激。
在组织培养T225-烧瓶中，在含有最低必需培养基(MEM)+10％胎牛血清(FBS)以及0.1nM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的Daoy生长培养基中使Daoy细胞生长至汇合。使用胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)从T225-烧瓶移除细胞，离心，在培养基中再悬浮，然后计数。
然后将Daoy细胞以每孔50,000个细胞接种到Costar 96孔透明组织培养基板中的生长培养基中，并容许在37℃和5％二氧化碳(CO2)下孵育过夜。将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤1次，然后加入100μL Shh条件培养基(Shh-CM)以刺激Gli1表达的水平。使用对照生长培养基-0.1％FBS/DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium)稀释Shh-CM以实现最大刺激。然后，将经Shh-CM处理的Daoy细胞用约1μM至0.1nM的各种浓度hedgehog抑制剂进行处理。在37℃和5％CO2下允许测试化合物孵育24小时。
如生产商(Panomics公司)所述，通过使用Quantigene 2.0Gli1测定法进行Gli1转录物的测量。制备经稀释的裂解混合物(DLM)缓冲液，其包括蛋白酶K。用化合物孵育24小时后，将细胞用PBS洗涤1次，将180μL DLM加入细胞中。将含有裂解缓冲液的细胞板密封，在55℃放置30至45分钟。然后研磨所得细胞裂解液5次。根据生产商指导、通过在DLM中稀释探针而制备含有Gli1探针的工作探针组，然后将20μL工作探针和80μL Daoy裂解液加入到bDNA测定板中。密封各板，在55℃孵育过夜。然后根据生产商指导处理bDNA板。通过在检测发光的Perkin Elmer Envision读数器上读数各板而对信号进行定量。发光信号正好与存在于样品中的靶转录物的量成比例。
来自功能测定的发光信号数据用于计算体外测定的IC50。基于最大对照值(用Shh-CM处理的Daoy细胞)和最小对照值(用Shh-CM和抑制浓度的对照化合物1μM N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基)-3，5-二甲氧基苯甲酰胺处理的Daoy细胞)，计算数据。使用Activity Base软件程序版本5.3，方程205(Assay Guidance Manual Version5.0，2008，Eli Lilly and Companyand NIH Chemical Genomics Center)，采用四参数逻辑曲线拟合来产生IC50值。
按照所述方案，本文示例的本发明化合物展现出＜15nM的IC50。例如，实施例1的化合物的IC50为约1.26nM，在上述测定中标准误差为0.139(n＝3)。这些结果提供了证据，即本发明化合物是hedgehog拮抗剂并且因此可用作抗癌剂。

Claims (8)

1.下式的化合物或其可药用盐：
Figure FDA0000061411490000011
其中：
R1是氢、氟或氰基；以及
R2和R3独立地为甲基或氢。
2.权利要求1的化合物，其中R1是氢。
3.权利要求1或2的化合物，其中R2和R3中的一个是氢，另一个是甲基。
4.根据权利要求1-3中任一项的化合物或其可药用盐，其中R1是氢、R2是氢，且R3是甲基。
5.药物组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项的化合物或其可药用盐，和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
6.治疗哺乳动物中的脑癌、基底细胞瘤、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆道癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、肾癌或黑素癌的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-4中任一项的化合物或其可药用盐。
7.根据权利要求1-4中任一项的化合物或其可药用盐，其用作药物。
8.根据权利要求1-4中任一项的化合物或其可药用盐，其用于治疗癌症。
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