JP5518088B2

JP5518088B2 - 四置換ピリダジンヘッジホッグ経路アンタゴニスト

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Publication number: JP5518088B2
Application number: JP2011536403A
Authority: JP
Inventors: ジュリア・マリー・クレイ; フィリップ・アーサー・ヒップスカインド; ダニエル・ジョン・サル; ウィルソン貴子; ミシェル・リー・トンプソン; ジョリー・アン・バスチャン
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2009-11-09
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2029-11-09
Also published as: EA201170700A1; ES2446307T3; AU2009314288A1; US20110178093A1; KR20110075020A; CA2743264A1; EP2358703B1; KR101335770B1; BRPI0921777A2; AU2009314288B2; EA018372B1; WO2010056620A1; MX2011005176A; CN102216292B; CN102216292A; US8445493B2; JP2012509265A; EP2358703A1; CA2743264C

Description

本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニストに関し、より具体的には、新規四置換ピリダジンおよびその治療的使用に関する。

ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、細胞分化および増殖に関わることによって胚パターン形成および成体組織維持に重要な役割を果たす。ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、およびデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）を含む、ヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質ファミリーは、自己触媒的切断およびコレステロールのアミノ末端ペプチドへのカップリングを含む、翻訳後修飾を受けて、シグナル伝達活性を有するフラグメントを生成する、分泌糖タンパク質である。Ｈｈは、１２回膜貫通型タンパク質Ｐｔｃｈ（Ｐｔｃｈ１およびＰｔｃｈ２）と結合し、それによりＰｔｃｈにより媒介されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の抑制を軽減する。Ｓｍｏの活性化が一連の細胞間イベントを引き起こし、最終的にＧｌｉの転写因子（Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２およびＧｌｉ３）を安定化し、細胞増殖、細胞生存、血管新生および浸潤に関与するＧｌｉ依存性遺伝子を発現させる。

Ｈｈシグナル伝達は、最近、種々の腫瘍（例えば、膵臓癌、髄芽腫、基底細胞癌、小細胞肺癌、および前立腺癌）の形成を導くＳｈｈシグナル伝達の異常活性化の発見に基づいて、大きな関心を引いている。いくつかのＨｈアンタゴニスト（例えば、ステロイドアルカロイド化合物ＩＰ−６０９、アミノプロリン化合物ＣＵＲ６１４１４、および、２，４−二置換チアゾール化合物ＪＫ１８）が当該技術分野において報告されている。特許文献１は、ヘッジホッグアンタゴニストとして主張された特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。同様に、特許文献２は、ヘッジホッグ経路に関連する病理の診断および処置に関与する、特定の１，４二置換フタラジン化合物を開示している。

国際公開第２００５０３３２８８号国際公開第２００８１１０６１１号

しかしながら、未だ、強力なヘッジホッグ経路阻害剤（特に、所望の薬力学的、薬物動態的、および毒物学的特性を有するもの）が必要とされている。本発明は、この経路の強力なアンタゴニストである新規四置換ピリダジンを提供する。

本発明は、以下の式の化合物

（式中、
Ｒ^１は水素、フルオロまたはシアノであり、
Ｒ^２およびＲ^３は独立してメチルまたは水素である）
または、その薬学的に許容される塩を提供する。

本発明の化合物が第３級アミン部分を含み、多くの無機酸および有機酸と反応可能であり、薬学的に許容される酸付加塩を形成することを、当業者は理解するだろう。このような薬学的に許容される酸付加塩およびこれらを調製する一般的な方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫＯＦＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮＡＮＤＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ．１，１９７７年，１月を参照のこと。

本発明の特定の実施形態は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、ここで、
（ａ）Ｒ^１は水素であり、
（ｂ）Ｒ^２およびＲ^３のうち一方は水素であり、他方はメチルである、請求項１または２の化合物である。

本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を提供する。

本発明の化合物は、好ましくは、種々の経路により投与される薬学的組成物として処方される。好ましくは、このような組成物は、経口投与または静脈内投与のためのものである。このような薬学的組成物およびこれらを調製するプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＰＲＡＣＴＩＣＥＯＦＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，第１９版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，１９９５）を参照のこと。

本発明また、治療を必要とする患者に対し、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者において、脳腫瘍、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌または黒色腫を治療する方法を提供する。

実際に投与される化合物の量は、治療状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物（単数または複数を含む）、年齢、体重、および、個々の患者の反応、患者の症状の重篤度などといった関連する状況に基づいて医師により決定されることが理解されるだろう。一日当たりの投与量は、通常、体重１ｋｇ当たり約０．１から約５ｍｇの範囲内である。場合によっては、上述範囲の下限以下の投与レベルがより適切であり得るが、他の場合、さらに多い投与量もまた適用され得る。したがって、上述の投与範囲は、いかなる場合においても本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明はまた、医薬として使用するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

加えて、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。特に、癌は、脳腫瘍、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌または黒色腫からなる群より選択される。

更に、本発明は、脳腫瘍、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌または黒色腫を治療する活性成分として、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を提供する。

式Ｉの化合物またはその塩は、当該技術分野において公知の種々の手順、ならびに、以下のスキーム、調製物、および実施例に記載された手順により調製され得る。記載された各経路における特定の合成工程は、様々な方法において組み合わされ得るかまたは様々なスキームからの工程と組み合わされ得て、式Ｉの化合物またはその塩を調製する。

他に指定しない限り、置換基は上述のように定義される。試薬および出発物質は当業者が一般的に容易に取得可能である。その他については、有機化学および複素環化学の標準的な技術、既知の構造類似化合物を合成する類似した技術、ならびに、任意の新規手順を含む以下の調製物および実施例において記載された手順によって作製され得る。

本願明細書において、以下の用語は、以下に示す意味を有する。「ｂｏｃ」または「ｔ−ｂｏｃ」は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを意味する。「ＥＤＣＩ」は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を意味する。「Ｅｔ_２Ｏ」は、ジエチルエーテルを意味する。「ＨＯＢＴ」は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を意味する。「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味する。「ＤＭＳＯ」は、メチルスルホキシドを意味する。「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを意味する。「ＭｅＯＨ」は、メタノールを意味する。「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を意味する。「ＳＣＸ」は、強カチオン交換を意味する。そして、「ＩＣ_５０」は、薬剤にとって可能な最大阻害反応の５０％を生じるその薬剤の濃度を意味する。

式Ｉの化合物は、スキーム１に記載された反応にしたがって調製され得る。

スキーム１において、１，３，６−ジクロロ−４，５−ジメチルピリダジン（１）を、芳香族求核置換反応（ＳＮＡｒ）において、モノｂｏｃ保護置換ピペラジン（２）で置換して、式（３）の３−クロロ−４，５−ジメチル−６−（置換）ピリダジンを生成する。例えば、工程１において、（１）の塩化物を、有機塩基（例えばジイソプロピルエチルアミン）の存在下で、極性非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中にて、置換されたモノｂｏｃ保護ピペラジンで反応させ得る。工程２において、ジメチルピリダジン（３）上の残余塩化物を、鈴木・宮浦クロスカップリング反応において、フェニルボロン酸（４）で反応させて、対応する４，５−ジメチル−６−置換フェニルピリダジン−３−置換ピペラジン（５）を得ることができる。当業者は、このようなクロカップリング反応を促進するのに有用な種々の条件が存在することを理解するであろう。この反応条件は、適切な溶媒（例えば、ジオキサンまたはジオキサン／水）を利用し、フッ化セシウムなどの塩基の存在下で達成される。この反応を、約８０〜１６０℃の温度にて不活性雰囲気下で、パラジウム触媒（例えば、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド）の存在下で実施して、式（５）の化合物を得る。アミンを標準的な脱保護方法により脱保護することができる。窒素保護基を導入し、除去する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９９）を参照のこと）。例えば、式（５）のピペラジンのｂｏｃ脱保護を、適切な溶媒（例えば、メタノールまたはジオキサン）中の酸性条件（例えば、塩化水素）下で達成して、式（６）の化合物を得ることができる。工程４におけるアミンのアシル化を、極性非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で有機塩基（例えば、トリエチルアミン）を使用し、約９０〜１１０℃まで熱して、置換トリクロエチルカルバメート（７）で達成することができる。式Ｉの化合物を、当業者に公知の方法によって、例えば、Ｅｔ_２ＯにＨＣｌを添加することにより、塩（例えば、ＨＣｌ塩）に変換して、式Ｉの化合物を得ることができる。

置換トリクロロエチルカルバメートを、スキーム２に示されるように調製することができる。

４，４−ジフルオロシクロヘキシルアミン塩酸塩（８）を、不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で、有機塩基（例えば、トリエチルアミン）を用いて、２，２，２−トリクロロエチルカルボノクロリダート（９）でアシル化して、２，２，２−トリクロロエチル４，４−ジフルオロシクロヘキシルカルバメート（７）を得る（工程１）。

あるいは、３，６−ジクロロ−４，５−ジメチルピリダジンを、スキーム３に示される環化ピペラジンに合成され得るベンジルエチレンジアミンでアルキル化することができる。

（１）の塩化物を、スキーム３の工程１において示したように、極性非プロトン性溶媒（例えばＤＭＳＯ）中で、有機塩基（例えば、ジイソプロピルアミン）を用い、１１０〜１３０℃にて加熱して、ベンジルエチレンジアミン（１０）で置換することで、式（１１）の保護されたエチレンジアミンピリダジンを得る。第２の塩化物を、工程２に示したボロン酸（４）で上記のように反応させて、式（１２）の化合物を得ることができる。ベンジル窒素を、ＨＯＢＴとともに有機塩基（例えば、トリエチルアミン）および適切なカップリング試薬（例えば、ＥＤＣＩ）を用いて、２−クロロプロピオン酸（１３）でアシル化して、工程３に示すような式（１４）の化合物を得る。ピリダジンを形成するために環化を、不活性溶媒（例えば、ＴＨＦ）中にて水素化ナトリウムで達成して、式（１５）の化合物を得る（工程４）。還元剤（例えば、ボラン−硫化メチル）は、ケトンを還元して、式（１６）の化合物を得る（工程５）。例えば、式（１５）の化合物を、不活性溶媒（例えば、ＴＨＦ）中にてボラン−硫化メチル錯体で処理することができる。混合物を４０〜６０℃まで加熱して、式（１６）の置換ピペラジンを得ることができる。ピペラジンの脱保護を、極性溶媒（例えば、エタノール）を用いて、触媒（例えば、１０％のＰｄ／Ｃ）とともに、４０〜７０ｐｓｉ水素ガスの水素処理条件下で達成して、式（６）の化合物を得る（工程６）。工程７においてアミンのアシル化を、極性非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）中で、有機塩基（例えば、トリエチルアミン）を用い、約９０〜１１０℃まで加熱して、置換トリクロエチルカルバメート（７）で達成して、式Ｉの化合物を得ることができる。ここで、この化合物は、当業者に公知の方法によって、例えば、Ｅｔ_２ＯにＨＣｌを添加することにより、塩（例えば、ＨＣｌ塩）に変換され得る。

以下の調製物および実施例は、本発明を更に詳細に例示するために提供され、式１の化合物の典型的な合成を示すものである。本発明の化合物の名称は、一般的にＣｈｅｍＤｒａｗＵｌｔｒａ（登録商標）１０．０により提供される。

調製物１
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−２−メチルピペラジン−１−カルボキシレート

ＤＭＳＯ（３０ｍＬ）中の１，４−ジクロロ−２，３−ジメチルピリダジン（６．０６ｇ，３４．２ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−メチル−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６．８８ｇ，３４．４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（３０ｍｌ，１７２ｍｍｏｌ）の混合物を、１２０℃で５日間、加熱する。混合物を冷却し、さらに（Ｓ）−２−メチル−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３．７４ｇ，１８．７ｍｍｏｌ）で処理し、さらに２日間１２０℃で加熱を再開する。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ_２Ｏおよびブラインで洗浄する。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中に２０〜５０％のＥｔＯＡｃの勾配）により精製して、淡黄色の泡状物として標題の化合物（７．３６ｇ，６３％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ（^３５Ｃｌ）３４１．０（Ｍ＋１）。

調製物２
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４，５−ジメチル−６−フェニルピリダジン−３−イル）−２−メチルピペラジン−１−カルボキシレート

１，４−ジオキサン（１２０ｍＬ）中の（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−２−メチルピペラジン−１−カルボキシレート（３．０３ｇ，８．８７ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸（１．６２ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）、およびＣｓＦ（４．０９ｇ，２６．９ｍｍｏｌ）のＮ_２で脱気した混合物を、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（１．０８ｇ，１．３２ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を９５℃で一晩加熱する。反応物を冷却し、ＥｔＯＡｃとＨ_２Ｏとの間で分配する。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中に１５〜８５％のＥｔＯＡｃの勾配）により精製して、白色固体として標題の化合物（２．９３ｇ，８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３８３．０（Ｍ＋１）。

適切なフェニルボロン酸を用いて、調製物２に記載される手順に実質的に従って以下の表の置換ジメチルピリダジンを調製する。

調製物５
（Ｓ）−４，５−ジメチル−３−（３−メチルピペラジン−１−イル）−６−フェニルピリダジン

ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４，５−ジメチル−６−フェニルピリダジン−３−イル）−２−メチルピペラジン−１−カルボキシレート（２．９３ｇ，７．６６ｍｍｏｌ）の溶液を、１，４−ジオキサン（１０ｍＬ，４０．０ｍｍｏｌ）中の４ＭのＨＣｌで処理する。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮する。残留物をＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸカラム（Ｖａｒｉａｎ，１０ｇ）上に注ぐ。カラムをＭｅＯＨでリンスする。所望の生成物を２ＭのＮＨ_３／ＭｅＯＨで溶出する。減圧下で濃縮して、標題の化合物（２．０７ｇ，９５％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２８３．０（Ｍ＋１）。

３時間の反応時間で適切なｂｏｃ保護ピペラジンを用いて、および溶媒としてＭｅＯＨの代わりに１，４−ジオキサンを用いて、調製物５に記載される手順に実質的に従って以下の表の脱保護したピペラジンを調製する。

調製物８
Ｎ１−ベンジル−Ｎ２−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）エタン−１，２−ジアミン

ＤＭＳＯ（７８ｍＬ）中の３，６−ジクロロ−４，５−ジメチルピリダジン（６．９０ｇ，３９．０ｍｍｏｌ）、Ｎ−ベンジルエチレンジアミン（８．７８ｇ，５８．５ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（２５．２ｇ，１９５ｍｍｏｌ）の混合物を、１２０℃で３日間加熱する。反応混合物を冷却し、Ｈ_２Ｏに注ぎ、混合物をＥｔ_２Ｏで抽出する。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０〜５％の２ＭのＮＨ_３／ＭｅＯＨの勾配）を用いて精製して、ろう状の固体として標題の化合物（６．４１ｇ，５７％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２９１．２（Ｍ＋１）。

調製物９
Ｎ１−ベンジル−Ｎ２−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）エタン−１，２−ジアミン

１，４−ジオキサン（２２０ｍＬ）中のＮ１−ベンジル−Ｎ２−（６−クロロ−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）エタン−１，２−ジアミン（６．４０ｇ，２２．０ｍｍｏｌ）、４−フルオロフェニルボロン酸（９．２４ｇ，６６．０ｍｍｏｌ）およびＣｓＦ（１０．０ｇ，６６．０ｍｍｏｌ）のＮ_２で脱気した混合物を、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（２．７０ｇ，３．３０ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を９５℃で一晩加熱する。冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３（水溶液）とＥｔＯＡｃとの間に分配する。層を分離し、ＥｔＯＡｃで水層を抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中に０〜６％の２ＭのＮＨ_３／ＭｅＯＨの勾配）により精製して、ろう状の固体として標題の化合物（４．９１ｇ，６４％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３５１．２（Ｍ＋１）。

調製物１０
（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−２−クロロ−Ｎ−（２−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イルアミノ）エチル）プロパンアミド

ＣＨ_２Ｃｌ_２（７０ｍＬ）中のＮ１−ベンジル−Ｎ２−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）エタン−１，２−ジアミン（４．９０ｇ，１３．９８ｍｍｏｌ）の溶液を、（Ｒ）−（＋）−２−クロロプロピオン酸（１．８４ｍＬ，２０．９７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．９２ｍＬ，２０．９７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３．２１ｇ，２０．９７ｍｍｏｌ）、および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４．０２ｇ，２０．９７ｍｍｏｌ）で連続して処理する。得られた混合物を周囲温度で一晩攪拌する。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄する。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中に２０％のＥｔＯＡｃ）により精製して、黄色の泡状物として標題の化合物（４．５９ｇ，７４％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４１．２（Ｍ＋１）。

調製物１１
１−ベンジル−４−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−３−メチルピペラジン−２−オン

ＴＨＦ（１０４ｍＬ）中の（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−２−クロロ−Ｎ−（２−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イルアミノ）エチル）プロパンアミド（４．５９ｇ，１０．４ｍｍｏｌ）の０℃の溶液をＮａＨ（６０％，６２５ｍｇ，１５．６ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を周囲温度まで加温し、一晩攪拌する。反応物を０℃まで冷却し、さらにＮａＨ（６０％，２０８ｍｇ，５．２０ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を周囲温度まで加温し、３日間攪拌する。反応混合物をブラインとＥｔＯＡｃとの間に分配する。有機層を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中に０〜２％の２ＭのＮＨ_３／ＭｅＯＨの勾配）により精製して、白色の泡状物として標題の化合物（３．６４ｇ，８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４０５．２（Ｍ＋１）。

調製物１２
３−（４−ベンジル−２−メチルピペラジン−１−イル）−６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン

ＴＨＦ（７０ｍＬ）中の１−ベンジル−４−（６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン−３−イル）−３−メチルピペラジン−２−オン（２．８４ｇ，７．０２ｍｍｏｌ）の溶液を、ボラン−硫化メチル錯体（１．９６ｍＬ，２１．１ｍｍｏｌ）で処理する。得られた混合物を５０℃で２時間加熱する。反応混合物を氷浴中で冷却し、滴下漏斗によりＭｅＯＨ（２０ｍＬ）、続いて１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中の４ＭのＨＣｌを加える。得られた混合物を６５℃にて１時間加熱する。混合物を減圧下で濃縮する。残留物をＣＨ_２Ｃｌ_２と飽和ＮａＨＣＯ_３（水溶液）との間に分配する。層を分離し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で水層を抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中に０〜３％の２ＭのＮＨ_３／ＭｅＯＨの勾配）により精製して、ろう状の固体として標題の化合物（２．４５ｇ，８９％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３９１．２（Ｍ＋１）。

キラルクロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＪ−Ｈ、流速３０ｍＬ／分、検出２２５ｎｍ、６：４のＭｅＯＨ：アセトニトリル）によって３−（４−ベンジル−２−メチルピペラジン−１−イル）−６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジンの異性体を分離する。第１の溶出ピーク、異性体１：９９％ｅｅ。第２の溶出ピーク、異性体２：９９％ｅｅ。

調製物１５
３−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチル−６−（２−メチルピペラジン−１−イル）ピリダジン

無水ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中の３−（４−ベンジル−２−メチルピペラジン−１−イル）−６−（４−フルオロフェニル）−４，５−ジメチルピリダジン（２００ｍｇ，３．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＥｔＯＨ（５ｍＬ）で予め湿らせた１０％のＰｄ／Ｃ（４６．８ｍｇ）に加える。混合物を、１０時間６０ｐｓｉにてＨ_２で加圧したＰａｒｒボトル中で振盪する。反応混合物を濾過し、溶液をＳＣＸカラム（Ｖａｒｉａｎ，２ｇ）に直接適用する。カラムをＭｅＯＨおよびＣＨ_２Ｃｌ_２でリンスする。生成物を、２ＭのＮＨ_３／ＭｅＯＨとＣＨ_２Ｃｌ_２との１：１の混合物で溶出する。減圧下で溶出液を濃縮して、オフホワイトの泡状物として標題の化合物（１４２ｍｇ，９２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３０１．２（Ｍ＋１）。

適切な保護アミンを用いて、実施例１５に記載される手順に従って以下の表の脱保護メチルピペラジンを調製する。

調製物１８
２，２，２−トリクロロエチル４，４−ジフルオロシクロヘキシルカルバメート

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１９２ｍＬ）中の４，４−ジフルオロシクロヘキシルアミン塩酸塩（３．２９ｇ，１９．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５．８８ｍＬ，４２．２ｍｍｏｌ）の０℃の混合物を、２，２，２−トリクロロエチルカルボノクロリダート（２．９１ｍＬ，２１．１ｍｍｏｌ）の液滴で処理する。１時間後、反応混合物を周囲温度まで加温し、一晩攪拌する。反応混合物をＨ_２ＯとＣＨ_２Ｃｌ_２との間に分配し、層を分離する。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、オフホワイトの固体として標題の化合物（５．７５ｇ，９７％）を得る。ＧＣ／ＭＳｍ／ｚ ^３５Ｃｌ３０９（Ｍ^＋）。

実施例１
（Ｓ）−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−４−（４，５−ジメチル−６−フェニルピリダジン−３−イル）−２−メチルピペラジン−１−カルボキシアミド塩酸塩

ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中の（Ｓ）−４，５−ジメチル−３−（３−メチルピペラジン−１−イル）−６−フェニルピリダジン（１９９ｍｇ，０．７０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．３０ｍｌ，２．１５ｍｍｏｌ）の混合物を、２，２，２−トリクロロエチル４，４−ジフルオロシクロヘキシルカルバメート（３４１ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ）で処理する。反応物を１００℃で４日間加熱する。反応混合物をＨ_２Ｏに注ぎ、ＥｔＯＡｃでリンスする。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層をＨ_２Ｏで２回、次いでブラインで洗浄する。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残留物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２中に０〜１０％のＭｅＯＨの勾配）により精製する。精製した遊離塩基をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ_２Ｏ（１ｍＬ）中の１ＭのＨＣｌで処理する。混合物を濃縮して、黄色の泡状物として標題の化合物（２５６ｍｇ，７６％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４４．２（Ｍ＋１）。

適切なピペラジニルピリダジンを用いて、実施例１に記載される手順に実質的に従って以下の表のピペラジニル尿素を調製する。

生物学
ヘッジホッグは以下の癌：基底細胞癌；上部消化管癌（食道、胃、膵臓、および胆管）；前立腺癌；乳癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；Ｂ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫；胃癌；卵巣癌；結腸直腸癌；肝臓癌；黒色腫；腎臓癌；および脳腫瘍についての生存因子として関与している。

ヘッジホッグ経路の要素は癌の治療のための潜在的な薬剤標的であると主張されている。骨芽腫から確立されたＤａｏｙ細胞株（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ−１８６）はＨｈリガンドに応答する。これらの細胞を外から加えられたＳｈｈ馴化培地で処理する場合、Ｈｈシグナル伝達経路は活性化され、Ｇｌｉ１の増大された発現を生じる。コーンリリー（ｃｏｒｎｌｉｌｙ）Ｖｅｒａｔｒｕｍｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍから単離されたアルカロイドである、シクロパミンは弱いヘッジホッグアンタゴニストであり、Ｓｈｈ刺激に応答するＧｌｉ１の発現を抑制することが示されている。最近の観測により、シクロパミンが、培養された髄芽腫細胞および同種移植片の増殖を阻害することが示唆されている。このＤａｏｙ細胞モデルシステムを用いて、ヘッジホッグシグナル伝達経路の潜在的な阻害剤が同定され得る。本発明の化合物はヘッジホッグアンタゴニストであるため、それらは上述の腫瘍タイプを治療するのに適している。

生物学的活性ＩＣ_５０の測定
以下のアッセイプロトコルおよびその結果は、本発明の化合物および方法の有用性および効果をさらに実証する。機能的アッセイは、本発明の化合物がＳｈｈシグナル伝達を阻害する能力を示すという支持を提供する。以下のアッセイに利用される全てのリガンド、溶媒、および試薬は、市販の供給業者から容易に入手可能であるか、または当業者により容易に調製され得る。

生物活性を、ＤＡｏｙニューロン癌細胞において機能的アッセイを用いて測定し、ｂＤＮＡ（分枝デオキシリボ核酸）アッセイ系（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によってＧｌｉ１リボ核酸のレベルを測定する。Ｇｌｉは最初に膠芽腫細胞株において発見され、Ｓｈｈシグナル伝達によって活性化される亜鉛フィンガータンパク質をコードする。最大反応は、２４時間、馴化培地（ヒト胎児腎臓細胞である、組み換えＳｈｈを安定発現するＨＥＫ−２９３細胞）を用いてＤａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１転写を誘発することによって得られ、次いで、刺激されたＧｌｉ１転写産物の量を測定する。最小反応は、２４時間、馴化培地（ヒト胎児腎臓細胞である、組み換えＳｈｈを安定発現するＨＥＫ−２９３細胞）で刺激されているＤａｏｙ細胞においてコントロール化合物で阻害されるＧｌｉ１転写産物の量である。

Ｄａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１の阻害を測定するための機能的アッセイ
ｂＤＮＡアッセイ系は、標的リボ核酸（転写産物）の増幅を可能にする分枝鎖ＤＮＡの技術を利用する。この技術は、ハイブリダイゼーションシグナルを増幅するために標的転写産物との複合体としてハイブリダイズする標的転写産物の特異性を測定する３種類の合成ハイブリッド短Ｇｌｉ１−特異的ｃＤＮＡプローブ［捕捉増量剤（ＣＥ）、標識増量剤（ＬＥ）および遮断剤（ＢＬ）］を利用する。増幅工程の間の化学発光基質の添加により、発光を用いる検出が可能となる。

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得たＤａｏｙ細胞株は、Ｓｈｈ反応ヒトニューロン腫瘍細胞株であり、生理学的に関連する腫瘍細胞株である、線維形成小脳髄芽腫から１９８５年に確立された。Ｇｌｉ１転写産物レベルの内因性レベルはＤａｏｙ細胞において低いが、ヒトＳｈｈを安定に過剰発現する細胞（ｈＳｈｈで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞株）から得た馴化培地を用いることによって刺激され得る。

Ｄａｏｙ細胞を、０．１ｎＭの非必須アミノ酸および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを有する最小必須培地（ＭＥＭ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤａｏｙ増殖培地中で組織培養Ｔ２２５フラスコにおいてコンフルエンシーまで増殖させる。細胞を、トリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてＴ２２５フラスコから除去し、遠心分離し、培地に再懸濁し、次いで計数した。

次いで、Ｄａｏｙ細胞を、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル透明組織培養プレートにおいて増殖培地中で１ウェルあたり５０，０００細胞にて播種し、５％二酸化炭素（ＣＯ_２）下で３７℃にて一晩、インキュベートする。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１度洗浄し、続いて、１００μＬのＳｈｈ馴化培地（Ｓｈｈ−ＣＭ）を加えて、Ｇｌｉ１発現のレベルを刺激する。Ｓｈｈ−ＣＭを希釈して、コントロール増殖培地−０．１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用いて最大刺激を達成する。次いで、Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞を、約１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の種々の濃度のヘッジホッグ阻害剤で処理する。試験化合物を、５％ＣＯ_２下で３７℃にて２４時間インキュベートする。

Ｇｌｉ１転写産物の測定を、製造業者（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって記載されるＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０Ｇｌｉ１アッセイを用いて実施する。プロテイナーゼＫを含む、希釈した溶解混合物（ＤＬＭ）緩衝液を調製する。化合物との２４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、１８０μＬのＤＬＭを細胞に加える。溶解緩衝液を含有する細胞プレートを密閉し、５５℃にて３０〜４５分間、静置させる。次いで、得られた細胞溶解物を５回粉砕する。Ｇｌｉ１プローブを含有する作業プローブセットを、製造業者の指示に従って、ＤＬＭ中でプローブを希釈することによって作製し、次いで、２０μＬの作業プローブセットを、８０μＬのＤａｏｙ溶解物とともにｂＤＮＡアッセイプレートに加える。プレートを密閉し、５５℃にて一晩インキュベートする。次いで、ｂＤＮＡプレートを、製造業者の指示に従って処理する。シグナルを、発光を検出するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーでプレートを読み取ることによって定量化する。発光シグナルは、サンプルに存在する標的転写産物の量と正比例する。

機能的アッセイからの発光シグナルデータを、インビトロでのアッセイに関するＩＣ_５０を算出するために使用する。データを、最大コントロール値（Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞）および最小コントロール値（Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞およびコントロール化合物、１μＭのＮ−（３−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−４−クロロフェニル）−３，５−ジメトキシベンズアミドの阻害濃度）に基づき算出する。４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用して、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアプログラムバージョン５．３、等式２０５（ＡｓｓａｙＧｕｉｄａｎｃｅＭａｎｕａｌＶｅｒｓｉｏｎ５．０，２００８，ＥｌｉＬｉｌｌｙａｎｄＣｏｍｐａｎｙａｎｄＮＩＨＣｈｅｍｉｃａｌＧｅｎｏｍｉｃｓＣｅｎｔｅｒ）を用いてＩＣ_５０値を生成する。

記載されるプロトコルによれば、本明細書に例示した本発明の化合物は、１５ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す。例えば、実施例１の化合物は、上記のアッセイにおいて０．１３９（ｎ＝３）の標準誤差で約１．２６ｎＭのＩＣ_５０を有する。これらの結果は、本発明の化合物がヘッジホッグアンタゴニストであり、例えば抗癌剤として有用であるという証拠を与える。

Claims

以下の式の化合物

（式中、
Ｒ^１は水素、フルオロまたはシアノであり、
Ｒ^２およびＲ^３は独立してメチルまたは水素である）
または、その薬学的に許容される塩。
Ｒ^１は水素である、請求項１に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩。
Ｒ^２およびＲ^３のうち一方は水素であり、他方はメチルである、請求項１または２に記載の化合物、または、その薬学的に許容される塩。
（Ｓ）−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−４−（４，５−ジメチル−６−フェニルピリダジン−３−イル）−２−メチルピペラジン−１−カルボキシアミド塩酸塩である、請求項１から３のうちいずれか一項に記載の化合物。
薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、請求項１から４のうちいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物。
癌の治療に使用するための、請求項５に記載の薬学的組成物。
前記癌は、脳腫瘍、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌および黒色腫からなる群より選択される、請求項６に記載の使用のための薬学的組成物。