KR20110053119A - 뇌혈관 장벽을 통과하여 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 세포사멸을 표적하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

뇌혈관 장벽을 통과하여 퇴행성 뇌 질환 부위의 세포사멸을 표적하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌 조직으로의 약물전달용 조성물, 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 사멸 세포(apoptotic cell) 검출용 조성물 및 퇴행성 뇌신경질환 부위의 영상화용 조성물 및 상기 펩타이드 및 이와 결합된 퇴행성 뇌신경 질환 예방/치료 및 치료진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있으며, 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 퇴행성 뇌신경질환에서 아포토시스의 검출, 더 나아가 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포 (특히, 사멸신경세포)의 검출과 영상진단, 표적 약물전달, 치료진단 등의 목적으로 다양하게 사용될 수 있다.
뇌혈관 장벽, 퇴행성 뇌신경질환, 사멸세포, 영상화, 약물전달, 펩타이드

Description

뇌혈관 장벽을 통과하여 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 세포사멸을 표적하는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide that cross blood-brain barrier and target apoptosis in neurodegenerative diseases and uses thereof}
뇌혈관 장벽을 통과하여 퇴행성 뇌 질환 부위의 세포사멸을 표적하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌 조직으로의 약물전달용 조성물, 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 사멸 세포(apoptotic cell) 검출용 조성물 및 퇴행성 뇌신경질환 부위의 영상화용 조성물 및 상기 펩타이드 및 이와 결합된 퇴행성 뇌신경 질환 예방/치료 및 치료진단용 조성물에 관한 것이다.
아포토시스란 개체의 생명 유지를 위해서 불필요한 세포 혹은 위험한 세포를 스스로 죽게 하도록 하는 현상을 말한다. 아포토시스는 그리스어로 "떨어져 나간다"를 뜻하며 세포가 죽어 가는 과정에서 마치 꽃에서 잎들이 떨어지듯이 세포의 구조물들이 떨어져 나가는 것을 표현하여 붙여진 이름으로, 1972년 Kerr 등에 의해 처음으로 관찰되었다(Kerr et al., Br J Cancer, 1972, 26:239-257). 아포토시스는 세포의 발생, 분화, 면역 등의 생리학적 현상에 중요한 역할을 한다(Meier et al., Nature, 2000, 407:796-801). 한편, 여러 가지 병리학적 환경 및 질환에서도 아포토시스는 중요하다. 예를 들어, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병 등 퇴행성 뇌신경질환에서 베타 아밀로이드 등의 축적으로 신경세포가 손상을 받아 아포토시스 발생이 증가한다(Thomson, Science, 1995). 또 다른 예로, 항암제로 성공적 치료를 하는 경우 다량의 아포토시스가 종양조직 내 발생한다(Thomson, Science, 1995, 267:1456-1462). 반면, 종양의 발생에는 아포토시스의 감소가 원인으로 관여한다. 또한 뇌졸중 및 심근경색에서 뇌 및 심장으로 가는 혈액 공급의 부족으로 뇌세포 및 심근세포가 각각 손상을 받아 아포토시스가 발생한다(Du et al, J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16:195-201; Narula et al., New Engl J Med, 1996, 335:1182-1189). 또한 장기 이식 후 거부반응, 자가면역질환, 동맥경화 및 바이러스 감염 등의 질환에서도 아포토시스가 흔히 발생한다(Thomson, Science, 1995, 267:1456-1462; Kageyama et al., Ann Thorac Surg, 1998, 65:1604-1609).
이러한 아포토시스는 임상적으로 진단 및 치료적 측면에서 매우 중요한 의미를 가진다. 즉, 아포토시스의 영상화는 이의 과도한 증가와 연관된 퇴행성 뇌신경질환(알츠하이머 병 및 파킨슨 병 등)의 조기 진단 및 병의 진행 정도 모니터링, 심근경색 및 뇌졸중에서 병의 진행 정도 모니터링, 항암제 처리에 의한 암 치료효과 모니터링, 동맥경화에서 동맥경화반의 파열 가능성 판단 등의 경우에 매우 큰 도움이 될 것이다. 또한 아포토시스가 왕성한 부위에 이를 표적으로 치료제나 세포를 보호하는 제제를 선택적으로 전달하게 되면 부작용을 줄이면서 치료효과를 훨씬 높일 수 있을 것이다.
사멸세포에서 일어나는 초기 사건의 하나는 세포막을 구성하는 인지질(phospholipid)의 분포 변화이다. 이 중 가장 특징적인 것으로 포스파티딜세린(phosphatidylserine)의 세포막 바깥쪽으로의 노출이다. 정상적으로 포스파티딜세린은 세포막의 내부에 존재하나 세포가 사멸신호를 받거나 적혈구가 노화되면 세포막의 외부로 노출된다(Fadeel, B. et al., Cell Mol Life Sci, 2003, 60:2575-2585). 이러한 포스파티딜세린을 대식세포가 세포표면의 수용체를 통해서 인식하여 사멸세포에 대한 탐식작용을 일으킨다(Fadok, V.A. et al., J immunol 1992, 148:2207-2216; Fadok, V. A. et al., Nature 2000, 405:85-90; Park, S.Y. et. al., Cell Death Differ, 2008, 15:192-201). 특히, 많은 종양세포들이 세포막의 외부로 포스파티딜세린의 발현 증가를 나타낸다(Utsugi, T. et al., Cancer Res. 1991, 15:3062-3066; Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Woehlecke, H. et al., Biochem J. 2003, 376:489-495). 또한 종양조직 내 소혈관의 혈관내피세포는 포스파티딜세린을 세포막의 외부로 노출하고 있다(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Zwaal, R.F.A. et al., Blood. 1997, 89:1121-1132). 따라서, 이러한 포스파티딜세린의 역할들로 인해 특히 종양을 비롯한 여러 상황에서 포스파티딜세린은 진단, 치료, 및 치료추적을 위한 표적 물질로 제시되고 있다.
현재 사멸세포 표면의 포스파티딜세린을 검출하는데 주로 사용되는 것은 아넥신 V(annexin V) 단백질이다. 이는 분자량 36 kDa 짜리 단백질로서 포스파디딜세린과 강한 친화도(affinity)로서 결합한다(Vermes, I. et al., Immunol Methods. 1995, 184:39-51). 한편, 아넥신 V는 시험관(in vitro) 내에서는 아주 유용한 표적 물질 또는 프로브(probe)이나, 큰 분자량 때문에 체외로의 제거가 늦게 되는 문제 및 정상세포에 대한 비특이적 결합 등의 문제로 인해 생체(in vivo) 내 사용은 제한적이라 보고되었다(Vermeersch, H., et al., Nucl Med Commun. 2004, 25:259-263; Belhocine, T.Z. et al., J Proteome Res. 2004, 3:345-349).
한편, 알츠하이머 병의 경우 현재 PIB(Pittsburgh Compound B, N-methyl 2-(4'-methylaminophenyl-6-hydroxybenzathiazole)라는 물질이 알츠하이머 병 조직 내 베타 아밀로이드 단백질과 결합하는 성질을 이용하여, 이를 방사성 동위원소인 [11C]를 표지하여 핵의학적 영상용 또는 진단용으로 사용되고 있다. 그러나 아밀로이드의 축적이 신경손상 또는 세포사멸 및 환자의 임상 증상을 정확하게 반영하는지에 대해서는 아직도 논쟁이 되고 있고 분명치 않다. 더구나, [11C]-PIB는 알츠하이머 병에 대한 특이적인 영상 프로브가 아니라, 베타 아밀로이드 관련된 뇌 아밀로이드증(beta amyloid-related cerebral amyloidosis)에 대한 비특이적 영상 프로 브라는 보고도 있다(Lockhart et al., Brain. 2007, 130:2607-2615). 이러 측면을 고려할 때, 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 뇌신경질환에서 세포사멸을 직접적으로 검출하거나 진단함으로써 정확한 병의 진행 정도를 파악하는 기술이 요구된다.
뇌혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 뇌혈관의 내피세포 간의 조밀한 연결(tight junction) 및 이를 더욱 강화하는 성상세포(astrocyte)로 이루어진 구조물로서, 혈관 내부의 물질이 혈관벽을 통과하여 뇌 실질 내로 쉽게 나오지 않게 해주는 기능을 한다. 이런 이유로 뇌질환 치료제로 개발된 상당수의 약이 뇌혈관 장벽의 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 또한 아포토시스를 검출하거나 표적할 수 있는 물질 중에도 뇌혈관 장벽 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 현재 뇌혈관 장벽을 통과하여 약물 등을 전달해 줄 수 있는 전달체(carrier)에 대한 개발이 활발하게 진행 중이다. 한편, 특정한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 뇌혈관 장벽 통과하며 약물이나 siRNA 등을 전달하는 기능을 갖고 있다 (Kumar et al., Nature. 2007, 448:39-43; Teixido 및 Giralt, Journal of peptide science. 2008, 14:163-173).
한편, 치료진단(theranosis)은 치료(therapy)와 진단(diagnosis, diagnostics)의 합성어로 진단기술과 융합된 치료기술을 나타내는 것이다. 그 경우, 각각의 환자에 있어서 치료제에 있어서의 반응을 확인하여 이를 치료법의 선정에 적용할 수 있으므로 약물의 오용이나 남용을 막고, 치료효과를 높이는 데에 크 게 기여할 수 있다. (Frederic P et al., Crit Care Med, 2009, Vol. 37, No. 1(Suppl.) S50-S58; Haglund E et al.. Annals of Biomedical Engineering, Vol. 37, No. 10, 2009, pp. 2048??.2063; Ozdemir V et al., Nature Biotechnology, Vol. 24, No. 8, 2006, 942-946)
이에 본 발명자들은 뇌혈관 장벽을 효과적으로 통과하고 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포를 특이적으로 그리고 초기에 생체 내 표적화 할 수 있는 새로운 단백질 또는 그 단편을 탐색하고자 연구한 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 뇌혈관 장벽을 통과하고 퇴행성 뇌신경질환 조직의 사멸세포를 특이적으로 표적할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 뇌혈관 장벽을 통과하여 퇴행성 뇌신경질환 부위의 세포사멸을 표적하는 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌 조직으로의 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 사멸 세포(apoptotic cell) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 퇴행성 뇌신경질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 펩타이드, 이와 결합된 퇴행성 뇌신경질환 치료제 및 표지물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 치료진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 가지는 펩타이드가 뇌혈관 장벽을 통과한다는 점에 착안하여, 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌 조직으로의 약물전달용 조성물, 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 사멸 세포(apoptotic cell) 검출용 조성물 및 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공하고, 상기 펩타이드 및 이와 결합된 퇴행성 뇌신경질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 예방/치료 및 치료진단용 조성 물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 펩타이드는 사멸세포 표적용 펩타이드(아미노산 서열 CQRPPR, 일명 ApoPep-1)로서, 아포토시스가 진행되고 있는 사멸세포에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1(CQRPPR)의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 모든 종류의 펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 사멸세포에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩타이드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 사멸세포에 특이적으로 결합하는 것으로 선별되었으며, 아포토시스 과정에 있는 배양상태의 종양세포, 정상상피세포 및 마크로파지를 특이적으로 인식함으로써 상기 세포에 결합한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 종양조직 내 사멸세포를 표적하여 이에 대한 생체 내 영상(in vivo imaging) 및 모니터링이 가능하고, 약물을 대상질환 부위에 전달하는 것도 가능하다.
아울러, 본 발명의 펩타이드는 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 통과하여 뇌 조직, 보다 구체적으로는 뇌실질, 뇌의 신경세포 또는 신경조직 내로 쉽게 나올 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 뇌 조직에서 아포토시스가 진행되고 있는 사멸세포에 특이적으로 결합할 수 있어 사멸세포에 약물을 전달할 수 있 다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌 조직으로의 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 사멸세포에 특이적으로 결합하는 것으로 선별된 상기 펩타이드의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 본 발명의 펩타이드가 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있으며, 퇴행성 뇌신경질환 조직(또는 부위) 내 아포토시스 과정에 있는 사멸세포를 특이적으로 인식함으로써 상기 세포에 결합한다는 사실을 확인하였다. 또한, 본 발명의 펩타이드가 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포를 표적하여 이에 대한 생체 내 영상(in vivo imaging) 및 모니터링이 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 퇴행성 뇌신경질환 부위로 약물을 전달하는 데에이용할 수 있고, 퇴행성 뇌신경질환 조직 내에 사멸세포를 검출하고, 이를 영상화하며, 진단 또는 치료추적용 제제, 또는 별도의 치료용 제제와 더불어 퇴행성 뇌신경질환 조직의 질환 예방 및 치료, 치료진단의 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 근적외선 형광시약을 표지한 서열번호 1로 표시되는 CQRPPR의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 정맥 주사한 후, APP/PS1 단백질을 과발현 하는 알츠하이머 병 모델 마우스에서 알츠하이머 뇌 조직에 펩타이드가 표적되고, 이를 생체 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 연령이 증가함에 따른 병의 진행 정도가 증가함에 따라 근적외선 형광이 더 강해지는 것을 알 수 있었다. 반면, 알츠하이머 병 마우스에 대조군 펩타이드를 정맥 주사하거나, 정상 마우스에 본 발명의 펩타이드를 주사한 경우는 형광이 거의 관찰되지 않음을 알 수 있었다. 뇌조직을 격리하여 형광을 관찰하여 유사한 결과를 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 격리된 알츠하이머 병 뇌조직을 동결절편을 제작하여 면역형광염색법을 시행하여 본 발명의 펩타이드의 조직 내 위치를 현미경으로 조사 하였다. 그 결과, 아포토시스의 바이오마커의 하나인 카스파제-3 (caspase-3)를 항체 염색한 것과 본 발명의 펩타이드가 동일한 위치에 있음을 알 수 있었다. 즉, 뇌조직 내 사멸세포에 본 발명의 펩타이드가 결합하는 것을 확인하였다. 또한 혈관의 바이오마커의 하나인 알파-평활근 액틴 (alpha-smooth muscle actin)을 항체 염색하였을 때, 혈관 바깥의 뇌실질에 본 발명의 펩타이드가 위치함을 알 수 있었다. 즉, 펩타이드가 뇌혈관 장벽을 통과하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 약물 주사로 유도된 파킨스 병 모델 마우스에 근적외선 형광시약을 표지한 본 발명의 펩타이드를 정맥 주사한 후, 파킨슨 뇌조직에 펩타이드가 표적되고, 이를 생체 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 파킨슨 병 마우스의 뇌 부위에서 강한 근적외선 형광을 관찰 할 수 있었다. 반면, 파킨슨 병 마우스에 대조군 펩타이드를 정맥 주사하거나, 정상 마우스에 본 발명의 펩타이드를 주사한 경우는 형광이 거의 관찰되지 않음을 알 수 있었다. 뇌조직을 격리하여 형광을 관찰하여 유사한 결과를 확인하였다.
결론적으로, 본 발명의 펩타이드가 뇌혈관 장벽을 통과하며 뇌조직 내 사멸세포와 특이적으로 결합하여 생체 내에서 퇴행성 뇌신경질환의 아포토시스를 인식 및 표적 할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 펩타이드는 펩타이드 및 이와 결합된 약물의 확인, 추적, 정량, 영상화 등을 위하여 표지물질로 표지될 수 있다. 즉, 본 발명의 펩타이드는 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 125I, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)일 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
본 발명의 펩타이드는 뇌 조직의 사멸세포에 특이적으로 결합하므로 본 발명의 약물전달용 조성물은 뇌 또는 뇌신경조직에 있어서 아포토시스와 관련된 질환인 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병(Huntington's disease), 루게릭 병(Amyotrophic lateral sclerosis), 니만-픽 병(Nieman-Pick disease) 또는 뇌졸중(stroke)에 특이적일 수 있다. 또한 본 발명의 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병(Huntington's disease), 루게릭 병(Amyotrophic lateral sclerosis), 니만-픽 병(Nieman-Pick disease) 또는 뇌졸중(stroke)일 수 있다. 즉 본 발명의 조성물은 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병 등의 뇌신경질환 부위에 특이적으로 결합함으로써 그 부위를 확인, 추적, 정량, 영상화하거나, 결합된 약물을 전 달할 수 있다.
한편, 본 발명의 펩타이드는 사멸세포에 특이적으로 결합하므로 이의 위치를 확인하는 경우 사멸세포의 존재를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 사멸 세포(apoptotic cell) 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 펩타이드는 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있으므로 약물을 상기 세포에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 치료를 위한 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드를 종래 신경세포 보호 제제 또는 뇌신경 질환 치료제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 상기 제제가 사멸세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상세포에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
한편, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합된 퇴행성 뇌신경질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 펩타이드, 이와 결합된 퇴행성 뇌신경 질환 치료제 및 표지물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 치료진단(theranosis)용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 퇴행성 뇌신경질환 치료제는 종래 이들 질환의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 뇌신경세포 보호제인 NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 항 아밀로이드 단백질제 등으로, 예를 들어, 도네페질, 갈란타민, 타그린, 메만틴 등일 수 있다. 상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드의 양은 결합되는 상기 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물일 수 있으며, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드, 약물 또는 약제, 표지물질 또는 이들의 조합의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로 좀, 생분해성 나노입자 등이 포함된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 약학적 조성물 0.001~99.999중량% 및 약학적으로 허용되는 담체 99.999~0.001중량%를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예 를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형 화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명의 펩타이드는 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포와 특이적으로 결합하므로 이들 질환의 발병 부위의 영상화 및 진단에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 이 때, 퇴행성 뇌신경질환의 영상화 및 이를 이용한 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 퇴행성 뇌신경질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 퇴행성 뇌신경질환 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 치료진단(theranosis, theragnostics, theranostics)의 용도로도 이용할 수 있다.
참고로, 본 발명에서 언급한 뉴클레오타이드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있으며, 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 퇴행성 뇌신경질환에서 아포토시스의 검출, 더 나아가 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포 (특히, 사멸신경세포)의 검출과 영상진단, 표적 약물전달, 치료진단 등의 목적으로 다양하게 사용될 수 있다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명의 펩타이드를 이용한 알츠하이머 병의 생체 영상
<1-1> 본 발명의 펩타이드를 이용한 알츠하이머 병의 생체 영상
알츠하이머 질환은 아밀로이드 단백질 (Amyloid precursor protein, APP) 유전자와 프레세닐린 (Presenilin 1, PS1) 유전자가 과발현된 형질전환 마우스 모델을 이용하였다. 상기 모델은 연령이 증가함에 따라 알츠하이머 질환의 특징인 베타 아밀로이드단백의 세포 외 침착과 함께 신경세포의 사멸이 점차적으로 증가 하는 특징을 지닌 모델 동물이다. 알츠하이머 질환의 초기 단계인 5개월령 마우스에서 중증 단계인 13개월령 마우스를 대상으로 질병의 진행 정도에 따라 실험을 진행하였다. 아포토시스는 제조회사(Roche사)의 지침에 따라 TUNEL(in vitro terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석법으로 확인하였다.
그 결과, 도 1에서 보듯이, 9개월령 마우스에 비해 13개월령 마우스에서 TUNEL 염색된 세포의 증가 즉, 세포의 아포토시스가 증가함을 확인하였다 (도 1a). 반면, 대조군 마우스는 11개월령에도 TUNEL 염색된 세포가 거의 없었다. 알츠하이머 질환 마우스의 대조군은 같은 배에서 태어난 정상 마우스이다. 또한 5, 7, 9, 11, 13 개월 수령 마우스를 대상으로 질병 진행에 따른 TUNEL 염색된 세포 수를 분석한 결과, 질병 진행 정도에 비례적으로 아포토시스가 증가함을 확인하였다 (도 1b).
상기 알츠하이머 질환 마우스 (5, 7, 9, 13 개월 수령) 모델에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 본 발명의 펩타이드(ApoPep-1)를 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia) 하에서 최종 50 ㅅM 농도가 되게 정맥 주사한 2시간 후, 머리 부위의 근적외선을 촬영하고, 각각의 뇌를 격리하여 근적외선을 촬영하였다. 생체 근적외선 형광영상은 Optix exPlore 기기(ART사)를 사용하여 촬영하였다. 또한 기기 자체의 소프트웨어를 사용하여 각 영상을 표준화하였다.
본 발명에서 사용된 펩타이드는 표준 Fmoc 방법에 따라 합성한 후 HPLC 기기로 분리하였다. 펩타이드의 합성은 전문회사(Peptron사 및 Anygen사)에 의뢰하여 시행하였다. 펩타이드는 N-말단에 fluorescein isothiacyanate(FITC)이 결합된 형태로서 합성하거나, 합성 후 N-말단에 Cy7.5 근적외선형광시약을 결합시켰다.
그 결과, 도 2a에서 보듯이, 알츠하이머 질환이 중증으로 진행 (신경세포 사멸이 증가)됨에 따라 근적외선 형광의 강도 역시 증가함을 관찰하였다. 한편 알츠 하이머 질환 마우스(8개월령)에 대조군 펩타이드(아미노산 서열, NSSSVDK)를 사용하였을 때는 근적외선 형광이 거의 관찰되지 않았다. 또한 정상(wild type) 마우스(8개월령)에 본 발명의 펩타이드를 주사한 후 관찰하였을 때, 비슷한 시기(7개월 및 9개월령)의 알츠하이머 질환 마우스의 뇌 부위에서 정상 마우스에 비해 훨씬 강한 근적외선 형광이 관찰되었다.
또한 도 2b에서 보듯이, 각각의 뇌를 격리하여 체외에서 형광을 측정한 경우에도 상기 생체 영상과 유사한 결과를 나타내었다.
<1-2> 본 발명의 펩타이드를 주입한 알츠하이머 병 뇌조직의 면역형광 분석
조직학적 조사를 위해, 상기 실시예 <1-1>에서 FITC 형광(녹색)이 표지된 본 발명의 펩타이드를 주입한 마우스(13 개월령)에서 생체 영상 후 분리한 뇌조직을 4% 파라포름알데히드 액으로 후고정 한 후, Sucrose/인산완충액에 24시간 침적하여 cryostat를 이용하여 30 μm 두께의 냉동 절편 제작하였다. 항체에 대한 면역형광염색은 붉은 색 형광시약인 알렉사568로 표지된 2차 항체를 이용하여 실시하였다. 각 조직 슬라이드는 형광현미경(fluorescence microscopy, Zeiss사)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이, 본 발명의 펩타이드(녹색 형광)와 세포사멸의 바이오마커인 Caspase-3에 대한 항체(붉은색 형광)가 동시에 동일한 세포에서 염색됨 을 확인하였다 (도 3a). 이는 본 발명의 펩타이드가 사멸세포에 표적 하는 것임을 나타낸다.
또한 도 3b에서 보듯이, 뇌조직 내의 혈관염색법인 alpha-smooth muscle actin(α-SMA)에 대한 항체 염색(붉은색 형광)을 통해 본 발명의 펩타이드가 뇌혈관을 통과하여 혈관 바깥의 뇌실질 내에 분포함을 관찰하였다.
<실시예 2>
본 발명의 펩타이드를 이용한 파킨슨 병의 생체 영상
파킨슨병 모델은 약물을 이용하여 뇌의 흑질부에 존재하는 도파민성 신경을 특이적으로 파괴하는 방법을 사용하여 유도하였다. 이를 위해 몸무게 21 - 23 그램의 C57BL 수컷 마우스(코아텍(주))를 대상으로 1마리 당 1회에 15mg/kg의 용량의 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro pyridine hydrochloride)(Sigma사)투여하였다. MPTP 투여는 2시간 간격으로 4회 반복하여 복강 주사하는 방법을 사용하였고, 1 마리 당 총 60mg/kg의 MPTP를 투여하였다.
MPTP를 투여한 날을 실험 0일로 계산하여 7일, 14일 및 21일이 되는 날짜에 Cy7.5가 표지된 본 발명의 펩타이드를 주입하였다. 펩타이드를 이소플루란 마취하에서 꼬리 정맥을 통해 최종 50 μM 농도로 정맥 주사한 후 2 시간 동안 순환시키고 생체 근적외선 형광영상을 촬영하였다. 실험이 완료된 생쥐는 즉시 마취시켜 안락사를 시켜서 뇌조직 샘플을 채취하였다. 안락사한 생쥐를 즉시 심장을 통한 생리 식염수 관류를 통해 혈액을 제거하고 4% 파라포름알데하이드 용액으로 다시 관류하여 1차 고정을 실시하였다. 1차 고정이 된 뇌를 마우스에서 채취한 뒤에 1일 동안 30% sucrose/인산완충액에 넣은 뒤 다시 1일 동안 4% 파라포름알데하이드 인산버퍼용액에 넣어 후고정시켰다. 고정이 완료된 뇌조직은 드라이아이스로 급속 냉각시킨 뒤에 냉동절편을 만들기 위한 블록으로 만들어 보관하였고 필요한 시기에 냉동절편으로 제작하여 각종 염색법에 이용하였다.
그 결과, 도 4a에서 보듯이, 파킨슨 병 마우스에 본 발명의 펩타이드를 주입한 경우 강한 근적외선 형광이 뇌 부위에서 확인되었다. 반면, 대조군 펩타이드는 근적외선 형광이 거의 관찰되지 않았다. 또한 정상(wild type) 마우스에 본 발명의 펩타이드를 주사한 경우에도 근적외선 형광이 거의 관찰되지 않았다.
또한 도 4b에서 보듯이, 각각의 뇌를 격리하여 체외에서 근적외선 형광을 측정한 경우에도 상기 생체 영상과 유사한 결과를 나타내었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 뇌혈관 장벽을 통과할 수 있으며, 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 퇴행성 뇌신경질환에서 아포토시스의 검출, 더 나아가 퇴행성 뇌신경질환 조직 내 사멸세포 (특히, 사멸신경세포)의 검출과 영상진단, 표적 약물전달, 치료진단 등의 목적으로 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 알츠하이머 질환의 초기 단계인 5개월령 마우스에서 중증 단계인 13개월령 마우스까지 연령이 증가함에 따라 알츠하이머 질환의 특징인 베타 아밀로이드단백의 세포 외 침착과 함께 TUNEL 염색으로 관찰한 세포의 사멸이 점차적으로 증가하는 것을 나타낸 것이다. 알츠하이머 질환 마우스의 대조군은 같은 배에서 태어난 정상 마우스이다.
도 2는 알츠하이머 질환 마우스 (5, 7, 9, 13 개월 수령) 모델에 Cy7.5 근적외선형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 정맥 주사한 2시간 후, 머리 부위의 근적외선을 촬영하고 (a), 각각의 뇌를 격리하여 근적외선을 촬영한 것이다 (b). 또한 알츠하이머 질환 마우스 (8개월령)에 대조군 펩타이드 및 정상 (wild type) 마우스 (8개월령)에 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 후 같은 조건으로 촬영한 것이다.
도 3은 뇌조직을 면역형광염색법을 실시하여 FITC 형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(녹색)와 세포사멸의 바이오마커인 Caspase-3에 대한 항체 염색(붉은 색)을 한 것이다 (a). 이와 함께 뇌조직 내의 혈관염색법인 α-SMA에 대한 항체 염색(붉은 색)을 한 것이다 (b). 화살표는 펩타이드와 각 항체 염색이 일치하는 곳을 나타낸 것이다.
도 4는 파킨슨 병 마우스 모델에 Cy7.5 근적외선 형광이 표지된 서열번호 1의 펩타이드(ApoPep-1)를 정맥 주사한 2시간 후, 머리 부위의 근적외선을 촬영하고 (a), 각각의 뇌를 격리하여 근적외선을 촬영한 것이다 (b). 또한 파킨슨 병 마우스 에 대조군 펩타이드 및 정상 마우스에 서열번호 1의 펩타이드를 주사한 후 같은 조건으로 촬영한 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-academic Cooperation Foundation <120> Peptide that cross blood-brain barrier and target apoptosis in neurodegenerative diseases and uses thereof <130> NP09-0079 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> apoptotic cell-targeting peptide, ApoPep-1 <400> 1 Cys Gln Arg Pro Pro Arg 1 5

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌 조직으로의 약물전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병(Huntington's disease), 루게릭 병(Amyotrophic lateral sclerosis), 니만-픽 병(Nieman-Pick disease) 및 뇌졸중(stroke)으로 이루어진 군에서 선택된 질환에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
  4. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환 부위의 사멸 세포(apoptotic cell) 검출용 조성물.
  5. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 및 이와 결합된 퇴행성 뇌신경질환 치료제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 및 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병(Huntington's disease), 루게릭 병(Amyotrophic lateral sclerosis), 니만-픽 병(Nieman-Pick disease) 및 뇌졸중(stroke)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드, 이와 결합된 퇴행성 뇌신경질환 치료제 및 표지물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환의 치료진단용 조성물.
  8. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 부위의 영상화용 조성물.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016089187A1 (ko) * 2014-12-05 2016-06-09 경북대학교 산학협력단 사멸세포와 특이적으로 결합하는 고리형 펩타이드 및 이의 용도
WO2018102762A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Avelas Biosciences, Inc. Nerve labeling compositions and uses thereof
KR20180111327A (ko) 2017-03-31 2018-10-11 도레이케미칼 주식회사 복합편광필름, 이의 제조방법, 이를 포함하는 광원 어셈블리 및 액정표시장치
KR20190113151A (ko) 2018-03-27 2019-10-08 한림대학교 산학협력단 동물의 혈관계의 시각화 방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003523330A (ja) 2000-02-04 2003-08-05 チルドレンズ・ホスピタル・リサーチ・ファウンデイション アテローム性動脈硬化症および関連疾患のための脂質加水分解治療
LT3205351T (lt) 2010-04-23 2023-07-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Lizosomų kaupimosi ligos fermentas
PL2977057T3 (pl) 2010-09-09 2020-06-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Izolowana rekombinowana ludzka lizosomalna N-glikozylowana kwaśna lipaza
EP2675472A4 (en) 2011-02-15 2014-09-17 Synageva Biopharma Corp METHOD FOR THE TREATMENT OF LACK OF LYSOSOMAL SAURER LIPASE

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPR874601A0 (en) * 2001-11-08 2001-11-29 Unisearch Limited Selective targeting of apoptotic cells
KR20040071812A (ko) * 2003-02-07 2004-08-16 한국생명공학연구원 ＨＢｘ 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을유도시키는 방법 및 이 방법을 이용하여 세포사멸 억제물질 및 유전자를 탐색하는 방법
WO2006028993A2 (en) * 2004-09-02 2006-03-16 Vanderbilt University Assessment of cancer susceptibility to molecular targeted therapy by use of recombinant peptides
KR20080093741A (ko) * 2007-04-18 2008-10-22 고려대학교 산학협력단 신경조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법
EP2279201B1 (en) * 2008-05-14 2016-07-13 Kyungpook National University Industry- Academic Cooperation Foundation Peptides for targeting apoptotic cells and uses thereof

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016089187A1 (ko) * 2014-12-05 2016-06-09 경북대학교 산학협력단 사멸세포와 특이적으로 결합하는 고리형 펩타이드 및 이의 용도
WO2018102762A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Avelas Biosciences, Inc. Nerve labeling compositions and uses thereof
US10994017B2 (en) 2016-12-02 2021-05-04 Avelas Biosciences, Inc. Nerve labeling compositions and uses thereof
US11771774B2 (en) 2016-12-02 2023-10-03 Avelas Acquisition Corporation Nerve labeling compositions and uses thereof
KR20180111327A (ko) 2017-03-31 2018-10-11 도레이케미칼 주식회사 복합편광필름, 이의 제조방법, 이를 포함하는 광원 어셈블리 및 액정표시장치
KR20190113151A (ko) 2018-03-27 2019-10-08 한림대학교 산학협력단 동물의 혈관계의 시각화 방법

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