TWI677574B

TWI677574B - 澱粉球蛋白（ａｍｙｌｏｓｐｈｅｒｏｉｄ）所結合而誘發成熟神經細胞死亡之標靶分子、抑制澱粉球蛋白所誘導之神經細胞死亡的方法及物質、及其等之用途

Info

Publication number: TWI677574B
Application number: TW101150962A
Authority: TW
Inventors: 星美奈子; Minako Hoshi
Original assignee: 日商Tao健康生活製藥股份有限公司; Tao Health Life Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2019-11-21
Also published as: JP2018058838A; KR101948456B1; US20170327536A1; JP2015214557A; EP2799542A1; KR20170077282A; TW201829444A; JPWO2013099806A1; TW201333202A; US20130171069A1; KR20140068105A; CN110075111A; KR20160075836A; EP2799542A4; US9751912B2; CN103930545A; KR101948400B1; JP6241855B2; JP6440276B2; JP5828461B2

Abstract

本發明於一個或複數個實施形態中提供一種標靶分子，其係於成熟神經細胞中表現之澱粉球蛋白之標靶分子，且藉由與澱粉球蛋白結合而誘發細胞死亡。又，本發明於一個或複數個實施形態中提供一種抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡的方法及物質。本發明於一態樣中係關於一種作為澱粉球蛋白之結合標靶分子之Na⁺/K⁺-ATP酶α3之用途。於其他態樣中，係關於一種抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡的方法等，該方法包括阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用等。

Description

澱粉球蛋白(amylospheroid)所結合而誘發成熟神經細胞死亡之標靶分子、抑制澱粉球蛋白所誘導之神經細胞死亡的方法及物質、及其等之用途

本說明書之揭示可關於一種澱粉球蛋白(amylospheroid)所結合而誘發成熟神經細胞死亡之標靶分子、抑制澱粉球蛋白所誘導之神經細胞死亡的方法及/或物質、阿茲海默症(包含阿茲海默氏癡呆症)及/或路易氏體型癡呆症(dementia with Lewy bodies/Lewy body dementia(路易氏體型癡呆症)/diffuse Lewy body disease(彌漫性路易氏體症)、cortical Lewy body disease(皮質路易氏體症)/sentile dementia of Lewy body type(路易氏體型老年癡呆症))之預防、診斷、改善、治療、及/或醫藥組合物、篩選方法、成像探針、及成像方法等。

阿茲海默症係經由突觸變性而使成熟神經細胞死亡之疾病。根據最近之研究，可知阿茲海默症之發病為階段性。作為最初之階段，有主要產生突觸變性之階段。該階段係可逆之階段。作為上述可逆之階段之下一階段，有產生神經細胞死亡之階段。該階段係不可逆之階段，認為因到達該不可逆之階段而使阿茲海默症發病(非專利文獻1)。

認為突觸變性係主要由聚蓄積之β類澱粉蛋白(amyloid)(Aβ)二聚物及十二聚物作用於麩胺酸受體等而產生。然而，Aβ二聚物及十二聚物均不會於體外(in vitro)及體內(in vivo)導致神經細胞死亡(非專利文獻2)。因此，為了進行人類之阿茲海默症之病情分析，必需瞭解於可逆之突觸變性階段後之不可逆階段中產生之神經細胞死亡之原因與分子機制。

澱粉球蛋白(ASPD)係不對非神經細胞及未成熟神經細胞顯示毒性，而選擇性地殺死功能成熟之神經細胞之獨特之Aβ集合體(非專利文獻1)。澱粉球蛋白最初係作為於體外引起神經細胞死亡之直徑約10 nm之球狀Aβ集合體而被單離(非專利文獻3)。其後，製作出針對該合成澱粉球蛋白之特異抗體(專利文獻1及2)，並使用該抗體而自阿茲海默症之人類患者之腦中單離出於活體內形成之(即天然之)澱粉球蛋白(非專利文獻3)。根據使用該天然澱粉球蛋白之研究可知：i)天然澱粉球蛋白與合成澱粉球蛋白同樣選擇性地對成熟神經細胞地誘發細胞死亡；又ii)確認到神經細胞缺陷之阿茲海默症患者之大腦皮質中之天然澱粉球蛋白量係與阿茲海默症之嚴重程度相關聯而增加；並且iii)幾乎未觀察到神經細胞缺陷之阿茲海默症患者之小腦中之天然澱粉球蛋白量僅微量存在(非專利文獻3)。因此，認為澱粉球蛋白於阿茲海默症發病之不可逆階段中起到重要之作用。進而，自路易氏體型癡呆症患者之腦中亦檢測出天然澱粉球蛋白(非專利文獻1)，認為於路易氏體型癡呆症中，澱粉球蛋白亦於其發病中起到重要之作用。

再者，揭示有澱粉球蛋白與認為係引起突觸變性之主要原因之Aβ二聚物及十二聚物均為Aβ集合體，並且以不同之路徑自Aβ單體形成。即，Aβ二聚物及十二聚物經由Aβ二聚物，相對於此，澱粉球蛋白係自Aβ三聚物形成(非專利文獻4)。

先前技術文獻 專利文獻

專利文獻1：WO 2006/016644

專利文獻2：WO 2009/057664

非專利文獻

非專利文獻1：Noguchi et al. J. Biol. Chem. vol.284 no.47, 32895-32905 (2009)

非專利文獻2：Shankar et al. Nature Medicine 14, 837-842 (2008)

非專利文獻3：Hoshi et al. Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol.100, no.11, 6370-6375 (2003)

非專利文獻4：Matsumura et al. J. Biol. Chem. vol.286 no.13, 11555-11562 (2011)

猜想澱粉球蛋白與其他Aβ集合體不同，係結合於前突觸細胞之表面而對成熟神經細胞誘發細胞死亡(非專利文獻1)。然而，澱粉球蛋白對成熟神經細胞之結合方式尚屬不明。

因此，本說明書揭示一種標靶分子等，其係於成熟神經細胞中表現之澱粉球蛋白之標靶分子，且藉由與澱粉球蛋白相互作用而誘發細胞死亡。

本揭示於一個或複數個態樣中，係關於一種作為澱粉球蛋白之結合標靶分子之Na⁺/K⁺-ATP酶α3的用途。

本揭示於一個或複數個實施形態中係基於如下情況：鑑定出Na⁺/K⁺-ATP酶α3作為成熟神經細胞表面上澱粉球蛋白所結合並發揮作用之標靶分子。進而，本揭示於一個或複數個實施形態中係基於如下情況：鑑定出對澱粉球蛋白具有結合能力，並且可抑制神經細胞死亡之多肽及/或肽基序(peptide motif)。

本揭示於一個或複數個實施形態中，可藉由阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用而阻礙澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡。本揭示於一個或複數個實施形態中，藉由阻礙澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡，而較佳為能夠實現阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療。又，本揭示於一個或複數個實施形態中，基於澱粉球蛋白及/或Na⁺/K⁺-ATP酶α3之測定或成像，而較佳為能夠實現阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之診斷。進而又，本揭示於一個或複數個實施形態中，基於澱粉球蛋白所結合之Na⁺/K⁺-ATP酶α3之特定區域之立體結構，而較佳為能夠實現可阻礙澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡之化合物的篩選方法。

即，本揭示於一個或複數個實施形態中，可關於如下：(1)一種Na⁺/K⁺-ATP酶α3之用途，其係用作澱粉球蛋白(amylospheroid)所結合而誘發成熟神經細胞死亡之標靶分子；(2)如上述(1)之用途，其包括基於澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用而進行醫藥品開發之內容；(3)一種抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡的方法，其包括阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之內容；(4)如上述(3)之方法，其中澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙係藉由基於兩者或一者之表面立體結構之可進行競爭性抑制之物質與澱粉球蛋白的接觸而進行；(5)如上述(3)之方法，其中澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙係藉由可與Na⁺/K⁺-ATP酶α3競爭而結合於澱粉球蛋白之物質與澱粉球蛋白的接觸而進行；(6)一種抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡的方法，其包括如下內容：於與澱粉球蛋白相互作用之成熟神經細胞中，阻礙選自由細胞膜之N型電位依賴性鈣通道(VGCC，Voltage-Gated Calcium Channel)、線粒體之Na⁺/Ca²⁺交換輸送體(mNCX，Mitochondrial Sodium-Calcium Exchanger)、線粒體之膜滲透性轉換孔(mPTP，Mitochondrial Permeability Transition pore)、及內質網之理阿諾鹼受體(RyR，Ryanodine Receptor)所組成之群中之至少1種鈣通道；(7)一種阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法，其包括藉由阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用而抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡的內容；(8)如上述(7)之方法，其中澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙係藉由基於兩者或一者之表面立體結構之可進行競爭性抑制之物質與澱粉球蛋白的接觸而進行；(9)如上述(7)之方法，其中澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙係藉由可與Na⁺/K⁺-ATP酶α3競爭並結合於澱粉球蛋白之物質與澱粉球蛋白的接觸而進行；(10)一種阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法，其包括如下內容：於與澱粉球蛋白相互作用之成熟神經細胞中，阻礙選自由細胞膜之N型電位依賴性鈣通道(VGCC)、線粒體之Na⁺/Ca²⁺交換輸送體(mNCX)、線粒體之膜滲透性轉換孔(mPTP)、及內質網之理阿諾鹼受體(RyR)所組成之群中之至少1種鈣通道；(11)一種篩選方法，其係用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療的醫藥組合物之有效成分之候補化合物之篩選方法，並且包括如下內容：使用試驗化合物測定澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙能力，及基於上述測定結果而選擇候補化合物；(12)一種篩選方法，其係用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療的醫藥組合物之有效成分之候補化合物之篩選方法，並且包括如下內容：使用進行基於Na⁺/K⁺-ATP酶α3之細胞外域4或其一部分之立體結構的藥劑設計而合成之試驗化合物，測定澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙能力、及/或對澱粉球蛋白之結合能力、及/或對澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制能力，及基於上述測定結果而選擇候補化合物；(13)一種診斷方法，其係阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之診斷方法，並且包括如下內容：自被投予具備Na⁺/K⁺-ATP酶α3之結合對象(Binding Partner)作為與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之結合部分之Na⁺/K⁺-ATP酶α3成像探針的受檢體檢測出上述成像探針之訊號，及基於上述訊號之訊號資料或影像資料、或者根據上述訊號資料或影像資料算出之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量之測定結果，判定阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度；(14)一種調查受檢體之阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之方法，其包括如下內容：自被投予具備Na⁺/K⁺-ATP酶α3之結合對象作為與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之結合部分之Na⁺/K⁺-ATP酶α3成像探針的受檢體檢測出上述成像探針之訊號，測定根據上述訊號之訊號資料或影像資料算出之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量，及將上述測定結果與基準進行比較，上述基準係設為越低於正常個體之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量，嚴重程度越高，及/或高於/低於上述受檢體之以前之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量之情形時，嚴重程度分別變高/變低；(15)一種物質，其係經合成、單離、或純化者，其對澱粉球蛋白具有結合能力，且可抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡，並且與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之細胞外域4或其一部分之結構類似；(16)如上述(15)之物質，其與上述Na⁺/K⁺-ATP酶α3之細胞外域4中之胺基酸序列為RLNW(序列編號1)或LNW之部分之結構類似；(17)一種多肽，其係經合成、單離、或純化者，並且其含有下述式(I)、(II)、或(III)之胺基酸序列所表示之基序：

X₁X₂X₃X₄ (I)(序列編號7)

X₂X₃X₄X₅ (II)(序列編號43)

X₂X₃X₄ (III)(序列編號48)

X₁為精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、或離胺酸(Lys)，X₂為疏水性胺基酸殘基、或甘胺酸(Gly)，X₃為天冬醯胺(Asn)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、組胺酸(His)、或酪胺酸(Tyr)，X₄為色胺酸(Trp)、苯丙胺酸(Phe)、或酪胺酸(Tyr)，X₅為色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、天冬醯胺酸(Asp)或疏水性胺基酸殘基，且該多肽具有對澱粉球蛋白之結合能力；(18)如上述(17)之多肽，其於N末端具有上述式(I)、(II)、或(III)之胺基酸序列所表示之基序；(19)如上述(17)或(18)之多肽，其中胺基酸序列之長度為4~25個胺基酸；(20)如上述(17)至(19)中任一項之多肽，其可阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用，及/或可抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡；(21)如上述(17)至(20)中任一項之多肽，其與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之細胞外域4或其一部分之結構類似；(22)如上述(21)之多肽，其與上述Na⁺/K⁺-ATP酶α3之細胞外域4中之胺基酸序列為RLNW(序列編號1)之部分之結構類似；(23)一種擬肽，其係與如上述(17)至(22)中任一項之多肽之結構類似者，且可阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用，及/或可抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡；(24)一種多核苷酸，其編碼如上述(17)至(22)中任一項之多肽；(25)一種載體，其用以表現上述多肽，且包含編碼如上述(17)至(22)中任一項之多肽之多核苷酸；(26)一種組合物，其含有如上述(17)至(22)中任一項之多肽或如上述(23)之擬肽； (27)如上述(26)之組合物，其係用於檢測及/或測定澱粉球蛋白；(28)如上述(26)之組合物，其係用於抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡；(29)如上述(26)之組合物，其係用於阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用；(30)一種醫藥組合物，其含有：如上述(17)至(22)中任一項之多肽、如上述(23)之擬肽、如上述(24)之多核苷酸、或如上述(25)之載體；(31)如上述(30)之醫藥組合物，其用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療；(32)一種探針或其前驅物，其係針對澱粉球蛋白者，並且其具備如上述(17)至(22)中任一項之多肽或如上述(23)之擬肽作為其與澱粉球蛋白之結合部分；(33)如上述(32)之探針或其前驅物，其用於澱粉球蛋白之成像或檢測或者測定；(34)一種澱粉球蛋白成像方法，其包括如下內容：自被投予具備如上述(17)至(22)中任一項之多肽或如上述(23)之擬肽作為與澱粉球蛋白之結合部分之澱粉球蛋白成像探針的受檢體檢測出上述成像探針之訊號；(35)一種澱粉球蛋白量之測定方法，其包括基於利用如上述(34)之澱粉球蛋白成像方法獲得之訊號資料或影像資料而算出澱粉球蛋白量的內容；(36)一種診斷方法，其係阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之診斷方法，並且包括如下內容：自被投予具備澱粉球蛋白之結合對象作為與澱粉球蛋白之結合部分之澱粉球蛋白成像探針的受檢體檢測出上述成像探針之訊號，及基於上述訊號之訊號資料或影像資料、或者根據上述訊號資料或影像資料算出之澱粉球蛋白量之測定結果，判定阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度；(37)如上述(36)之診斷方法，其中澱粉球蛋白之結合對象為如上述(17)至(22)中任一項之多肽或如上述(23)之擬肽；(38)一種調查受檢體之阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之方法，其包含如下內容：自被投予具備澱粉球蛋白之結合對象作為與澱粉球蛋白之結合部分之澱粉球蛋白成像探針的受檢體檢測出上述成像探針之訊號，測定根據上述訊號之訊號資料或影像資料算出之澱粉球蛋白量，及將上述測定結果與基準進行比較，上述基準係設為越低於正常個體之澱粉球蛋白量，嚴重程度越高，及/或高於/低於上述受檢體之以前之澱粉球蛋白量的情形時，嚴重程度分別變高/變低；(39)如上述(38)之方法，其中澱粉球蛋白之結合對象為如上述(17)至(22)中任一項之多肽或如上述(23)之擬肽。

[澱粉球蛋白]

本說明書中，所謂澱粉球蛋白(以下亦稱為「ASPD」)，係指可擇性地對功能成熟之神經細胞選誘發細胞死亡之Aβ集合體。ASPD包含「合成ASPD」及「天然ASPD」。所謂合成ASPD，係指作為使用合成Aβ而於體外製備及單離之直徑約10~15 nm之球狀體的ASPD(非專利文獻3)。又，所謂天然ASPD，係指於人類活體內形成之ASPD，尤其是可自阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之患者之腦中單離之ASPD(非專利文獻1)。合成ASPD及天然ASPD均對成熟人類神經細胞誘發細胞死亡。亦製作出可識別ASPD特異性立體結構之抗ASPD抗體(例如專利文獻1及2所揭示之haASD1、haASD2、mASD3等)。根據該等抗ASPD單株抗體之特性解析或ASPD之NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)解析之結果可知，ASPD具有與目前為止所報告之其他Aβ集合體不同之獨特之立體結構(例如非專利文獻1之Supplemental Table S1、厚生勞動科學研究費補助金(醫療機器開發研究促進事業)2010年度報告書)。具體而言，首先根據抗ASPD抗體之抗原決定基圖(Epitope Map)之結果，可知形成ASPD時，作為其構成要素之Aβ摺疊而使N末端與中間部位一起露出於ASPD之表面。根據該情況可知ASPD形成特異性之表面立體結構。ASPD之平面NMR圖譜亦支持該結果，於原本應於Aβ單體中檢測出之訊號中，於露出於ASPD表面之部位上可觀測到訊號，另一方面，來自摺疊至ASPD之內側之部位之訊號因被摺疊至內部，故而磁性不等價且運動性受到抑制，因此訊號減弱而未被檢測出。自NMR解析獲得之結果亦顯示Aβ之N末端與中間部位露出於ASPD表面之情況，且與抗ASPD抗體所識別之部位一致。顯示露出於ASPD表面之中間部位於通常之凝聚體中係摺疊至內部之部位，且係具有ASPD之特異性之立體結構之凝聚體。因此，本說明書中，可將ASPD亦稱為與專利文獻1及2所揭示之對ASPD具有特異性之抗ASPD抗體進行反應，且對功能成熟之神經細胞選擇性地誘發細胞死亡的Aβ集合體。於未限定之一個或複數個實施形態中，ASPD係Aβ單體之約20~150聚物。於未限定之一個或複數個實施形態中，ASPD作為細胞毒性較高之形態，分子量為約84 kDa~約172 kDa，且平均分子量為約128 kDa。於未限定之一個或複數個實施形態中，ASPD於溶液中之利用AFM(Atomic Force Microscopy，原子力顯微鏡)所測定之直徑為約4.6 nm~約9.8 nm，平均為約7.2 nm。

合成ASPD可利用非專利文獻3所揭示之方法而製備。具體而言，可藉由花5~7天(Aβ_1-40)或一晚(Aβ_1-42)慢慢地旋轉攪拌合成之類澱粉蛋白β單體(Aβ_1-40及/或Aβ_1-42)而形成合成ASPD，並可藉由回收對0.22 μm-過濾器之濾液進行50 kDa或100 kDa超過濾之保持液(retentate)而進行純化。但本說明書中，合成ASPD並不限定於藉由該製造方法而製造者。再者，用於合成ASPD之Aβ單體可使用人類及人類以外之動物之Aβ單體。另一方面，天然ASPD可利用非專利文獻1所揭示之方法而獲得。具體而言，可藉由對阿茲海默症等之患者之腦萃取物之100 kDa超過濾保持液，使用專利文獻1及2所揭示之haASD1、haASD2、mASD3等ASPD立體結構特異性之單株抗體進行免疫沈澱而獲得。但本說明書中，天然ASPD並不限定於藉由該製造方法而獲得者。

[類澱粉蛋白β肽]

本說明書中，所謂「類澱粉蛋白β單體」係指藉由類澱粉蛋白前驅物蛋白質(APP，Amyloid Precursor Protein)被β-及γ-分泌酵素(secretase)切割而切下之肽，亦記作為「β類澱粉蛋白」、「Aβ」或「Aβ單體」。又，本說明書中，Aβ可包含根據其胺基酸序列之長度而被稱為Aβ_1-39、Aβ_1-40、Aβ_1-41、Aβ_1-42、及Aβ_1-43者。本說明書中，Aβ可為人型(存在於人類中之序列)，亦可為非人型(存在於人類以外之動物中之序列)。又，本說明書中，Aβ可包含活體內之(天然之)Aβ及合成之Aβ。合成Aβ並無特別限定，可利用公知之肽合成法(例如，Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl，9-茀基甲氧基羰基)法或Boc(t-butoxycarbonyl，第三丁氧基羰基)法)而合成，例如可利用公知之肽合成儀而製造。人型之Aβ_1-42(亦稱為「Aβ42」)係包含胺基酸序列(自N末端起)：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(序列編號2)所表示之胺基酸序列之肽。又，人型之Aβ_1-41(Aβ41)、Aβ_1-40(Aβ40)、及Aβ_1-39(Aβ39)係包含自序列編號2之胺基酸序列之C末端起分別缺少A、IA、及VIA之胺基酸序列的肽。進而，人型之Aβ_1-43(Aβ43)係包含序列編號2之胺基酸序列之C末端附加有1個蘇胺酸殘基(T/Thr)之胺基酸序列的肽。

[Na⁺/K⁺-ATP酶α3]

本說明書中，所謂Na⁺/K⁺-ATP酶α3(以下亦稱為「NAKα3」)，係指作為ATP1A3基因之基因產物之膜蛋白質的「鈉/鉀輸送體ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)酶次單元α3」。Na⁺/K⁺ATP酶係發揮維持經由細胞質膜之鈉與鉀之電化學梯度之作用的ATP酶輸送體。認為α3尤其是於神經細胞中參與膜電位之維持。本說明書中，ATP1A3基因及NAKα3可為人型(存在於人類中之序列)，亦可為非人型(存在於人類以外之動物中之序列)。再者，本說明書中，所謂「人類以外之動物」並無特別限定，係具有表現人類Aβ及/或人類NAKα3之直系同源基因(ortholog)之細胞的動物，於一個或複數個實施形態中，例如為哺乳類，例如為靈長類或齧齒類，例如為猴子或大鼠。

人類ATP1A3基因可於NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術資訊中心)資料庫寄存編號No.NM_152296.3(mRNA(Messenger Ribonucleic Acid，信使核糖核酸)，2011年5月12日)中指定。又，人類NAKα3可於寄存編號No.NP_689509.1(mRNA，2011年5月12日)中指定。

[作為ASPD之標靶分子的NAKα3之鑑定]

NAKα3係ASPD所結合而對成熟神經細胞誘導細胞死亡之標靶分子。本說明書中所謂「ASPD之標靶分子」係包含「ASPD所結合而對成熟神經細胞誘導細胞死亡之標靶分子」。作為ASPD之標靶分子的NAKα3係以如下之方式鑑定。即，藉由利用電泳分別展開由成熟神經細胞、未成熟神經細胞、及作為源自人胚腎臓之細胞的HEK293細胞獲取之萃取液，將於活體內形成之(即天然之)ASPD作為配位子，並使用抗ASPD抗體進行檢測，從而進行遠西方分析。其結果，根據僅於成熟神經細胞之情形時出現之約105 kDa之條帶而鑑定NAKα3。再者，該條帶於將合成ASPD作為配位子之情形時亦被檢測到，但於將Aβ單體作為配位子並將抗Aβ抗體(6E10)用於檢測之遠西方分析中未出現。又，若於ASPD共存下，利用抗ASPD抗體對成熟大鼠之海馬區神經元(21DIV)之細胞萃取物進行免疫沈澱，則NAKα3共沈澱。

再者，Na⁺/K⁺ATP酶α次單元有α1~4四種，其中於神經細胞中表現的主要為α1與α3。α1於成熟神經細胞、未成熟神經細胞、及HEK293細胞中均表現。另一方面，α3僅於成熟神經細胞中表現。於容易因阿茲海默症而受到損傷之海馬區等中，α3之mRNA表現量為α1之2倍至3倍以上。因此，ASPD選擇性地對成熟神經細胞誘導細胞死亡之情況可由標靶分子為Na⁺/K⁺-ATP酶α3(NAKα3)說明。

[ASPD所誘發之成熟神經細胞之細胞死亡之機制]

對ASPD與作為標靶之NAKα3進行蛋白質間相互作用而誘發成熟神經細胞之細胞死亡的機制作如下考慮。認為若ASPD與NAKα3相互作用，則成熟神經細胞之Na⁺/K⁺ATP酶之功能受到阻礙，因此，細胞膜電位上升，神經細胞成為過度興奮狀態，細胞外Ca²⁺經由電位依賴性鈣通道而大量地流入細胞內。因Ca²⁺之異常流入而失去細胞內Ca²⁺穩定狀態(homeostasis)，其結果，細胞內Ca²⁺濃度過度上升而導致細胞死亡(參照圖1)。更詳細而言，認為細胞內Ca²⁺濃度之上升依序引起鈣蛋白酶之活化、p25/週期素依賴性激酶5(CDK5)之活化、肝糖合成酶激酶3β(GKS3β)之活化、及tau蛋白質之過度磷酸化，而導致成熟神經細胞之細胞死亡。但本揭示亦可不限定於該等機制地加以解釋。

[ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用]

ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡係由ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用所引起，該情況係目前為止未報告之超出先前技術所預測之新穎見解。只要可阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用，則可抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡，進而可實現阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之治療、診斷、改善、及/或預防。因此，本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種作為澱粉球蛋白(amylospheroid)所結合而誘發成熟神經細胞死亡之標靶分子的NAKα3之用途。於一個或複數個實施形態中，作為ASPD之標靶分子之NAKα3之用途可包括：藉由阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用而抑制ASPD之神經細胞死亡；藉由阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用而治療、診斷、改善、及/或預防阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症；進行基於ASPD與NAKα3之相互作用之醫藥組合物之開發。於一個或複數個實施形態中，作為ASPD之標靶分子之NAKα3之用途可包括本說明書所揭示之發明及其實施形態。再者，本說明書中所謂「蛋白質間相互作用」包括結合，且所謂「ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用」包括對NAKα3產生結果可導致細胞死亡之作用。又，本說明書中，「阿茲海默症」包含阿茲海默氏癡呆症。又，本說明書中，「阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之治療、診斷、改善、及/或預防」之對象並無特別限定，可設為人類及/或人類以外之動物。

因此，本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種係抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡的方法，其包括阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用之內容。又，本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法，其包括藉由阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用而抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡的內容。

[阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用之方法]

如上所述，ASPD係具有獨特之立體結構之Aβ集合體。因此，若為模擬參與ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用之ASPD或NAKα3之部位之立體結構的物質(例如多肽、擬肽、低分子化合物、該等之鹽、該等之溶劑合物等)，則可阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用。雖認為藉由存在模擬進行相互作用之一方之立體結構之分子而產生競爭性抑制，但本揭示亦可不受該觀點限定。再者，本說明書中所謂「物質」，可意指化合物、其鹽、其溶劑合物、及/或包含該等之組合物，更具體而言，可意指多肽、擬肽、低分子化合物、該等之鹽、該等之溶劑合物、及/或包含該等之組合物。

因此，於一個或複數個實施形態中，本揭示中之阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質相互作用之方法係關於如下方法，其包括如下內容：使ASPD或NAKα3與模擬參與ASPD與NAKα3之相互作用之ASPD或NAKα3之部位之立體結構的物質相互作用。又，於一個或複數個實施形態中，本揭示中之阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質相互作用之方法係關於如下方法，其係藉由基於ASPD與NAKα3之兩者或一者之表面立體結構並可進行競爭性抑制之物質與ASPD的接觸而進行。又，於一個或複數個實施形態中，本揭示中之阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質相互作用之方法係關於如下方法，其係藉由可與NAKα3競爭並結合於ASPD之物質與ASPD的接觸而進行。該等阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質相互作用之方法可應用於上述抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之方法；及上述阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。

ASPD主要與NAKα3之細胞外域4相互作用。推測人類NAKα3之細胞外域4係ACNo.NP_689509.1之胺基酸序列之第857~908號之序列(序列編號3，圖2)。圖2係利用線框表示比對人類NAKα1~4中之細胞外域4(序列編號3~6)，基於實施例所示之多肽(AAT肽)而新發現之2處基序(與ASPD相互作用之基序，以下亦稱為「ASPD相互作用基序」)之一例。又，於圖2之2處ASPD相互作用基序上，將實施例所示之AAT01肽(序列編號35)與比對之部分序列進行比對。認為圖2之2處ASPD相互作用基序中，NAKα3之包含「RLNW」或「LNW」之N末側之ASPD相互作用基序為NAKα3具有與其他NAKα不同之序列、結構之部分(圖2)，且由於ASPD與NAKα3之特異性之蛋白質間相互作用而為重要之部分。NAKα3之包含含有「YGQQWT」之C末側之基序(AAT01肽中為「Y-NLWR」)的部分係NAKα3與NAKα1中序列結構共通之部分。再者，NAKα3之細胞外域4於人類與大鼠間被完全地保存(未圖示)。

因此，於一個或複數個實施形態中，本揭示中之阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質相互作用之方法可使用模擬NAKα3之細胞外域4、包含「RLNW」或「LNW」之部分、及/或包含「YGQQWT」或「Y-NLWR」之部分之立體結構的物質、或可基於上述立體結構進行競爭性抑制之物質而進行。該等物質亦可藉由進行基於NAKα3之細胞外域4、包含「RLNW」或「LNW」之部分、及/或包含「YGQQWT」或「Y-NLWR」之部分之結構的藥劑設計(SBDD，Structure Based Drug Design，基於結構之藥劑設計)而獲得。如上所述，該等阻礙ASPD與NAKα3之蛋白質相互作用之方法可應用於上述抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之方法、及上述阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。再者，可知 NAKα3之細胞外域4係與NAKβ次單元直接相互作用之部位，認為其與NAKβ次單元之相互作用影響結構穩定及酵素活性。

本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種物質，其係經合成、單離、或純化者，其對ASPD具有結合能力，並且可抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡，且與NAKα3之細胞外域4或其一部分之結構類似。作為上述物質，係關於多肽、擬肽、低分子化合物、該等之鹽、該等之溶劑合物、及/或包含該等之組合物。於一個或複數個實施形態中，NAKα3之細胞外域4或其一部分之立體結構係NAKα3之細胞外域4、包含「RLNW」或「LNW」之部分、及/或包含「YGQQWT」或「Y-NLWR」之部分的立體結構。於一個或複數個實施形態中，該等物質可用於ASPD與NAKα3之相互作用之阻礙、ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制、或阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、診斷、及/或治療。

本說明書中，所謂「擬肽」包含肽樣化合物(例如類肽(peptoid))及該領域中公知之其他改形體。具體而言，例如例示有：作為公知之N取代甘胺酸低聚物之類肽(S.M.Miller,R.J.Simon,S.Ng,R.N.Zuckermann,J.S.Kerr,W.H.Moos,Bioorg.Med.Chem Lett.,4,2657(1994))、或模擬蛋白質之β、γ-旋轉結構之非肽化合物(M.Kahn Tetrahedron,49,3433(1993)，組合化學，化學同人(股)p44-64，1997)等。本說明書中所謂「低分子化合物」，係指分子量例如為700以下，較佳為500以下之化合物。

[抗NAKα3抗體]

進而又，本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種特異性地識別NAKα3之細胞外域4、包含「RLNW」或「LNW」之部分、及/或包含「YGQQWT」或「Y-NLWR」之部分之立體結構的抗NAKα3抗體。於一個或複數個實施形態中，上述抗NAKα抗體係多株抗體、單株抗體、人類化抗體、及/或完全人類抗體。於一個或複數個實施形態中，該等抗體中，較佳為阻礙NAKα3與ASPD之相互作用，同時不阻礙NAKα3之離子通道之功能者。因此，本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之方法及阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法，其包括對可存在澱粉球蛋白之條件下之成熟神經細胞之NAKα3結合上述抗NAKα3抗體的內容，又，本揭示於其他態樣中係關於一種含有上述抗NAKα3抗體之組合物，其用於ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制、或阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。

[篩選方法]

本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種篩選方法，其係用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療的醫藥組合物之有效成分之候補化合物之篩選方法，且包括如下內容：使用試驗化合物而測定ASPD與NAKα3之蛋白質間相互作用之阻礙能力；及基於上述測定結果而選擇候補化合物。

又，本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種篩選方法，其係用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療的醫藥組合物之有效成分之候補化合物之篩選方法，且包括如下內容：使用進行基於NAKα3之細胞外域4或其一部分之立體結構之藥劑設計(SBDD)而合成的試驗化合物，測定澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙能力、及/或對澱粉球蛋白之結合能力、及/或對澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制能力；及基於上述測定結果而選擇候補化合物。於一個或複數個實施形態中，NAKα3之細胞外域4或其一部分之立體結構係NAKα3之細胞外域4、包含「RLNW」或「LNW」之部分、及/或包含「YGQQWT」或「Y-NLWR」之部分之立體結構。

[利用鈣通道抑制劑之細胞死亡之抑制]

由ASPD與NAKα3之相互作用而導致Ca²⁺自細胞外流入細胞內並殺死神經者為N型電位依賴性鈣通道(VGCC)。進而，認為Ca²⁺自細胞胞器向細胞質之流入亦與細胞死亡相關。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之方法及阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法，其包括如下內容：於與澱粉球蛋白相互作用之成熟神經細胞中，阻礙選自由細胞膜之N型電位依賴性鈣通道(VGCC)、線粒體之Na⁺/Ca²⁺交換輸送體(mNCX)、線粒體之膜滲透性轉換孔(mPTP)、及內質網之理阿諾鹼受體(RyR)所組成之群中至少1種鈣通道。各鈣通道之抑制劑亦可使用公知之抑制劑。又，本揭示於其他態樣中係關於一種組合物或醫藥組合物，其用於ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制、或阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法，且包含可阻礙選自由細胞膜之N型電位依賴性鈣通道(VGCC)、線粒體之Na⁺/Ca²⁺交換輸送體(mNCX)、線粒體之膜滲透性轉換孔(mPTP)、及內質網之理阿諾鹼受體(RyR)所組成之群中至少1種鈣通道的化合物。

[ASPD相互作用基序]

ASPD相互作用基序(與ASPD相互作用之基序)可以下述式(I)、(II)、或(III)之胺基酸序列表示。

X₁X₂X₃X₄ (I)(序列編號7)

X₂X₃X₄X₅ (II)(序列編號43)

X₂X₃X₄ (III)(序列編號48)

上述式(I)~(III)中，X₁為精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、或離胺酸(Lys)，X₂為疏水性胺基酸殘基、或甘胺酸(Gly)，X₃為天冬醯胺(Asn)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、組胺酸(His)、或酪胺酸(Tyr)，X₄為色胺酸(Trp)、苯丙胺酸(Phe)、或酪胺酸(Tyr)，X₅為色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、天冬醯胺酸(Asp)或疏水性胺基酸殘基。

本說明書中，疏水性胺基酸殘基包含白胺酸(Leu)、纈胺酸(Val)、異白胺酸(Ile)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、丙胺酸(Ala)、及甲硫胺酸(Met)。

上述ASPD相互作用基序中，於一個或複數個實施形態中，就加強與ASPD之相互作用之觀點而言，X₁較佳為組胺酸或精胺酸。X₂於一個或複數個實施形態中，就相同之觀點而言，較佳為疏水性胺基酸殘基，更佳為白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、及苯丙胺酸，進而較佳為白胺酸、異白胺酸、及苯丙胺酸，進而更佳為白胺酸及苯丙胺酸。於一個或複數個實施形態中，就相同之觀點而言，X₃較佳為天冬醯胺、麩醯胺、組胺酸，更佳為天冬醯胺。於一個或複數個實施形態中，就相同之觀點而言，X₄較佳為色胺酸。就相同之觀點而言，X₅較佳為色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、天冬醯胺。

上述ASPD相互作用基序於一個或複數個實施形態中，就加強與ASPD之相互作用之觀點而言，第7或第8號之胺基酸殘基(即自X₄至C末端中第2個至第4個之胺基酸殘基)(若存在)較佳為色胺酸。

於一個或複數個實施形態中，就加強與ASPD之相互作用之觀點而言，作為上述ASPD相互作用基序之長度，較佳為3~25個胺基酸或4~25個胺基酸，更佳為3~20或4~20，進而較佳為3~18或4~18，進而更佳為3~14或4~14，進而更佳為3~12、4~12或5~12，進而更佳為3~8或4~8。

於一個或複數個實施形態中，ASPD相互作用基序可列舉下述胺基酸序列(序列編號7~34、42~51)所示之基序。

X₁X₂X₃X₄ (序列編號7)

X₁X₂NW (序列編號8)

HX₂NW (序列編號9)

H(F/L)NW (序列編號10)

HFNW (序列編號42)

X₂X₃X₄X₅ (序列編號43)

X₂NWX₅ (序列編號44)

(F/L)NWX₅ (序列編號45)

(F/L)NWD (序列編號46)

FNWD (序列編號47)

X₂X₃X₄ (序列編號48)

X₂NW (序列編號49)

(F/L)NW (序列編號50)

FNW (序列編號51)

X₁X₂X₃X₄X₅ (序列編號11)

X₁X₂NWX₅ (序列編號12)

HX₂NWX₅ (序列編號13)

H(F/L)NWX₅ (序列編號14)

H(F/L)NWY (序列編號15)

H(F/L)NWW (序列編號16)

H(F/L)NWL (序列編號17)

H(F/L)NWD (序列編號18)

X₁X₂NWX₅W (序列編號19)

HX₂NWX₅W (序列編號20)

H(F/L)NWX₅W (序列編號21)

H(F/L)NWYW (序列編號22)

H(F/L)NWWW (序列編號23)

H(F/L)NWLW (序列編號24)

H(F/L)NWDW (序列編號25)

X₁X₂NWX₅XW (序列編號26)

HX₂NWX₅XW (序列編號27)

H(F/L)NWX₅XW (序列編號28)

X₁X₂NWX₅XXW (序列編號29)

HX₂NWX₅XXW (序列編號30)

H(F/L)NWX₅XXW (序列編號31)

H(F/L)NWYNLW (序列編號32)

H(F/L)NWWHSW (序列編號33)

H(F/L)NWLSWF (序列編號34)

於序列編號7~34、42~51之胺基酸序列中，X₁~X₅如上所述，X為任意之胺基酸殘基。

[多肽]

本揭示於一個或複數個實施形態中係關於一種多肽，其係經合成、單離、或純化者，且含有上述ASPD相互作用基序，並且具有對澱粉球蛋白之結合能力(以下亦稱為「第1多肽」)。於第1多肽中，上述ASPD相互作用基序之實施形態如上所述。於一個或複數個實施形態中，第1多肽較佳為可抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡，更佳為進而/或可阻礙ASPD與NAKα3之相互作用。

就提高ASPD-NaKα3間相互作用之阻礙之觀點而言，第1多肽較佳為於N末端具有上述ASPD相互作用基序，即N末端之第一個之胺基酸為X₁或X₂。第1多肽之長度只要為包含上述式(I)之長度，則並無特別限制。可為包含上述ASPD相互作用基序者，亦可為於上述ASPD相互作用基序中進而包含胺基酸序列者。於一個或複數個實施形態中，就提高ASPD誘發成熟神經細胞死亡之抑制及/或提高ASPD-NaKα3間相互作用之阻礙的觀點而言，第1多肽之長度為50以下、25以下、20以下、或15以下，及/或3以上、4以上、5以上、6以上、9以上、或10以上。

本揭示於其他態樣中係關於一種經合成、單離、或純化之多肽，其係第2多肽，且對澱粉球蛋白具有結合能力，並且可抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡。本揭示之第2多肽較佳為模擬NAKα3之細胞外域4之立體結構或其一部分之立體結構，較佳為模擬NAKα3之細胞外域4、包含「RLNW」或「LNW」之部分、及/或包含「YGQQWT」或「Y-NLWR」之部分之立體結構，更佳為進而/或可阻礙ASPD與NAKα3之相互作用。作為第2多肽之一實施形態，可列舉第1多肽。第2多肽之長度並無特別限制，可設為與本揭示之第1多肽相同。

於一個或複數個實施形態中，本揭示之多肽(包含第1及第2，以下相同)可列舉上述ASPD相互作用基序與腦靶向性肽直接或經由連接肽而結合之形態。藉由結合腦靶向性肽，可提高本揭示之多肽越過血腦障壁而向腦轉移之效率。作為腦靶向性肽，可應用先前公知者。

本揭示之多肽可藉由利用通常之合成方法適當合成並純化而製備。本揭示之多肽較佳為經合成、單離、及/或純化之形態。

藉由使本揭示之多肽與ASPD共存或接觸而將本揭示之多肽與ASPD結合。因此，本揭示之多肽可較佳用於抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡、及/或阻礙ASPD與NAKα3之相互作用，並且可作為醫藥組合物之有效成分而用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種醫藥組合物，其包含本揭示之多肽，且用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。

或者，本揭示之多肽可用作ASPD之探針或成像探針或其前驅物，可用於ASPD之檢測及/或測定方法、ASPD之成像方法、及阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之判定及/或診斷方法。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種ASPD之檢測及/或測定用、ASPD成像用、或阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之判定及/或診斷用的組合物、醫藥組合物、或試劑盒，並且包含本揭示之多肽。

[擬肽]

本揭示進而作為其他態樣，係關於一種模擬本揭示之多肽之結構的擬肽。本揭示之擬肽具有對ASPD與NAKα3之相互作用之阻礙能力。作為本揭示之擬肽之較佳實施形態，可列舉上述式(I)所表示之基序之擬肽與腦靶向性肽直接或經由連接子而結合之形態。藉由結合腦靶向性肽，可提高本揭示之擬肽越過血腦障壁而向腦轉移之效率。作為腦靶向性肽，可應用先前公知者。

因此，藉由使本揭示之擬肽與ASPD共存或接觸而阻礙ASPD與NAKα3之相互作用。因此，本揭示之擬肽可較佳用於抑制ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡、及/或阻礙ASPD與NAKα3之相互作用，並且可作為醫藥組合物之有效成分而用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種醫藥組合物，其包含本揭示之擬肽，且用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法。

或者，本揭示之擬肽可用作ASPD之探針或成像探針或其前驅物，可用於ASPD之檢測及/或測定方法、ASPD之成像方法、及阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之判定及/或診斷方法。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種ASPD之檢測及/或測定用、ASPD成像用、或阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之判定及/或診斷用的組合物、醫藥組合物、或試劑盒，並且包含本揭示之擬肽。

又，本揭示於其他態樣中係關於一種篩選方法，其係篩選用於ASPD與NAKα3之相互作用之阻礙、ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制、或阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之方法之擬肽或低分子化合物的方法，並且包括進行基於第1多肽之立體結構之藥劑設計(SBDD)之內容。上述篩選方法亦可包括如下內容：對藉由上述SBDD而設計並製造之候補化合物調查ASPD結合能力及/或ASPD所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制。

[多核苷酸及載體]

本揭示進而作為其他態樣，係關於一種編碼本揭示之多肽之多核苷酸，又，係關於一種含有編碼本揭示之多肽之多核苷酸，且用以表現上述多肽之載體。作為上述載體，只要為可將上述多核苷酸進行基因導入者，則並無特別限定，但就安全性之觀點而言，較佳為AVV(Adeno-Associated Virus，腺相關病毒)載體。作為本揭示之載體之較佳實施形態，可列舉與腦靶向性肽結合之形態。藉由結合腦靶向性肽，可提高本揭示之載體越過血腦障壁而向腦轉移之效率。作為腦靶向性肽，可應用先前公知者。

[醫藥組合物]

本揭示為醫藥組合物之情形時，其劑形可根據投予方法而適當選擇，例如可列舉：注射劑、液體製劑、膠囊劑、咀嚼劑、錠劑、懸浮劑、乳霜劑、軟膏等。又，投予方法亦並無特別限制，可列舉經口投予、非經口投予。本揭示之醫藥組合物亦可含有對應投予形態或劑形之先前公知之添加物(例如賦形劑或稀釋劑)。

作為適合經口投予之劑形，可列舉：錠劑、含粒子、液體或粉末之膠囊、口含錠、咀嚼劑、多粒子及奈米粒子、凝膠、膜等固體製劑；懸浮液、溶液、糖漿及酏劑等液體製劑。作為上述賦形劑，可列舉：纖維素、碳酸鈣、磷酸氫鈣、甘露醇及檸檬酸鈉等載體；聚乙烯吡咯啶、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素及明膠等造粒結合劑；澱粉乙醇酸鈉及矽酸鹽等崩解劑；硬脂酸鎂及硬脂酸等潤滑劑；月桂基硫酸鈉等濕潤劑；保存劑、抗氧化劑、矯味矯臭劑及著色劑。

作為本揭示之醫藥組合物之非經口投予，可列舉向血流中、肌肉中或內部器官中直接投予之情況。非經口投予包含靜脈內、動脈內、腹腔內、鞘內、心室內、尿道內、胸骨內、頭蓋內、肌肉內及皮下之投予。非經口投予例如可利用針注射器、無針注射器及其他注入技術進行。又，作為適合非經口投予之劑形，例如可列舉含有賦形劑及/或緩衝劑之水溶液。

[預防、改善、及/或治療方法]

本說明書中，所謂阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防係包括如下內容：抑制阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之發病；或不使病情自可逆之輕度認知障礙發展。又，本說明書中，所謂阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之改善係包括如下內容：停止阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之可逆之輕度認知障礙之病情的發展；或使病情變為輕度。進而，本說明書中，所謂阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之治療係包括使病情之發展緩慢或基本上停止之內容。

作為本態樣之較佳之一實施形態，包括將含有多肽、擬肽、或低分子化合物之本揭示之醫藥組合物向對象進行投予的內容。本態樣之治療或預防方法較佳為包括將本揭示之醫藥組合物向對象投予有效量之內容。於對象為人類之情形時，例如通常可將多肽、擬肽、或低分子化合物平均每天之総量設為0.0001 mg/kg~100 mg/kg之範圍內。又，平均每天之總量可單次投予或分批投予。投予方法可適當選擇上述經口/非經口投予。

[成像方法]

本揭示於其他態樣中係關於一種成像用探針或其前驅物，其係ASPD成像探針或其前驅物，且具備本揭示之多肽或擬肽作為其與ASPD之結合部分。可藉由對本揭示之多肽或擬肽利用適當之標記放射性化合物進行標記而製成ASPD之成像用探針。

又，於其他態樣中，本揭示係關於一種ASPD之成像方法。成像方法可藉由自上述成像用探針之投予開始起經過固定時間後，自被投予上述探針之受檢體(較佳為受檢體之腦)檢測上述探針的訊號而進行。作為受檢體，例如可列舉人類及/或人類以外之動物(哺乳類等)。又，上述探針之訊號之檢測例如包括檢測上述成像用探針之標記所使用之放射性核種之訊號的內容。本揭示之成像方法進而亦可包括對檢測出之訊號進行再構成處理而轉換為圖像之內容。又進而，亦可包含顯示經轉換之圖像之內容。又，於本揭示之成像方法中，訊號之檢測可根據使用之分子探針之放射性核種之種類而適當決定，例如，可藉由使用PET(Positron Emission Tomography，正子放射斷層攝影)之測定、使用SPECT(Single-Photon Emission Computed Tomography，單光子放射電腦斷層攝影)之測定等而進行。

使用SPECT之測定例如包括藉由γ相機而測定自被投予上述成像用探針之受檢體發射之γ射線的內容。利用γ相機之測定例如包括於固定時間單位內測定自上述成像用探針之標記所使用之上述放射性核種發射之放射線(γ射線)的內容，較佳為包括於固定時間單位內測定放射線發射之方向及放射線數量的內容。本揭示之成像方法進而亦可包括如下內容：將藉由放射線之測定而獲得之經測定之本揭示之成像用探針之分佈以剖面圖像表示；及對獲得之剖面圖像進行再構成。

使用PET之測定例如包括自被投予上述成像用探針之受檢體利用PET用檢測器對藉由正子與電子之結合而產生之1對湮沒放射線進行同時計數的內容，進而亦可包括基於測量之結果而繪製發射正子之放射性核種之位置之立體分佈的內容。

於本揭示之成像方法中，亦可與SPECT之測定或PET之測定一併進行X射線CT(Computed Tomography，電腦斷層攝影)或MRI(Magnetic Resonance Imaging，磁共振成像)之測定。藉此，例如可獲得融合利用SPECT而獲得之圖像或利用PET而獲得之圖像(功能圖像)與利用CT而獲得之圖像或利用MRI而獲得之圖像(形態圖像)的融合圖像。

[判定/診斷方法]

亦可基於利用本揭示之ASPD成像方法而獲得之訊號資料或影像資料而算出ASPD量。阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之患者之大腦皮質中之天然ASPD量係與阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之嚴重程度相關聯而增加，因此，可藉由進行本揭示之成像方法而判定或診斷阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情的嚴重程度。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種診斷方法，其包含如下內容：基於利用ASPD成像方法而獲得之訊號資料或影像資料，判定阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度。

再者，阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症患者之大腦皮質中之表現NAKα3之神經細胞之數與阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之嚴重程度相關聯而減少。因此，亦可藉由成像NAKα3而判定或診斷阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度。因此，本揭示於其他態樣中係關於一種診斷方法，其係阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之診斷方法，且包括如下內容：基於利用NAKα3成像方法而獲得之訊號資料或影像資料，或根據上述訊號資料或影像資料算出之NAKα3量之測定結果，判定阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度，上述NAKα3成像方法包括自被投予具備NAKα3之結合對象作為與NAKα3之結合部分之NAKα3成像探針的受檢體檢測上述成像探針之訊號的內容。作為上述NAKα3之結合對象，例如可列舉抗NAKα3抗體。又，NAKα3之成像可以與ASPD之成像相同之方式進行。

以下，使用實施例進而說明本揭示之一個或複數個實施形態。

實施例 1. ASPD對成熟神經細胞發揮毒性，但不對作為未成熟神經細胞或非神經細胞之HEK293細胞揮發毒性 (1-1)ASPD結合實驗

利用過濾器純化合成ASPD後，對源自人類胚胎之HEK293細胞、成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞進行投予，於1小時後進行固定、免疫組織染色。ASPD未結合於HEK293細胞上，而結合於成熟神經細胞上。將其結果示於圖3之左。如該圖所示，ASPD與成熟神經細胞之結合被抗ASPD抗體阻礙。

(1-2)ASPD毒性實驗

對各細胞投予固定濃度之ASPD(5 μM)並放置一晚後，使用Roche公司製造之細胞死亡ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析法)定量細胞凋亡活性。ASPD未對作為非神經細胞之HEK293細胞、源自大鼠海馬區之未成熟神經細胞發揮毒性，而僅對成熟神經細胞發揮毒性。將其結果示於圖3之右。如該圖所示，ASPD對成熟神經細胞之毒性由抗ASPD抗體阻止。(1-3)根據上述內容及圖3，提示出ASPD藉由其特異性之立體結構而與僅存在於成熟神經細胞表面之標靶分子結合，並發揮神經毒性。

2.作為ASPD之標靶分子的Na⁺/K⁺-ATP酶α3之鑑定(2-1)利用遠西方法之分析

藉由RIPA(RadioImmunoPrecipitation Assay，放射免疫沈澱測定)而分別自源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞(圖4所表示之培養天數)與HEK293細胞製備萃取液，對蛋白質量進行定量後，利用SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)對固定量進行電泳分離，轉至硝化纖維素膜上後，與天然ASPD或Aβ單體反應固定時間。利用抗ASPD抗體haASD1檢測天然ASPD之結合，Aβ單體之結合係利用市售之作為抗Aβ單體抗體之6E10進行檢測(遠西方墨點(Far-Western Blotting))。將其結果示於圖4。

如圖4所示，可知ASPD僅於源自成熟神經細胞之萃取液中識別105 kDa之條帶。另一方面，於Aβ單體中，未與該條帶結合，而識別50 kDa左右之條帶。天然ASPD與105 kDa之條帶之結合係對ASPD具有特異性，僅利用抗ASPD抗體時未檢測出條帶，於預先利用過量之抗ASPD抗體處理天然ASPD之情形時亦未檢測出條帶。其係與ASPD對成熟神經細胞之結合與毒性於抗ASPD抗體之預先處理中失去有關。

(2-2)利用質譜分析法之分析

於圖5之左，表示使用合成ASPD代替圖4之天然ASPD之情形時之遠西方墨點分析的結果。表示合成ASPD與天然ASPD(圖4左)同樣地僅於成熟神經細胞中結合於105 kDa之條帶上。因此，認為合成ASPD與天然ASPD等效，此後使用其實施解析。

於圖5之右，表示圖5左所使用之源自細胞之萃取液之銀染色圖案。於用方框包圍之部位確認到於源自未成熟神經細胞之萃取液或源自HEK293細胞之萃取液中無法檢.測出之條帶。將其切下並藉由質譜分析計(MALDI-TOF-MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀)，Bruker Daltonics公司製造，商品名：Ultraflex)而進行MS/MS(Tandem Mass Spectrometry，串聯式質譜法)解析，結果檢測出Na⁺/K⁺-ATP酶α次單元。

(2-3)α3次單元之確認

使用圖4左及圖5左之遠西方墨點分析所使用之萃取液，對Na⁺/K⁺-ATP酶α1次單元與α3次單元進行利用選擇性抗體之西方墨點分析。將其結果示於圖6。如圖6所示，可認為選擇性地於成熟神經細胞中表現者為α3次單元，ASPD所結合之標靶為Na⁺/K⁺-ATP酶α3次單元(NAKα3)。

(2-4)ASPD免疫沈澱中之NAKα3之共沈澱

分別對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞之萃取液、及於該萃取液中添加合成ASPD並且使用抗ASPD抗體(haASD1)或作為對照之正常小鼠IgG(immunoglobulin G，免疫球蛋白G)的免疫沈澱物進行電泳，利用NAKα3特異性抗體進行西方墨點分析。將其結果示於圖7。如該圖所示，可知藉由抗ASPD抗體，NAKα3與ASPD共沈澱。

(2-5)ASPD免疫沈澱中之NAKα3之共沈澱

根據上述(2-4)之實驗，顯示ASPD與NAKα3係直接相互作用。為了表示該相互作用係於活細胞上產生，而製備以固定比率調配經生物素化之Aβ之生物素化ASPD，將其對活成熟神經細胞(源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞)進行投予，於1小時以內，於不破壞ASPD之結構之條件下回收細胞膜，並利用對生物素具有較強親和力之抗生物素蛋白進行分級。將銀染色之結果示於圖8。如該圖所示，僅於生物素化ASPD投予條件下存在105 kDa附近觀察到之條帶，根據串聯質譜分析(MS/MS)解析可知為NAKα。

根據以上不同之2個實驗(2-4)及(2-5)，顯示ASPD與NAKα3具有充分之結合強度而直接相互作用。

(2-6)螢光顯微鏡觀察

投予合成ASPD後，藉由抗ASPD抗體對成熟神經細胞(源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞)上之ASPD之結合部位進行螢光染色，並藉由特異性抗體對NAKa3之存在部位進行螢光染色，然後進行螢光顯微鏡觀察，將結果示於圖 9。如該圖所示，表示ASPD所結合之部位與NAKα3之存在部位吻合。

(2-7)解離常數

對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞投予合成ASPD，於1小時後固定細胞，將使用抗ASPD抗體而定量結合於細胞上之ASPD量之結果之史卡查圖(Scatchard plot)的一例示於圖10。又，根據該圖之史卡查圖，顯示合成ASPD之解離常數為Kd=1.5±7.8×10^-7 M。

(2-8)由ASPD所致之NAKα3之ATP酶活性抑制

對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞投予合成ASPD，於約24小時後回收細胞膜，測定ATP酶活性，並使用作為NAK之選擇性抑制劑之鳥巴箭毒(ouabain)求出NAK活性。於大鼠中，鳥巴箭毒之Ki為α3=3.1±0.3×10^-8 M、α1=4.3±1.9×10^-5 M。因此，於低濃度之鳥巴箭毒(10 nM)存在下，僅NAKα3受到抑制，故而可求出NAKα3活性(圖11之左欄之圖表)。並且，可作為於10 nM鳥巴箭毒存在下未受到抑制而於100 μM鳥巴箭毒下受到抑制之活性而求出NAKα1活性(圖11之中間欄之圖表)。如圖11所示，可知藉由ASPD處理，可使NAKα3活性變為20%以下。另一方面，可知NAKα1活性不如NAKα3活性那麼降低。因此，可知ASPD尤其是較強地抑制NAKα3活性。

(2-9)關於NAKα3

將Na⁺/K⁺-ATP酶(NAK)之功能、結構、分佈示於圖12。圖12上圖係對作為NAK之功能之與ATP水解相關聯之鈉-鉀泵功能進行說明之圖的一例。圖12中圖係表示NAK之α次單元及β次單元之結構之一例之圖。報告有如該圖所示，β次單元結合於α次單元之細胞外域4(Lemas et al.vol 269,8255-8259,1994)。如圖12下圖之表所示，α1次單元係存在於全部細胞中之普遍類型。另一方面，α3次單元選擇性地於成熟神經細胞中地表現。已知α2次單元於未成熟神經中表現，若成熟則轉變為α3次單元。該等NAKα3之見解與圖3~11之結果非常吻合。

3. ASPD所誘導之細胞死亡之機制 (3-1)測定細胞內鈣濃度

若因結合ASPD而抑制NAKα3之活性，則預測會有如下情況：(1)因流入之Na未被汲出，故而膜電位上升，其結果，膜電位依賴性Ca離子通道打開；或(2)對應Na之上升，細胞膜上之Na/Ca交換輸送體(NCX)進行反應而吸收Ca，最終於細胞內產生異常之鈣之流入。因此，利用Fura PE3螢光鈣指示劑觀察對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞投予ASPD時之細胞內鈣濃度。將其結果示於圖13。如該圖所示，可知自剛投予ASPD後起便檢測出細胞內鈣濃度之上升，最終細胞內鈣濃度超過界限而導致細胞死亡。亦顯示出此情況會根據ASPD濃度不同而更快發生。

(3-2)鈣通道抑制劑之效果

將下述表1所示之各種抑制劑以該表所示之濃度對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞進行預先投予，於 30分鐘後投予4 μM之合成ASPD，並於大約24小時後測定細胞凋亡活性。將其結果示於表1及圖14。如該表及該圖所示，可知膜電位依賴性鈣通道中，大量存在於預突觸中之N型離子通道關係到ASPD投予後因NAKα3活性受到抑制而產生之神經細胞死亡訊號級聯反應。進而，可知存在於線粒體中之NCX、mPTP亦分別與此相關。因此，如圖15所示，顯示首先因突觸上之膜電位依賴性N型鈣通道活化而產生鈣向細胞內之流入，繼而產生線粒體之鈣代謝異常，從而導致細胞死亡。

4.阿茲海默症之病情與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之關係

使用特異性抗體於人腦中檢驗NAK之分佈。根據正常腦中之解析，首先NAKα1係整體性地分佈，其與NAKα1普遍存在之情況吻合(圖16左上)。另一方面，可知NAKα3顯示與NAKα1完全不同之分佈，於大腦皮質中係沿神經突或軸索而點狀地分佈，或以包圍錐體細胞(神經細胞)之方式分佈(圖16右上)。於小腦中，NAKα3係沿神經突或軸索點狀地存在，除此以外，以包圍浦金埃氏細胞(purkinje cell)之方式分佈(圖17左上)。其與籃狀細胞(Basket cell)之分佈非常準確地重疊。籃狀細胞亦存在於大腦皮質中，與在mRNA之表現解析中經常於抑制性神經中觀察到NAKα3之表現的情況吻合。

患者腦中，於因阿茲海默症而發現較大損傷之大腦皮質中，NAKα3之染色消失(圖16右下)。另一方面，獲得如下結果：雖然NAKα1之染色於原先之存在部位消失，但於其以外之部分中量反而增大(圖16左下)。其係與以往之mRNA之解析吻合之結果(Siegel 1998)。同時，嘗試調查ASPD量，結果於患者小腦中僅檢測出與正常相同等級之極少量之ASPD，另一方面，於損傷較大之大腦皮質中存在大量之ASPD，其與NAKα3之減少相關(表2)。

5.與ASPD結合並且抑制細胞死亡之多肽

藉由抗ASPD抗體與ASPD結合而阻止ASPD與作為標靶分子之NAKα3之相互作用，抑制神經細胞死亡，因此尋找具有相同效果之肽。為此，對固定於微量滴定盤上之ASPD利用於病毒表面上表現之噬菌體展示庫(phage display library)(市售)篩選無規之12個胺基酸之基因庫，並解析收斂之序列。根據3次噬菌體展示，反覆獲得具有相同序列之噬菌體複數次，因此產生某種生物學濃縮，提示出獲得對ASPD有結合活性之肽之可能性。又，若生物資訊學(bioinformatics)性地解析獲得之全部序列，則H(His)及W(Trp)明顯以高頻率出現。提示於大量含有H/W之肽基序中，含有特異性地與ASPD結合者。若自其中實際調查中和ASPD毒性者與未中和毒性者，則可知中和毒性者具有共通之結構。將具有該中和活性之肽命名為Anti-AD toxicity(AAT)肽。將獲得之AAT肽01~05示於表3。又，將不具有中和活性之肽(PD)之兩例示於表3。

對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞投予AAT肽(01~03)14 μM，於30分鐘後投予4 μM之合成ASPD，於大約24小時後測定細胞凋亡活性。將其結果示於圖18。

有意思的是，關於AAT肽(01~03)，開頭之4個胺基酸(HLNW)與作為標靶分子之NAKα3之細胞外域4之特定部分(RLNW，此處為NAKα3與NAKα1大不相同之處)類似，接著的4個胺基酸與較其略下游之部分(Y-NLWR，NAKα3與NAKα1共通)類似(圖2)。又，提示出最後之4個胺基酸不具有特定之結構。顯示開頭之4個胺基酸之基序中，第3號之N(Asn)係於NAKα3中具有特異性(參照圖2，保存於人類與大鼠中)，其較為重要。

對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞投予AAT肽(04~05)0.14 μM，於30分鐘後投予4 μM之合成ASPD，於大約24小時後測定細胞凋亡活性。將其結果示於圖19。可知縮短AAT01而成之AAT04及AAT05具有與AAT01相同或其以上之抑制效果。

進而，使用下述表4所示之AAT肽06及07，以相同之方式確認ASPD之細胞凋亡活性之抑制效果。

對成熟之源自大鼠海馬區之初代培養神經細胞投予AAT肽(04、06、07)2.8 μM，於30分鐘後投予4 μM之合成ASPD，於大約24小時後測定細胞凋亡活性，與未投予AAT肽之對照組比較細胞凋亡活性，而算出其抑制活性。將其結果示於圖20。可知於縮短AAT04而成之肽中，AAT06具有與AAT04相同或其以上之抑制效果。

5. ASPD與AAT肽之解離常數

使生物素結合於上述AAT肽01~03之C末端側，並於末端固相化，將ASPD作為配位子，並藉由表面電漿子共振(SPR，Surface Plasmon Resonance)而求出解離常數。將其結果示於下述表5中。

[序列表非關鍵文字]

序列編號7~39、42~51：ASPD相互作用基序/肽

序列編號40、41：ASPD相互作用基序/肽(對照組)

圖1係神經細胞死亡之機制之說明圖。

圖2係表示NAK之細胞外域4之序列及認為澱粉球蛋白(ASPD)所結合之部分的圖。

圖3係表示ASPD之結合實驗(左照片)及ASPD之毒性實驗(右圖表)之結果的一例。

圖4係表示使用抗ASPD抗體(haASD1)及抗Aβ單體抗體 (6E10)而進行遠西方墨點分析之一例。

圖5係表示遠西方墨點分析(左)及銀染色圖案(右)之一例。

圖6係表示遠西方墨點分析(下段)、以及使用抗Na⁺/K⁺-ATP酶α1(NAKα1)抗體(上段)及抗Na⁺/K⁺-ATP酶α3(NAKα3)抗體(中段)之西方墨點分析的一例。

圖7係表示利用抗NAKα3抗體而對由抗ASPD抗體(haASD1)產生之免疫沈澱物進行西方墨點分析之一例。

圖8係表示自被投予生物素化ASPD之成熟神經細胞獲得之由抗生物素蛋白分級之銀染色圖案的一例。

圖9係表示藉由抗ASPD抗體而檢測出之成熟神經細胞中之ASPD之結合部位(紅)與藉由抗NAKα3抗體而檢測出之NAKα3之局部存在(綠)的螢光顯微鏡觀察照片之一例。

圖10係表示對成熟神經細胞投予合成ASPD，於1小時後固定細胞，使用抗ASPD抗體對結合於細胞之ASPD量進行定量之結果的史卡查圖之一例。

圖11係表示測定由ASPD所致之NAKα3及NAKα1之活性抑制之結果之一例。

圖12係表示NAKα3之功能、結構、及表現分佈。

圖13係表示測定ASPD之接觸所誘導之成熟神經細胞內鈣濃度之結果的一例。

圖14係表示調查各種鈣通道抑制劑對ASPD活性(細胞凋亡活性)之影響之結果之一例。

圖15係神經細胞死亡之機制之說明圖。

圖16係表示利用抗體對正常人(年齢匹配之非癡呆症者)及阿茲海默症(AD)患者之大腦皮質中之NAKα3及NAKα1進行組織染色之結果之一例。

圖17係表示利用抗體對正常人(年齢匹配之非癡呆症者)及AD患者之小腦中之NAKα3進行組織染色之結果之一例。

圖18係表示AAT肽對ASPD活性(細胞凋亡活性)之抑制效果之圖之一例。

圖19係表示AAT肽對ASPD活性(細胞凋亡活性)之抑制效果之圖之一例。

圖20係表示AAT肽對ASPD活性(細胞凋亡活性)之抑制效果之圖之一例。

<110> 日商TAO健康生活製藥股份有限公司

<120> 澱粉球蛋白(amylospheroid)所結合而誘發成熟神經細胞死亡之標靶分子、抑制澱粉球蛋白所誘導之神經細胞死亡的方法及物質、及其等之用途

<130> H3931

<140> 101150962

<141> 2012-12-28

<150> US 61/581267

<151> 2011-12-29

<150> JP2012-2448

<151> 2012-01-10

<160> 47

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 現代人種

<400> 1

<210> 2

<211> 42

<212> PRT

<213> 現代人種

<400> 2

<210> 3

<211> 52

<212> PRT

<213> 現代人種

<400> 3

<210> 4

<211> 52

<212> PRT

<213> 現代人種

<400> 4

<210> 5

<211> 52

<212> PRT

<213> 現代人種

<400> 5

<210> 6

<211> 52

<212> PRT

<213> 現代人種

<400> 6

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Asn、Gln、Ser、Thr、Cys、Tyr、Trp、Phe或Tyr

<220>

<221> 新特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Trp、Phe或Tyr

<400> 7

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<400> 8

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<400> 9

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Asn、Gln、Ser、Thr、Cys、Tyr、Trp、Phe或Tyr

<220>

<221> 新特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Trp、Phe或Tyr

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 14

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 15

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 16

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 17

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 18

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 19

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 20

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 21

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 22

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 23

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 24

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 25

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<220>

<221> 新特徵

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸

<400> 26

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<220>

<221> 新特徵

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸

<400> 27

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<220>

<221> 新特徵

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸

<400> 28

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Arg、His或Lys

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<220>

<221> 新特徵

<222> (6)..(7)

<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸

<400> 29

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<220>

<221> 新特徵

<222> (6)..(7)

<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸

<400> 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<220>

<221> 新特徵

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<220>

<221> 新特徵

<222> (6)..(7)

<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸

<400> 31

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 32

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 33

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 34

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 35

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 36

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 37

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 38

<210> 39

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 39

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽(對照)

<400> 40

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽(對照)

<400> 41

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 42

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Asn、Gln、Ser、Thr、Cys、Tyr、Trp、Phe 或Tyr

<220>

<221> 新特徵

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Trp、Phe或Tyr

<220>

<221> 新特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 43

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為疏水性胺基酸或Gly

<220>

<221> 新特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 44

<210> 45

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Phe或Leu

<220>

<221> 新特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Trp、Tyr、Asp或疏水性胺基酸

<400> 45

<210> 46

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<220>

<221> 新特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa為Phe或Leu

<400> 46

<210> 47

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASPD相互作用基序/肽

<400> 47

Claims

一種Na⁺/K⁺-ATP酶α3之於活體外之用途，其係用作誘發成熟神經細胞死亡之澱粉球蛋白之結合標靶分子。
如請求項1之用途，其包括基於澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用而進行醫藥品開發。
一種篩選方法，其係用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療的醫藥組合物之有效成分之候補化合物之篩選方法，並且包括：使用進行基於Na⁺/K⁺-ATP酶α3之細胞外域4或其一部分之立體結構的藥劑設計而合成之試驗化合物，測定澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之蛋白質間相互作用之阻礙能力、及/或對澱粉球蛋白之結合能力、及/或對澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡之抑制能力；及基於上述測定結果而選擇候補化合物。
一種Na⁺/K⁺-ATP酶α3成像探針之用途，其係用以製造調查受檢體之阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之病情之嚴重程度之組合物，該組合物係以下列方式使用：自被投予具備Na⁺/K⁺-ATP酶α3之結合對象作為與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之結合部分之Na⁺/K⁺-ATP酶α3成像探針的受檢體檢測出上述成像探針之訊號；測定根據上述訊號之訊號資料或影像資料算出之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量；其後將基準與上述測定結果進行比較，上述基準係選自由設為越低於正常個體之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量，嚴重程度越高之基準，及設為高於/低於上述受檢體之以前之Na⁺/K⁺-ATP酶α3量之情形時，嚴重程度分別變低/變高之基準所組成群之1個以上之基準。
一種經合成、單離、或純化之多肽，且其長度為50個胺基酸以下，該多肽於N末端具有X₁X₂NW(序列編號8)之胺基酸序列，此處，X₁為組胺酸(His)或離胺酸(Lys)，X₂為疏水性胺基酸殘基或甘胺酸(Gly)，且該多肽具有對澱粉球蛋白之結合能力。
如請求項5之多肽，其中胺基酸序列之長度為4~25個胺基酸。
如請求項5或6之多肽，其可阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用，及/或可抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡。
一種多核苷酸，其編碼如請求項5至7中任一項之多肽。
一種載體，其用以表現上述多肽，且包含編碼如請求項5至7中任一項之多肽之多核苷酸。
一種組合物，其含有如請求項5至7中任一項之多肽。
如請求項10之組合物，其係用於檢測及/或測定澱粉球蛋白。
如請求項10之組合物，其係用於抑制澱粉球蛋白所誘發之成熟神經細胞死亡。
如請求項10之組合物，其係用於阻礙澱粉球蛋白與Na⁺/K⁺-ATP酶α3之相互作用。
一種醫藥組合物，其含有：如請求項5至7中任一項之多肽、如請求項8之多核苷酸、或如請求項9之載體。
如請求項14之醫藥組合物，其用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療。
一種用於阿茲海默症及/或路易氏體型癡呆症之預防、改善、及/或治療之醫藥組合物，其含有多肽作為有效成分，該多肽之長度為50個胺基酸以下，且於N末端具有X₁X₂NW(序列編號8)或X₂NW(序列編號49)之胺基酸序列，此處，X₁為精胺酸(Arg)、組胺酸(His)或離胺酸(Lys)，X₂為疏水性胺基酸殘基或甘胺酸(Gly)。
一種探針或其前驅物，其係針對澱粉球蛋白者，並且其具備如請求項5至7中任一項之多肽作為其與澱粉球蛋白之結合部分。
如請求項17之探針或其前驅物，其用於澱粉球蛋白之成像或檢測或者測定。
一種澱粉球蛋白成像方法，其包括：自被投予具備如請求項5至7中任一項之多肽作為與澱粉球蛋白之結合部分之澱粉球蛋白成像探針的受檢體，檢測出上述成像探針之訊號。
一種澱粉球蛋白量之測定方法，其包括基於利用如請求項19之澱粉球蛋白成像方法獲得之上述訊號之訊號資料或影像資料而算出澱粉球蛋白量。