KR102577154B1 - 알츠하이머 질환에 대한 림프구-기반 PKCε 시험 - Google Patents

알츠하이머 질환에 대한 림프구-기반 PKCε 시험 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법 및 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 (a) 대상체로부터의 림프구를 적합한 조건 하에 배양하는 단계; (b) 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교하는 단계를 포함한다.

Description

알츠하이머 질환에 대한 림프구-기반 PKCε 시험
본 출원은 미국 가출원 번호 62/584,381 (2017년 11월 10일 출원) 및 62/479,663 (2017년 3월 31일 출원)의 이익을 주장하며, 둘 다의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 출원 전체에 걸쳐 다양한 공개물이 인용된다. 이들 공개물의 개시내용은 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 기술 수준을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 PKCε-기반 방법 및 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 갖기 쉬운지의 여부를 결정하는 PKCε-기반 방법에 관한 것이다.
지난 15년에 걸쳐 알츠하이머 질환의 병리생리학은 뇌와 관련이 있을 뿐만 아니라 전신 표출을 가질 수도 있음을 나타내는 많은 데이터가 수집되었다. 예컨대, 많은 중요한 아밀로이드 및 타우 효소가 신체 전체에서 발견될 수 있다. 이에 근거하여, 예컨대 알츠하이머 질환에 대한 피부 세포를 다양한 대조군 환자로부터의 세포에 대비하여 시험하기 위한 정확한 검정법이 개발되었다. 일부 피부 세포-기반 검정법은 PKCε 및 ERK1,2와 같은 표적에 중점을 둔다.
본 발명은 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제1 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제2 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 아밀로스페로이드가 없는 것을 제외하고는 동일한 증후성 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 크거나 동일한 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 단계를 포함하는, 제3 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 아밀로스페로이드가 없는 것을 제외하고는 동일한 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 크거나 동일한 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운 것인 단계를 포함하는, 제4 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 제1의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 제1 농도보다 높은 제2의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 증후성 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 큰 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 단계를 포함하는, 제5 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 (a) 제1 집단은 제1의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 제1 농도보다 높은 제2의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 큰 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운 것인 단계를 포함하는, 제6 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
도 1
혈액 림프구에서의 낮은 PKCe 수준
알츠하이머 질환 환자 (AD - 청록색)에서 PKCe 수준은 다른 2개의 케이스, 헌팅턴 질환 케이스 (비-ADD - 담청색) 및 연령-일치된 대조군 케이스 (AC- 보라색)와 비교하여 가장 낮다. 이 결과는 피부 섬유아세포 및 뇌에서 나타나는 PKCe 효과와 유사하다 (Khan and Alkon, Journal of Alzheimer's Disease, 43 (2015) 491-509).
도 2A 및 2B
PKCe 바이오마커에서 B 림프구와 총 단백질 농도의 선형 상관관계
(도 2A) B 림프구에 대한 총 단백질 농도는 세포 밀도와 선형으로 서로 연관된다 (피어슨 (Pearson)의 선형 상관관계 계수 0.916). (도 2B) AD 케이스에서 PKCe 수준은 P <0.001의 통계적 유의도로 비-ADD 케이스보다 낮다 (청색 원통). AD 케이스에서 PKCe 수준은 AC보다 통계적으로 유의하게 낮지 않다 (황색 원통). 그러나, AC 케이스는 치매가 아니므로, AD와 AC 간의 차이는 임상적으로 평가될 수 있다.
도 3A 및 3B
ASPD 농도의 함수로서의 차등 PKCe 값
(도 3A) AD 케이스 (보라색 사각형) 및 AC 케이스 (녹색 원)에 대한 ASPD- 처리된 B 림프구에 대한 PKCe 값이 나타나 있다. 선은 최선의 피트 (fit)를 나타낸다. (도 3B) 9개의 세포주에 대한 기울기 (S) 및 절편 (I)의 분포가 나타나 있다. 녹색 원은 AC를 나타낸다. 보라색 사각형은 AD를 나타낸다. 청색 삼각형은 비-ADD를 나타낸다.
정의
본 출원에서, 하기에 제시된 바와 같은 의미를 가질 특정 용어가 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 증후성 인간 대상체와 관련하여 "알츠하이머 질환을 진단하는"은 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 50% 초과인 것을 결정하는 것을 의미한다. 바람직하게는, "알츠하이머 질환을 진단하는"은 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과인 것을 결정하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는"은 문구 "알츠하이머 질환을 진단하는"과 동의어이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는"은 대상체가 그녀 또는 그의 생애 동안 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 평균보다 높다는 것을 결정하는 것을 의미한다. 65세 이후에는 5명 중 1명이 알츠하이머 질환을 앓고, 85세 이후에는 2명 중 1명이 알츠하이머 질환을 앓게 될 것이다. 바람직하게는, 이 소인을 결정하는 것은 대상체가 그녀 또는 그의 생애 동안 알츠하이머 질환을 앓게 될 가능성이 적어도 20%인 것을 결정하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "알츠하이머 질환"은 하기의 3종의 증상과 동시에 발생하는 고통을 의미한다: (i) 치매; (ii) 아밀로이드 플라크; 및 (iii) 신경원섬유 매듭. 치매는 일생 동안 진단될 수 있다. 예컨대, 대뇌 아밀로이드 플라크 및 신경원섬유 매듭은 부검 중에 진단될 수 있다. 알츠하이머 질환에 대한 이 정의는 국립 보건원 (NIH)의 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)에 의해 제공된 것이며, "골드 표준"으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 알츠하이머 질환에 대해 "증후성"인 인간 대상체는 질환의 적어도 하나의 증상, 즉 치매, 아밀로이드 플라크 및 신경원섬유 매듭 중 하나를 나타내는 대상체이다. 바람직하게는, 알츠하이머 질환에 대해 증후성인 인간 대상체는 치매를 나타내는 대상체이다. 반대로, 알츠하이머 질환에 대해 "무증후성"인 인간 대상체는 어떠한 질환 증상도 나타내지 않는 대상체이다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 대상체"는 임의의 연령일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 40세 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 50세 이하이다. 추가의 실시양태에서, 대상체는 40세 초과이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 대상체는 50세 초과, 60세 초과, 70세 초과, 80세 초과 또는 90세 초과이다.
본원에 사용된 바와 같이, 림프구를 이들이 "증식"할 수 있는 조건 하에서 "배양하는" 것은, 예컨대 세포 성장을 허용하는 온도 및 성장 인자 환경에서 배양을 수행함으로써 달성된다. 또 다른 실시양태에서, 림프구를 "배양하는" 것은 림프구 생존력을 보존하는 조건 (예컨대, 증식에 대해 하기에 기재된 것들) 하에서 수행된다. 한 실시양태에서, 세포 성장을 허용하는 온도, 염도 및 단백질 환경은 37℃, 10% 우태 혈청 ("FBS") 및 1% 페니실린 ("PS")을 갖는 RPMI 1640 배지이다. 본 발명의 예상치 못한 특징에서, 림프구 (예컨대, B 림프구)는 연장된 기간 동안 생존 가능하게 유지되어 림프구를 수거한 후 3시간 초과에 림프구 PKCε의 측정을 허용한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 림프구-배양 단계는 3시간 초과 동안 수행된다. 바람직하게는, 림프구-배양 단계는 6시간 초과 동안 (예컨대, 밤새) 수행된다. 불멸화된 B 림프구에서, PKCε 수준은 무기한으로 안정하게 유지되므로, 불멸화 후 수일, 수주, 수개월 또는 수년 후에 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체"로부터의" 림프구를 배양하는 것은 대상체로부터 유래된 림프구를 배양하는 것을 의미하며, 여기서 배양 전 림프구는 대상체로부터 꺼낸 후 조작되거나 (예컨대, 단리, 불멸화 및/또는 달리 변형되거나) 조작되지 않았다.
본원에 사용된 바와 같이, "림프구"는 예로서 B 림프구, T 림프구 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 림프구는 B 림프구이다. 대상체의 혈액으로부터 림프구를 수득하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 유동 세포측정, 피콜 (혈액 층을 분리시키는 친수성 다당류) 및 구배 원심분리를 포함한다. 추가로, 본 방법에서, 림프구 (예컨대, B 림프구)는 불멸화 또는 1차 (즉, 비-불멸화) 형태로 사용될 수 있다. 림프구 (예컨대, B 림프구)를 불멸화하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 림프구를 엡스타인-바 바이러스 ("EBV")로 처리하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "PKCε" (본원에서 "PKCe"로도 지칭됨)은 단백질 키나제 C 입실론을 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 "측정"하는 것은, 예컨대 제자리에서 또는 림프구로부터 단백질을 단리한 후에 수행될 수 있다. 또한, 측정은, 예컨대 단백질 키나제의 양을 정량적으로 결정할 수 있는 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 공지되어 있고, 제한 없이, ELISA- 기반 검정법, 분광광도측정 검정법, 웨스턴 블롯 방법, 듀오링크 방법 및 임의의 다른 항체-기반 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 것은, 예컨대 (i) 림프구당 PKCε의 fg, (ii) 공지된 세포 집단당 PKCε의 ng, (iii) 세포 분해물 부피당 PKCε의 ng 또는 (iv) PKCε 단리 과정 동안 생성되는 상청액 부피당 PKCε의 ng으로 표현되는 PKCε의 양을 결정하는 것을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 측정은 총 림프구 단백질과 관련하여 표현된다. 예컨대, 배양된 림프구에서 측정된 PKCε의 양은 "ng/mL/μg"으로 표현될 수 있으며, 여기서 "mL"는 PKCε 단리 과정 동안 생성되는 상청액의 부피를 나타내고, "ng"은 상청액 중에 존재하는 PKCε의 양을 나타내고, "μg"은 상청액 중에 존재하는 단백질의 양을 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 것은, 예컨대 이 단락에 기재된 하나 이상의 단위로 표현되는 PKCε의 양의 시간에 따른 변화율을 결정하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동일해야 하는 본 방법을 수행하기 위한 "적합한 대조군"은, 제한 없이, 양성 대조군, 음성 대조군 또는 각각의 하나 이상을 포함한다. 예컨대, 양성 대조군은 알츠하이머 질환을 앓고 있는 인간 대상체로부터 수득된 림프구에 대해 본 방법 중 하나를 수행함으로써 수득되는 림프구 PKCε 데이터일 수 있다. 음성 대조군은, 예컨대 알츠하이머 질환을 앓고 있지 않은 인간 대상체 (예컨대, 어떠한 인지 증상도 없는 대상체, 경도 인지 장애를 앓고 있는 대상체 또는 비-알츠하이머 치매를 앓고 있는 대상체)로부터 수득되는 림프구에 대해 본 방법 중 하나를 수행함으로써 수득되는 림프구 PKCε 데이터일 수 있다. 중요하게는, 본 방법의 일부 방법에서, 관심의 인간 대상체로부터의 림프구를 시험하기 전, 동시에 또는 후에 대조군 시험 (예컨대, 양성, 음성 및/또는 둘 모두)을 수행하는 것이 고려된다. 이 경우, 이러한 대조군 시험으로부터의 데이터는 적합한 대조군으로 역할을 할 수 있다. 또한, 본 방법의 다른 방법에서, 관심의 인간 대상체로부터의 림프구를 시험하기 전, 동시에 또는 후에 어떠한 대조군 시험도 수행하지 않는 것이 고려된다. 대신에, 각각의 이러한 방법에서, 알츠하이머 질환을 앓고 있는지 또는 그에 대한 소인을 갖는지를 결정하는 것은 (해당되는 경우), 예컨대, 방법의 결과를, 해당되는 경우, 질환 상태 또는 소인과 공지된 상관 관계를 갖는 림프구 PKCε 파라미터 (예컨대, 1.0 ng/mL/μg)와 비교함으로써 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "아밀로스페로이드" (본원에서 "ASPD"로도 지칭 됨)는 β-아밀로이드의 구형 응집체를 의미한다. 아밀로스페로이드는 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다. 바람직하게는, 아밀로스페로이드는, 예컨대 10 nm 초과의 직경 (예컨대, 10 nm 내지 20 nm, 20 nm 내지 50 nm 및 50 nm 내지 100 nm)을 갖는 독성 크기의 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 아밀로스페로이드의 "적합한 농도"는, 제한 없이, 0 nM 초과 및 500 nM 미만 (예컨대, 1 nM 내지 100 nM, 100 nM 내지 200 nM, 200 nM 내지 300 nM, 300 nM 내지 400 nM 및 400 nM 내지 500 nM)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 상이한 배양된 림프구 집단에서 PKCε의 양과 관련하여 "별도로 측정하는"은 2개의 집단을 먼저 혼합하거나 달리 조합하지 않고 각각의 집단에서 PKCε의 양을 측정하는 것을 의미한다.
본 발명의 실시양태
본 발명은 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 림프구-기반 방법을 제공한다. 또한, 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 림프구-기반 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 부분적으로, 해당되는 경우, 대상체의 림프구가 알츠하이머 질환을 진단하거나 알츠하이머 질환에 대한 소인을 결정하기 위해 PKCε-기반 시험에 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 증후성 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 제1 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 방법에서, 림프구는 임의의 유형의 림프구일 수 있다. 바람직하게는, 림프구는 B 림프구이다. 또한, 불멸화되는 B 림프구가 바람직하다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 방법에서, 배양 단계 (a)는 3시간 초과 동안 및 이상적으로는 6시간 초과 동안 수행된다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제3 및 제5 방법의 바람직한 실시양태에서, 증후성 인간 대상체는 알츠하이머 질환 또는 비-알츠하이머 치매를 갖는 것으로 의심되고, 상기 방법은 대상체가 이들 2개의 장애 중 어느 것을 앓고 있는지를 결정하는 것을 허용한다.
이 제1 방법 및 하기에 기재된 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 단계 (a)가 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 6시간 초과 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 인간 대상체로부터의 림프구를 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 적합한 대조군과 비교함으로써 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 제2 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
이 제2 방법 및 하기에 기재된 제4 및 제6 방법에서, 대상체는 인지 장애를 앓고 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 이 장애는 경도 인지 장애이다. 대안적으로, 이 제2 방법 및 하기에 기재된 제4 및 제6 방법에서, 대상체는 인지적으로 손상되지 않는다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 아밀로스페로이드가 없는 것을 제외하고는 동일한 증후성 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 크거나 동일한 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 단계를 포함하는, 제3 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 아밀로스페로이드가 없는 것을 제외하고는 동일한 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 크거나 동일한 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운 것인 단계를 포함하는, 제4 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 제1의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 제1 농도보다 높은 제2의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 증후성 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 큰 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 단계를 포함하는, 제5 방법, 즉 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 제1 집단은 제1의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 제1 농도보다 높은 제2의 적합한 농도의 아밀로스페로이드를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 인간 대상체로부터의 2개의 림프구 집단을 림프구 생존력을 보존하고/하거나 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제2 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양이 제1 집단으로부터 배양된 림프구에서의 PKCε의 양보다 큰 경우 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운 것인 단계를 포함하는, 제6 방법, 즉 인간 대상체가 알츠하이머 질환을 앓게 되기 쉬운지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
제5 및 제6 방법에서, 아밀로스페로이드 (다시, "ASPD"로 표시됨)의 제1 및 제2의 적합한 농도는, 적어도 제2의 아밀로스페로이드 농도는 0 nM보다 큰 경우, 예컨대 0 nM 내지 500 nM 범위의 값을 포함한다. 바람직하게는, ASPD의 1 및 제2의 적합한 농도는 하기의 2-농도 순열에 의해 예시되는 0 nM 내지 125 nM 범위의 값을 포함한다: (i) 0 nM 및 25 nM; (ii) 0 nM 및 50 nM; (iii) 0 nM 및 75 nM; (iv) 0 nM 및 100 nM; 및 (v) 0 nM 및 125 nM.
제5 및 제6 방법의 한 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 집단이 특유한 적합한 농도의 ASPD를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 대상체로부터의 2개 초과의 림프구 집단을 배양하는 단계 및 각각의 집단으로부터 배양된 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계를 포함한다. 단지 한 실시양태를 지정하기 위한, ASPD의 제1, 제2 및 제3의 적합한 농도의 예는 하기를 포함한다: (i) 0 nM, 25 nM 및 50 nM; (ii) 0 nM, 50 nM 및 100 nM; 및 (iii) 0 nM, 50 nM 및 125 nM.
제5 방법의 진단 결과 및 제6 방법의 예후 결과는, 한 실시양태에서, PKCε 측정치 (즉, 데이터 포인트)를 그래프 상에 플로팅하고 데이터 포인트에 의해 형성된 선의 기울기를 측정함으로써 표현될 수 있다. 특정 예로서, PKCε 측정치가 x-축 = ASPD 농도 (nM) (예컨대, 0 nM 내지 100 nM, 125 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM 또는 500 nM)이고 y-축 = PKCε (ng/mL/μg의 단백질)인 그래프 상에 플로팅되는 경우, 생성된 기울기는 양수 (예컨대, 0.000 초과, 0.005 초과 또는 0.010 초과)이다. 바람직하게는, 플로팅된 각각의 데이터 포인트는 평균값이다.
마지막으로, 본 발명은 별도의 구획 또는 단일 구획에 (i) 성장 배지 (예컨대, 10% FBS 및 1% PS를 갖는 RPMI 1640 배지) 및 (ii) PKCε를 정량적으로 측정하기 위한 수단 (예컨대, 샌드위치 인간 항체를 갖는 PKCε ELISA 키트)을 포함하는, 본 방법의 임의의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의적으로 본 ASPD-의존적 방법을 수행하기 위해 적합하게 제형화된 ASPD를 함유할 수 있다. PKCε ELISA 키트는 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, https://www.mybiosource.com/prods/ELISA-Kit/Human/Protein-Kinase-C-Epsilon/PKCE/datasheet.php?products_id=21356 또는 http://www.antibodies-online.com/search.php).
또한, 본 발명을 (i) 임의의 비-림프구 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 (ii) 재프로그래밍된 EBV-불멸화된 B 림프구로부터 유래된 임의의 다능성 줄기 세포 (iPSC)에 적용하는 것이 고려된다 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3158714/; 및 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596471/). 이 실시양태에서, 이러한 세포는 림프구가 본 발명에서 처리되는 것과 같이 필요한 변경을 가하여 처리된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 것이지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 열거된 특정 실시예가 이후의 청구범위에서 보다 완전하게 기재되는 본 발명을 단지 예시하는 것임을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
PBMC 준비. 나트륨 헤파린 (BD 바이오사이언즈 (BD Bioscience), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)을 갖는 BD 진공채혈관 (Vacutainer) CPTTM 세포 준비 튜브에 샘플링된 전혈을 PBS 중에 1:2로 희석하고, 저온 피콜-파크 PLUS (GE 헬스케어 (GE Healthcare), 영국 리틀 찰폰트) 위에 조심스럽게 층을 형성하게 하고, 얼음에 보관한 후, 18-20℃에서 브레이크 없이 900 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 이루어진 피콜-파크 PLUS 상단의 세포층을 수집하고, PBS 중에 희석하였다. PBMC를 18 내지 20℃에서 450 x g에서 7분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 5 ml PBS 중에 재현탁시키고, 계수한 후, 18-20℃에서 7분 동안 350 x g에서 원심분리하였다. 마지막으로, 세포를 동결 배지 (열-불활성화된 우태 혈청 (FBS) 중 10% DMSO) (노르딕 바이오랩스 AB (Nordic Biolabs AB), 스웨덴 타바이)에 재현탁시키고, 적어도 3시간 동안 엠알. 프로스티 (Mr. Frosty)TM 냉동 용기 (써모 피셔 (Thermo Fisher))에 -70℃에서 둔 후, 연장된 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다.
유동 세포측정. 각각의 개별 세포 샘플에 대해, 5 x 106개의 PBMC를 37℃에서 신속하게 해동시키고, 40 ml의 저온 세척 완충액 (2.5% FBS (라이프 테크놀로지스 엘티디. (Life Technologies Ltd.), 영국 페이즐리) 및 0.1% 아지드화나트륨으로 보충된 PBS)으로 희석하였다. 세포 현탁액을 5분 동안 250 x g에서 원심분리하고, 상청액을 버린 후, 펠렛을 400 ml 세척 완충액 중에 재현탁시켰다. 각각의 샘플을 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 700 (BD 바이오사이언시즈)으로 표지된 적정된 양의 항-CD19로 2℃에서 광-보호된 환경에서 1시간 동안 염색하였다. 샘플을, BD FACSDiva 6.0 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈)에 의해 제어되는, BD LSR II 특별 주문 시스템을 이용하여 분석하였다. 예비 포워드 스캐터 (FSC) 대 사이드 스캐터 (SSC) 게이트를 사용하여 림프구를 식별하고, 샘플 크기에 따라 총 100,000개 이하의 인-게이트 이벤트를 기록하였다. 추가 게이팅 및 분석을 위해 모든 데이터세트를 플루오조 (FlowJo) 7.6.5 (트리스타 인크. (Treestar Inc.), 미국 오레곤주 애쉬랜드)로 이동하였다.
세포를 코리엘 세포 저장소 (Coriell Cell Repository) 사양에 따라, 즉 즉 37℃에서 워터 재킷 CO2 인큐베이터에서 10% FBS 및 1% PS를 갖는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

Claims (42)

  1. (a) 증후성 인간 대상체로부터의 2개의 B 림프구 집단을 B 림프구 생존력을 보존하고/하거나 B 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계이며, 상기 2개의 B 림프구 집단 중 제1 집단은 0 nM 초과 내지 500 nM 미만의 제1의 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 0 nM 초과 내지 500 nM 미만의 제2의 농도의 아밀로스페로이드를 포함하되 여기서 상기 제2의 농도는 제1의 농도보다 높은 것임을 제외하고는 동일한 것인 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 B 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 제2 집단으로부터 배양된 B 림프구에서의 PKCε의 양이 제1 집단으로부터 배양된 B 림프구에서의 PKCε의 양보다 큰 경우 상기 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, B 림프구가 불멸화된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 3시간 초과 동안 수행되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (a)가 6시간 초과 동안 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 증후성 인간 대상체가 알츠하이머 질환 또는 비-알츠하이머 치매를 갖는 것으로 의심되고, 방법이 대상체가 이들 2개의 장애 중 어느 것을 앓고 있는지를 결정하도록 하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 (a)가 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 6시간 초과 동안 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. (a) 증후성 인간 대상체로부터의 2개의 B 림프구 집단을 B 림프구 생존력을 보존하고/하거나 B 림프구가 증식하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계이며, 상기 2개의 B 림프구 집단 중 제1 집단은 0 nM 초과 내지 500 nM 미만의 제1의 농도의 아밀로스페로이드를 포함하고 제2 집단은 0 nM 초과 내지 500 nM 미만의 제2의 농도의 아밀로스페로이드를 포함하되 여기서 상기 제2의 농도는 제1의 농도보다 높은 것임을 제외하고는 동일한 것인 단계; (b) 제1 및 제2 집단으로부터 배양된 B 림프구에서 PKCε의 양을 별도로 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 측정치를 비교하는 단계이며, 이로써 x-축이 nM 단위의 아밀로스페로이드 농도를 나타내고 y-축이 단백질의 ng/ml/μg 단위의 PKCε를 나타내는 그래프 상에 PKCε 측정치를 플로팅할 때 생성된 기울기가 0.000 초과인 경우 상기 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 단계를 포함하는, 증후성 인간 대상체에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, x-축이 nM 단위의 아밀로스페로이드 농도를 나타내고 y-축이 단백질의 ng/ml/μg 단위의 PKCε를 나타내는 그래프 상에 PKCε 측정치를 플로팅할 때 생성된 기울기가 0.005 초과인 경우 상기 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, x-축이 nM 단위의 아밀로스페로이드 농도를 나타내고 y-축이 단백질의 ng/ml/μg 단위의 PKCε를 나타내는 그래프 상에 PKCε 측정치를 플로팅할 때 생성된 기울기가 0.010 초과인 경우 상기 대상체가 알츠하이머 질환을 앓고 있는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, B 림프구가 불멸화된 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 단계 (a)가 3시간 초과 동안 수행되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 (a)가 6시간 초과 동안 수행되는 것인 방법.
  13. 제7항에 있어서, 단계 (a)가 대상체로부터의 불멸화된 B 림프구를 6시간 초과 동안 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
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