KR20080093741A

KR20080093741A - 신경조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법

Info

Publication number: KR20080093741A
Application number: KR1020070037898A
Authority: KR
Inventors: 이봉희; 김미영
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2007-04-18
Publication date: 2008-10-22

Abstract

본 발명은 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 신경세포 표지물질인 MAP2에 특이적으로 반응하는 1차 항체로 신경세포를 반응시키는 1단계, 상기 1단계의 신경세포를 형광으로 표지된 2차 항체로 반응시키는 2단계, 상기 2단계의 신경세포를 TUNEL assay를 시행하여 사멸하는 세포를 상기 제 2단계의 형광표지와 다른 파장으로 염색하는 3단계 및 상기 3단계의 신경세포를 공초점 형광현미경을 이용하여 MAP2 형광염색과 TUNEL assay가 이중으로 염색된 결과를 확인하는 4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법으로 MAP2에 특이적으로 반응하는 형광-표지된 항체와 TUNEL assay를 이용하는 경우, 신경조직에서 사멸하는 신경세포만을 확인할 수 있다.

신경세포, 뇌조직, 곤충, MAP2, TUNEL assay, Cy3, 공초점 형광현미경

Description

신경조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법 {Methods for detecting apoptotic neurons in nerve tissue}

도 1a는 누에 뇌 조직에서 MAP2가 붉은 색으로 형광염색된 사진이다.

도 1b는 누에 뇌 조직에서 모든 사멸하는 세포가 TUNEL assay로 처리에 의해 녹색형광물질인 FITC에 의해 염색된 사진이다.

도 1c는 누에 뇌 조직에서 MAP2 반응 결과와 TUNEL assay 처리 결과를 서로 중첩시켜 사멸하는 모든 신경세포의 핵이 노란색으로 나타난 사진이다.

도 2는 누에 뇌 조직에서 MAP2에 대해 western blot하여 MAP2가 존재함을 증명한 사진이다.

도 3a는 누에 뇌 조직에서 MAP2에 대한 immunogold staining을 시행한 결과이다.

도 3b는 누에 뇌 조직에서 MAP2에 대한 immunogold staining을 시행한 결과 뇌 조직의 신경세포만이 포유동물 신경세포 표지물질인 MAP2를 포함하고 있음을 나타낸다.

도 4는 TUNEL assay 과정을 나타낸 Flow Diagram이다.

도 5는 western blotting 과정을 나타낸 Flow Diagram이다.

본 발명은 신경조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 신경세포 표지물질인 MAP2에 특이적으로 반응하는 1차 항체로 신경세포를 반응시키는 1단계, 상기 1단계의 신경세포를 형광물질로 표지된 2차 항체로 반응시키는 2단계, 상기 2단계의 신경세포를 TUNEL assay를 시행하여 사멸하는 세포를 상기 제 2단계의 형광표지와 다른 파장으로 염색하는 3단계 및 상기 3단계의 신경세포를 공초점 형광현미경 (confocal microscope)을 이용하여 MAP2 형광염색과 TUNEL assay가 이중으로 염색된 결과를 확인하는 4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법에 관한 것이다.

신경세포사는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등과 같은 퇴행성 신경계 질환에서 나타나는 공통적인 병태이다. 신경세포사는 잠재적으로 개체에 대하여 강력하고 비가역적인 효과를 야기할 수 있고, 발작, 심장마비, 뇌 또는 척수 허혈, 외상 등의 결과로 나타날 수도 있다. 이러한 신경세포사의 원인 중의 하나가 신경세포의 세포사멸 (apoptotic neuronal cell death)이다. 세포는 생체내에서 불필요하게 되면 자연히 사멸하도록 하는 자멸기구를 가지는데 , 이러한 계획적인 세포사를 "세포사멸 (apoptosis)"이라고 하며, 세포 생리학 분야에서 주목을 받고 있다. 초기에는 메타모포시스 (metamorphosis)에서의 세포의 죽음이나 시납토제네시스 (synaptogenesis) 동안의 신경세포의 죽음 혹은 림프구 분화과정에서의 면역계 세포의 죽음 등과 같은 경우의 현상으로 생각되었으나, 최근에는 동물세포가 자신을 죽이기 위한 능동적 과정을 갖고 있는 것으로 알려지고 있으며, 세포사멸은 세포주기 조절의 중요부분으로서 이해되고 있다.

세포사멸 (apoptosis)은 세포가 외부의 자극에 대해서 능동적으로 사멸하는 프로그램화된 사멸 기작으로 수동적인 세포 사멸 기작인 괴사와 구별된다 (in Apoptosis; The Molecular Basis of Cell Death, L. D. Tomei & F. O. Cope Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1991;5-29). 프로그램화된 세포사멸은 이전까지는 필요했던 세포이나 이제부터는 불필요해진 세포를 제거하는 과정으로 배 발생과 종양의 퇴화 및 면역 시스템에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 방법은 곤충 배후발생과정에서 불필요해진 뇌 속 사멸 신경세포를 먼저 MAP2로 반응시켜 표지시키고 이어 TUNEL assay로 처리하여 이를 찾아내는 유일한 방법이다.

이제까지 곤충의 신경세포를 표지하기 위해 사용된 물질은 neuron-specific enolase (NSE)만이 보고 되어 있으며 MAP2를 이용한 곤충의 신경세포 확인 방법은 본 발명자가 처음으로 사용한 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법으로 MAP2에 특이적으로 반응하는 형광-표지된 항체와 TUNEL assay를 이용하는 경우, 사멸하는 신경세포만을 확인할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 포유류 신경세포에서 유래한 MAP2 protein이 곤충의 뇌조직의 신경세포에도 존재하는 지를 확인하고 이어 TUNEL assay를 처리함으로써 사멸하는 신경세포만을 확인할 수 있는 방법으로 곤충의 신경조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 곤충의 신경조직에서 사멸하는 신경세포 확인 방법을 이용한 인간 신경조직에서 사멸하는 신경세포 확인 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법에 있어서,

a) 신경세포 표지물질인 MAP2 (microtubule-associated protein 2)에 특이적으로 반응하는 1차 항체로 신경세포를 반응시키는 1단계;

b) 상기 1단계의 신경세포를 형광물질로 표지된 2차 항체로 반응시키는 2단계;

c) 상기 2단계의 신경세포를 TUNEL assay를 시행하여 사멸하는 세포를 상기 제 2단계의 형광물질과 다른 파장의 형광물질로 염색하는 3단계; 및

d) 상기 3단계의 신경세포를 공초점 형광현미경 (confocal microscope)을 이 용하여 MAP2 형광염색과 TUNEL assay가 이중으로 염색된 결과를 확인하는 4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 상기 TUNEL assay에 사용되는 형광염색물질은 상기 MAP2항체에 표지된 형광물질과는 서로 다른 파장을 가지는 것이 바람직하다. 본 발명은 두 가지 염색법을 사용하여 그 염색결과를 이중으로 중첩시켜 확인하는 것으로, 공초점 형광현미경 (confocal microscope)을 사용하여 그 중첩된 결과를 확인할 수 있어야 하므로 상기 두 형광물질은 서로 다른 파장을 가지는 형광물질들을 사용하는 것이 좋다. 예컨대 하기 표에서 두 가지 대응하는 형광물질들을 선택할 수 있다.

본 발명에서는 실시예로써, MAP2 항체에 사용된 형광물질로는 Cy3 (붉은색형광)과 TUNEL assay에 사용된 형광물질로는 FITC (fluorescein isothiocyanate: 녹색형광)를 사용하였다.

본 발명의 방법에서, 상기 뇌 조직은 신경조직이 발달한 모든 고등동물의 뇌 조직에 대하여 적용할 수 있으나 바람직하게는 곤충의 뇌 조직인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 포유류의 신경세포에만 특이성을 나타내는 것으로 알려진 MAP2 분자가 곤충의 신경세포에도 특이성을 나타냄을 확인하였고 이를 이용하여 곤충의 신경세포들 중 사멸하는 세포들만 확인할 수 있는 방법으로 TUNEL assay를 적용시켜 본 발명을 확립하였다.

본 발명에 사용된 TUNEL assay (Terminal deoxynucleotidyl-mediated dUTP nick-end labeling assay)는 사멸하는 세포를 측정하는 염색방법을 말하는 것으로, 측정원리는 다음과 같다.

사멸하는 세포의 DNA는 정상 세포와 다르게 3’-OH DNA 말단을 노출시킨 조각난 DNA 조각 (fragmented DNA)의 특징이 이미 알려져 있다. 이러한 차이점을 이용해, TUNEL assay는 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT enzyme)이라는 3’-OH DNA 말단에 nucleotide를 가져다 붙이는 특이효소를 사용해서 3’-OH DNA 말단을 fluorescein-12-dUTP(nucleotide)로 표지해 사멸하는 세포를 정상 세포와 구별해 측정할 수 있게 된다.

본 발명의 방법에서, 상기 MAP2에 특이적으로 반응하는 항체는 바람직하게는 포유동물의 신경세포에서 유래한 MAP2에 대한 항체인 것을 특징으로 한다. MAP2 (microtubule-associated protein 2)는 포유류의 신경세포에 대한 특이적 표지물질로서 이미 알려져 있는 분자이지만, 본 발명에서는 곤충의 신경세포에도 적용할 수 있음을 본 발명의 실시예에서 확인하였다. 본 발명에서 사용된 mouse anti-MAP2 primary antibody는 소(bovine) 유래 MAP2 단백질 (Accession No. S74025, GI:786427)에 대한 항체이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 신경조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법을 이용하여 인간 신경조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 신경세포사는 잠재적으로 개체에 대하여 강력하고 비가역적인 효과를 야기할 수 있고, 발작, 심장마비, 뇌 또는 척수 허혈, 외상 등의 결과로 나타날 수도 있다. 상기 신경조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법을 이용하여 환자의 신경조직을 검사함으로써 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 병 등과 같은 퇴행성 신경계 질환에서 나타나는 공통적인 병태인 신경세포사를 진단할 수 있으며, 이를 이용한 진단기기 및 시약의 생산에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포 검출장치를 만들 수 있다. 본 발명은 신경세포 표지물질인 MAP2에 특이적으로 반응하는 1차 항체, 상기 1차 항체와 특이적으로 반응하는 형광물질로 표지된 2차 항체, 신경세포의 사멸을 측정하는 상기 2차 항체에 표지된 형광물질과 다른 파장의 형광물질을 갖는 TUNEL assay 키트, 및 MAP2와 TUNEL assay가 이중으로 염색된 결과를 확인하기 위한 공초점 형광현미경으로 구성된 사멸하는 신경세포 검출장치를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 MAP2를 포함하는 곤충의 신경세포 표지인자를 제공한다.

종래 몇몇의 연구에 의하면, 곤충의 신경세포를 표지하기 위해 사용된 물질은 neuron-specific enolase (NSE)만이 보고 되어 있으며, MAP2가 곤충의 신경세포에 사용된 것은 본 발명에서 처음이다. 본 발명자들은 포유류 신경세포 표지인자로 잘 알져진 MAP2가 새로운 용도로써 곤충의 신경세포 표지인자로 사용될 수 있음을 증명하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 누에 뇌 조직에서 MAP2 항체를 이용한 신경세포 형광염색과 TUNEL assay를 이용한 사멸 신경세포 염색 방법

본 발명에서는 백옥잠 (Bombyx mori)이 사용되었다. 4령 3일째 되는 누에에서 뇌 조직이 적출되었고, 적출 이전 1시간 동안 얼음에서 마취시키고, 마취 이후 모든 과정은 저온 상태에서 수행되었다.

뇌 조직은 0.1M sodium phosphate buffer (PB, pH 7.4)에서 해부되고 곧바로 4% paraformaldehyde (PFA)에 6 ~ 10시간, 4 ℃에서 고정시켰다. 고정 후 0.1M PB로 수차례 세척한 후 1% PBST (Phosphate buffered saline with 1% Triton X-100)에 24시간 담궈 permeability를 증가시켰다. 상기 뇌 조직을 상승농도 순의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 알코올로 처리하여 수화시키고 xylene으로 처리하여 투명화 시킨 후 다시 역순의 알코올로 처리, 재수화 시켰다. 1% PBST로 여러 차례 세척한 후 실온에서 30분간 2% rabbit serum으로 blocking시켜 non-specific background를 없앴다. 1:200의 농도로 mouse anti-MAP2 primary antibody (monoclonal, Chemicon)로 24시간 저온상태에서 처리하고 희석 완충액인 PBS로 여러 차례 세척한 후 1:500 농도로 2차 형광 항체 (붉은색)인 Cy3과 결합한 rabbit polyclonal anti-mouse IgG antibody (Sigma)를 24시간 동안 저온 상태에서 암처리 하였다 (도 1a). 항체 처리 시 반응을 높이기 위해 100 rpm으로 흔들어 주었다.

PBS에서 두 차례 세척한 후, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) method를 사용하여 nick에 붙는 dUTP에 FITC (녹색)를 결합시켰다 (도 1b). 상기 TUNEL method의 과정의 자세한 실험과정은 다음과 같다 (도 4 참조). 상기 2차 형광 항체와 결합한 뇌조직을 PBS (-200ml 0.1M PB, 1.7g NaCl)로 10분씩 두 번 세척한 후, 20㎍/ml Proteinase K (100mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM EDTA)로 10분 처리하고 다시 PBS로 10분씩 두 번 세척하였다. 그리고, Equilibration Buffer (200mM potassium cacodylate(pH 6.6), 25mM Tris-HCl(pH 6.6), 0.2mM DTT, 0.25mg/ml BSA, 2.5mM cobalt chloride)로 10분 처리한 후, Equilibration Buffer 45㎕, Nucleotide Mix 5㎕ 그리고 rTdT Enzyme 1㎕의 혼합액으로 37℃, 1시간 암실 처리하였다. 이 후, 2× SSC (-8.77g NaCl, 4.41g sodium citrate, Total 500ml deionized water (pH 7.2))로 15분 처리하고, PBS로 10분씩 두 번 세척하여 Confocal microscope로 그 결과를 분석하였다.

결과는 confocal microscope (Zeiss LSM 310)로 확인하였고 MAP2와 TUNEL assay가 이중으로 염색된 결과를 얻을 수 있었다 (도 1c).

도면을 참조하여 설명하면, 누에 뇌 조직에서 포유류 신경세포 표지물질 MAP2와 반응시키면 뇌 속의 모든 신경세포는 붉은색으로 형광염색 (MAP2에 결합되는 Cy3에 의해 일어남)이 되고 (도 1a), 이어 세포사멸 (에이파토시스)을 탐지하는 TUNEL assay로 처리하면 사멸하는 모든 신경세포는 녹색 형광물질인 FITC에 의해 녹색으로 염색되며 (도 1b), MAP2 반응결과와 TUNEL assay 처리결과를 서로 중첩시키면 결국 뇌 속에서 사멸하는 모든 신경세포는 핵이 노란색으로 표지된다 (도 1c).

실시예 2: 누에 뇌 조직이 함유한 MAP2 western blotting 방법

포유류 신경세포에서 유래한 MAP2 protein이 누에 뇌조직의 신경세포에도 존재하는지를 확인하고자 4령 3일 누에에서 뇌 조직을 적출해 western blotting을 하였다.

상기 western boltting 과정을 다음과 같이 수행하였다 (도 5참조). 누에에서 적출한 뇌조직만을 수득하여 lysis buffer (25mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% Sodium deoxycholate, 1% SDS, Protease inhibitor cocktail)를 넣고 세포 분쇄 후 sample buffer (60mM Tris-HCl, 25% glycerol, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1% Bromophenol Blue)를 섞는다. 그리고 6% SDS-Gel을 만든 후, 전기 영동기에 장착하고 sample을 loading해서 30mA로 1시간 반 전기영동 한다. 전기 영동기에서 떼어낸 Gel을 NC membrane과 함께 카세트에 장착하고 15V로 3시간 transfer한다. 단백질입자들이 transfer된 NC membrane에 MAP2 antibody(1:2500)에 실온에서 2시간 처리 후 이차 항체(1:5000)로 실온에서 1시간 처리한다. NC membrane에 ECL kit의 solution을 처리한 후 LAS (Luminescent Image Analyzer)으로 분석하였다.

이 때 양성 대조군 (positive control)으로써 인간 신경세포주인 SK-N-MC cells를 쓰기 위해 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)(10% fetal bovine serum, FBS), 50 units/ml 페니실린 (penicillin)과 50 ?g/ml 스트렙토마이신 (streptomycin)이 함유된 배지에서 계대 후 2 ~ 3일 더 배양시켰다. 음성 대조군 (negative control)으로써 4령 3일 누에의 중장(gut) 조직을 사용하였다. 결과로서 누에 뇌 조직과 SK-N-MC cells 샘플에서 MAP2 항체에 대한 반응성을 보였고 중장 샘플에서는 반응을 보이지 않았으므로 신경세포 특이적 반응이라고 판단할 수 있었다 (도 2).

도면을 참조하여 설명하면, 누에 뇌 조직을 포유류 신경세포 표지물질인 MAP2에 대해 western blot하여 누에 뇌에 포유류 신경세포 특이 단백질인 MAP2가 존재함을 증명하였다. 인간 신경세포주인 SK-N-MC와 누에 장 조직을 각각 양성대조군 (positive control)과 음성대조군 (nagative control)으로 하여 행한 MAP2에 대한 western blot한 결과는 누에 뇌 조직의 세포들이 MAP2를 포함함을 입증하였다 (도 2).

실시예 3: 누에 뇌 조직에 대한 MAP2 immunogold 염색방법

5령3일 누에에서 뇌 조직이 적출되었고, 적출 이전 1시간동안 얼음에서 마취시키고, 마취 이후 모든 과정은 저온상태에서 수행되었다.

뇌 조직은 0.1M PB (pH 7.4)에서 해부되었고 곧바로 4 % PFA에 6 ~ 10 시간, 4 ℃에서 고정되었다. 고정 후 0.1M PB로 수차례 세척한 후 OsO₄에 1시간 동안 담궈둔 후 고정시켰다. 뇌 조직은 상승농도 순의 알코올로 처리하고 아세톤으로 처리된 후 Epon-Araldite에 매몰(embedding)되었다. Ultramicrotome (RMC MT-X)으로 Semi-thin과 thin section되어 copper grid에 올려진 조직 절편들은 2% BSA, 1% tween-20 완충액으로 1시간 동안 실온에서 blocking 시켰다. Blocking이 끝난 절편은 1:50의 농도로 희석한 anti-MAP2 primary antibody (monoclonal, Chemicon) 용액에 담궈 4℃에서 24시간 처리한 후 blocking 용액으로 수차례 세척하고 gold-conjugated secondary antibody (BBInternational UK)로 반응시킨 후 uranyl acetate로 마지막으로 염색했다.

결과는 도 3에서와 같이, MAP2가 신경세포 ("Ne"로 표지) 세포질 ("Cy"로 표지)에는 골드입자가 결합하나 (도 3a 및 3b의 좌) 신경교세포 (“Gl"로 표지)에는 골드입자가 전혀 결합하지 않았다 (도 3b의 우). 즉, 신경세포의 세포질에는 1차 항체인 MAP2가 결합되며, 골드입자가 결합되어 있는 2차 항체로 1차 항체 특이적 반응을 시키게 되면, 신경세포 세포질 -> 1차 항체(MAP2) -> 2차 항체 -> 골드입자의 순서로 결합되는 결과를 나타낸다. 이는 누에 뇌 속의 신경세포만이 포유동물 신경세포 표지물질인 MAP2를 생산, 포함하고 있음을 의미한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 포유류의 신경세포에 특이적 표지분자인 MAP2로 먼저 염색하고 이어 TUNEL assay로 이중 형광 염색하면 곤충의 뇌에서 특정시기에 나타나는 모든 사멸 신경세포를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 환자의 신경조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 진단 기기 또 는 진단 시약에 사용될 수 있다.

Claims

뇌 조직에서 사멸하는 신경세포를 확인하는 방법에 있어서,

a) 신경세포 표지물질인 MAP2 (microtubule-associated protein 2)에 특이적으로 반응하는 1차 항체로 신경세포를 반응시키는 1단계;

b) 상기 1단계의 신경세포를 형광물질로 표지된 2차 항체로 반응시키는 2단계;

c) 상기 2단계의 신경세포를 TUNEL assay를 시행하여 사멸하는 세포를 상기 제 2단계의 형광물질과 다른 파장의 형광물질로 염색하는 3단계; 및

d) 상기 3단계의 신경세포를 공초점 형광현미경 (confocal microscope)를 이용하여 MAP2 형광염색과 TUNEL assay가 이중으로 염색된 결과를 확인하는 4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌 조직에서 사멸하는 신경세포의 확인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 뇌 조직은 곤충의 뇌 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 2단계의 형광물질은 Cy3, 상기 3단계의 형광물질은 FITC인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 MAP2에 특이적으로 반응하는 항체는 포유동물의 신경 세포에서 유래한 MAP2에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
MAP2를 포함하는 곤충의 신경세포 표지인자.