KR20110053051A

KR20110053051A - 고압 효소 분해 기법을 이용한 식물 추출물의 제조방법 및 이 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110053051A
Application number: KR1020090109850A
Authority: KR
Inventors: 강현서; 김혜원; 강찬구; 조성아; 조준철; 한상훈
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2011-05-19
Also published as: US20110117220A1; JP5925414B2; JP2011103880A; KR101757255B1

Abstract

본 발명은 고압 효소 분해 기법(High Pressure-Enzymatic Decomposition Technique, HPED Technique)을 이용한 식물 추출물의 제조방법 및 고압 효소 분해 기법으로 제조된 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 개발한 고압 효소 분해 기법으로 제조된 식물 추출물은 다른 추출법을 사용하여 제조된 추출물에 비해 다양한 종류와 다량의 효능 성분을 포함하고 있어 효능 성분들이 가진 효과를 극대화시킬 수 있다.

고압 효소 분해 기술 * 식물 추출물 * 녹차 * 대나무 * 항산화 * 미백 * 보습 * 화장료 조성물

Description

고압 효소 분해 기법을 이용한 식물 추출물의 제조방법 및 이 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Preparation method of plant extract using High Pressure-Enzymatic Decomposition Technique and the cosmetic composition containing the extract}

식물로부터 유효성분을 추출하는 종래의 기법으로 용매추출법은 물, 물을 포함한 유기용매(에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 헥산 등) 또는 유기용매를 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출하는 공정을 2회 이상 반복하여 추출액을 얻으며, 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기로 농축하여 1차 수득물을 얻는다. 그 수득물에 물과 유기용매를 가하고 상온에서 2시 간 이상 교반한 후 정치하여 층 분리를 시킨다. 층 분리가 된 후 물 층을 제거한 후 유기용매를 추가로 첨가한다. 위의 공정을 2회 이상 반복하여 충분히 세척하고 여과한 후 여과물을 진공오븐에서 건조하여 원하는 추출물을 얻는다. 그러나 이러한 용매추출법은 추출 수율이 낮고 유기용매의 잔존 여부 등의 안전성 문제로 인해 새로운 추출법에 대한 필요성이 대두되었다.

최근 개발된 식물성분 추출법으로는 초임계 유체 추출법(Supercritical fluid extraction, SFE)이 있다. 이 추출법은 초임계 유체(액화 이산화탄소, 액화 프로판 등)를 사용하여 유기용매로 인한 부작용이 없다는 장점이 있으나, 고가의 비용, 임계온도에서 다양한 물질의 추출 가능성 여부 등의 문제점을 가지고 있다.

이에, 본 발명은 다양한 종류와 다량의 효능성분을 함유하는 식물 성분 추출물을 제조할 수 있는 추출법을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 고압 효소 분해 기법을 사용하여 제조한 식물 추출물은 다양한 종류와 다량의 효능성분을 포함하고 있어 항산화, 미백 및 보습 등의 효과가 극대화되는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고압 효소 분해 기법을 이용하여 다양한 종류 및 다량의 효능 성분을 포함하는 식물 추출물의 제조방법 및 이 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 400~800MPa의 고압에서 원재료를 효소로 처리하는 고압 효소 분해 단계를 포함하는 식물 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 고압 효소 분해 기법으로 제조된 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 고압 효소 분해 기법으로 제조된 식물 추출물은 다른 추출법을 사용하여 제조된 추출물에 비해 다양한 종류와 다량의 효능 성분을 포함하고 있어 효능 성분들이 가진 효과를 극대화시킬 수 있다.

본 발명에 의하여 제공되는 식물 추출물 중 녹차 추출물을 함유하는 조성물은 DPPH 라디컬 제거 효과 및 글루타치온 합성 촉진 효과를 나타내어 항산화 효과가 탁월하며, 멜라닌 합성을 저해하고 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 억제하여 미백효과도 우수하므로 항산화 및 미백용 화장료 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 추출한 대나무 추출물을 함유하는 조성물은 트랜스글루타미나아제-1(Transglutaminase-1) 합성을 촉진시켜 피부 장벽 강화 및 보습효과가 뛰어나고 멜라닌 합성을 저해해 미백효과도 우수하므로 피부 보습 및 미백용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명은 400~800MPa의 고압에서 원재료를 효소로 처리하는 고압 효소 분해 단계를 포함하는 식물 추출물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 고압 및 효소 분해를 함께 사용하여 식물 추출물을 제조함으로써 기존의 추출 방법으로는 얻어낼 수 없었던 미량의 아미노산 등의 효능 성분들을 추출해 낼 수 있다. 또한, 효능 성분들을 다량으로 추출할 수 있기 때문에 효능 성분들이 가진 효과를 극대화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 식물 추출물의 제조방법은 400~800MPa의 고압에서 원재료를 효소로 처리하는 고압 효소 분해 단계를 포함한다. 또한, 고압 효소 분해된 추출물을 여과 및 희석하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용하는 식물 추출물의 제조 방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

1) 400~800MPa의 고압에서 원재료를 효소로 처리하여 효소 분해하는 단계;

400~800MPa, 바람직하게는 6,000m 깊이의 바닷속 압력인 600MPa에서 식물 원재료를 효소로 혼합 처리하여 분해한다. 400MPa 미만의 압력에서는 유효 성분들이 충분히 추출되지 않고, 800MPa 초과 압력에서는 고압 대비 유효 성분 추출 증가량이 미미하여 비효율적이기 때문에 상기 범위의 압력에서 효소 분해한다.

본 발명의 식물 추출물의 제조방법은 당업계에 통상적인 모든 식물의 추출에 적용 가능하다. 본 발명에 사용 가능한 원재료의 구체적인 예를 들면, 녹차, 대나무 및 율무로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다.

본 발명에 사용 가능한 효소로는 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 글리코시다아제(glycosidase), 락타아제(lactase), 수크라아제(sucrose) 및 말타아제(maltase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다.

또한, 효소 분해시 온도는 사용하는 효소의 활성 온도 범위에 맞게 조절하며, 30~60℃로 조절하는 것이 바람직하다. 60℃를 초과하면 대부분의 효소가 파괴되어 그 기능을 상실하기 때문에 60℃이하의 온도로 조절한다.

상기 원재료와 효소는 100,000:1~100:1의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다. 이는 100,000:1미만이면 효소량이 너무 적어서 유효성분의 추출이 제대로 이루 어지지 않고, 100:1을 초과하면 투입된 효소량 대비 추출 성분의 양 증가량이 미미하기 때문에 오히려 비효율적이다.

2) 효소 분해된 용액을 여과하는 단계;

상기 1) 단계에서 효소 분해시킨 용액을 여과하여 불순물을 제거함으로 원하는 효소 분해된 식물 추출물 원액을 얻을 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 여과 방법으로는 당업계에 통상적인 모든 방법이 사용될 수 있으며, 구체적인 예를 들면 미세 여과지를 통과시킴으로써 불순물이 제거된 식물의 효소 분해 추출물 원액을 얻을 수 있다.

3) 여과된 용액을 희석하는 단계;

상기 2) 단계에서 여과된 식물 추출물 원액을 사용 편의성을 위해 적절한 용매에 희석한다. 이때 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 용매가 사용될 수 있으며, 일반적으로 물, 부틸렌글라이콜 또는 이들의 혼합용매 등을 사용하여 희석한다.

본 발명은 상기의 고압 효소 분해 기법으로 제조된 식물 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 고압 효소 분해 기법으로 제조된 녹차 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 DPPH 라디컬 제거 효과 및 글루타치온 합성 촉진 효과를 나타내어 항산화 효과가 탁월하며, 멜라닌 합성을 저해하고 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 억제하여 미백효과가 우수하므로 항산화 및 미백용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 고압 효소 분해 기법으로 추출한 대나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 트랜스글루타미나아제-1(Transglutaminase-1) 합성을 촉진시켜 피부 장벽 강화 및 보습 효과가 뛰어나고 멜라닌 합성을 저해해 미백효과도 우수하므로 피부 보습, 미백 및 항산화용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 식물 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.000001~10중량%, 보다 바람직하게는 0.001~5중량%의 양으로 함유된다. 그 함량이 0.000001중량% 미만이면 그 효과가 미미하고, 10중량%를 초과하면 함량 증가에 비해 효능의 증가가 크지 않아 오히려 비효율적이기 때문이다.

본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 샴푸, 린스, 보디세정제, 치약 또는 구강 청정액 등으로 제형화될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 고압 효소 분해 기법을 사용한 녹차 추출물의 제조

600MPa의 압력 및 50℃의 온도에서 녹차잎(100g)에 프로테아제(0.1g)를 넣고 혼합하여 효소 분해된 녹차 추출물 원액을 얻었다. 이어서, 이 원액을 여과 종이로 여과하여 불순물을 제거하고 물:부틸렌글라이콜(2:1, v/v)의 용매에 1% 농도로 희석시켜 녹차 추출물을 제조하였다.

[실시예 2] 고압 효소 분해 기법을 사용한 대나무 추출물의 제조

600MPa의 압력 및 50℃의 온도에서 대나무(100g)에 프로테아제(0.1g)를 넣고 혼합하여 효소 분해된 대나무 추출물 원액을 얻었다. 이어서, 이 원액을 여과 종이로 여과하여 불순물을 제거하고 물:부틸렌글라이콜(2:1, v/v)의 용매에 1% 농도로 희석시켜 대나무 추출물을 제조하였다.

[비교예 1] 고압 추출 기법을 사용한 녹차 추출물의 제조

600MPa의 압력에서 녹차잎(100g)을 고압 추출시킨 후, 여과 종이로 여과한 용액을 물:부틸렌글라이콜(2:1, v/v)의 용매에 1% 농도로 희석시켜 녹차 추출물을 제조하였다.

[비교예 2] 효소 분해 기법을 사용한 녹차 추출물의 제조

50℃의 온도에서 녹차잎(100g)에 프로테아제(0.1g)를 넣고 혼합하여 효소 분해시킨 후, 여과 종이로 여과한 용액을 물:부틸렌글라이콜(2:1, v/v)의 용매에 1% 농도로 희석시켜 녹차 추출물을 제조하였다.

[비교예 3] 에탄올 추출법을 사용한 녹차 추출물의 제조

녹차잎(10g)을 50vol% 에탄올(100㎖)에 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출하는 공정을 2회 반복하여 추출액을 얻고, 이 추출액을 여과하여 진공 농축기로 농축한 후, 농축물에 물과 에탄올을 가하여 상온에서 2시간 교반한 후 정치하여 층을 분리시켰다. 층 분리가 된 후에 물 층을 제거하고 에탄올을 추가로 첨가하였다. 이러한 공정을 2회 반복하여 충분히 세척하고 여과한 후, 진공 오븐에서 건조하여 녹차 추출물을 제조하였다.

[비교예 4] 에탄올 추출법을 사용한 대나무 추출물의 제조

대나무(10g)를 50vol% 에탄올(100㎖)에 넣고 상온에서 하루 동안 방치하여 추출하는 공정을 2회 반복하여 추출액을 얻고, 이 추출액을 여과하여 진공 농축기로 농축한 후, 농축물에 물과 에탄올을 가하여 상온에서 2시간 교반한 후 정치하여 층을 분리시켰다. 층 분리가 된 후에 물 층을 제거하고 에탄올을 추가로 첨가하였다. 이러한 공정을 2회 반복하여 충분히 세척하고 여과한 후, 진공 오븐에서 건조하여 대나무 추출물을 제조하였다.

[시험예 1] 본 발명의 고압 효소 분해 기법과 기존 추출법을 이용한 녹차 추출물의 아미노산 함량 비교

하기 OPA법을 이용하여 상기 실시예 1 및 비교예 1~3의 녹차 추출물의 아미노산 종류별 함량을 분석하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

<아미노산 분석법 (OPA법)>

1) HPLC 조건

- 컬럼: zorbax 컬럼 (아미노산 분석 전용)

- 이동상:

A= 1.36g 아세트산 나트륨 트리수화물 + 100㎕ 트리에틸아민→ 500㎖ 정용 →pH 7.2 (아세트산으로 조절) →THF 1.5㎖

B= 1.36g 아세트산 나트륨 트리수화물/100㎖ H₂O → pH 7.2 + 메탄올 200㎖ + ACN 200㎖

- 유속: 0.5㎖/min

- 주입: 온라인 유도화(online derivatization *)를 위한 주입 프로그램

- 검출기: 338nm

- 구배(gradient): 온라인 프로그램 *

2) 시약 준비

- 아미노산 표준액: 아스파라트산, 글루타민산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 발린 등 시약 각각 10㎎/100㎖ H₂O

- OPA 시약: HP사에서 만들어 공급하는 시약, 보존기한 6개월, 앰플 형태

- 붕산 완충액(borate buffer): 100㎖ 단위 공급, 아미노산 발색을 위해 필요

구분	고압효소분해기법의 녹차추출물 (실시예1)	고압추출기법의 녹차추출물 (비교예1)	효소분해기법의 녹차추출물 (비교예2)	에탄올추출법의 녹차추출물 (비교예3)
아스파라트산	0.558	0.518	0.809	0.562
글루타민산	0.747	0.668	1.006	0.694
프롤린	0.061	0.024	0.018미만	0.017미만
글리신	0.062	0.035	0.005미만	0.005미만
알라닌	0.347	0.238	0.227	0.143
발린	0.471	0.269	0.050	0.033
메티오닌	0.073	0.053	0.032미만	0.032미만
이소류신	0.273	0.140	0.052	0.032
류신	0.985	0.491	0.046미만	0.046미만
티로신	0.199	0.132	0.052미만	0.052미만
페닐알라닌	0.501	0.262	0.031미만	0.031미만
히스티딘	0.458	0.329	0.231	0.235
리신	0.401	0.208	0.038	0.023
아르기닌	0.559	0.425	0.491	0.337
총	5.695	3.792	2.904	2.059
증가율(%)	277	184	141	100

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 에탄올 추출법을 사용하여 얻은 녹차추출물(비교예 3)의 아미노산 총 함량을 100%로 하여 비교할 때, 고압추출기법과 효소분해기법으로 제조된 녹차추출물(비교예 1~2)은 각각 184%, 141%로 아미노산 총 함량이 증가한 반면, 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 이용하여 얻은 녹차추출물(실시예 1)의 아미노산 총 함량은 277%로 유의하게 증가하였다.

따라서, 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용하여 추출한 식물 추출물은 기존의 다른 추출 방법을 사용하는 것보다 다량의 효능 성분들을 함유할 수 있었다.

[시험예 2] DPPH(Diphenylpicryl Hyrazyl) 라디컬 제거 효과

고압 효소 분해 기법을 사용한 식물 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용한 녹차 추출물(실시예 1), 용매 추출법을 사용하여 추출한 녹차 추출물(비교예 3) 및 알려진 항산화 효능 성분인 바이칼린(Baicalin)을 이용하여 DPPH 라디컬의 제거 효과를 비교하였다.

상기 DPPH 라디컬의 제거 효과 실험은 대표적인 항산화능 측정방법으로 통용되고 있는 방법으로서, 유기 라디칼인 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(Diphenylpicryl Hyrazyl, DPPH)의 환원에 의해 발생되는 흡광도의 변화를 통해 항산화능을 평가하는 방법이다. DPPH의 산화가 억제되어 흡광도가 대조군에 비해 감소되는 정도를 측정하여, 대조군의 흡광도에 비해서 50％ 이하의 흡광도를 나타내는 농도(IC₅₀)를 유효 항산화 농도로 평가하였다. IC₅₀가 낮을수록 라디컬 제거 효과가 높아 항산화능이 뛰어난 것을 의미한다.

실험 과정을 구체적으로 설명하면, 100μM(in 에탄올) DPPH 용액 190㎕와 실시예1, 비교예 3 및 바이칼린을 각각 10㎕씩 넣어 반응액을 만들고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

구분	IC₅₀ (mg/㎖)
실시예1	3.4
비교예3	6.7
바이칼린	3.1

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용한 녹차추출물(실시예1)은 에탄올 추출법을 사용한 녹차추출물(비교예3)에 비해 두 배 가량 항산화능이 뛰어나며, 대표적인 항산화제인 바이칼린과 유사한 수준의 항산화능을 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 글루타치온(Glutathione) 합성 촉진 효과 실험

고압 효소 분해 기법을 사용한 식물 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용한 녹차 추출물(실시예 1), 용매 추출법을 사용하여 추출한 녹차 추출물(비교예 3) 및 알려진 항산화 효능 성분인 도금양 천인화(Rose Myrtle)를 이용하여 글루타치온 합성 촉진 효과를 비교하였다. 여기서, 글루타치온은 우리 몸에 있는 대표적인 항산화제로 활성산소를 억제하는 효능을 갖고 있다. 따라서, 글루타치온의 합성 촉진은 활성 산소를 억제함으로써 피부 노화를 막고 피부를 건강하게 만들어줄 수 있다.

실험과정을 구체적으로 설명하면, 섬유아세포를 24웰 플레이트에 웰당 3x10⁴개씩 분주한 후, 37℃에서 12시간 배양하였다. 이렇게 준비된 세포에 고압 효소 분해 기법의 녹차추출물과 에탄올 추출법을 사용한 녹차추출물을 24시간 동안 처리하였다. 이때, 양성 대조군은 도금양 천인화를 사용하였다. 세포　배양액에 0.9% 트리톤(Triton) X-100을 가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 용해물(Lysate)을 회수하여 2,000rpm에서 20분 간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 상기 용해물의 1/10 부피의 1M 2-비닐피리돈(2-vinylpyridone)을 가한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 반응은 환원형 글루타치온(glutathione)을 제거하는 단계로 환원형 글루타치온(glutathione)을 제거하지 않는 경우에는 수행하지 않고 다음 단계로 넘어갔다. 용해물과 같은　부피의 10% 메타인산(metaphosphoric acid)을 가한 후 5분간 상온에 방치하였다. 12,000rpm에서 2 분간 원심분리한 후 상층액을 회수하였다.　상층액의 1/5 부피의 4M 트리에탄올아민(triethanolamine)을 가하여 산화형/환원형 글루타치온(glutathione) 정량용 샘플을 준비하였다. 96웰 마이크로티터플레이트(microtiterplate)에 2-비닐피리돈을 처리하였거나 처리하지 않은 샘플 50㎕를 넣고 G 효소 혼합물(1.28mU/㎕ 글루타치온 환원효소) 50㎕를　넣은 후 100㎕의 G 완충용액 혼합물(2mM NADPH, 20mM DTNB, 0.4M MES, 2mM EDTA, 0.1M 인산 나트륨, pH 6.0)를 넣고　상온에서 10 분간 반응시킨 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 각각의 시료가 들어가지 않은 경우의 흡광도 값과 비교하여 글루타치온 합성 촉진율을 계산하고 하기 표 3에 나타내었다.

구분	농도(mg/㎖)	글루타치온 합성 촉진율(%)
실시예1	100	148.0±4.5
실시예1	200	181.3±1.7
비교예3	100	89.3±2.3
도금양 천인화	100	109.1±1.2

상기 표 3에서 알 수 있듯이, 글루타치온 합성을 촉진하는 것으로 알려진 도금양 천인화(Rose Myrtle) 추출물이 109%의 글루타치온 합성 촉진율을 나타낸 것에 비해 고압 효소 분해 기법의 녹차추출물(실시예 1)은 동일한 농도에서 148%의 글루타치온 합성 촉진 효능을 나타내었다. 또한, 본 발명의 고압 효소 분해 기법으로 추출한 녹차추출물은 에탄올 추출법을 사용한 녹차추출물(비교예 3)과 비교해서도 더욱 강한 글루타치온 합성 촉진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 멜라닌 생성 억제 실험

고압 효소 분해 기법을 사용한 식물 추출물의 피부 미백 효과를 측정하기 위해 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용한 녹차 및 대나무 추출물(실시예 1~2), 용매 추출법을 사용하여 추출한 녹차 및 대나무 추출물(비교예 3~4), 대표적인 미백 기능성 성분인 코직산을 이용하여 멜라닌 생성 억제능을 비교하였다.

실험과정을 구체적으로 살펴보면, 인간 멜라노마 세포인 HM3KO 세포(Y. Funasaka, Department of dermatology, Kobe university school of medicine, 5-1 Kusunoki-cho 7-chrome, Chuo-ku, Kobe 650, Japan)를 우태아혈청이 10% 들어간 MEM(Minimum Essential Medium)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 세포수가 각 플라스크 당 3x10⁵이 되도록 75 플라스크에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 다음, 세포가 잘 붙은 것을 확인한 후 배지를 각각의 시험물질이 10ppm씩 들어있는 새 배지로 갈아주었다. 대조군은 DMSO가 들어있는 배지를 사용하였다. 이런 식으로 2~3일에 한번씩 시료가 들어 있는 새 배지로 갈아주면서 세포가 플라스크에 꽉 찰 때까지 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후 1N 수산화나트륨으로 녹여 500㎚에서 흡광도를 측정한 후 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

구분	농도(mg/㎖)	멜라닌 생성 억제율(%)
실시예1	200	39.3±1.2
실시예2	200	28.4±1.2
비교예3	200	No effect
비교예4	200	No effect
코직산	200	48.9±1.2

상기 표 4에서 알 수 있듯이, 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용하여 추출한 녹차 추출물(실시예 1)은 코직산 대비 80%가량, 대나무 추출물(실시예 2)은 코직산 대비 60% 가량의 멜라닌 합성 저해능을 가진 것으로 확인되었다. 반면, 에탄올 추출법을 사용하여 추출한 비교예 3~4에서는 멜라닌 합성 저해능이 없음을 확인하였다.

[시험예 5] 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 억제 효과

고압 효소 분해 기법을 사용한 식물 추출물의 피부 미백 효과를 측정하기 위해 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용한 녹차 추출물(실시예 1), 용매 추출법을 사용하여 추출한 녹차 추출물(비교예 3) 및 대표적인 미백 기능성 성분인 비타민C 를 이용하여 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 억제 효과를 비교하였다. 비타민 C는 티로시나아제 활성을 억제하여 피부 미백에 효과적인 성분이다.

상기 티로시나아제 활성 저해 효과를 반니등의 방법(A. Vanni, Annali Di Chimica, 80, p35, 1990)을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.8) 1.0㎖, 0.3mg/㎖ 티로신 수용액 1.0㎖, 1,250 유니트/㎖ 티로시나아제(SIGMAT-7755) 0.1㎖를 혼합한 후 여기에 시료용액을 200mg/㎖ 농도로 각각 0.2㎖씩 첨가하여 37℃에서 10분간 효소 반응을 진행시켰다. 반응 용액의 흡광도를 480nm에서 측정하여 하기 수학식 2로 티로시나아제 활성 억제율(%)을 구하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

A: 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 480nm에서 흡광도

B: 시료를 첨가한 반응용액의 480nm에서 흡광도

구분	농도(mg/㎖)	티로시나아제의 활성 억제율(%)
실시예1	200	21.1
비교예3	200	No effect
비타민 C	200	20

상기 표 5에서 알 수 있듯이, 에탄올 추출법을 사용하여 추출한 녹차 추출물(비교예 3)이 티로시나아제의 활성 억제 효과가 없는 반면, 본 발명의 고압 효소 분해 기법으로 추출한 녹차 추출물(실시예 1)은 비타민 C와 유사하거나 보다 높은 티로시나아제 활성 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

[시험예 6] 트랜스글루타미나아제-1(Transglutaminase-1) 합성 촉진 효과

고압 효소 분해 기법을 사용한 식물 추출물의 피부 보습 효과를 측정하기 위해 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 사용한 대나무 추출물(실시예 2), 용매 추출법을 사용하여 추출한 대나무 추출물(비교예 4) 및 대표적인 트랜스글루타미나아제-1의 합성 촉진 성분인 염화칼슘을 이용하여 트랜스글루타미나아제-1 합성 촉진 효과를 비교하였다.

상기 트랜스글루타미나아제-1의 합성은 각질층의 형성 및 유지에 필수적인 요소이기 때문에 트랜스글루타미나아제-1 의 합성 촉진 효과는 피부 장벽 강화 및 보습 효과 증대로 볼 수 있다.

실험 과정을 구체적으로 살펴보면, 인간의 피부세포주를 96공 평판배양기에 각 공당 5x10⁴개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 부착시킨 피부 세포주에 시험물질을 처리한 후, 2일이 지난 다음, 배지를 제거하고 -20℃ 냉장고에 보관하였다. 동결해동(Freeze-thawing)을 2회 반복하여 물질 처리한 세포를 파괴시킨 후, -20℃ 에 보관한 아세톤: 에탄올(1:1, v/v)을 처리하여 4℃에서 30분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후, 실온에 방치하여 유기용매가 증발되게 하고, 블록킹(1% 소혈청알부민), 트랜스글루타미나아제 항체(primary antibody), HRP 안티-마우스 항체(secondary)를 수행하였으며, 발색은 OPD(o-phennyldiamine)를 첨가하여 수행하였다. 발현량은 490nm에서 흡광도를 측정하였고, 보정은 630nm에서 백그라운드(background)를 측정하여 수행하였다. 무처리 대조군의 흡광도 값과 비교하여 트랜스글루타미나아제-1 합성 촉진율을 계산하고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

구분	농도(mg/㎖)	트랜스글루타미나아제-1의 합성 촉진율(%)
실시예2	12.5	137.0±1.9
실시예2	50	161.0±4.0
비교예4	12.5	No effect
비교예4	50	No effect
염화칼슘	1.5mM	169.9±6.4

상기 표 6에서 알 수 있듯이, 본 발명의 고압 효소 분해 기법을 이용하여 추출한 대나무 추출물(실시예 2)는 용매 추출법으로 추출한 대나무 추출물(비교예 4)와 달리 트랜스글루타미나아제-1의 합성 촉진 효과가 있다는 것을 확인하였다. 또한, 대표적인 트랜스글루타미나아제-1의 합성 촉진 성분인 염화칼슘1.5mM과 비교했을 때 실시예2를 50mg/㎖로 사용할 경우 약 95%의 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

400~800MPa의 고압에서 원재료를 효소로 처리하는 고압 효소 분해 단계를 포함하는 식물 추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 원재료가 녹차, 대나무 및 율무로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 효소가 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 글리코시다아제(glycosidase), 락타아제(lactase), 수크라아제(sucrose) 및 말타아제(maltase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 원재료 및 효소가 100,000:1~100:1의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 효소 분해가 30~60℃의 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 고압 효소 분해된 추출물을 여과 및 희석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 추출물의 제조방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 얻어진 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 식물 추출물이 조성물 총 중량에 대하여 0.000001~10중량%의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 얻어진 녹차 또는 대나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 보습용 화장료 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 녹차 또는 대나무 추출물이 조성물 총 중량에 대하여 0.000001~10중량%의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 및 보습용 화장료 조성물.