KR20110050639A - 당 사슬 인식 수용체의 신규 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 비항상성 세포사에 의해 유도되는 염증 반응의 신호전달을 조절함으로써 염증 반응을 조절하기 위한 신규한 수단을 개시한다. 구체적으로는, 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해할 수 있는 물질을 포함하는 항-염증제; 민클 또는 세포외 영역을 포함하는 이의 단편과 SAP130 을, 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서 접촉시키고, 이들 두 조건 하에서의 민클 또는 이의 단편과 SAP130 과의 상호작용의 정도를 서로에 대해 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증 반응을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법; 시험 동물로부터보다 채취한 샘플 내의 SAP130 량을 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비항상성 세포사의 검출 방법; 등을 개시한다.

Description

당 사슬 인식 수용체의 신규 용도 {NOVEL USE APPLICATION OF SUGAR CHAIN-RECOGNIZING RECEPTOR}
본 발명은, 당 사슬 인식 수용체로서 알려진 민클 (Mincle) (대식세포 유도가능 C-유형 렉틴 (Macrophage inducible C-type lectin)) 의 신규 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 민클의 발현 또는 기능 (비항상성의 사멸 세포로부터 방출되는 단백질 또는 Fc 수용체 공통 γ 서브유닛 (FcRγ) 과의 상호작용) 을 저해하는 것에 의한 염증 반응의 억제, 민클의 발현 또는 기능을 지표로 하는 염증 반응의 조절 물질, 특히 항-염증 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법, 그리고 사멸 세포로부터 방출되는 민클과 상호작용하는 단백질을 지표로 하는 비항상성 세포사의 진단에 관한 것이다.
사멸하는 세포가 염증을 유발하는 일 없이 급속히 식세포에 삼켜져 소화되는 생리학적인 프로그램 세포사 (비특허 문헌 1) 와 대조적으로, 방사선 조사 및 조직 손상과 같은 비감염성 자극에 의해 일으켜지는 과잉 또는 비항상성의 세포사에서는 호중구의 조직으로의 일시적 침윤이 유도된다 (비특허 문헌 2). 세포가 이러한 과잉 또는 비항상성의 세포사를 인식하고, 적절히 반응하는 분자적 메커니즘은 충분히 해명되어 있지 않다.
선천성 면역 수용체의 Toll-형 수용체 (TLR) 패밀리는 히아루로난, 열 쇼크 단백질 (HSP), 요산, 피브로넥틴, 카르디오리핀 및 뉴클레오솜 뿐 아니라 핵내 저분자 리보뉴클레오단백질 (snRNP) 과 같은 DNA/RNA-단백질 복합체와 같은, 사멸 세포로부터 방출되는 자가 리간드를 인식하는 것으로 보고되었다 (비특허 문헌 3). 이들의 TLR-자가 리간드 상호작용 중 일부가 염증성 질환에 관련되는 것이 나타나 있다.
C-유형 렉틴은, TLR 과는 다른 패밀리의 수용체이지만, 사멸 세포의 감지에 관여할 수 있다. 이들의 수용체는, 병원체 당 사슬의 패턴 인식 수용체 (PRR) 로서 면역에 있어서 명확한 역할을 갖는다. 게다가 최근의 증거로부터, 그것들이 단백질, 지방 및 무기질과 같은 리간드도 인식할 수 있는 것이 시사되고 있다. PRR 로서 작용하는 것에 추가로, 골수성 세포로 발현하는 C-유형 렉틴 중 일부는 또한 사멸 세포의 수용체로서 기능한다 (비특허 문헌 4). 이들 대부분은 사멸 세포의 일소 (clearance) 를 촉진하는 식세포의 수용체이다.
C-유형 렉틴 수용체 중, 민클 (Clec4e 또는 Clecsf9 로서도 알려짐) 은 대식세포에서 발현하는 2-형 막관통 C-유형 렉틴 수용체이다. 이전의 보고에 의해, 민클의 전사가 일부 자극 및 세포 스트레스로 상승하고, 전사 인자 NF-IL6 (C/EBPβ) 에 의해 발현이 조절되는 것이 나타났으나 (특허 문헌 1, 비특허 문헌 5); 민클의 생리학적 기능 및 이의 생리학적 리간드는 불명인 채로 남아있다.
[선행 기술 문헌]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: JP-A-2001-112482
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1: J Clin Invest 108, 957-62 (2001)
비특허 문헌 2: Oncogene 20, 7085-95 (2001)
비특허 문헌 3: Nat Rev Immunol 6, 823-35 (2006)
비특허 문헌 4: Nat Immunol 7, 1258-65 (2006)
비특허 문헌 5: J Immunol 163, 5039-48 (1999)
본 발명의 목적은, 프로그램되어 있지 않은, 과잉 또는 비항상성의 세포사를 인식하고, 염증 반응을 유발하는 메커니즘에 관여하는 신규 분자, 특히 사멸 세포로부터 방출되는 자가 리간드를 인식하는 수용체 분자를 확인하는 것이며, 상기 리간드 수용체 상호작용을 통해 신호 전달을 조절함에 의한 신규한 염증 반응 조절 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 민클의 생리학적 리간드를 확인하고, 이의 생리학적 기능을 해명하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 광범위한 조사를 수행하였고, 민클이 FcRγ 와 선택적으로 회합하고 대식세포를 활성화시켜 염증성 사이토카인/케모카인을 생성시키고, 그 수용체가 사멸 세포로부터 방출된 핵내 저분자 리보뉴클레오단백질의 성분인 130-kDa 단백질 (SAP130; "Sf3b3" 으로도 불림) 을 인식하는 것을 발견하였다. 게다가 방사선 조사에 의해 흉선 세포사를 유도한 마우스에서, 항-민클 항체의 투여에 의해 흉선에서의 호중구의 침윤이 저해됨으로써, 생체내 민클 억제에 의한 항-염증 효과를 발견하였다.
본 발명자들은, 이들의 발견에 기초하여 한층 더 조사를 수행하였고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 하기에 나타내는 바와 같다:
[1] 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질을 포함하는 항-염증제.
[2] 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질이 민클에 대한 항체인, [1] 에 기재된 제제.
[3] 항체가, SEQ ID NO:2 로 나타내는 인간 민클의 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 아미노산 서열 또는 다른 포유 동물의 오르토로그에서의 상응하는 아미노산 서열을 인식하는, [2] 에 기재된 제제.
[4] 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질이, SEQ ID NO:2 로 나타내는 인간 민클의 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 아미노산 서열 또는 다른 포유 동물의 오르토로그에서의 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, [1] 에 기재된 제제.
[5] 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질이 SAP130 에 대한 항체인, [1] 에 기재된 제제.
[6] 민클의 발현을 저해하는 물질이 민클 유전자에 대한 안티센스 핵산, 리보자임 또는 siRNA 인, [1] 에 기재된 제제.
[7] 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질이 민클 및/또는 FcRγ 에 대한 항체인, [1] 에 기재된 제제.
[8] 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질이 민클의 막관통 도메인 내의 보존된 아르기닌 잔기를 포함하는 부위에 결합하는, [1] 에 기재된 제제.
[9] 염증성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 제제.
[10] 민클 또는 세포외 영역을 포함하는 이의 단편과 SAP130 을 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서 접촉시키고, 두 조건 하에서의 민클 또는 이의 단편과 SAP130 과의 상호작용의 정도를 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법.
[11] 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서, 민클 또는 세포외 영역 및 막관통 영역을 포함하는 이의 단편을 발현하는 세포에서의, 민클 또는 이의 단편과 FcRγ 와의 상호작용의 정도를 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법.
[12] 지표로서 민클 및 FcRγ 를 통한 신호전달 경로의 활성화로, 민클 또는 이의 단편과 FcRγ 와의 상호작용의 정도를 비교하는 것을 포함하는, [11] 에 기재된 방법.
[13] 민클 및 FcRγ 를 통한 신호전달에 의해 활성화되는 전사 인자가 결합할 수 있는 염기 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 발현을 지표로서 사용하는 것을 포함하는, [12] 에 기재된 방법.
[14] SAP130 이 공존하는, [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[15] 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서, 단백질을 생성하는 세포에서의 민클 또는 이를 인코딩하는 mRNA 의 양을 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법.
[16] SAP130 이 공존하는, [15] 에 기재된 방법.
[17] 항-염증 작용을 갖는 물질을 선택하기 위한, [10] 내지 [16] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[18] 대상 동물로부터 채취한 샘플 내의 SAP130 량을 측정하는 것을 포함하는, 비항상성 세포사의 검출 방법.
민클의 발현, 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해함으로써, FcRγ-의존적 신호전달을 차단하여 비항상성의 세포사에 의해 자극되는 염증 반응을 저지할 수 있다. 또한, 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용에 미치는 효과를 지표로서 염증 반응을 조절하는 작용을 갖는 물질을 선택할 수 있다. 대안적으로, 세포 외부에 대한 SAP130 의 방출을 지표로서 비항상성 세포사를 검출할 수 있다.
도 1 은 하기를 나타낸다: (a) 유세포분석에 의한 항-민클 단일클론 항체의 스크리닝. 민클-IRES-GFP 를 발현하는 2B4 세포를 래트 IgG (대조군) 또는 하이브리도마 상청액 및 항-래트 IgG-PE 로 염색하였다. 1B6, 4A9 및 6E2 항체의 농도는 각각 2.3, 1.1 및 0.05 ㎍/㎖ 이었다. (b) 결합 경합. 민클 트랜스펙션물을 0 ㎍/㎖ (얇은 흑색), 1 ㎍/㎖ (회색) 및 10 ㎍/㎖ (두꺼운 흑색) 1B6 (위) 및 4A9 (하) 존재 하에서 1 ㎍/㎖ 1B6-비오틴 (왼쪽) 및 4A9-비오틴 (오른쪽) 으로 염색한 후; 스트렙타비딘-APC 염색을 실시하였다. (c) 펩티드 에피토프 맵핑. 민클의 세포외 도메인 (길이 13 a.a, 중복 11 a.a.) 을 감싸는 비오틴화 펩티드를 합성하였다. 각 펩티드는 스트렙타비딘을 코팅한 마이크로플레이트에 0.5 nM 로 코팅되었다. BSA 로 블로킹한 후, rIgG, 항-민클 단일클론 항체 및 항-래트 IgG-HRP 를 각각 1 차 및 2 차 항체로서 사용하였다. 추정한 에피토프 서열 (1B6 에 대해서는 VEGQW, 및 4A9 에 대해서는 FWD) 을 각각 나타낸다. (d) 세포외 도메인의 3-D구조의 분자 모델링. VEGQW 모티프 및 FWD 모티프를 각각 나타낸다. 추정상의 만노오스-결합 EPN 모티프를 흑색으로 나타낸다. (e) 웨스턴 블롯. 2B4 세포, 및 민클 세포로 트랜스펙션한 2B4 세포 유래의 라이세이트를 항-민클 단일클론 항체 및 항-래트 IgG-HRP 로 블로팅하였다. (f) 자극 활성. 항-민클 단일클론 항체를 10 ㎍/㎖ 로 코팅하고, NFAT-GFP, 민클 및 FcRγ 를 발현하는 2B4 세포를 18 시간 동안 자극하고, FACS 에 의해 분석하였다.
도 2 는 하기를 나타낸다: (a) 민클의 막관통 영역 서열의 정렬. 마우스, 래트 및 인간 민클의 아미노산 서열을 정렬시켰다. 보존된 아르기닌 잔기를 나타낸다. (b) 민클은 FcRγ 와 결합한다. 293T 세포를 Flag-표지된 DAP12, DAP10 및 FcRγ 와 함께 마우스 민클로 트랜스펙션하였다. 각 라이세이트를 항-Flag 로 면역 침강시키고, 항-민클 단일클론 항체 (1B6) 및 항-Flag 로 블로팅하였다. 전체 라이세이트도 항-민클로 블로팅하였다. (c) 민클은 복막 대식세포에서 FcRγ 와 결합한다. 티오글리콜레이트로 유도된 복막 대식세포를 0.1 ㎍/㎖ LPS 로 18 시간 동안 자극하고; 세포 라이세이트를 항-민클 다클론 항체로 면역 침강시키고 항-FcRγ 및 항-민클로 블로팅하였다. (d) 민클의 R42 가 FcRγ 와의 결합에 중요하다. 293T 세포를 FcRγ 와 함께 Flag-표지된 민클 야생형 및 민클 R42I 로 트랜스펙션하였다. 각 라이세이트를 항-FcRγ (상 패널) 또는 항-Flag (하 패널) 로 면역 침강시키고, 특이적 항체로 블로팅하였다. (e) 민클의 R42 가 신호전달 능력에 중요하다. 2B4 T 세포를 FcRγ 와 함께 Flag-표지된 민클 야생형 및 민클 R42I 로 트랜스펙션하였다. 세포를 플레이트에 코팅한 항-Flag 로 자극시키고, IL-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다. 데이터는 3 회의 개별 실험의 대표 예이다.
도 3 은 하기를 나타낸다: (a) 민클 라이게이션 후 TNFα 및 MIP-2 의 생성. 티오글리콜레이트로 유도된 복막 대식세포를 플레이트에 코팅한 래트 IgG1 (rIgG1) 또는 항-민클 단일클론 항체 (6E2) 로 18 시간 동안 자극하고, 배양 상청액에서의 사이토카인 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다. 다른 항-민클 단일클론 항체 클론 1B6 및 4A9 에 의해서도 유사한 결과를 얻었다. (b) 민클-유도성 활성화는 FcRγ-의존적이다. 티오글리콜레이트로 유도된 야생형, FcRγ-/- 및 MyD88-/- 마우스 유래의 복막 대식세포를 플레이트에 코팅한 항-민클 단일클론 항체 (6E2) 또는 100 ㎍/㎖ Zymosan 로 자극하고, MIP-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다. (c) 민클의 가교시 Syk 및 Erk 의 활성화. 티오글리콜레이트로 유도된 대식세포를 항-민클 및 당나귀 항-래트 항체로 표시한 시간 동안 자극하였다. 각 세포 라이세이트를 표시한 항체로 블로팅하였다. (d) 민클을 통한 FcRγ-의존적인 티로신 인산화. 티오글리콜레이트로 유도된 FcγRI/III-결손 마우스 및 FcRγ-결손 마우스 유래의 대식세포를 (c) 와 같이 5 분간 자극하고, 항-포스포티로신 (pY) 및 항-포스포-Erk 로 블로팅하였다. (e) 티오글리콜레이트로 유도된 야생형 (흰색), FcRγ-/- (회색) 및 CARD9-/- (흑색) 마우스 유래의 복막 대식세포를 플레이트에 코팅한 항-민클 단일클론 항체 (6E2) 또는 1 ng/㎖ LPS 로 자극하였다. 18 시간 후, MIP-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다. (f-g) 민클을 통한 BMMφ 의 활성화. 야생형, FcRγ-/- 및 MyD88-/- 마우스 유래의 BMMφ 를 10 ng/㎖ LPS 로 18 시간 동안 처리한 후, 세정하고 30 ㎍/㎖ 의 고정화 항-IgG1, 항-민클 단일클론 항체 (1B6) 또는 10 ng/㎖ LPS 로 6 시간 동안 자극하고, MIP-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다. 같은 세포를 (d) 와 같이 자극하고, 각각 항-포스포-Syk, 항-Syk 및 항-민클-비오틴으로 블로팅하였다.
도 4 는 골수 유래의 대식세포 (왼쪽 패널) 를 자극 없이 방치하거나, 1 ng/㎖ LPS 로 18 시간 동안 자극한 경우 수득된 결과를 나타낸다. 세포를 비오틴화 래트 IgG1-bio (rIgG) 및 비오틴화항-민클 (1B6) 뿐 아니라 스트렙타비딘-APC (오른쪽 패널) 로 염색하였다.
도 5 는 하기를 나타낸다: (a) 고정화 항-민클에 의한 NFAT-GFP 활성화. NFAT-GFP 를 발현하는 2B4 세포를 FcRγ 및/또는 민클로 트랜스펙션하였다. 세포를 10 ㎍/㎖ 의 플레이트 코팅한 항-rIgG1 (파단선) 또는 항-민클 (실선) 로 18 시간 동안 자극하고, 유세포분석에 의해 GFP 발현을 분석하였다. (b) 사멸 세포는 민클을 통해 NFAT-GFP 를 활성화한다. 민클 및 FcRγ 를 발현하는 NFAT 리포터 세포를 표시한 시간 동안 배지 교환 없이 10 ㎍/㎖ 래트 IgG1 (rIgG), 항-민클 클론 1B6 (1B6) 또는 항-민클 클론 4A9 (4A9) 의 존재 하 또는 부재 하에서 배양하였다. 2 회 반복의 시험으로 GFP 발현을, 표시한 시간 동안 유세포분석에 의해 분석하였다. 데이터는 3 회의 개별 실험의 대표 예를 나타낸다. (c) 배양물 내 GFP+ 세포 및 사멸 세포. 배양 2 일째의 (b) 의 세포를 프로피듐 요오디드로 염색하고, 형광 현미경 (BZ-9000, Keyence) 으로 분석하였다. 전형적인 병합 화상 (DIC, GFP 및 프로피듐 요오디드를 나타냄). (d) 에토포시드-처리된 사멸 세포가 민클을 통해 NFAT 활성화를 유도한다. 5×104 2B4 세포를 1 ㎍/㎖ 에토포시드로 4 시간 동안 처리하여 세포사를 유도하고 5×104 리포터 세포에 첨가하였다. 24 시간 후, IL-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다. 데이터는 3 회의 개별 실험의 대표 예를 나타낸다. (e) 민클의 EPN 모티프가 아니라 VEGQW 서열이 사멸 세포-유도성 활성화에 중요하다. 민클 야생형 (WT), 민클 E169Q/N171D (EPN -> QPD) 및 민클 ΔVEGQW (ΔVEGQW) 를 FcRγ 와 함께 NFAT-GFP 리포터 세포에서 발현시켰다. 세포를 (b) 와 같이 처리하고, 유세포분석으로 GFP 발현을 측정하였다.
도 6 은 하기를 나타낸다: (a) 민클, hIgG1 Fc (Ig) 및 hIgG1 Fc-민클 융합 단백질 (Ig-민클) 의 모식적 표시. TM, 막관통. CLD, C-유형 렉틴 도메인. (b) Ig-민클은 사멸 세포를 선택적으로 인식한다. 흉선 세포를 10 μM 덱사메타손으로 4 시간 동안 처리하고, Ig 또는 Ig-민클, 및 APC-표지한 항-hIgG 로 염색하였다. 세포는 Annexin V-FITC (AnV) 및 프로피듐 요오디드 (PI) 으로도 염색하였다. (c) p130 은 민클과 특이적으로 상호작용한다. 2B4 사멸 세포를 용해하고 계속해서 프리 (-), Ig-결합 (Ig) 및 Ig-민클-결합 (Ig-민클) 단백질 G 세파로오스로 끌어내리고, 은 염색으로 분석하였다. (d) p130 은 SAP130 으로서 확인되었다. 질량 분석법으로 독립적인 10 개 펩티드의 서열을 분석하였다 (왼쪽). 각 펩티드의 SAP130 중의 위치를 괄호 안에 나타낸다 (오른쪽). (e) 민클-결합 단백질의 웨스턴 블롯. 2B4 사멸 세포 라이세이트를 표시한 세파로오스 비즈로 끌어내리고, 항-SAP130, 항-DDB1, 항-HMGB1 및 항-hIgG-HRP 로 블로팅하였다. 화살표 끝은 Ig-민클 및 Ig 를 나타낸다. (f) 민클은 생 세포 유래의 SAP130 에 결합한다. 생 (L) 또는 사멸 (D) 2B4 세포를 표시한 비즈로 끌어내리고, 표시한 항체로 블로팅하였다. (g) SAP130 은 사멸 세포로부터 분비될 수 있다. 2B4 세포를 1 일간 (생 세포) 또는 4 일간 (사멸 세포) 배양하고, 배양 상청액을 회수하였다. 신선 배지 (-), 1 일째 상청액 (L) 및 4 일째 상청액 (D) 을 항-SAP130 (왼쪽 패널) 및 항-히스톤 H1 (오른쪽 패널) 로 면역 침강시켰다. 전체 라이세이트 및 각각의 면역 침전물을 항-SAP 및 항-히스톤으로 블로팅하였다. (h) Fas-매개성 세포사에서의 SAP130 의 방출. Fas 를 발현하는 2B4 는 표시한 시간 동안 류신 지퍼화된 Fas 리간드였다. 세포를 Annexin V-FITC 및 프로피듐 요오디드 (PI) 로 염색하고, 유세포분석으로 분석하였다 (상 패널). 처리 세포 유래의 상청액을 모아 (g) 와 같이 분석하였다 (하 패널).
도 7 은 하기를 나타낸다: (a) 민클과 상호작용하는 단백질이 단백질 G, Ig-단백질 G 및 Ig-민클-단백질 G 세파로오스 컬럼을 이용해 연속적으로 정제되는 경우 수득된 결과. 용리한 단백질을 SDS-PAGE 로 분리하고, PVDF 에 옮기고, 콜로이드성 금으로 염색하였다. 세포 라이세이트가 없는 Ig-민클-단백질 G 도 대조군으로서 적용하였다. 화살표 끝은 Ig-민클-단백질 G 가 세포 라이세이트와 함께 사용되는 경우에서만 검출되는 단백질을 나타낸다. (b) 130-kDa 단백질 (p130) 을 자르고 제조하였다. 소화된 펩티드를 MALDI-TOF/MS (매트릭스 보조 레이저 탈착/이동 질량 분석의 이온화 시간 (matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) 에 의해 분석하였다. (c) p130 은 SAP130 으로서 확인되었다. 펩티드 유래의 서열은 SAP130 의 전체의 아미노산 서열 상에 중첩되었다.
도 8 은 하기를 나타낸다: (a) 대식세포에서의 SAP130-V5 에 의한 MIP-2 생성의 유도. V5-표지된 SAP130 을 293T 세포에 트랜스펙션하였다. 세포 라이세이트를 항-V5 아가로오스 컬럼에 적용하고, 결합 단백질을 V5 펩티드로 용리하였다. 티오글리콜레이트로 유도한 복막 대식세포를 항-V5-코팅한 플레이트 상에서 재조합 V5-표지된 SAP130 으로 18 시간 동안 자극하였다. 배양 상청액 안의 MIP-2 농도를 ELISA 로 측정하였다. (b) SAP130-V5 는 민클을 통한 세포 활성화를 유도한다. FcRγ 단독 또는 민클 및 FcRγ 를 모두 발현하는 NFAT 리포터 세포를 항-V5-코팅한 플레이트 상에서 10 ㎍/㎖ 항-민클 (1B6) 존재 하 또는 부재 하에 재조합 V5-표지된 SAP130 으로 18 시간 동안 자극하였다. 배양 상청액 안의 IL-2 농도를 ELISA 로 측정하였다. (c) 바큘로바이러스를 사용하여 발현된 SAP130 의 기능 분석. HN-표지된 SAP130 을 Q-세파로오스 및 TALON 컬럼을 이용해 Sf9 세포로부터 정제하였다. 정제 단백질을 SDS-PAGE 로 분리하고 은 염색 (레인 1) 및 항-SAP130 블롯으로 확인하였다. 티오글리콜레이트로 유도한 대식세포를 0.5 ㎍/㎖ 재조합 HN-표지된 SAP130 (SAP130-HN) 및 1 ng/㎖ LPS 로 6 시간 동안 자극하고, MIP-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다 (오른쪽 패널).
도 9 는 하기를 나타낸다: (a) 비처리 마우스 및 1-Gy 조사 (조사) 를 거치는 마우스 (GammaCell, MDS Nordion) 유래의 흉선의 TUNEL 염색. 조사 후 24 시간의 피질 영역을 나타낸다. (b) 전신 조사 후 세포 충실도의 변화. B6 마우스를 1 Gy 에서 조사하고, 총 흉선 세포 계수 (왼쪽) 및 CD11b+Gr1 높은 호중구의 백분율 (오른쪽) 을 조사후 표시한 날에 측정하였다. (c) 전신 조사에 의한 민클의 급속 유도. B6 마우스를 1 Gy 에서 조사하고, 조사 후 표시한 기간에 흉선으로부터 총 RNA 를 추출하였다. 민클에 대해, 실시간 PCR 분석을 실시하였다. TLR2 및 FcRγ 도 염증성 세포의 침윤의 지표로서 분석하였다. (d-f) 항-민클은 조사 후의 호중구의 침윤을 억제하였다. 마우스에 0.5 mg 의 래트 IgG 또는 항-민클 (클론 1B6 또는 4A9) 를 정맥내 투여하였다. 1 시간 후, 같은 마우스를 γ-선 조사 (1 Gy) 한 후, 12 시간 후에 흉선 세포의 절대수와 세포 충실도를 분석하였다. CD11b 및 Gr1 에 관해서 흉선 세포를 분석하였다. CD11b+Gr1 높은 호중구의 절대수를 나타낸다 (e). 흉선 대식세포 유래의 MIP-2 생성을 ELISA 에 의해 측정하였다 (f). 각 군은 3 마리 이상의 마우스를 포함한다. *, p<0.05.
도 10 은 하기를 나타낸다: (a) 덱사메타손 (Dex) 투여에 의한 DP 흉선 세포의 사멸. 각 마우스에 100 ㎍ 의 Dex 를 복강내 투여하였다. 투여 후 24 시간째에, 흉선 세포를 계수하고 CD4 및 CD8 의 발현을 분석하였다. (b) Dex 유도성 호중구 침윤에 대한 항-민클의 효과. 500 ㎍ 의 래트 IgG 또는 항-민클 (1B6) 을 Dex 투여 1 시간 전에 정맥내 투여하였다. Dex 투여 후 24 시간째에 흉선 세포를 항-Gr1 및 항-CD11b 로 염색하였다. 각 숫자는 흉선에 둘러싸인 세포의 백분율을 나타낸다. 미처리 흉선에서의 동집단의 백분율은 도 9d 에 기재된 것처럼 0.03% 미만이었다.
도 11 은 하기를 나타낸다: (a-b) B6 마우스에 500 ㎍의 항-민클 (1B6) 을 정맥내 투여하였다. 1 시간 후, 10 ㎍ 의 LPS 를 복막내 주사하고; 20 시간째에 복막 세포를 모아 분석하였다. 복막 세포 중의 호중구의 백분율 (a) 및 절대수 (b) 를 나타냈다. 각 군은 4 마리 이상의 마우스를 포함한다.
도 12 은 하기를 나타낸다: (a) 덱사메타손 처리한 흉선 세포를 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트 (CMFDA) 로 표지하였다. 표지한 흉선 세포를 티오글리콜레이트로 유도한 복막 대식세포에 4 시간 동안 첨가하고, 형광 현미경으로 분석하였다. 화살표 끝은 대식세포에 삼켜진 표지한 흉선 세포를 나타낸다. (b) 티오글리콜레이트로 유도한 복막 대식세포를 미처리로 방치 (무: None) 하거나, 민클을 유도하기 위해 0.1 ㎍/㎖ LPS 로 8 시간 동안 처리 (LPS) 하였다. 그 다음에, 표지한 흉선 세포를 항체 존재 하 또는 부재 하에서 표시한 바와 같이 첨가하였다. 4 시간 후, 세포를 트립신-EDTA 로 회수하고, 둘러싸인 CD11b+ 집단 내에서 흉선 세포를 포함하는 대식세포의 백분율을 유세포분석에 의해 측정하였다.
도 13 은 하기를 나타낸다: (a) 스플라이싱 인자 3b 서브유닛 (SF3b) 단백질의 모식적 표시. U2 snRNP 복합체는 SF3b, SF3a, Sm, U2A＇및 U2B＇로 이루어진다. SAP49, SAP130, SAP145, SAP155 및 snRNA 가 SF3b 를 형성한다. U2 snRNA 내의 GUAGUA 서열은 상이한 종 간에 잘 보존되어 있고, 인트론 내의 분기점의 주위의 서열과 쌍을 형성한다. (b) 도 4a 에 나타낸 샘플을 Ig-민클 및 단백질 G 세파로오스로 끌어내리고, U2 snRNP 복합체 단백질에 대한 항-SAP49, 항-SAP145 및 항-SAP155 와 같은 항체로 블로팅하였다.
본 발명에서의 "민클", "SAP130"및 "FcRγ" 는, 각각 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6 으로 나타내는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 본 명세서에서의 단백질 및 펩티드에 대해, 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단은 N-말단 (아미노 말단) 을 나타내고, 우단은 C-말단 (카르복실 말단) 을 나타낸다.
이들의 단백질은, 인간이나 다른 온혈동물 (예를 들어, 기니아 피그, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 개, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 [예를 들어, 간세포, 비장세포, 신경 세포, 신경교 세포, 췌장 β 세포, 골수 세포, 혈관사이 세포, 랑게르한스 세포, 표피 세포, 상피 세포, 잔세포, 내피 세포, 평활근 세포, 섬유모세포, 섬유 세포, 근육 세포, 지방 세포, 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 비만 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구), 거핵구, 활막 세포, 연골 세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선 세포 또는 사이질세포, 또는 상응하는 선구 세포, 줄기 세포 또는 이의 암 세포 등] 또는 이러한 세포가 존재 하는 임의의 조직 [예를 들어, 뇌, 뇌의 각부 (예를 들어, 후구, 편도핵, 대뇌 기저공, 해마, 시상, 시상하부, 대뇌 피질, 연수, 소뇌), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육 (예를 들어, 평활근, 골격근), 폐, 소화관 (예를 들어, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 턱밑샘, 말초 혈액, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 뼈, 관절, 지방 조직(예를 들어, 백색 지방 조직, 갈색 지방 조직) 등] 으로부터, 자체 공지된 단백질 분리 및 정제 방법에 의해 단리/정제되는 것일 수 있다.
"SEQ ID NO:n (n = 2, 4 또는 6) 으로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열" 로서는, SEQ ID NO:n 으로 나타내는 아미노산 서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 한층 더 바람직하게는 약 90% 이상, 특히 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 97% 이상의 유사성을 갖는 아미노산 서열 등이 언급될 수 있다. 여기서 "유사성" 이란, 그 기술 분야에 있어서 공지된 수학적 알고리즘을 이용해 2 개의 아미노산 서열을 정렬시켰을 경우의, 최적인 정렬 (바람직하게는, 그 알고리즘은 최적인 정렬을 위해서 서열의 한쪽 또는 양쪽 모두의 갭의 도입을 고려할 수 있는 것임) 에서의, 모든 오버래핑 아미노산 잔기에 대한 동일 아미노산 잔기 및 유사 아미노산 잔기의 비율 (%) 을 의미한다. "유사 아미노산" 이란 물리화학적 성질에 있어서 유사한 아미노산을 의미하며; 이의 예는 방향족 아미노산 (Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산 (Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산 (Gln, Asn), 염기성 아미노산 (Lys, Arg, His), 산성 아미노산 (Glu, Asp), 히드록실기를 갖는 아미노산 (Ser, Thr), 및 작은 측쇄를 갖는 아미노산 (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) 과 같은 동일한 군으로 분류되는 아미노산을 포함한다. 이와 같은 유사 아미노산에 의한 치환은 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않는 (즉, 보존적 아미노산 치환) 것으로 예측된다. 보존적 아미노산 치환의 구체예는 그 기술 분야에 공지되어 있으며, 여러 가지의 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990) 참조).
본 명세서에서의 아미노산 서열 유사성은, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) 를 이용해 하기 조건 (기대치=10; 갭 허용; 매트릭스=BLOSUM62; 필터링=OFF) 에서 계산할 수 있다. 아미노산 서열의 유사성을 측정하기 위한 다른 알고리즘으로서는, 예를 들어 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) 에 기재된 알고리즘 [상기 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 에 통합됨 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))], Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970) 에 기재된 알고리즘 [상기 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램에 통합됨], Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) 에 기재된 알고리즘 [상기 알고리즘은 CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 에 통합됨], Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) 에 기재된 알고리즘 [상기 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지 내의 FASTA 프로그램에 통합됨] 등을 포함하며; 이들도 마찬가지로 바람직하게 사용될 수 있다.
보다 바람직하게는, SEQ ID NO:n 으로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이란, SEQ ID NO:n 으로 나타내는 아미노산 서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 한층 더 바람직하게는 약 90% 이상, 특히 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 97% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
"SEQ ID NO:n 으로 나타내는 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질" 은, SEQ ID NO:n 으로 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO:n 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질이다.
여기서 "활성" 이란, 민클의 대해서는, SAP130 과 상호작용하여 FcRγ 를 통해 염증성 사이토카인 등의 생성을 유도하는 활성, 및 호중구를 수송시키는 활성을 의미하고, SAP130 에 대해서는, 민클과 상호작용하여 민클을 활성화하는 능력을 의미하며, FcRγ 에 대해서는, 민클과 협동하여 염증성 사이토카인 등의 생성을 유도하는 활성, 및 호중구를 수송시키는 활성을 의미한다. "실질적으로 동질" 이란, 예를 들어 생리학적 또는 약리학적 관점에서 그 성질이 정성적으로 동일한 것을 의미한다. 따라서, 그 활성은 서로 동등한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도 (예를 들어, 약 0.01 내지 약 100 배, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 배, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 2 배) 및 단백질의 분자량 등과 같은 양적 요소는 상이할 수 있다.
민클과 SAP130, 또는 민클과 FcRγ 의 상호작용, 및 호중구의 수송 활성의 측정은, 자체 공지된 방법에 따라 실시할 수 있으며; 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에서의 민클에는 또한, SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개 이상 (예를 들어 약 1 내지 30 개, 바람직하게는 약 1 내지 10 개, 보다 바람직하게는 1 내지 수 개 (5, 4, 3 또는 2 개)) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 (또는 이의 조합) 아미노산 서열을 함유하는 단백질의 이른바 무테인도 포함된다. 상기와 같이 아미노산 서열이 삽입, 결실 또는 치환되는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, SAP130 및 FcRγ 와 상호작용하는 능력이 유지되는 한, 특별히 한정되지 않는다.
동일하게, 본 발명에서의 SAP130 에는, SEQ ID NO:4 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개 이상 (예를 들어 약 1 내지 50 개, 바람직하게는 약 1 내지 30 개, 보다 바람직하게는 1 내지 10 개, 더욱 바람직하게는 1 내지 수 개 (5, 4, 3 또는 2 개)) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 (또는 이의 조합) 아미노산 서열을 함유하는 단백질도 포함된다. 또, 본 발명에서의 FcRγ 에는, SEQ ID NO:6 으로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개 이상 (예를 들어 약 1 내지 30 개, 바람직하게는 약 1 내지 10 개, 보다 바람직하게는 1 내지 수 개 (5, 4, 3 또는 2 개)) 의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 (또는 이의 조합) 아미노산 서열을 함유하는 단백질도 포함된다.
본 발명에서의 민클, SAP130 및 FcRγ 단백질의 다른 바람직한 예로서 여러 가지의 스플라이싱 변이체 (예를 들어, 민클의 경우, GeneCards (등록상표) 의 Alternative Splicing Database (ASD) 에 CLEC4E 에 관한 Supplice Patterns (SP) 1 내지 SP5 로서 등록되어 있는 인간 민클의 스플라이싱 변이체 등; SAP130 의 경우, ASD 에 SF3B3 에 관한 SP1 내지 SP13 으로서 등록되어 있는 인간 SAP130 의 스플라이싱 변이체 등; ASD 에 FCER1G 에 관한 SP1 내지 SP2 로서 등록되어 있는 인간 SAP130 의 스플라이싱 변이체 등), 다른 포유 동물에서의 이의 오르토로그 (예를 들어, 민클의 경우, GenBank 에 RefSeq No. NP_064332 로서 등록되어 있는 마우스 오르토로그, RefSeq No. NP_001005897 로서 등록되어 있는 래트 오르토로그, RefSeq No. XP_001135204 로서 등록되어 있는 침팬지 오르토로그, RefSeq No. XP_854311 로서 등록되어 있는 개 오르토로그 등; SAP130 의 경우, GenBank 에 RefSeq No. NP_598714 로서 등록되어 있는 마우스 오르토로그, RefSeq No. XP_214697 로서 등록되어 있는 래트 오르토로그, RefSeq No. XP_511081 로서 등록되어 있는 침팬지 오르토로그, RefSeq No. XP_536791 로서 등록되어 있는 개 오르토로그, RefSeq No. XP_001232348 로서 등록되어 있는 닭 오르토로그 등; FcRγ 의 경우, GenBank 에 RefSeq No. NP_034315 로서 등록되어 있는 마우스 오르토로그, RefSeq No. NP_001003171 로서 등록되어 있는 개 오르토로그 등), 나아가서는 이의 천연의 대립형질적 변이체 또는 다형체 등이 포함된다.
본 발명에서 "민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질" 이란, SAP130 의 자극에 의해 민클이 활성화되고 FcRγ 와 협동하여 신호전달하는 것을 저해할 수 있는 임의의 것일 수 있으며; 바람직하게는, 민클과 SAP130 과의 결합을 저해하는 물질이 언급될 수 있다.
구체적으로는, 민클과 SAP130 과의 결합을 저해하는 물질의 예로서, 민클 또는 SAP130 단백질에 대한 항체가 언급될 수 있다. 상기 항체는 다클론 항체, 또는 단일클론 항체일 수 있다. 이들 항체는, 자체 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조될 수 있다. 항체의 이소타입은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 IgG, IgM 또는 IgA, 특히 바람직하게는 IgG 이다. 상기 항체는, 표적 항원을 특이적으로 인식하고 이에 결합하기 위한 상보성 결정 영역 (CDR) 을 적어도 갖는 것이면 특별히 제한은 없으며; 완전 항체 분자에 추가로, 예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab＇)2 와 같은 단편, scFv, scFv-Fc, 미니바디 및 디아바디와 같은 유전자 공학적으로 제작된 접합 분자, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 단백질 안정화 작용을 갖는 분자로 개질된 이의 유도체 등이 허용가능하다.
민클은 1 회 막관통형의 세포 표면 수용체이므로, 본 발명에서의 항-민클 항체가 민클의 세포외 영역을 인식하는 것인 것이 바람직하다. 하기 실시예에서 나타나듯이, SAP130 과의 상호작용에 중요한 민클의 영역은, 인간 민클의 경우, SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 VEGQW (SEQ ID NO:7) (다른 포유 동물의 오르토로그에 있어서는, 상응하는 아미노산 서열) 를 포함한다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명에서의 항-민클 항체는, 그 영역을 인식하는 것이다. 그러한 항체는, 그 영역의 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩티드를 고상 합성법과 같은 잘 알려져 있는 펩티드 합성법을 이용해 합성하고, 이를 적당한 담체 단백질과 접합시키고, 상기 접합체를 면역원으로서 동물을 면역화시키거나, 동물을 림프구 등을 사용하는 체외 면역을 거치게 함으로써 취득될 수 있다. 그러나, 본 발명에서의 항-민클 항체는, SAP130 과의 상호작용에 중요한 영역 이외를 인식하는 경우에도, SAP130 에 결합하여 이를 활성화시키기 위해 SAP130 이 민클에 결합하는 것을 저해할 수 있는 한, 마찬가지로 바람직하게 사용될 수 있다.
한편, SAP130 은 사멸 세포로부터 세포 외부에 방출되므로, 본 발명에서의 항-SAP130 항체는 SAP130 의 임의의 영역을 인식할 수 있으며; 바람직하게는, 민클과의 상호작용에 중요한 민클 의 영역, 특히, SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 VEGQW (SEQ ID NO:7) 또는 다른 포유 동물의 오르토로그에 있어서의 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 영역과의 결합에 관여하는 영역을 인식하는 항체이다.
바람직한 구현예에서, 민클 또는 SAP130 단백질에 대한 항체는 인간을 투여 대상으로 하는 의약품으로서 사용되기 때문에, 상기 항체 (바람직하게는 단일클론 항체) 는 인간에 투여했을 경우에 항원성을 나타내는 위험성이 감소된 항체, 구체적으로는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 마우스-인간 키메라 항체 등이며, 특히 바람직하게는 완전 인간 항체이다. 인간화 항체 및 키메라 항체는, 통상적인 방법에 따라 유전자 공학적으로 제작될 수 있다. 또, 완전 인간 항체가 인간-인간 (또는 마우스) 하이브리도마로부터 제조될 수 있으나, 대량의 항체를 안정적이고 저비용으로 제공하기 위해서는, 인간 항체-생성 마우스나 파지 디스플레이법을 이용해 항체를 제조하는 것이 바람직하다.
민클과 SAP130 과의 결합을 저해하는 다른 물질의 예로서, 민클의 SAP130 과의 결합에 관여하는 영역의 아미노산 서열과 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 언급될 수 있다. 여기서 "실질적으로 동일한 아미노산 서열" 이란, SAP130 과의 결합에 관여하는 영역의 아미노산 서열에서 1 내지 3 개, 바람직하게는 1 내지 2 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로서, SAP130 과의 결합 가능성을 유지하는 서열을 의미한다. 구체적으로는, 민클의 SAP130 과의 결합에 관여하는 영역의 아미노산 서열로서는, 상기 SEQ ID NO:2 로 나타내는 인간 민클의 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 VEGQW (SEQ ID NO:7), 또는 다른 포유 동물의 오르토로그에 있어서의 서열에 상응하는 아미노산 서열이 언급될 수 있다. 펩티드의 길이에 특별히 제한은 없지만, 분자량의 크기, 합성의 용이함, 항원성의 문제 등을 고려 하면, 길이는 약 5 내지 50 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 30 아미노산, 보다 바람직하게는 약 5 내지 15 아미노산이다. 펩티드는, SAP130 과의 결합에 관여하지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 예를 들어, 그 결합에 관여하는 아미노산 서열과 SAP130 과의 상호작용에 악영향을 미치지 않는 한, 펩티드의 물리화학적 성질 (예를 들어, 소수성, 등전점, 열안정성, pH 안정성, 항-효소 안정성 등) 을 개선하도록 설계된 아미노산 서열을, 그 결합에 관여하는 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 측에 부가할 수 있다.
본 발명에서의 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질은, 상기와 같은 항-민클 항체 및 SAP130 결합성 펩티드로 한정되지 않으며; 민클과 SAP130 과의 상호작용을 직접적 또는 간접적으로 저해하는 한, 저분자 화합물과 같은 다른 물질일 수 있다. 그러한 물질은, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 스크리닝 방법 (I) 또는 (III) 에 의해 취득될 수 있다.
본 발명에서, "민클의 발현을 저해하는 물질" 이란, 민클 유전자 전사 수준, 전사 후 조절 수준, 단백질로의 번역 수준, 번역 후 개질 수준 등에서의 임의의 단계에서 작용하는 것일 수 있다. 따라서, 민클 단백질의 발현을 저해하는 물질의 예는, 민클 유전자의 전사를 저해하는 물질, 초기 전사 산물로부터 mRNA 로의 프로세싱을 저해하는 물질, mRNA 의 세포질에 대한 전위를 저해하는 물질, mRNA 의 분해를 촉진하는 물질, mRNA 로부터 단백질로의 번역을 저해하는 물질, 민클 폴리펩티드의 번역 후 개질을 저해하는 물질 등이 포함된다.
민클의 mRNA 로부터 단백질로의 번역을 특이적으로 저해할 수 있는 물질로서, 바람직하게는, 이의 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그 일부를 포함하는 핵산이 언급될 수 있다.
민클 mRNA 의 염기 서열과 실질적으로 상보적인 염기 서열이란, 포유 동물 세포 내의 생리학적 조건 하에서, mRNA 의 표적 서열에 결합하여 이의 번역을 저해할 수 있는 정도의 상보성을 갖는 염기 서열을 의미하며; 구체적으로는, 예를 들어, mRNA 의 염기 서열과 완전 상보적인 염기 서열 (즉, mRNA 의 상보 가닥의 염기 서열) 에 대한 중복 영역에 관해서, 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 97% 이상의 유사성을 갖는 염기 서열이다.
본 발명에서의 "염기 서열 유사성" 은, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) 를 이용해 하기의 조건 (기대치=10; 갭 허용; 필터링=ON; 매치 스코어=1; 미스매치 스코어=-3) 에서 계산할 수 있다.
보다 구체적으로는, 민클 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열로서, (a) SEQ ID NO:1 로 나타내는 염기 서열 또는 (b) 염기 서열과 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 염기 서열로서, SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열이 언급될 수 있다. 여기서 "실질적으로 동질의 활성" 이란 상기 기재된 바와 같다.
엄격한 조건의 예에는, [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999] 에 기재되는 조건, 예를 들어, 6×SSC (염화나트륨/구연산나트륨)/45℃ 에서의 하이브리드화, 그 후 0.2×SSC/0.1% SDS/50 내지 65℃ 에서의 1 회 이상의 세정이 포함되며; 당업자는 이와 동등한 엄격도를 주는 하이브리드화의 조건을 적절히 선택할 수 있다.
민클 mRNA 는, 바람직하게는 SEQ ID NO:1 로 나타내는 염기 서열을 포함하는 인간 민클 mRNA (RefSeq Accession No. NM_014358), 또는 다른 포유 동물에 있어서의 이의 오르토로그 (예를 들어, GenBank 에 RefSeq No. NM_019948 로서 등록되어 있는 마우스 오르토로그, RefSeq No. NM_001005897 로서 등록되어 있는 래트 오르토로그, RefSeq No. XM_001135204 로서 등록되어 있는 침팬지 오르토로그, RefSeq No. XM_849218 로서 등록되어 있는 개 오르토로그 등), 또는 이의 천연의 대립형질적 변이체 또는 다형체이다.
"민클 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열의 일부" 란, 민클 mRNA 에 특이적에 결합할 수 있고, 또한 그 mRNA 로부터 단백질로의 번역을 저해할 수 있는 것인 한, 그 길이나 위치에 특별히 제한은 없지만, 서열 특이성의 관점에서, 상기 일부는 표적 서열에 상보적 또는 실질적으로 상보적인 부분을 적어도 10 염기 이상, 바람직하게는 약 15 염기 이상, 보다 바람직하게는 약 20 염기 이상 포함하는 것이다.
구체적으로는, 민클 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 이의 일부를 포함하는 핵산은, 예를 들어 하기의 (a) 내지 (c) 중 하나인 것이 바람직하다.
(a) 민클 mRNA 에 대한 안티센스 핵산
(b) 민클 mRNA 에 대한 siRNA
(c) 민클 mRNA 에 대한 siRNA 를 생성할 수 있는 핵산
본 발명에서의 "민클 mRNA 에 대한 안티센스 핵산" 이란, mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 그 일부를 포함하는 핵산으로서, 표적 mRNA 와 특이적 또한 안정적인 이중 사슬이 형성되도록 결합함으로써 단백질 합성을 억제하는 기능을 갖는 것이다. 안티센스 핵산은, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, DNA:RNA 하이브리드일 수 있고, 공지된 개질이 이에 부가된 것일 수 있다. 여기서 "핵산" 은, 푸린 및 피리미딘 염기 뿐 아니라 개질된 그 밖의 헤테로시클릭 염기를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산이 DNA 인 경우, 표적 RNA 와 안티센스 DNA 에 의해 형성되는 RNA:DNA 하이브리드는, 내재성 RNase H 에 의해 인식되어 표적 RNA 의 선택적인 분해를 일으킬 수 있다. 따라서, RNase H 에 의한 분해를 일으키는 것으로 의도되는 안티센스 DNA 의 경우, 표적 서열은 mRNA 중의 서열 뿐 아니라, CPSF5 또는 CPSF6 유전자의 초기 번역 산물에서의 인트론 영역의 서열일 수 있다.
게다가 본 발명의 안티센스 핵산은, 이중 가닥 DNA 인 민클 유전자와 결합하여 삼중 가닥 (삼중물) 을 형성하고, RNA 로의 전사를 저해할 수 있는 것 (안티진 (antigene)) 일 수 있다.
본 발명의 안티센스 핵산의 표적 영역은, 안티센스 핵산이 하이브리드화함으로써 결과적으로 민클 단백질로의 번역이 저해되는 것이면 그 길이에 특별히 제한은 없고; 표적 영역은 짧은 것으로는 약 10 염기의 서열, 또는 긴 것으로는 mRNA 또는 초기 전사 산물의 전체 서열일 수 있다. 합성의 용이함, 항원성, 세포내 이행성의 문제 등을 고려하면, 약 10 내지 약 40 염기, 특히 약 15 내지 약 30 염기로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
안티센스 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 분자가 천연형의 DNA 또는 RNA 일 수 있으나, 안정성 (화학적 및/또는 효소에 대한) 또는 특이적 활성 (RNA 와의 친화성) 을 증가시키기 위해 여러 가지의 화학적 개질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 등에 의한 분해를 방지하기 위해, 안티센스 핵산을 구성하는 각 뉴클레오티드의 인산 잔기 (포스페이트) 를, 예를 들어 포스포로티오에이트 (PS), 메틸포스포네이트 또는 포스포로디티오네이트와 같은 화학적을 개질된 인산 잔기로 치환할 수 있다. 각 뉴클레오티드의 당 (리보오스) 의 2'-위치의 히드록실기를, -OR (R 은 예를 들어 CH3(2'-O-Me), CH2CH2OCH3(2'-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN 등을 나타냄) 로 치환할 수 있다. 게다가 염기 부분 (피리미딘, 푸린) 을 화학적으로 개질할 수 있고; 예를 들어, 피리미딘 염기의 5-위치로의 메틸기 또는 양이온성 관능기의 도입, 2-위치 카르보닐기의 티오카르보닐로의 치환 등을 언급할 수 있다.
RNA 의 당 부분의 구조에 대해, C2'-엔도 (S 형) 및 C3'-엔도 (N 형) 의 두 유형이 지배적이며; 단일 가닥 RNA 에서는 당 부분이 두 가지의 평형으로서 존재 하지만, 이중 가닥이 형성되는 경우 구조는 N 형에 고정된다. 따라서, 표적 RNA 에 대해 강한 결합 능력을 부여하기 위해서, 2' 산소와 4' 탄소를 가교함으로써, 당 부분의 구조를 N 형에 고정한 RNA 유도체인 BNA (LNA) (Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004) 및 ENA (Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003) 가 또한 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 민클 cDNA 서열 또는 게놈 DNA 서열에 기초하여 표적 서열을 결정하고, 시판되는 DNA/RNA 자동 합성기 (Applied Biosystems Company, Beckman Company 등) 를 사용하여, 이에 상보적인 서열을 합성함으로써 제조될 수 있다.
본원에서는, 민클 mRNA 에 상보적인 올리고-RNA 와 그 상보 가닥으로 이루어지는 이중 가닥 RNA, 이른바 siRNA 도 또한, 민클 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 이의 일부를 포함하는 핵산에 포함되는 것으로서 정의된다. siRNA 는 표적이 되는 mRNA 의 염기 서열 정보에 기초하여, 시판되는 소프트웨어 (예를 들어, RNAi Designer; Invitrogen) 를 이용해 적절히 설계될 수 있다. siRNA 를 구성하는 리보뉴클레오시드 분자도 또한, 안정성, 특이적 활성 등을 향상시키기 위해 상기의 안티센스 핵산의 경우와 동일한 개질을 가질 수 있다. 그러나, siRNA 의 경우, 천연형 RNA 중의 모든 리보뉴클레오시드 분자를 개질된 형태로 대체한다면, 이의 RNAi 활성이 없어지는 경우가 있으므로, RISC 복합체가 기능할 수 있게 하는 최소한의 개질된 뉴클레오시드의 도입이 필요하다.
siRNA 는, mRNA 상의 표적 서열의 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 DNA/RNA 자동 합성기로 각각 합성하고, 적당한 어닐링 완충액에서 약 90 내지 약 95℃ 로 약 1 분 동안 사슬을 변성시킨 후, 약 30 내지 약 70℃ 로 약 1 내지 약 8 시간 동안 어닐링시킴으로써 제조될 수 있다. siRNA 는 또한, siRNA 전구체로서 역할하는 쇼트 헤어핀 RNA (shRNA) 를 합성하고, 이것을 다이서 (dicer) 를 이용해 절단함으로써 제조될 수 있다.
생체 내에서 민클 mRNA 에 대한 siRNA 를 생성할 수 있도록 설계된 핵산으로서, 상기 shRNA, 이를 발현하도록 구축된 발현 벡터 등을 언급할 수 있다. shRNA 는, mRNA 상의 표적 서열의 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 적당한 루프 구조를 형성할 수 있는 길이 (예를 들어 약 15 내지 25 염기) 의 스페이서 서열을 사이에 삽입해 연결하여 생긴 염기 서열을 포함하는 올리고-RNA 를 설계하고, 이것을 DNA/RNA 자동 합성기로 합성함으로써 제조될 수 있다. shRNA 의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터는, 상기 shRNA 를 인코딩하는 이중 가닥 DNA 를 통상적인 방법에 의해 제작한 후, 적당한 발현 벡터 내에 삽입함으로써 제조될 수 있다. shRNA 발현 벡터로서, U6 또는 H1 과 같은 Pol III 계 프로모터를 갖는 것이 이용될 수 있다. 이 경우, 발현 벡터가 혼입된 동물 세포 내에서 전사된 shRNA 는 자신으로 루프를 형성한 후에, 내재성 효소 다이서 (dicer) 등에 의해 프로세싱됨으로써 성숙 siRNA 가 형성된다.
민클 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 이의 일부를 포함하는 핵산의 다른 바람직한 예에는, mRNA 를 코딩 영역 내에서 특이적으로 절단할 수 있는 리보자임이 포함된다. 본원에서, 리보자임은 서열 특이적 핵산 절단 활성을 갖는 한, DNA 를 포함하는 개념으로서 사용된다. 가장 범용성인 리보자임은 비로이드 및 비루소이드와 같은 감염성 RNA 에서 발견되는 자가-스플라이싱 RNA 이며, 해머헤드형, 헤어핀형 등이 알려져 있다.
민클 mRNA 의 염기 서열과 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기 서열 또는 이의 일부를 포함하는 핵산은, 리포솜 또는 마이크로스피어와 같은 특수한 형태로 공급될 수 있으며, 폴리리신과 같은 다가양이온, 또는 지질 (예를 들어, 인지질, 콜레스테롤 등) 과 같은 소수성 물질이 부가된 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에서의 민클의 발현을 저해하는 물질은, 상기와 같은 안티센스 핵산, siRNA, 리보자임 등에 한정되지 않으며; 민클의 발현을 직접적 또는 간접적으로 저해하는 한, 저분자 화합물과 같은 다른 물질일 수 있다. 그러한 물질은, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 스크리닝 방법 (IV) 에 의해 취득될 수 있다.
본 발명에서 "민클과 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질" 이란, 활성화된 민클이 FcRγ 와 협동하여 신호전달하는 것을 저해할 수 있는 것이면 임의의 것일 수 있으며; 바람직하게는, 민클과 FcRγ 와의 회합을 저해하는 물질이 언급될 수 있다.
구체적으로는, 민클과 FcRγ 와의 회합을 저해하는 물질로서, 예를 들어, 민클 및/또는 FcRγ 에 대한 항체가 언급될 수 있다. 민클 또는 FcRγ 에 대한 각 항체는, 민클 또는 FcRγ 에 결합함으로써 파트너 분자와의 회합을 입체적으로 저해하거나, 구조 변화를 일으켜 파트너 분자와 회합하는 능력을 저하시킬 수 있다. 민클 및 FcRγ 를 인식하는 이중 특이성 항체도, 그것이 양 항원 분자에 결합함으로써 그것들이 상호작용할 수 있는 정도로까지 서로 접근할 수 없게 되면, FcRγ 를 통한 신호전달을 차단할 수 있기 때문에, 마찬가지로 바람직하게 사용될 수 있다. 이들의 항체가 인식하는 민클 및 FcRγ 의 영역은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 세포외 영역이다.
민클 및/또는 FcRγ 에 대한 항체는, 다클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 이들 항체는, 자체 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조될 수 있다. 항체의 이소타입은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 IgG, IgM 또는 IgA, 특히 바람직하게는 IgG 이다. 항체는, 표적 항원을 특이적으로 인식하고 이에 결합하기 위한 상보성 결정 영역 (CDR) 을 적어도 갖는 것이면 특별히 제한되지 않으며; 상기와 동일한 각종 형태의 것이 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이들 항체는 인간 수용자에 대한 의약품으로서 사용되고, 항체는 바람직하게는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 마우스-인간 키메라 항체 등이며, 특히 바람직하게는 완전 인간 항체이다.
본 발명에서의 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질은, 상기와 같은 민클 및/또는 FcRγ 에 대한 항체로 한정되지 않으며; 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 직접적 또는 간접적으로 저해하는 한, 저분자 화합물과 같은 또 다른 물질일 수 있다. 그러한 물질은, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 스크리닝 방법 (II) 또는 (III) 에 의해 취득될 수 있다.
하기 실시예에서 기재하는 바와 같이, 민클과 FcRγ 와의 회합에는, 민클의 막관통 도메인 내의 포유 동물 종 간에 잘 보존된 아르기닌 잔기 (SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열 중 아미노산 번호 41 로 나타내는 아미노산) 가 중요하다. 따라서, 아르기닌 잔기를 함유하는 민클의 막관통 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은, 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 유효하게 저해할 수 있다. 막관통 영역을 표적으로 하는 경우에는 소수성이 요구되므로, 지용성 저분자 화합물의 이용이 극히 유리하다.
민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질은, FcRγ-의존적인 신호전달을 차단하여 비항상성 세포사에 의해 자극되는 염증 반응을 저해할 수 있다. 따라서, 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질을 함유하는 의약품은, 예를 들어 항-염증제로서 여러 가지의 염증성 질환 (예를 들어, 크론씨병, 류머티스 관절염, 베체트병 (안과 증상), 궤양성 대장염, 경직성 척추염, 건선 (건선성 관절염 포함), HIV 감염, 다발성 골수종, 울혈성 심부전, GVHD, 거대 세포 혈관염 (GCA), 류머티스성 다발성 근육통 (PMR), 색소성 자반성 태선양 피부염, 유육종증, 베게너 육아종, 농피증, 베체트병, TNF 수용체 관련 주기성 증후군 (TRAPS), SAPHO 증후군, 타카야스병, 근육 염증, 스틸병, 결절성 동맥 주위염 (PN), 재발성 다발 연골염, 강피증 다발성 근염, 혈구탐식 증후군, 천포창, 카와사키병 아토피성 피부염) 의 예방 및/또는 치료제 등으로 사용될 수 있다.
(1) 항체, 저분자 화합물 등을 함유하는 의약품
민클, SAP130 또는 FcRγ 에 대한 항체, 또는 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 저분자 화합물을 함유하는 의약품은 저독성이며, 그대로 액체로서 또는 적당한 투약 형태의 의약 조성물로서 인간 또는 다른 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대해 경구적 또는 비경구적 (예를 들어, 혈관내 투여, 피하 투여 등) 으로 투여될 수 있다.
투여에 사용되는 의약 조성물은 상기의 항체 또는 저분자 화합물 또는 이의 염과 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이와 같은 의약 조성물은, 경구 또는 비경구 투여에 적절한 투약 형태로 공급된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예로서, 주사제, 좌제 등이 사용되며; 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 및 점적 주입 주사제와 같은 투약 형태를 포함할 수 있다. 이와 같은 주사제는 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 주사제는, 예를 들어 상기 본 발명의 항체 또는 저분자 화합물 또는 이의 염을 통상 주사에 대해 사용되는 무균의 수성액 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 제조될 수 있다. 주사용의 수성액의 예로서, 생리 식염수, 포도당이나 그 밖의 보조제를 포함하는 등장액 등이 사용될 수 있어, 적당한 가용화제, 예를 들어, 알코올 (예를 들어 에탄올), 폴리알코올 (예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 [예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소화 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 mol) 부가물)] 등과 병용될 수 있다. 유성액의 예로서, 참깨유, 대두유 등이 사용될 수 있어, 가용화제로서 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 병용될 수 있다. 제조된 주사액은, 적당한 앰플에 충전되는 것이 바람직하다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, 상기 항체 또는 이의 염을 통상적인 좌약용 기제에 혼합하여 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물로서, 고체 또는 액체 투약 형태, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름-코팅 정제 포함), 환약, 과립제, 가루약, 캡슐제 (연질 캡슐제 포함), 시럽제, 유제, 현탁제 등이 언급될 수 있다. 이와 같은 조성물은 공지된 방법에 의해 제조되며, 의약품 제조 분야에 있어서 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 정제용 담체 및 부형제의 예에는, 락토오스, 전분, 수크로오스 및 마그네슘 스테아레이트가 포함된다.
상기의 비경구용 또는 경구용 의약 조성물은, 활성 성분의 투약에 적합한 투약 단위 제형으로 편리하게 제조된다. 이와 같은 투약 단위 제형의 예에는, 정제, 환약, 캡슐제, 주사제 (앰플) 및 좌제가 포함된다. 항체 또는 저분자 화합물은, 투약 단위 제형 당 통상 5 내지 500 mg, 특히 주사제에서는 5 내지 100 mg, 또는 그 밖의 투약 형태에서는 10 내지 250 mg 함유되는 것이 바람직하다.
상기의 항체 또는 저분자 화합물 또는 이의 염을 함유하는 상기 의약품의 투여량은 투여 대상, 표적 질환, 증상, 투여 경로 등에 따라 가변적이며; 예를 들어, 상기 의약품을 성인 류머티스 관절염의 치료/예방을 위해 사용하는 경우에는, 항체 또는 저분자 화합물을 1 회량을 기준으로 통상 약 0.01 내지 20 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/kg 체중을, 1 일 약 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 약 1 내지 3 회, 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 편리하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우도 유사한 투여량을 투여할 수 있다. 증상이 특히 중증인 경우에는, 그 증상에 따라 투여량을 증가시킬 수 있다.
상기 언급된 각 조성물은, 상기 항체나 저분자 화합물과 배합되는 경우 원치 않는 상호작용을 일으키지 않는 임의의 다른 약물을 포함할 수 있다. 상기 항체나 저분자 화합물과 병용될 수 있는 약물의 예에는, 항균약, 항진균약, 비스테로이드성 항-염증약, 스테로이드약, 항응혈약, 혈소판 응집 방지약, 혈전 용해약, 면역조절약, 항원충약, 항생 물질, 항바이러스약, 진해/거담약, 진정약, 마취약, 항궤양약, 부정맥 치료약, 강압 이뇨약, 정신 안정약, 항정신병약, 항종양약, 항고지혈증약, 근이완약, 항간질약, 항우울증약, 항알레르기약, 강심약, 부정맥 치료약, 혈관 확장약, 혈관 수축약, 강압 이뇨약, 당뇨병 치료약, 마약 대항약, 비타민약, 비타민 유도체, 관절염 치료약, 항류머티즘약, 항천식약, 빈뇨/요실금 치료약, 아토피성 피부염 치료약, 알레르기성 비염 치료약, 고혈압약, 단백질 분해약, 단백질 분해 효소 저해약, 항-SIDS 약, 항패혈증약, 항패혈증 쇼크약, 엔도톡신 대항약 또는 항체, 신호전달 저해제, 염증성 매개체 작용 억제약, 염증성 매개체 작용 억제 항체, 염증성 매개체 생성 억제약, 항-염증성 매개체 작용 억제약, 항-염증성 매개체 작용 억제 항체, 항-염증성 매개체 생성 억제약, α1 아드레날린 작동약 등이 포함된다. 상기의 항체 또는 저분자 화합물과 이들 다른 약품은, 동시 또는 상이한 시간에 환자에게 투여될 수 있다.
(2) 안티센스 핵산, siRNA 또는 리보자임과 같은 핵산을 함유하는 의약품
민클 mRNA 에 대한 안티센스 핵산, siRNA 또는 리보자임 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 의약품은 저독성이며, 그대로 액체로서 또는 적당한 투약 형태의 의약 조성물로서 인간 또는 비인간 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대해 경구적 또는 비경구적 (예를 들어, 혈관내 투여, 피하 투여 등) 으로 투여될 수 있다.
이들 핵산을 상기의 항-염증제, 염증성 질환의 예방/치료제 등으로서 사용하는 경우, 이는 자체 공지된 방법에 따라 의약 제형으로서 제조되고 투여될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 핵산은 단독 또는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 적당한 포유 동물 세포용의 발현 벡터에 기능적 양태로 삽입된 후, 일상적인 수단에 따라 의약 제형으로서 제조될 수 있다. 핵산은, 그대로, 또는 섭취 촉진을 위한 보조제와 함께, 유전자총이나 히드로겔 카테터와 같은 카테터에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로는, 핵산은 에어로졸로서 제조되고 흡입제로서 기관 내에 국소 투여될 수도 있다.
게다가 체내 동태의 개량, 반감기의 장기화, 및 세포내 흡수 효율의 개선을 목적으로, 상기 핵산을 단독 또는 리포솜과 같은 담체와 함께 제제물 (주사제) 로서 제조하고, 정맥내, 피하 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 핵산은, 그 자체로서, 또는 적당한 의약 조성물로서 투여될 수 있다. 투여에 사용되는 의약 조성물은 본 발명의 핵산과 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 모두 포함할 수 있다. 이와 같은 의약 조성물은, 경구 또는 비경구 투여에 적절한 투약 형태로 공급된다.
비경구 투여를 위한 조성물의 예로서, 주사제, 좌제 등이 사용되며; 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 및 점적 주입 주사제와 같은 투약 형태를 포함할 수 있다. 이와 같은 주사제는, 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, 상기 핵산을 통상적인 좌약용 기제에 혼합함으로써 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물로서, 고체 또는 액체 투약 형태, 구체적으로는 정제 (당의정 및 필름-코팅 정제 포함), 환약, 과립제, 가루약, 캡슐제 (연질 캡슐제 포함), 시럽제, 유제, 현탁제 등이 언급될 수 있다. 이와 같은 조성물은 공지된 방법에 의해 제조되며 의약 제조 분야에 있어서 통상 사용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 정제용 담체 및 부형제의 예에는, 락토오스, 전분, 수크로오스 및 마그네슘 스테아레이트가 포함된다.
상기의 비경구용 또는 경구용 의약 조성물은, 활성 성분의 투약에 적합한 투약 단위 제형으로 편리하게 제조된다. 이와 같은 투약 단위 제형의 예에는, 정제, 환약, 캡슐제, 주사제 (앰플) 및 좌제가 포함된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, 투약 단위 제형 당 통상 5 내지 500 mg, 특히 주사제에서는 5 내지 100 mg, 또는 그 밖의 제형에서는 10 내지 250 mg 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산을 함유하는 상기 의약품의 투약량은, 투여 대상, 표적 질환, 증상, 투여 경로 등에 따라 가변적이며; 예를 들어, 성인 류머티스 관절염의 치료/예방을 위해서 사용하는 경우에는, 본 발명의 핵산을 1 회량을 기준으로 통상 약 0.01 내지 20 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/kg 체중을, 1 일 약 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 약 1 내지 3 회, 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 편리하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우도, 유사한 투여량을 투여할 수 있다. 증상이 특히 중증인 경우에는, 그 증상에 따라 투여량을 증가시킬 수 있다.
상기 언급한 각 조성물은, 본 발명의 핵산과 배합되는 경우 원치 않는 상호작용을 일으키지 않는 임의의 다른 약물을 포함할 수 있다. 다른 약물로서는, 상기 항체 및 저분자 화합물과 병용될 수 있는 상기 언급된 약물이 예시된다.
상기 서술한 대로, 민클은 사멸 세포로부터 방출되는 SAP130 을 인식해 활성화되어, FcRγ 와 상호작용하여 염증성 사이토카인 등의 생성을 유도하고, 호중구를 침윤시키는 작용을 갖는다. 따라서, 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질은, 항-염증제로서 여러 가지의 염증성 질환의 예방/치료에 사용될 수 있다. 한편, 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 증강시키는 물질은, 손상 또는 병원체-감염된 조직에 대한 호중구의 침윤을 적당한 수준으로 촉진하고, 조직 회복을 촉진할 수 있기 때문에, 조직 손상이나 감염증의 치료제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 조절하는 물질을 선택함에 의한 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(I) 민클과 SAP130 의 상호작용을 조절하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명은, 민클 또는 이의 세포외 영역을 포함하는 단편과 SAP130 을, 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서 접촉시키고, 두 조건 하에서의 민클 또는 이의 단편과 SAP130 과의 상호작용의 정도를 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이러한 스크리닝 방법에서 사용되는 민클 및 SAP130 단백질은, 상기 본 발명의 의약품에 관한 설명에서 기재되었던 바와 같다. 민클에 대해, 이의 전체 길이를 사용할 수 있거나, 세포외 영역 (SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열에서, 아미노산 번호 45 내지 219 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 영역) 을 함유하는 이의 단편을 사용할 수 있다. SAP130 단백질에 대해서도, 민클과의 결합 및 민클의 활성화에 관여하는 영역을 포함하는 한, 이의 단편을 사용할 수 있다.
이하, 달리 나타내지 않는 한, 용어 민클 및 SAP130 은 상기의 기능적 단편을 포함하는 의미로 사용될 것이다.
민클 및 SAP130 단백질은, 단백질을 생성하는 상기 기재된 세포 또는 조직으로부터, 적절히 조합된 자체 공지된 단백질 분리 및 정제 기술을 사용하여 취득될 수 있다. 대안적으로는, 이들 단백질은 또한, 단백질을 인코딩하는 핵산을, 상기 기재된 그들의 염기 서열 정보에 기초하여 제작한 프로브 또는 프라이머를 사용하여 그 단백질을 생성하는 세포 또는 조직으로부터 제조한 RNA, cDNA, cDNA 라이브러리 등으로부터 클로닝하고, 상기 클론을 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 형질전환체 세포를 배양하여 재조합 단백질을 수득하고, 자체 공지된 방법에 의해 단백질을 회수함으로써도 취득될 수 있다. 또한 이는, 이들 단백질 상의 상기 기재된 아미노산 서열 정보를 기준으로, 공지된 펩티드 합성법에 의해 화학적으로 합성될 수도 있다.
보다 구체적으로는, 이러한 스크리닝 방법은 하기의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함한다:
(a) 시험 물질과 민클 및 SAP130 을 접촉시키는 단계,
(b) 시험 물질을 접촉시킨 민클의 SAP130 과의 결합 활성을 측정하고, 그 활성을 시험 물질을 접촉시키지 않은 대조군 민클의 SAP130 과의 결합 활성과 비교하는 단계, 및
(c) 상기 (b) 의 비교 결과에 기초하여, 민클 및 SAP130 의 결합 활성을 조절하는 시험 물질을 선택하는 단계.
단계 (a) 에서, 시험 물질은 임의의 공지 물질 또는 신규 물질일 수 있으며; 예를 들어, 핵산, 당질, 지질, 단백질, 펩티드, 유기 저분자 화합물, 조합 화학 기술을 사용하여 제조된 화합물 라이브러리, 고상 합성이나 파지 디스플레이법에 의해 제작된 랜덤 펩티드 라이브러리, 또는 미생물, 동물, 식물, 해양 생물 등 유래의 천연 성분 등을 포함한다.
단계 (a) 에서, 시험 물질은 민클 및 SAP130 과 접촉된다. 단계 (a) 에서, 접촉 방법은 특별히 한정되지 않으며; 이의 예에는 25 내지 37℃ 의 생리학적 조건 하에서 민클 및 SAP130 을 특정 농도로 혼합하고, 시험 물질을 첨가하는 것을 포함하는 방법, SAP130 을 고상에 고정시키고, 시험 물질의 존재 하 민클과 결합시키는 것을 포함하는 방법, 민클을 발현하는 세포의 배양액에 시험 물질 및 SAP130 을 첨가하는 것을 포함하는 방법 등이 포함된다. 첨가되는 시험 물질의 농도는 화합물의 선택 (용해성, 독성 등) 에 따라 가변적이며, 예를 들어 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 인큐베이션 시간은, 예를 들어 약 10 분 내지 약 24 시간이다.
단계 (b) 에서, 민클과 SAP130 과의 결합 활성은 하기 예에 언급된 방법으로 측정될 수 있다.
b-1) 항-민클 항체 또는 항-SAP130 항체를 사용하여 면역 침강시키고, 면역 침강으로 사용하지 않았던 항체로 웨스턴 블로팅을 실시하여, 민클과 SAP130 과의 결합량을 측정하는 방법.
b-2) 민클 또는 SAP130 을 폴리히스티딘 또는 GST 와 같은 마커와의 융합 단백질로서 발현시키거나, 이를 비오틴화시킨 후, 폴리히스티딘이 니켈에, GST 가 글루타티온에, 또는 비오틴이 아비딘에 결합하는 것을 이용하여 접합체를 회수하고, b-1) 과 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅으로 결합량을 측정하는 방법.
b-3) 표면 플라스몬 공명법 (Biacore).
b-4) 형광 표지한 민클의 SAP130 발현 세포에 대한 결합을, 유세포 분석기로 측정하는 것을 포함하는 방법.
단계 (b) 에서, 결합 활성의 비교는, 예를 들어 시험 물질의 존재 하 및 비존재 하에 있어서, 민클과 SAP130 과의 결합량의 유의차의 유무에 기초하여 수행된다.
단계 (c) 에서, 민클의 SAP130 과의 결합 활성을 저하 또는 증대시키는 시험 물질이 선택된다. 결합 활성을 저하시킨 시험 물질은, 항-염증성 물질, 특히 염증성 질환의 예방/치료 약물의 후보로서 유용하다. 이는 또한, 면역 조절제나 연구용 시약으로서 유용하다. 한편, 결합 활성을 증대시킨 시험 물질은, 조직 손상이나 감염증의 치료 약물의 후보로서 유용하다.
(II) 민클과 FcRγ 의 상호작용을 조절하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 또한, 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서, 민클 또는 세포외 및 막관통 영역을 포함하는 이의 단편과 FcRγ 를 모두 발현하는 세포에서의, 민클 또는 이의 단편과 FcRγ 와의 상호작용의 정도를 측정 및 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 스크리닝 방법에서 사용되는 민클 및 FcRγ 단백질은, 상기 본 발명의 의약품에 관한 설명에서 기재되었던 바와 같다. 민클에 관해, 이의 전체 길이를 사용할 수 있거나, 세포외 영역 및 막관통 영역 (SEQ ID NO:2 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 번호 22 내지 219 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 영역) 을 포함하는 이의 단편을 사용할 수 있다. FcRγ 단백질에 대해서도, 민클과의 결합 및 세포내 신호전달에 관여하는 영역을 포함하는 한, 이의 단편을 사용할 수 있다. 이하, 다르게 나타내지 않는 한, 용어 민클 및 FcRγ 는 상기의 기능적 단편을 포함하는 의미로 사용될 것이다.
보다 구체적으로는, 이러한 스크리닝 방법은 하기의 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함한다:
(a) 시험 물질과, 민클 및 FcRγ 를 발현하고 이의 상호작용에 의해 전달되는 신호 ("활성화 신호" 라고 칭함) 를 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 단계,
(b) 시험 물질을 접촉시킨 세포에서의 활성화 신호의 수준을 측정하고, 그 수준을 시험 물질을 접촉시키지 않는 대조 세포에서의 활성화 신호의 수준과 비교하는 단계, 및
(c) 상기 (b) 의 비교 결과에 기초하여, 염증 반응을 조절하는 시험 물질을 선택하는 단계.
단계 (a) 에서, 사용되는 시험 물질은 상기 기재된 바와 같다. 민클 및 FcRγ 를 발현하는 세포는, 내재성 민클 및 FcRγ 를 갖는 세포일 수 있거나, 이의 어느 하나 또는 둘 모두를 혼입하는 형질전환된 세포일 수 있다. 민클 및 FcRγ 를 내재적으로 발현하는 세포로서, 포유 동물로부터 단리한 흉선 세포, 대식세포, 수상 세포, 신경교세포, 쿠퍼 세포, 신경절 세포 등이 언급될 수 있다. 형질전환된 세포의 경우, 숙주 세포의 예에는 H4IIE-C3 세포, HepG2 세포, 293T 세포, HEK293 세포, COS7 세포, 2B4T 세포, CHO, MCF-7 세포 및 H295R 세포와 같은 동물 세포가 포함된다. 민클 및 FcRγ 를 인코딩하는 핵산은, 스크리닝 방법 (I) 에서 상기와 같은 동일한 방법으로 단백질을 단리하고, 이를 숙주 세포 내에서 기능할 수 있는 프로모터를 갖는 발현 벡터에 삽입하고, 예를 들어, 인산 칼슘 공침법, PEG 법, 전기천공법, 현미주사법, 리포펙션법 등에 의해 이 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 제작될 수 있다.
시험 물질과 상기 세포와의 접촉은, 예를 들어, 그 세포의 배양에 적절한 배지 (예를 들어, 약 5 내지 20% 소 태아 혈청을 포함하는 최소 필수 배지 (MEM), 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM), RPMI 1640 배지, 199 배지, F12 배지 등) 및 각종 완충액 (예를 들어, HEPES 완충액, 인산 완충액, 인산 완충 생리 식염수, Tris-염산 완충액, 보레이트 완충액, 아세테이트 완충액 등) 에 시험 물질을 첨가하고, 세포를 일정 시간 인큐베이션함으로써 실시될 수 있다. 첨가되는 시험 물질의 농도는 화합물의 선택 (용해성, 독성 등) 에 따라 가변적이며, 예를 들어, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 인큐베이션 시간은, 예를 들어 약 10 분 내지 약 24 시간이다.
단계 (b) 에서, 활성화 신호 수준의 측정은, 그 신호의 결과로서 유도되는 세포의 반응을 측정함으로써 수행된다.
예를 들어, 활성화 신호의 측정은 민클 및 FcRγ 를 통한 신호전달 경로의 하류에 위치하는 키나아제, 예를 들어 Syk, Erk, CARD9 등의 인산화를 정량함으로써 수행될 수 있다. 이들 분자의 인산화는, 세포 라이세이트에 대해, 각각의 인산화 산물에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅이나 ELISA 와 같은 면역검정법을 수행함으로써 정량될 수 있다. 이들 인산화 산물 특이적 항체는 시판되고 있다.
활성화 신호의 측정은, 상기 신호전달 경로의 활성화에 의해 생성되는 MIP-2, TNFα, IL-6, IL-8 및 IL-12 와 같은 염증성 사이토카인/케모카인을, 예를 들어, 그것들에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅이나 ELISA 와 같은 면역검정법에 의해 정량함으로써 수행될 수 있다.
한층 또 다른 바람직한 양태에서, 활성화 신호 수준은 민클 및 FcRγ 를 통한 신호전달에 의해 활성화되는 전사 인자가 결합할 수 있는 염기 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 발현을 지표로서 측정될 수 있다. 그러한 전사 인자는, 예를 들어 NFAT, FB 등을 포함한다. 이들 전사 인자가 결합하는 공통 (consensus) 시스-서열은 당업계에 널리 알려져 있다. 시스-서열을 포함하는 프로모터의 하류에 리포터 단백질 (예를 들어, 루시페라아제, GFP, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 등) 을 인코딩하는 DNA 가 연결된 발현 벡터를, 민클 및 FcRγ 를 발현하는 세포에 도입하여, 상기와 동일한 방법에 의해 활성화 신호에 의해 시스-서열을 활성화하는 전사 인자가 활성화되면 리포터 단백질의 발현이 유도되므로; 이를 측정함으로써 활성화 신호 수준을 정량할 수 있다.
단계 (b) 에서, 활성화 신호 수준의 비교는 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서의 활성화 신호 수준에 있어서의 유의차의 유무에 기초하여 수행된다. 또한, 시험 물질을 접촉시키지 않는 대조 세포에서의 활성화 신호 수준이, 시험 물질을 접촉시킨 세포에서의 활성화 신호 수준의 측정 전 또는 동시에 측정된 발현량일 수 있으나, 실험적 정밀도 및 재현성의 관점으로부터, 동시에 측정한 발현량인 것이 바람직하다.
단계 (c) 에서, 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 통한 활성화 신호 수준을 저하 또는 증대시키는 시험 물질이 선택된다. 활성화 신호 수준을 저하시킨 시험 물질은, 항-염증성 물질, 특히 염증성 질환의 예방/치료 약물의 후보로서 유용하다. 또한, 면역 조절제나 연구용 시약으로서도 유용하다. 한편, 활성화 신호 수준을 증대시킨 시험 물질은, 조직 손상이나 감염증의 치료 약물의 후보로서 유용하다.
(III) 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 조절하는 물질의 스크리닝 방법
상기 스크리닝 방법 (II) 에서, 시험 물질과 세포와의 접촉을, SAP130 의 존재 하에서 수행함으로써, 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 조절하는 물질에 추가적으로, 민클과 SAP130 과의 상호작용을 조절하는 물질을 스크리닝하는 것이 가능하다. 이러한 스크리닝 방법에서도, 마찬가지로, 활성화 신호 수준을 저하시킨 시험 물질은 항-염증성 물질, 특히 염증성 질환의 예방/치료 약물의 후보로서 선택된다. 한편, 활성화 신호 수준을 증대시킨 시험 물질은, 조직 손상이나 감염증의 치료 약물의 후보로서 선택된다. 선택된 물질이 민클과 SAP130, 또는 민클과 FcRγ 의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부는, 예를 들어 상기 스크리닝 방법 (I) 또는 (II) 을 병용함으로써 확인할 수 있다.
(IV) 민클의 발현을 조절하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 또한, 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서, 민클을 생성하는 세포에서의 민클 단백질 또는 이를 인코딩하는 mRNA 의 양을 측정 및 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 민클의 발현을 조절하는 물질에 대한 본 발명의 스크리닝 방법은, 하기 단계 (a), (b) 및 (c) 를 포함한다:
(a) 시험 물질과, 민클의 발현을 측정할 수 있는 세포를 접촉시키는 단계,
(b) 시험 물질을 접촉시킨 세포에서의 민클의 발현량을 측정하고, 그 발현량을 시험 물질을 접촉시키지 않는 대조 세포에서의 민클의 발현량과 비교하는 단계, 및
(c) 상기 (b) 의 비교 결과에 기초하여, 민클의 발현량을 감소시키는 시험 물질을 선택하는 단계.
단계 (a) 에서, 시험 물질은 상기 기재된 바와 같다. 민클의 발현을 측정할 수 있는 세포로서, 내재성 및 외래성을 불문하고 민클을 발현하는 모든 배양 세포, 또는 민클 유전자의 내재성 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자를 포함하는 세포 등이 언급될 수 있다. 배양 세포에서 이들 유전자가 발현하고 있는지의 여부는, 공지된 노던 블로팅법이나 RT-PCR 법에 의해 이들 유전자 발현을 검출함으로써, 용이하게 측정될 수 있다.
민클의 발현을 측정할 수 있는 세포는, 비인간 포유 동물로부터 단리한 민클을 생성하는 조직 또는 기관, 또는 비인간 포유 동물 개체의 형태로 공급될 수 있다. 대안적으로는, 상기 세포는 민클 유전자의 내재성 프로모터의 제어 하에 있는 리포터 유전자를 혼입하는 트랜스제닉 동물의 세포, 조직, 기관 또는 개체일 수 있다.
세포가 배양 세포, 단리된 조직 또는 기관 등의 형태로 공급되는 경우, 시험 물질과 세포와의 접촉은, 상기와 같이 수행될 수 있다. 한편, 세포가 동물 개체의 형태로 공급되는 경우, 시험 물질과 세포와의 접촉은, 그 동물에 대한 시험 물질의 투여에 의해 수행된다. 투여 경로는 특별히 제한되지 않으며; 예를 들어, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 복강내 투여, 경구 투여, 기도내 투여, 직장 투여 등이 언급될 수 있다. 투여량도 특별히 제한은 없으며; 예를 들어, 1 회량으로 약 0.5 내지 20 mg/kg 를 1 일 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 1 내지 3 회로, 1 내지 14 일간 투여할 수 있다.
단계 (b) 에서, 민클의 발현량의 측정은, mRNA 또는 단백질에 대해 수행된다. mRNA 의 발현량은, 예를 들어, 세포로부터 총 RNA 를 제조하고, RT-PCR, 노던 블로팅 등을 수행하여 측정된다. 단백질의 발현량은, 예를 들어, 세포로부터 추출액을 제조하고, 면역학적 기술을 수행하여 측정될 수 있다. 유용한 면역학적 기술은 웨스턴 블롯법, 방사성 동위 원소 면역 검정법 (RIA 법), ELISA 법, 형광 항체법 등을 포함한다. 민클 유전자 프로모터의 하류에 연결된 리포터 유전자를 포함하는 세포 (예를 들어, 루시페라아제, GFP) 를 사용하는 경우, 발현량은 리포터 단백질의 신호 강도에 근거해 측정된다.
하기 실시예에서 나타내는 바와 같이, SAP130 의 존재에 의해 민클 유전자의 발현이 유도된다. 따라서, 단계 (a) 에서, 시험 물질과 세포와의 접촉을, SAP130 의 존재 하에서 수행함으로써, SAP130 의 자극에 의해 유도되는 민클 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있다. 단계 (a) 에서 SAP130 을 공존시키는 방법으로서는, 세포가 배양 세포 등의 형태로 제공되는 경우 SAP130 의 배지로의 첨가가 언급될 수 있지만; 방사선 조사 등에 의해 비항상성 세포사 유도된 세포의 첨가나, 민클의 발현을 측정할 수 있는 세포에게 적당량의 방사선을 조사하는 것 등에 의해, 부분적으로 세포사를 유도함으로써 실시될 수도 있다. 한편, 세포가 동물 개체의 형태로 제공되는 경우에는, 그 동물에 방사선을 조사하는 것 등에 의해, 부분적으로 세포사를 유도함으로써 SAP130 을 제공할 수 있다.
분석물로서 RNA 를 이용하는 경우, 구체적으로는, 본 발명의 스크리닝 방법은 민클 유전자 서열에 기초하여 공지된 방법에 의해 프라이머 또는 프로브를 제작하고, 노던 블로팅법, RT-PCR 법, DNA 칩 분석, 제자리 (in situ) 하이브리드화 분석법 등에 의해 상기 질환 마커에 대한 RNA 또는 이의 전사물의 결합량이 증가하는 것을 지표로서 검출함으로써 수행될 수 있다.
노던 블로팅법을 이용하는 경우에는, 본 발명의 상기 프로브를 사용하는 것에 의해, 민클 유전자의 발현의 유무 및 발현 수준을 검출하고 측정할 수 있다. 구체적으로는, 상기 프로브 (상보적 가닥) 를 방사성 동위 원소 (RI), 형광 물질 등으로 표지하고, 이를 통상적인 방법에 따라 나일론 멤브레인 등에 미리 옮긴 상기 세포 유래의 RNA 와 하이브리드화시킨 후, 생성된 상기 프로브 (DNA) 와 RNA 와의 이중 가닥에서의 질환 마커의 표지물 (RI 또는 형광 물질) 로부터의 신호를 방사선 검출기 (BAS-1800II, FUJIFILM Corporation 사제) 또는 형광 검출기로 검출 및 측정하는 방법을 예로서 언급할 수 있다. 또한, Alk Phos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharamcia Biotech Company 사제) 을 사용하여 그 프로토콜에 따라 상기 프로브 (프로브 DNA) 를 표지하고, 대상의 생체 조직 유래의 RNA 와 하이브리드화시킨 후, 질환 마커의 표지물로부터의 신호를 multibioimager STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech Company 사제) 로 검출 및 측정하는 것을 포함하는 방법을 사용할 수도 있다.
RT-PCR 법을 이용하는 경우에는, 민클 유전자의 염기 서열에서 연속하는 15 개 이상의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 사용함으로써, RNA 에서의 민클 유전자의 발현의 유무나 발현 수준을 검출 및 측정할 수 있다. 구체적으로는, 상기 세포의 RNA 로부터 통상적인 방법에 따라 cDNA 를 제조하여, 이것을 주형으로서 민클 유전자의 표적 영역을 증폭할 수 있도록 제조된 1 쌍의 프라이머 (상기 cDNA (-가닥) 에 결합하는 정가닥, +가닥에 결합하는 역가닥) 와 하이브리드화시켜, 통상적인 방법에 따라 PCR 법을 수행하고, 생성된 증폭 이중 가닥 DNA 를 검출하는 방법을 예로서 언급할 수 있다. 증폭된 이중 가닥 DNA 의 검출은, 상기 PCR 을 미리 RI 나 형광 물질로 표지해 둔 프라이머를 사용하여 수행함으로써 생성되는 표지된 이중 가닥 DNA 를 검출하는 것을 포함하는 방법, 생성된 이중 가닥 DNA 를 통상적인 방법에 따라 나일론 멤브레인 등에 옮기고 표지한 질환 마커를 프로브로서 사용하여 이를 DNA 와 하이브리드화시키고 검출하는 것을 포함하는 방법 등에 의해 이루어질 수 있다. 생성된 표지 이중 가닥 DNA 산물은 Agilent 2100 bioanalyzer (Yokogawa Analytical Systems Comapny 사제) 등을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, SYBR Green RT-PCR 시약 (Applied Biosystems 사제) 으로 그 프로토콜에 따라 RT-PCR 반응액을 제조하여, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 사제) 을 사용하여 반응을 실행하고 그 반응물을 검출할 수도 있다.
DNA 칩 분석법을 이용하는 경우에는, 민클 유전자 부분 서열을 DNA 프로브 (단일 가닥 또는 이중 가닥) 로서 결합시킨 DNA 칩을 제조하여, 예를 들어, 상기 세포 유래의 RNA 로부터 통상적인 방법에 따라 제조되고 비오틴으로 표지된 cRNA 와 하이브리드화시키고, 생성된 DNA 와 cRNA 와의 이중 가닥을 형광 표지된 아비딘을 사용하여 검출하는 것을 포함하는 방법이 언급될 수 있다.
제자리 (In situ) 하이브리드화법을 이용하는 경우에는, 전술한 상기 세포를 고정 및 포매하고, 절편을 제조한다. 민클 유전자의 특이적 안티센스 프로브 또는 센스 프로브를 제작한다. 상기 프로브는, RI 마커 또는 비-RI 마커 (예를 들어, DIG 마커) 로 표지된다. 상기 절편을 탈파라핀 (파라핀 절편의 경우) 및 전처리한 후, 에탄올 등으로 고정시킨다. 고정된 절편을 전-하이브리드화시키고 상기 프로브와 하이브리드화시킨 후, 세정 및 RNase 처리를 수행하고, 마커에 적합한 검출 방법 (예를 들어, RI 마커의 경우에는 현상, 비-RI 마커의 경우에는 면역학적 검출과 현미경 검사) 에 의해 생체 조직에서의 민클 유전자의 발현의 유무나 이의 발현 수준을 검출 및 측정할 수 있다.
분석물로서 단백질을 이용하는 경우, 구체적으로는, 본 발명의 스크리닝 방법은 항-민클 항체를 사용하여 웨스턴 블롯법, 방사성 동위 원소 면역 검정법 (RIA 법), ELISA 법, 형광 항체법, 면역 세포 염색법 등에 의해 상기 항체에 대한 단백질의 결합량의 증대를 지표로서 확인함으로써 수행될 수 있다.
웨스턴 블롯법을 이용하는 경우에는, 이는 1 차 항체로서 항-민클 항체를 사용한 후, 125I 와 같은 방사성 동위 원소, 형광 물질, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 와 같은 효소 등으로 표지된 2 차 항체 (1 차 항체에 결합하는 항체) 를 사용하여 수득된 표지 화합물의 방사성 동위 원소, 형광 물질 등으로부터의 신호를, 방사선 측정기 (BAS-1800II: FUJIFILM Corporation 사제 등), 형광 검출기 등을 사용하여 검출 및 측정함으로써 수행될 수 있다. 또한, 1 차 항체로서 항-민클 항체를 사용한 후, ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech Company 사제) 을 사용하여, 그 프로토콜에 따라 항체를 검출하고, multibioimager STORM860 (Amersham Pharmacia Biotech Company 사제) 을 사용하여 항체를 측정할 수도 있다.
면역 세포 염색법을 이용하는 경우에는, 민클 양성 세포는 하기 실시예 4 에 기재된 방법에 따라, 예를 들어, 효소 표지 항체와 이의 발색 기질을 사용하여 측정될 수 있다.
단계 (b) 에서, 발현량의 비교는 시험 물질의 존재 하 또는 비존재 하에서 민클의 발현량에 있어서의 유의차의 유무에 기초하여 행해진다. 시험 물질을 접촉시키지 않는 대조 세포에서의 민클의 발현량은 시험 물질을 접촉시킨 세포에서의 민클의 발현량의 측정 이전 또는 동시에 측정한 발현량일 수 있으나, 실험적 정밀도 및 재현성의 관점으로부터, 동시에 측정한 발현량인 것이 바람직하다.
단계 (c) 에서, 민클의 발현을 저하 또는 증대시키는 시험 물질이 선택된다. 민클의 발현을 저하시킨 시험 물질은, 항-염증성 물질, 특히 염증성 질환의 예방/치료 약물의 후보로서 유용하다. 또한, 면역 조절제나 연구용 시약으로서 도 유용하다. 한편, 민클의 발현을 증대시킨 시험 물질은, 조직 손상이나 감염증의 치료 약물의 후보로서 유용하다.
상기 (I) 내지 (IV) 의 스크리닝 방법에 의해 선택된 물질을 함유하는 의약품은 저독성이며, 그대로 액체로서 또는 적당한 투약 형태의 의약 조성물로서 인간 또는 비인간 포유 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에게 경구적 또는 비경구적 (예를 들어, 혈관내 투여, 피하 투여 등) 으로 투여될 수 있다. 투여에 사용되는 의약 조성물은, 선택된 물질과 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 모두 함유할 수 있다. 이와 같은 의약 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 적절한 투약 형태로서 공급된다. 약리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제로서는, 상기 기재된 것들이 사용될 수 있다.
상기 의약품의 투여량은, 투여 대상, 표적 질환, 증상, 투여 경로 등에 따라 가변적이며; 예를 들어, 성인 류머티스 관절염의 치료/예방을 위해 사용하는 경우, 활성 성분을 1 회량을 기준으로 통상 약 0.01 내지 20 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/kg 체중을, 1 일 약 1 내지 5 회, 바람직하게는 1 일 약 1 내지 3 회로, 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 편리하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우에도 유사한 투여량을 투여할 수 있다. 증상이 특히 중증인 경우에는, 그 증상에 따라 투여량을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 대상 동물로부터 채취한 샘플 내의 SAP130 량을 측정하는 것을 포함하는, 비항상성 세포사의 검출 방법을 제공한다.
대상 동물에는, 인간 또는 다른 포유 동물, 바람직하게는 인간, 또는 실험 동물로서 범용되는 마우스, 래트, 토끼, 개 및 원숭이가 포함된다. 측정 대상 샘플로서는, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 점막, 소변, 눈물, 정액 및 관절액이 언급될 수 있다.
샘플 내의 SAP130 량은, 예를 들어, 항-SAP130 항체, 민클, 또는 SAP130 과의 결합에 관여하는 영역을 포함하는 이의 단편을 사용하여 측정될 수 있다. 구체적으로는, SAP 는, 예를 들어 제 1 의 항-SAP130 항체 또는 민클 또는 이의 단편을 고정시킨 반응 용기 (마이크로타이터 플레이트 등) 에 샘플액을 첨가하고, 용기를 일정 시간 인큐베이션한 후, 액상을 제거하고, 표지된 제 2 의 항-SAP 항체 또는 항-민클 항체를 첨가하고, 고상에 결합한 표지량을 측정함으로써 정량될 수 있다. 유용한 표지제의 예에는, 방사성 동위 원소 (예를 들어, [125I], [131I], [3H], [14C] 등), 효소 (예를 들어, β-갈락토시다아제,β-글루코시다아제, 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말레이트 데히드로게나아제), 형광 물질 (예를 들어, 플루오레스카민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등), 발광 물질 (예를 들어, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등) 등이 포함된다.
상기의 방법 이외에도, 다른 면역학적 기술, 표면 플라스몬 공명 등을 사용하여 샘플 내의 SAP130 량을 측정할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.
상기 측정의 결과로서, 대상 동물로부터 채취한 샘플 내의 SAP130 량이 정상 대조군으로부터 채취한 샘플 내의 SAP130 량과 비교해 유의하게 높은 경우, 상기 대상 동물 체내에서 비항상성 세포사가 발생하고 있다고 판단할 수 있다.
실시예
하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 결코 한정되지 않는다.
[방법]
마우스
C57BL/6 (B6) 마우스를 Clea Japan 으로부터 구입하였다. B6 백그라운드 FcRγ-/- 마우스를 [Park, S.Y. et al., J Clin Invest 102, 1229-38 (1998)] 에 기재된 바와 같이 확립하였다. CARD9-/- 마우스를 [Hara, H. et al., Nat Immunol 8, 619-29 (2007)] 에 기재된 바와 같이 확립하고, B6 과 6 회 역교배하였다. B6 백그라운드 MyD88-/- 마우스를 S. Akira (Osaka University) 에 의해 공급받았다. FcγRI-/- 및 FcγRIII-/- 마우스를 J. S. Verbeek (Leiden University) 에 의해 공급받았다. 모든 마우스를 공기 필터의 층류가 있는 사육 선반에서 유지시키고, 표준 식이 및 물을 자유 섭취시켰다. 모든 동물 실험을 시설 가이드 라인에 따라 수행하였다.
구축
민클 cDNA 를 PCR 로 클로닝하고, pMX-IRES-hCD8 vectors 50 에 삽입하였다. 민클-Flag 를, 이전에 기재된 바와 같은 프라이머 (Matsumoto, M. et al., J Immunol 163, 5039-48 (1999)) 를 사용하여 제작하였다. Ig-민클 융합 단백질을 구축하기 위해서, 마우스 민클의 세포외 도메인 (아미노산 46-214) 을 hIgG Fc 에 융합시켰다. SAP130 cDNA 를 PCR 로 클로닝하고, pcDNA3.1-V5-His-TOPO (Invitrogen) 에 삽입하였다.
항체
토끼 항-민클 다클론 항체를 마우스 민클의 세포질측 영역에 상응하는 펩티드 (아미노산 1-16) 에 대해 제작하였다. 항-포스포-Erk Ab 는 Promega 로부터, 항-포스포-Syk 는 Cell Signaling Technology 로부터, 항-인간 IgG-HRP 및 단백질 G 세파로오스는 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) 로부터, 항-래트 IgG-HRP 는 Zymed 로부터, 항-래트 IgG-PE 는 Jackson Immunoresearch 로부터, 항-히스톤-H1 및 항-SAP145 는 Santa Cruz 로부터, 항-SAP49 는 Abcam 으로부터, 항-SAP130 은 Novus Biologicals 로부터, SAP155 는 MBL 로부터, 항-DDB1 은 BD Biosciences 로부터, 그리고 항-Flag 는 Sigma 로부터 구입하였다.
세포 자극
티오글리콜레이트로 유도한 복막 대식세포를 항-민클 및 마우스 항-래트 IgAb 로 자극하였다. 세포를 1% Nonidet P-40 용해 완충액으로 용해하고; 면역 침강 및 웨스턴 블롯을 이전에 기재한 바와 같이 수행하였다 (Yamasaki, S. et al., Nat Immunol 7, 67-75 (2006)). LPS (L4516) 및 zymosan (Z4250) 은 SIGMA 로부터 구입하였다.
Ig-민클의 제조
민클의 세포외 도메인 (아미노산 46-214) 을, PCR 에 의해 종결 코돈이 결여된 hIgG Fc 영역의 C-말단에 융합시키고, pME18S-SLAMsig-hIgG Fc 의 XhoI/NotI 단편에 삽입하였다. 293T 세포를 pME18S-SLAMsig-hIgG Fc (Ig) 또는 pME18S-SLAMsig-hIgG Fc-민클 (Ig-민클) 로 일시적으로 트랜스펙션하였다. 세포를 무-단백질 배지 (PFMH-II) 를 사용하여 배양하였다. 여과한 상청액을 단백질 A-세파로오스 컬럼에 적용하고; 결합한 획분을 50 mM 디에틸아민으로 용리하고, 즉시 Tris-HCl (pH 7.5) 로 중화하였다. 주획분을 PBS 로 투석하고, 이를 정제된 Ig 융합 용액으로서 사용하였다. 단백질의 분자량 및 정제도는 은 염색 및 항hIgG-HRP (Pierce) 를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 추측하였다. 류신-지퍼화 Fas-리간드 (FasL) 는 S. Nagata (Kyoto University) 에 의해 공급받았다.
분자 모델링
민클의 서열을 NCBI 서버로부터 취득하였다. 79 내지 214 번째 잔기 범위의 민클의 부분 서열을 추출하고, 상동성 모델링의 일반적 방법을 사용하여 이의 삼차원 구조를 예측하였다. DC-SIGN (PDB-엔트리: 1 nfd) 의 결정 구조를 Protein Data Bank (PDB) 로부터 상동성 모델을 생성하기 위한 주형으로서 취하였다. 민클의 부분 서열을, NW 정렬을 사용하여 주형 단백질과 정렬시켰다. 적절한 정렬이 수득되도록, 민클 중의 갭 및 Cys 잔기를 주형 중의 상응하는 Cys 잔기의 위치로 수동으로 대체하였다. 적절한 정렬을 달성하고, 표적 단백질 내의 주쇄의 원자를 DC-SIGN 의 주형 단백질 내의 상응하는 잔기의 좌표에 배정하였다. 루프 영역 내의 삽입 및 결실을, 공지된 구조를 갖는 단백질의 단편으로부터 만들어진 단편 데이터베이스로부터 적합한 구조를 찾는 것에 의해 모델링하였다. Metropolis Monte Carlo 법을 사용하여 민클 모델의 골격에 측쇄를 구축하였다. 구조를 최적화하기 위해서, 2000 단계의 최적화를 분자 동력학 패키지 AMBER8 을 사용하여 최대 경사법으로 수행하였다.
도 1d 는 ViewerLite (Accelrys) 를 사용하여 생성되었다.
RT-PCR
게놈 DNA 를 DNase (Wako Nippon Gene) 처리에 의해 제거한 후, reverse transcriptase II (Invitrogen) 를 사용하여 랜덤 프라이머로 cDNA 가닥을 생성하였다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여, 실시간 PCR 에 의해 RNA 의 발현을 정량하고, 값을 β-액틴의 발현으로 정규화하였다. 유전자 특이적 프라이머 서열은 하기와 같다.
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통계학
모든 통계 분석은 비쌍 상관 분석 스튜던트 t 검정 (unpaired two-tailed Student＇s t-test) 을 사용하여 수행하였다.
[실시예 1]
마우스 민클을 발현하는 래트 호염기구성 백혈병 (RBL-2H3) 세포로 Wistar 래트를 면역화하여 항-민클 단일클론 항체를 확립하였다. 민클-IRES-GFP 를 발현하는 2B4 세포를 염색함으로써 클로닝된 하이브리도마의 상청액을 스크리닝하였다. 3 개의 독립 클론 1B6 (IgG1, κ), 4A9 (IgG1, κ) 및 6E2 (IgG2c, κ) 를 분석하고 (도 1), 본 연구에 사용하였다. 각각의 단일클론 항체에서의 엔도톡신 수준은 1 EU/㎖ (Limulus Color KY Test, Wako) 미만이었다. 단일클론 항체의 비오틴화를 EZ-link biotinylation kit (Pearce) 를 사용하여 수행하였다 (도 1).
항-민클 단일클론 항체의 에피토프 맵핑을 펩티드-기준 ELISA 로 수행하였다. 민클의 세포외 도메인 (길이 13 a.a, 중복 11 a.a.) 을 감싸는 79 의 비오틴화 펩티드를 JPT Peptide Technologies 에 의해 합성하였다. 각 펩티드를 0.5 nM 로, 스트렙타비딘-코팅한 멀티웰 플레이트 (PerkinElmer) 에 결합시켰다. 1 ㎍/㎖ BSA 로 블로킹한 후, 10 ㎍/㎖ 래트 IgG 및 각각의 항-민클 단일클론 항체를 첨가하였다. 플레이트 세정 후, 1 ㎍/㎖ 항-래트 IgG-HRP 를 첨가하고, TMBZ 퍼옥시다아제 기질 (SUMILON) 을 사용하여 발색을 수행하였다 (도 1).
[실시예 2]
마우스, 래트 및 인간 민클의 아미노산 서열의 정렬로부터, 막관통 도메인 내에 보존된 아르기닌 잔기가 존재한다는 것이 발견되었다 (도 2a). 다른 면역 수용체에 대해 기재한 바와 같이, 이러한 막관통 부분 내의 양전하 잔기의 존재로 인해, 민클이 ITAM-함유 어댑터 분자 (FcRγ, DAP10, DAP12 및 CD3ζ) 와 상호작용하는 것이 시사된다. 민클이 이들의 서브유닛 중 어떤 것에 결합할 수 있는지를 측정하기 위해, 민클을, 이들의 어댑터와 함께 293T 에 트랜스펙션하였다. 새롭게 확립된 항-민클 항체 (도 1) 를 사용하는 면역 침강 및 웨스턴 블롯 분석에 의해, 민클은 FcRγ 와 선택적으로 결합하지만 DAP10, DAP12 및 CD3ζ 와는 결합하지 않는다는 것을 발견하였다 (도 2b 및 데이터 생략). 중요하게, 내생성 민클과 FcRγ 와의 결합은 또한 마우스 복막 대식세포에서도 분명하였다 (도 2c). 이후, 인간 민클 또한 FcRγ 와 결합하는 것을 확인하였다 (데이터 생략). 민클과 FcRγ 와의 상호작용은 민클의 막관통 영역 내의 Arg42 (R42) 잔기에 의해 매개되었다. 이것은, 상호 면역 침강에 의해 입증된 바와 같이 (도 2d), R42I (양전하로부터 중성으로) 의 변이가 FcRγ 와의 결합이 없어지게 하기 때문이다. 이러한 결합은, 민클에 의한 신호전달에 중요한 것으로 보인다. 이것은, 민클 및 FcRγ 를 T 세포 하이브리도마에 이소 발현 (ectopically expression) 시키는 경우, 민클 가교에 의해 유도된 IL-2 생성이 R42 에 의존적으로 되기 때문이다 (도 2e). 민클은 이의 세포질측 영역에 잠재적인 세린/트레오닌 인산화 부위를 가지며; C-말단 측 테일 부분이 결여된 민클의 결실 변이체 (민클Δ2-18) 는 동일한 계에서의 신호전달 능력을 감소시키지 않았다 (데이터 생략). 이들 결과로부터, 민클이 FcRγ 를 통한 신호전달을 할 수 있다는 것이 시사되었다.
[실시예 3]
다음으로, 내생성 민클이 활성화 신호를 변환할 수 있는지 여부를 측정하기 위해서, 티오글리콜레이트로 유도한 복막 대식세포를 항-민클 항체로 자극하였다. 고정된 항-민클은 TNFα, MIP-2 (CXCL2) (도 3a), KC (CXCL1) 및 IL-6 (데이터 생략) 의 생성을 유도하였으나 대조 IgG 에서는 그렇지 않았다. 염증성 사이토카인의 민클-유도성 생성은 FcRγ-/- 세포에서 존재하지 않았으나, FcRγ-비의존성 LPS 자극으로, 필적하는 양의 사이토카인이 유도되었다 (도 3b). TLR 신호전달에 중요한 어댑터인 MyD88 은 민클을 통한 사이토카인 생성에는 필수적이지 않았다 (도 3b). 이는, 민클이 대식세포로의 활성화 신호를 FcRγ-의존적으로 변환시킨다는 것을 의미한다.
다음으로, 민클 자극 시에 생성되는 기부 신호를 조사하였다. 복막 대식세포에서, 키나아제 Syk 및 Erk 를 포함하는 세포 단백질의 인산화가 민클 가교에 의해 유도되었다 (도 3c). 많은 면역 수용체 중에서 Syk 는 인산화 ITAM 에 직접 결합하여, 다수의 하류 기질의 인산화를 유도하였다. 따라서, 항-민클 단일클론 항체에 의한 총체적인 티로신 인산화의 유도가 FcRγ-/- 대식세포에서는 현저하게 억제되었으며 (도 3d, 오른쪽 레인); 이는 민클이 하류 신호를 유도하기 위해서 FcRγ-Syk 캐스케이드를 이용하는 것을 시사한다. 항-민클을 통한 인산화는 FcRγ-/- 대식세포에서 감소되지만, FcγRI/III (CD64/16) 이중 결손 대식세포에서는 여전히 관찰된다 (도 3d, 왼쪽 레인). 이러한 발견은 항-민클이 Fcγ수용체 (FcγR) 와는 관계없이, 민클-FcRγ 복합체를 통한 직접 신호전달에 관여하는 것을 시사하였다.
최근, 어댑터 분자 CARD9 가 Syk 를 염증 반응과 연결시키는데 필수적인 것이 나타났다. 이러한 이유로, 야생형, FcRγ-/- 및 CARD9-/- 마우스 대식세포에서 항-민클에 의해 유도되는 반응을 비교하였다. 민클에 의해 유도되는 MIP-2 의 생성은 CARD9-/- 복막 대식세포에서, FcRγ-/- 세포에서와 동일한 정도로 감소되었다 (도 3e).
민클 신호전달에 대해 골수 유래의 대식세포 (BMMφ) 를 또한 시험하였다. 복막 대식세포와 일치하여, 활성화 BMMφ 에서의 민클-매개성 MIP-2 생성 (도 3f) 및 Syk 활성화 (도 3g) 는 MyD88 보다는 FcRγ 에 의존적이었다. 이들 결과에 의해, 민클이 FcRγ-Syk-CARD9 신호전달 축을 통해 대식세포를 활성화하는 것이 시사되었다.
[실시예 4]
민클의 표면 발현에 FcRγ 가 본질적으로 필요하지 않지만 (데이터 생략), LPS-유도성의 내생성 민클의 표면 발현의 증강은 야생형보다 FcRγ-/- BMMφ 에서 더 약하였다. 그러나 흥미롭게도, 이러한 상승은 MyD88 에 비의존성인 것으로 발견되었다 (도 4).
[실시예 5]
다음으로, 민클의 생리학적 리간드를 발견하고자 시도하였다. 골수성 세포에 의한 염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비는 리간드 후보에 대한 스크리닝에 사용될 수 있는 가능성이 있는 지표이다. 그러나, 이러한 사이토카인 및 케모카인은 또한 TLR 자극시 대량으로 생성된다. 따라서, 추정상의 민클의 리간드를 오염시킬 수 있는 TLR 의 리간드와 구별하기 위해서, 비골수성 T 세포 하이브리도마를 숙주 세포로서 사용하고, NFAT-GFP 리포터를 ITAM-매개성 신호의 특이적 검출 수단으로서 이용하였다.
민클, FcRγ 및 NFAT-GFP 리포터를 공동발현하는 T 세포 하이브리도마를 확립하였다. 가용성 항-민클은 GFP 발현에 영향을 주지는 않았으나 (데이터 생략), 플레이트에 코팅된 항-민클에 의한 민클의 가교로 인해 격렬한 GFP 발현이 유도되었다 (도 5a). 예상했던 바와 같이, LPS 나 zymosan 과 같은 TLR 리간드로는 GFP 유도가 관찰되지 않았다 (데이터 생략).
흥미롭게도, 세포를 3 내지 4 일간 배지 교환 없이 배양했을 경우, NFAT-GFP 발현이 현저하게 유도되는 것을 발견하였다 (도 5b, 첫 번째 패널). 이 배양 기간 중, 사멸하는 세포의 수가 증가하였고, 동시에 GFP+ 의 집단이 증가하였다 (도 5b, c). FcRγ 만을 발현하며 민클은 발현하지 않는 세포에서는, GFP 의 발현은 관찰되지 않았고 (데이터 생략), NFAT 활성화는 가용성 항-민클 단일클론 항체에 의해 거의 완전하게 저해되었다 (도 5b, 하 패널). 이들 결과에 의해, 사멸 세포 유래의 성분이 민클을 통한 신호전달에 관여할 수 있다는 것이 시사되었다.
이 가설과 일치하여, 일부 GFP+ 세포가 프로피듐 요오디드 (PI)-양성의 사멸 세포에 결합한 상태로 관찰되었다 (도 5c). 트포이소메라아제 II 저해제 에토포시드는 DNA 손상을 유도함으로써 세포사를 촉진한다. 심지어 에토포시드 처리한 사멸 세포를 단순하게 첨가해도, 민클 발현성 세포를 활성화시킬 수 있었다 (도 5d). 이들 결과로부터, 명확하지 않은 민클의 리간드가 세포사 동안에 생성 및/또는 방출되는 것이 시사되었다.
민클은, 잘 연구된 만노오스 결합 모티프인 EPN 모티프를 이의 C-유형 렉틴 도메인 내에 포함한다. 민클에 의한 사멸 세포의 인식이 만노오스 또는 관련된 탄화수소를 관여시키는지 여부를 측정하기 위해서, 민클의 EPN 모티프를 변이시켜 QPD 모티프를 수득하였다. QPD 모티프는 갈락토오스에 선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. E169Q/N171D (민클 EPN->QPD) 를 갖는 변이형 민클은, 야생형과 마찬가지로, 여전히 사멸 세포에 반응하는 활성화 신호를 전달하였다. 이러한 발견으로, 민클이 탄화수소와는 관계없이 이의 리간드를 인식하는 것이 시사되었다 (도 5e). 확실히, 최근의 보고에 의해 C-유형 렉틴이 탄화수소 리간드와 마찬가지로 비탄화수소 리간드를 인식하는 것이 나타났다. 강력한 저해 단일클론 항체 1B6 에 의해 인식되는 에피토프의 VEGQW 서열이 결여된 민클의 변이체에서는 (도 1), NFAT 의 활성화가 소실된다 (도 5e). 이러한 발견으로, 이들 잔기가 사멸 세포 유래의 민클 리간드의 인식에 중요하다는 것이 시사되었다.
[실시예 6]
사멸 세포 유래의 민클 리간드를 더욱 검사하기 위해서, 가용성 민클 단백질을 구축하였다. 민클이 II 유형 막 단백질이기 때문에, 민클의 세포외 도메인을 인간 면역글로불린 G 의 Fc 도메인에 융합시켰다 (Ig-민클) (도 6a). 처음에, Ig-민클이 사멸 세포를 특이적으로 인식하는지 여부를 측정하기 위해 시험을 수행하였다. Ig-민클은 AnnexinV+ PI+ 흉선 (도 6b) 및 사멸 2B4 세포 (데이터 생략) 에 선택적으로 결합했으나, 대조 Ig 는 그렇지 않았다. 따라서, 사멸 세포가 민클 결합 단백질을 발현하는 것으로 보인다.
특히, 비록 Ca2 + 가 렉틴에 있어서 탄화수소계 리간드의 인식에 필수적인 것으로 알려져 있으나, Ig-민클은 Ca2 + 가 없어도 사멸 세포에 결합한다. 이러한 이유로, 민클 리간드의 후보를 찾기 위해, Ig-민클을 사용하여 Ca2 + 부재 하에서 사멸 세포의 라이세이트 내의 민클 결합 단백질을 스크리닝하였다. 재현할 수 있는 방법을 사용하여, Ig-민클에는 특이적으로 결합했지만 대조 Ig 에는 결합하지 않았던 130-kD 단백질 (p130) 을 발견하였다 (도 6c). 따라서, 사멸 세포의 라이세이트를 사용하여 일련의 컬럼 정제 절차에 의해 민클 결합 단백질을 정제하였다 (도 7). 질량 분석계 분석에 의해, p130 유래의 모든 10 펩티드가 U2 핵내 저분자 리보뉴클레오단백질 (snRNP) 24 의 성분인 스플라이오솜 (spliceosome)-결합 단백질 130 (SAP130, Sf3b3 으로서도 알려짐) 에 상응하는 것이 밝혀졌다 (도 6d).
SAP130 은 UV-손상된 DNA 에 결합하는 손상 DNA 결합 단백질 1 (DDB1) 에 현저하게 상동성이다. 그러나, 항-SAP130 을 사용하는 면역블로팅으로, Ig-민클이 SAP130 에 선택적으로 결합하며, DDB1 에는 결합하지 않는다는 것이 밝혀졌다 (도 6e). 사멸 세포로부터 분비되며 과잉 또는 비항상성 세포사에 대해 면역계에 경고하는 신호로서 작용하는 것으로 보고된 핵 단백질인 고이동성 그룹 박스 1 (high mobility group box 1 (HMGB1)) 은 여전히 민클 리간드의 또 다른 후보이다. 그러나, HMGB1 은 Ig-민클 (도 6e, f) 또는 활성화된 민클을 발현하는 NFAT-GFP (데이터 생략) 와 상호작용하지 않았다. 이들 결과로부터, SAP130 이 민클에 선택적으로 결합하는 것이 나타났다.
세포사 과정에서 발생하는 인산화, 글리코실화, 유비퀴틴화 및 메틸화와 같은 단백질 개질이, SAP130 의 민클에 결합하는 능력을 부여할 수 있을 가능성이 있다. 이러한 생각을 확인하기 위해, 생 세포 및 사멸 세포 유래의 SAP130 의 민클 결합 가능성을 비교하였다. 도 6f 는, 민클이 생 세포 및 사멸 세포 유래의 SAP130 에 동일하게 잘 결합하는 것을 나타낸다. 이는 과잉인 세포사에 대한 SAP130 신호가 단백질 개질 수준에서는 조절되지 않는 것을 암시한다.
SAP130 이 정상적인 생 세포 내의 핵에 국지화되어 있기 때문에, 세포사시 외부 환경으로의 SAP130 의 전위가 비항상성 세포사에 대한 경고 신호가 될 수 있다. 확실히, snRNP 의 다른 구성 성분인 Sm 단백질은 후기 아포토시스 (apoptosis) 또는 네크로시스 세포로부터 상청액으로 전위하는 것이 알려져 있다. 이러한 생각에 일치하여, 또 다른 전형적인 핵 단백질인 히스톤 H1 과 비교했을 경우, 상당량의 SAP130 이 사멸 세포로부터 방출되었다 (도 6g). SAP130 의 방출은 또한 Fas-리간드 (Fas-L) 유도성 세포사 동안 분명하였고, 프로피듐 요오디드 (PI)+ 후기 아포토시스/네크로시스 세포의 출현과 밀접하게 관련되었다 (도 6h).
[실시예 7]
사멸 세포를 생성하기 위해서 2B4T 세포 하이브리도마를 4 일간 배양하였다. 1×108 세포를 1% NP-40 용해 완충액 (1% NP-40, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 12.5 ㎍/㎖ 키모스타틴, 50 ㎍/㎖ 류펩틴, 25 ㎍/㎖ 펩스타틴 A, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드) 으로 용해하였다. Ig 및 Ig-민클 단백질을, 디메틸 피멜리미데이트 (Pierce) 및 에탄올아민을 사용하여 단백질 G 세파로오스 4 Fast Flow (Amersham Bioscience) 에 공유결합시켰다. 세포 라이세이트를 단백질 G 세파로오스를 통해 2 회 용리한 후, Ig-결합된 단백질 G 세파로오스를 통해 3 회 용리하였다. 관통형 (flowthrough) 획분을 Ig-민클-결합 단백질 G 세파로오스 컬럼에 적용하고, 컬럼을 용해 완충액으로 세정하였다. 결합 획분을 샘플 완충액으로 비등시켜 용리하고, SDS-PAGE 로 분리하고, 이후 PVDF 에 옮기고, Colloidal Gold Total Protein Stain (Bio-Rad) 으로 염색하였다. p130 에 상응하는 밴드를 잘라내고, Protein Research Network, Inc. 에서의 MALDI-TOF/MS 에 의해 분석하였다 (도 7).
포유 동물 세포로부터 SAP130 을 정제하기 위해서, V5-표지된 SAP130 을 293T 세포에서 발현시켜, 항-V5 아가로오스를 사용하여 세포 라이세이트로부터 정제하고, 이후 V5 펩티드로 용리하였다. 바큘로바이러스에서 발현시킨 SAP130 을 정제하기 위해서, SAP130 cDNA 를 pLP-BacPAK9-6xHN 바큘로바이러스 벡터 (Clontech) 에 삽입하여, Sf9 세포를 재조합 바큘로바이러스로 감염시켰다. 세포 상청액을 Q-세파로오스 Fast Flow (GE Healthcare) 및 TALON 금속 친화성 수지 (Clontech) 를 사용하여 정제하였다 (도 7).
[실시예 8]
다음으로, 정제 SAP130 이 민클 발현 세포를 활성화할 수 있는지 여부를 측정하였다. 포유 동물세포로부터 재조합 SAP130 을 정제하기 위해서, V5-표지된 SAP130 을 293T 세포에서 발현시켜, 항-V5-아가로오스를 사용하여 V5 펩티드와 함께 용리하고, 세포 라이세이트로부터 정제하였다. 플레이트에 코팅한 항-V5 상에서 SAP130-V5 로 복막 대식세포를 자극하는 경우, 상당량의 MIP-2 가 상청액 안에 분비되었다 (도 8a). 동일한 자극으로, 민클 및 FcRγ 를 발현하는 T 세포 하이브리도마로부터 IL-2 생성이 또한 유도되었다 (도 8b). 이러한 발견은, 정제된 단백질의 활성이, 오염시키는 엔도톡신으로 인한 것일 가능성이 최소한도로 작아졌다는 것을 나타낸다. 또한, SAP-130-V5 가 민클을 발현하지 않는 모세포에는 아무런 영향을 미치지 않는 것도 확인하였다 (도 8b). 더욱이, 민클 발현 세포에 의한 SAP130-V5-유발성 IL-2 생성이 가용성 항-민클 단일클론 항체에 의해 거의 완전하게 저해되었다 (도 8b). 이들 결과에 의해, SAP130 이 민클의 내생성 리간드로서 작용할 수 있다는 것이 시사되었다.
또한, 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 재조합 HN-표지된 SAP130 을 생성시켰다. 재조합 SAP130 은 대식세포에서의 MIP-2 생성을 위한 면역 자극 활성을 보유하였다 (도 8c).
이들 결과와 함께, SAP130 이 민클의 기능적 리간드인 것이 암시된다. SAP130 이 내생성 핵 단백질이기 때문에, 민클에 의한 SAP130 의 인식이 과잉 세포사의 발생에 대한 신호가 될 수 있다.
[실시예 9]
마지막으로, 생체내 민클의 생리학적 기능을 조사하였다. 여러 보고로, 감염이 없음에도 불구하고 과잉 또는 비항상성 세포사에 의해 염증성 세포의 일시적 침윤이 유도되는 것이 입증되었다. 이러한 현상을 연구하기 위한 모델계에는 마우스 전신 조사가 포함되며, 이는 피질 영역 내에서 CD4+CD8+ 이중-양성 (DP) 흉선 세포의 대량 사멸을 유도하고 (도 9a, b), 또한 결과적으로 호중구의 흉선으로의 일시적 침윤을 야기한다 (도 9b, 오른쪽 패널). p53-/- 마우스와 같은 DP 흉선 세포사를 거치지 않는 변이체 마우스에서는 침윤이 감소되는 것으로 보고되고 있으므로, 호중구의 이러한 침윤은 과잉 세포사의 결과인 것으로 보인다. 또한, DP 흉선 세포가 결여된 Rag2-/- 마우스에서와 같이, 아포토시스-저항성 Apaf1-/- 마우스에서 조사한 후 호중구의 침윤이 훨씬 적은 것도 확인하였다 (데이터 생략).
전신 조사 후, 민클 mRNA 가 급속히 상승하는 것을 발견하였다 (도 9c). 민클의 상승이 TLR2 및 FcRγ 의 유도에 앞서 발생하여, 그것이 흉선 내의 염증성 세포의 침윤을 나타내기 때문에, 이러한 상승은 민클의 전사 활성화로 인한 것이었다 (도 9c).
다음으로, 사멸 세포를 인식함으로써 민클이 호중구 침윤을 야기하는지 여부를 측정하기 위해 시험을 수행하였다. 저지를 위한 항-민클 단일클론 항체 투여로, 조사 후의 흉선으로의 호중구의 침윤이 극적으로 억제된 반면 (도 9d, e), 흉선 세포사의 빈도는 단일클론 항체 처리에 의해 변화하지 않았다 (데이터 생략).
흉선 대식세포에 의해 생성된 MIP-2 가 호중구 보충에 중요하다고 보고되고 있다. 항-민클 처리는 흉선 대식세포에 의한 MIP-2 생성을 저해하였다 (도 9f). 이러한 발견으로, 이러한 단일클론 항체가 대식세포로부터 염증성 사이토카인/케모카인을 유도하기 위해서 민클-리간드 상호작용을 저지한다는 것이 시사되었다.
[실시예 10]
덱사메타손 유도성의 흉선 세포사로 인한 호중구의 침윤도 또한, 항-민클 단일클론 항체 처리에 의해 감소되었다 (도 10). 단일클론 항체 클론 1B6 의 호중구 침윤-저지 효과는 클론 4A9 의 것보다 더 강력했으며; 이는 생체내 민클에 대한 1B6 의 더 강력한 저지 효과와 일치한다 (도 5b).
[실시예 11]
항-민클은 LPS 자극에 의한 호중구의 생체내 수송에 영향을 주지 않았다 (도 11). 따라서, 흉선 세포사시 호중구의 침윤은, 대부분 민클에 의해 매개된다.
[실시예 12]
다양한 자가 및 비-자가 리간드를 인식하기 때문에, C-유형 렉틴 수용체가 중요한 면역 수용체라는 증거가 증가하고 있다. C-유형 렉틴에 의해 인식되는 병원체 성분이 잘 기재되어 있지만, 자가 리간드는 그만큼 잘 이해되어 있지 않았다. 대략적으로 말하면, 이는 조직 손상에 관련되는 분자인 것으로 생각된다. 예를 들어, 내포작용 수용체 MBL, Lox-1 및 MGL-1 은 사멸 세포로부터의 리간드를 인식하고, 이의 일소를 매개할 수 있다. 항-민클 단일클론 항체가 사멸된 흉선 세포의 식세포작용을 저지하지 않았기 때문에, 민클은 내포작용 수용체인 것으로 생각되지 않는다 (도 12). 지금까지, 손상된 자기를 인식하는 것으로 발견된 것이 없으나, 특정 렉틴 수용체가 ITAM 을 통한 신호전달을 매개할 수 있다. 따라서, 민클은 사멸 세포를 직접 인식하는 첫 ITAM-결합 수용체이다.
[실시예 13]
SAP130 은 민클의 리간드로서 확인되었다. U2 snRNP 복합체에서, SAP130 은 SAP145, SAP155 및 SAP49 와 상호작용하여 스플라이오솜을 형성한다 (도 13a). 따라서, SAP155, SAP145 및 SAP49 도 또한 Ig-민클과 함께 공침하지만, SAP130 만큼 효율이 높지 않다 (도 13b). 정제 SAP130 을 사용하여 수득한 데이터는, 각각 독립적으로 민클 발현 세포를 활성화하는 것을 시사하지만, 복합체 형성이 민클의 반응성을 증강시키는지 여부는 현시점에서 불명으로 남아있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 따라, 염증 반응 활성화 신호를 근본적으로 저해할 수 있는 신규한 항-염증제를 스크리닝할 수 있다. 이에 따라 수득된 본 발명의 항-염증제를 염증성 질환의 치료에 제공할 수 있다. 본 발명의 진단 방법으로, 염증 반응을 유도하는 조직 내의 세포사의 유무를 진단할 수 있다. 더욱이, 손상 또는 병원체-감염된 조직에서의 호중구의 침윤을 적당한 수준으로 촉진하고, 그 결과 조직 회복을 촉진하는 치료제로서 사용될 수 있는, 염증 반응의 아고니스트를 탐색할 수 있다.
본 발명은, 그 내용이 본원에 모두 포함되는 일본에서 출원한 특허 출원 번호 2008-186570 (출원 일자: 2008 년 7월 17 일) 을 기초로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Sugar Chain-recognizing Receptor and Use Thereof <130> 091429 <150> JP 2008-186570 <151> 2008-07-17 <160> 17 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 1 atg aat tca tct aaa tca tct gaa aca caa tgc aca gag aga gga tgc 48 Met Asn Ser Ser Lys Ser Ser Glu Thr Gln Cys Thr Glu Arg Gly Cys 1 5 10 15 ttc tct tcc caa atg ttc tta tgg act gtt gct ggg atc ccc atc cta 96 Phe Ser Ser Gln Met Phe Leu Trp Thr Val Ala Gly Ile Pro Ile Leu 20 25 30 ttt ctc agt gcc tgt ttc atc acc aga tgt gtt gtg aca ttt cgc atc 144 Phe Leu Ser Ala Cys Phe Ile Thr Arg Cys Val Val Thr Phe Arg Ile 35 40 45 ttt caa acc tgt gat gag aaa aag ttt cag cta cct gag aat ttc aca 192 Phe Gln Thr Cys Asp Glu Lys Lys Phe Gln Leu Pro Glu Asn Phe Thr 50 55 60 gag ctc tcc tgc tac aat tat gga tca ggt tca gtc aag aat tgt tgt 240 Glu Leu Ser Cys Tyr Asn Tyr Gly Ser Gly Ser Val Lys Asn Cys Cys 65 70 75 80 cca ttg aac tgg gaa tat ttt caa tcc agc tgc tac ttc ttt tct act 288 Pro Leu Asn Trp Glu Tyr Phe Gln Ser Ser Cys Tyr Phe Phe Ser Thr 85 90 95 gac acc att tcc tgg gcg tta agt tta aag aac tgc tca gcc atg ggg 336 Asp Thr Ile Ser Trp Ala Leu Ser Leu Lys Asn Cys Ser Ala Met Gly 100 105 110 gct cac ctg gtg gtt atc aac tca cag gag gag cag gaa ttc ctt tcc 384 Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Gln Glu Glu Gln Glu Phe Leu Ser 115 120 125 tac aag aaa cct aaa atg aga gag ttt ttt att gga ctg tca gac cag 432 Tyr Lys Lys Pro Lys Met Arg Glu Phe Phe Ile Gly Leu Ser Asp Gln 130 135 140 gtt gtc gag ggt cag tgg caa tgg gtg gac ggc aca cct ttg aca aag 480 Val Val Glu Gly Gln Trp Gln Trp Val Asp Gly Thr Pro Leu Thr Lys 145 150 155 160 tct ctg agc ttc tgg gat gta ggg gag ccc aac aac ata gct acc ctg 528 Ser Leu Ser Phe Trp Asp Val Gly Glu Pro Asn Asn Ile Ala Thr Leu 165 170 175 gag gac tgt gcc acc atg aga gac tct tca aac cca agg caa aat tgg 576 Glu Asp Cys Ala Thr Met Arg Asp Ser Ser Asn Pro Arg Gln Asn Trp 180 185 190 aat gat gta acc tgt ttc ctc aat tat ttt cgg att tgt gaa atg gta 624 Asn Asp Val Thr Cys Phe Leu Asn Tyr Phe Arg Ile Cys Glu Met Val 195 200 205 gga ata aat cct ttg aac aaa gga aaa tct ctt 657 Gly Ile Asn Pro Leu Asn Lys Gly Lys Ser Leu 210 215 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Ser Ser Lys Ser Ser Glu Thr Gln Cys Thr Glu Arg Gly Cys 1 5 10 15 Phe Ser Ser Gln Met Phe Leu Trp Thr Val Ala Gly Ile Pro Ile Leu 20 25 30 Phe Leu Ser Ala Cys Phe Ile Thr Arg Cys Val Val Thr Phe Arg Ile 35 40 45 Phe Gln Thr Cys Asp Glu Lys Lys Phe Gln Leu Pro Glu Asn Phe Thr 50 55 60 Glu Leu Ser Cys Tyr Asn Tyr Gly Ser Gly Ser Val Lys Asn Cys Cys 65 70 75 80 Pro Leu Asn Trp Glu Tyr Phe Gln Ser Ser Cys Tyr Phe Phe Ser Thr 85 90 95 Asp Thr Ile Ser Trp Ala Leu Ser Leu Lys Asn Cys Ser Ala Met Gly 100 105 110 Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Gln Glu Glu Gln Glu Phe Leu Ser 115 120 125 Tyr Lys Lys Pro Lys Met Arg Glu Phe Phe Ile Gly Leu Ser Asp Gln 130 135 140 Val Val Glu Gly Gln Trp Gln Trp Val Asp Gly Thr Pro Leu 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gac tac att gta gtt 240 Leu Met Ala Phe Arg Leu Thr Gly Gly Thr Lys Asp Tyr Ile Val Val 65 70 75 80 ggc agt gac tct ggt cga att gtt att ttg gaa tac cag cca tct aag 288 Gly Ser Asp Ser Gly Arg Ile Val Ile Leu Glu Tyr Gln Pro Ser Lys 85 90 95 aat atg ttt gag aag att cac caa gaa acc ttt ggc aag agt gga tgc 336 Asn Met Phe Glu Lys Ile His Gln Glu Thr Phe Gly Lys Ser Gly Cys 100 105 110 cgt cgc atc gtt cct ggc cag ttc tta gct gtg gat ccc aaa ggg cga 384 Arg Arg Ile Val Pro Gly Gln Phe Leu Ala Val Asp Pro Lys Gly Arg 115 120 125 gcc gtt atg att agt gcc att gag aaa cag aaa ttg gtg tat att ttg 432 Ala Val Met Ile Ser Ala Ile Glu Lys Gln Lys Leu Val Tyr Ile Leu 130 135 140 aac aga gat gct gca gcc cga ctt acc att tca tct ccc ctg gaa gcc 480 Asn Arg Asp Ala Ala Ala Arg Leu Thr Ile Ser Ser Pro Leu Glu Ala 145 150 155 160 cac aaa gca aac act tta gtg tat cat gta gtt gga gta gat gtc gga 528 His Lys Ala Asn Thr Leu Val Tyr His Val Val Gly Val Asp Val Gly 165 170 175 ttt gaa aat cca atg ttt gct tgt ctg gaa atg gat tat gag gaa gca 576 Phe Glu Asn Pro Met Phe Ala Cys Leu Glu Met Asp Tyr Glu Glu Ala 180 185 190 gac aat gat cca aca ggg gaa gca gca gct aat acc cag cag aca ctt 624 Asp Asn Asp Pro Thr Gly Glu Ala Ala Ala Asn Thr Gln Gln Thr Leu 195 200 205 act ttc tat gag cta gac ctt ggt tta aat cat gtg gtc cga aaa tac 672 Thr Phe Tyr Glu Leu Asp Leu Gly Leu Asn His Val Val Arg Lys Tyr 210 215 220 agt gaa cct ttg gag gaa cac ggc aac ttc ctt att aca gtt cca gga 720 Ser Glu Pro Leu Glu Glu His Gly Asn Phe Leu Ile Thr Val Pro Gly 225 230 235 240 ggg tca gat ggt cca agt gga gta ctg atc tgc tct gaa aac tat att 768 Gly Ser Asp Gly Pro Ser Gly Val Leu Ile Cys Ser Glu Asn Tyr Ile 245 250 255 act tac aag aac ttt ggt gac cag cca gat atc cgc tgt cca att ccc 816 Thr Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Gln Pro Asp Ile Arg Cys Pro Ile Pro 260 265 270 agg agg cgg aat gac ctg gat gac cct gaa aga gga atg att ttt gtc 864 Arg Arg Arg Asn Asp Leu Asp Asp Pro Glu Arg Gly Met Ile Phe Val 275 280 285 tgc tct gca acc cat aaa acc aaa tcg atg ttc ttc ttt ttg gct caa 912 Cys Ser Ala Thr His Lys Thr Lys Ser Met Phe Phe Phe Leu Ala Gln 290 295 300 act gag cag gga gat atc ttt aag atc act ttg gag aca gat gaa gat 960 Thr Glu Gln Gly Asp Ile Phe Lys Ile Thr Leu Glu Thr Asp Glu Asp 305 310 315 320 atg gtt act gag atc cgg ctc aaa tat ttt gat act gta ccc gtt gct 1008 Met Val Thr Glu Ile Arg Leu Lys Tyr Phe Asp Thr Val Pro Val Ala 325 330 335 gct gcc atg tgt gtg ctt aaa aca ggg ttc ctt ttt gta gca tca gaa 1056 Ala Ala Met Cys Val Leu Lys Thr Gly Phe Leu Phe Val Ala Ser Glu 340 345 350 ttt gga aac cat tac tta tat caa att gca cat ctt gga gat gat gat 1104 Phe Gly Asn His Tyr Leu Tyr Gln Ile Ala His Leu Gly Asp Asp Asp 355 360 365 gaa gaa cct gag ttt tca tca gcc atg cct ctg gaa gaa gga gac aca 1152 Glu Glu Pro Glu Phe Ser Ser Ala Met Pro Leu Glu Glu Gly Asp Thr 370 375 380 ttc ttt ttt cag cca aga cca ctt aaa aac ctt gtg ctg gtt gat gag 1200 Phe Phe Phe Gln Pro Arg Pro Leu Lys Asn Leu Val Leu Val Asp Glu 385 390 395 400 ttg gac agc ctc tct ccc att ctg ttt tgc cag ata gct gat ctg gcc 1248 Leu Asp Ser Leu Ser Pro Ile Leu Phe Cys Gln Ile Ala Asp Leu Ala 405 410 415 aat gaa gat act cca cag ttg tat gtg gcc tgt ggt agg gga ccc cga 1296 Asn Glu Asp Thr Pro Gln Leu Tyr Val Ala Cys Gly Arg Gly Pro Arg 420 425 430 tca tct ctg aga gtc cta aga cat gga ctt gag gtg tca gaa atg gct 1344 Ser Ser Leu Arg Val Leu Arg His Gly Leu Glu Val Ser Glu Met Ala 435 440 445 gtt tct gag cta cct ggt aac ccc aac gct gtc tgg aca gtg cgt cga 1392 Val Ser Glu Leu Pro Gly Asn Pro Asn Ala Val Trp Thr Val Arg Arg 450 455 460 cac att gaa gat gag ttt gat gcc tac atc att gtg tct ttc gtg aat 1440 His Ile Glu Asp Glu Phe Asp Ala Tyr Ile Ile Val Ser Phe Val Asn 465 470 475 480 gcc acc cta gtg ttg tcc att gga gaa act gta gaa gaa gtg act gac 1488 Ala Thr Leu Val Leu Ser Ile Gly Glu Thr Val Glu Glu Val Thr Asp 485 490 495 tct ggg ttc ctg ggg acc acc ccg acc ttg tcc tgc tcc tta tta gga 1536 Ser Gly Phe Leu Gly Thr Thr Pro Thr Leu Ser Cys Ser Leu Leu 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2544 Glu Leu Ala Ala Glu Met Ala Ala Ala Phe Leu Asn Glu Asn Leu Pro 835 840 845 gaa tcc atc ttt gga gct ccc aag gct ggc aat ggg cag tgg gcc tct 2592 Glu Ser Ile Phe Gly Ala Pro Lys Ala Gly Asn Gly Gln Trp Ala Ser 850 855 860 gtg atc cga gtg atg aat ccc att caa ggg aac aca ctg gac ctt gtc 2640 Val Ile Arg Val Met Asn Pro Ile Gln Gly Asn Thr Leu Asp Leu Val 865 870 875 880 cag ctg gaa cag aat gag gca gct ttt agt gtg gct gtg tgc agg ttt 2688 Gln Leu Glu Gln Asn Glu Ala Ala Phe Ser Val Ala Val Cys Arg Phe 885 890 895 tcc aac act ggt gaa gac tgg tat gtg ctg gtg ggt gtg gcc aag gac 2736 Ser Asn Thr Gly Glu Asp Trp Tyr Val Leu Val Gly Val Ala Lys Asp 900 905 910 ctg ata cta aac ccc cga tct gtg gca ggg ggc ttc gtc tat act tac 2784 Leu Ile Leu Asn Pro Arg Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Tyr Thr Tyr 915 920 925 aag ctt gtg aac aat ggg gaa aaa ctg gag ttt ttg cac aag act cct 2832 Lys Leu Val Asn Asn Gly Glu Lys Leu Glu Phe Leu His Lys Thr Pro 930 935 940 gtg gaa gag gtc cct gct gct att gcc cca ttc 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aat gat gaa gta gat gag 3204 Cys Val Val Arg Leu Pro Pro Asn Thr Asn Asp Glu Val Asp Glu 1055 1060 1065 gat cct aca gga aac aaa gcc ctg tgg gac cgt ggc ttg ctc aat 3249 Asp Pro Thr Gly Asn Lys Ala Leu Trp Asp Arg Gly Leu Leu Asn 1070 1075 1080 ggg gcc tcc cag aag gca gag gtg atc atg aac tac cat gtc ggg 3294 Gly Ala Ser Gln Lys Ala Glu Val Ile Met Asn Tyr His Val Gly 1085 1090 1095 gag acg gtg ctg tcc ttg cag aag acc acg ctg atc cct gga ggc 3339 Glu Thr Val Leu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Leu Ile Pro Gly Gly 1100 1105 1110 tca gaa tca ctt gtc tat acc acc ttg tct gga gga att ggc atc 3384 Ser Glu Ser Leu Val Tyr Thr Thr Leu Ser Gly Gly Ile Gly Ile 1115 1120 1125 ctt gtg cca ttc acg tcc cat gag gac cat gac ttc ttc cag cat 3429 Leu Val Pro Phe Thr Ser His Glu Asp His Asp Phe Phe Gln His 1130 1135 1140 gtg gaa atg cac ctg cgg tct gaa cat ccc cct ctc tgt ggg cgg 3474 Val Glu Met His Leu Arg Ser Glu His Pro Pro Leu Cys Gly Arg 1145 1150 1155 gac cac ctc agc ttt cgc tcc tac tac ttc cct gtg aag aat gtg 3519 Asp His Leu Ser Phe Arg Ser Tyr Tyr Phe Pro Val Lys Asn Val 1160 1165 1170 att gat gga gac ctc tgt gag cag ttc aat tcc atg gaa ccc aac 3564 Ile Asp Gly Asp Leu Cys Glu Gln Phe Asn Ser Met Glu Pro Asn 1175 1180 1185 aaa caa aag aac gtc tct gaa gaa ctg gac cga acc cca ccc gaa 3609 Lys Gln Lys Asn Val Ser Glu Glu Leu Asp Arg Thr Pro Pro Glu 1190 1195 1200 gtg tcc aag aaa ctc gag gat atc cgg acc cgc tac gcc ttc 3651 Val Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Arg Thr Arg Tyr Ala Phe 1205 1210 1215 <210> 4 <211> 1217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Phe Leu Tyr Asn Leu Thr Leu Gln Arg Ala Thr Gly Ile Ser Phe 1 5 10 15 Ala Ile His Gly Asn Phe Ser Gly Thr Lys Gln Gln Glu Ile Val Val 20 25 30 Ser Arg Gly Lys Ile Leu Glu Leu Leu Arg Pro Asp Pro Asn Thr Gly 35 40 45 Lys Val His Thr Leu Leu Thr Val Glu Val Phe Gly Val Ile Arg Ser 50 55 60 Leu Met Ala Phe Arg Leu Thr Gly Gly Thr Lys Asp Tyr Ile Val Val 65 70 75 80 Gly Ser Asp Ser Gly Arg Ile Val Ile Leu Glu Tyr Gln Pro Ser Lys 85 90 95 Asn 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Tyr Ser Tyr Gln Ser Arg Phe His Leu Thr Pro Leu Ser Tyr 725 730 735 Glu Thr Leu Glu Phe Ala Ser Gly Phe Ala Ser Glu Gln Cys Pro Glu 740 745 750 Gly Ile Val Ala Ile Ser Thr Asn Thr Leu Arg Ile Leu Ala Leu Glu 755 760 765 Lys Leu Gly Ala Val Phe Asn Gln Val Ala Phe Pro Leu Gln Tyr Thr 770 775 780 Pro Arg Lys Phe Val Ile His Pro Glu Ser Asn Asn Leu Ile Ile Ile 785 790 795 800 Glu Thr Asp His Asn Ala Tyr Thr Glu Ala Thr Lys Ala Gln Arg Lys 805 810 815 Gln Gln Met Ala Glu Glu Met Val Glu Ala Ala Gly Glu Asp Glu Arg 820 825 830 Glu Leu Ala Ala Glu Met Ala Ala Ala Phe Leu Asn Glu Asn Leu Pro 835 840 845 Glu Ser Ile Phe Gly Ala Pro Lys Ala Gly Asn Gly Gln Trp Ala Ser 850 855 860 Val Ile Arg Val Met Asn Pro Ile Gln Gly Asn Thr Leu Asp Leu Val 865 870 875 880 Gln Leu Glu Gln Asn Glu Ala Ala Phe Ser Val Ala Val Cys Arg Phe 885 890 895 Ser Asn Thr Gly Glu Asp Trp Tyr Val Leu Val Gly Val Ala Lys Asp 900 905 910 Leu Ile Leu Asn Pro Arg Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Tyr Thr Tyr 915 920 925 Lys Leu Val 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20

Claims (18)

  1. 민클의 발현 또는 민클과 SAP130 또는 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질을 포함하는 항-염증제.
  2. 제 1 항에 있어서, 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질이 민클에 대한 항체인 제제.
  3. 제 2 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:2 로 나타내는 인간 민클의 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 아미노산 서열 또는 다른 포유 동물의 오르토로그에서의 상응하는 아미노산 서열을 인식하는 제제.
  4. 제 1 항에 있어서, 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질이 SEQ ID NO:2 로 나타내는 인간 민클의 아미노산 서열 중 아미노산 번호 146 내지 150 으로 나타내는 아미노산 서열 또는 다른 포유 동물의 오르토로그에서의 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 제제.
  5. 제 1 항에 있어서, 민클과 SAP130 과의 상호작용을 저해하는 물질이 SAP130 에 대한 항체인 제제.
  6. 제 1 항에 있어서, 민클의 발현을 저해하는 물질이 민클 유전자에 대한 안티센스 핵산, 리보자임 또는 siRNA 인 제제.
  7. 제 1 항에 있어서, 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질이 민클 및/또는 FcRγ 에 대한 항체인 제제.
  8. 제 1 항에 있어서, 민클과 FcRγ 와의 상호작용을 저해하는 물질이 민클의 막관통 도메인 내의 보존된 아르기닌 잔기를 포함하는 부위에 결합하는 제제.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제.
  10. 민클 또는 세포외 영역을 포함하는 이의 단편과 SAP130 을 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서 접촉시키고, 두 조건 하에서의 민클 또는 이의 단편과 SAP130 과의 상호작용의 정도를 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법.
  11. 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서, 민클 또는 세포외 영역 및 막관통 영역을 포함하는 이의 단편을 발현하는 세포에서의, 민클 또는 이의 단편과 FcRγ 와의 상호작용의 정도를 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 지표로서 민클 및 FcRγ 를 통한 신호전달 경로의 활성화로, 민클 또는 이의 단편과 FcRγ 와의 상호작용의 정도를 비교하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 민클 및 FcRγ 를 통한 신호전달에 의해 활성화되는 전사 인자가 결합할 수 있는 염기 서열을 포함하는 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 발현을 지표로서 사용하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, SAP130 이 공존하는 방법.
  15. 시험 물질의 존재 하 및 부재 하에서, 단백질을 생성하는 세포에서의 민클 또는 이를 인코딩하는 mRNA 의 양을 측정하고 비교하는 것을 포함하는, 염증 반응을 조절하는 물질의 스크리닝 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, SAP130 이 공존하는 방법.
  17. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-염증 작용을 갖는 물질을 선택하기 위한 방법.
  18. 대상 동물로부터 채취한 샘플 내의 SAP130 량을 측정하는 것을 포함하는, 비항상성 세포사의 검출 방법.
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