JP2001112482A - 新規ｃ型レクチンおよびその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】腹腔マクロファージ（ＰＭΦ）における核因子
インターロイキン６（ＮＦ−ＩＬ６）の転写標的遺伝子
から生成される新規なＣ−タイプレクチン、「ミンク
ル」、それをコードする遺伝子及びそれを含有してなる
医薬組成物を提供する。 【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配
列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が付加、置
換若しくは欠失してなるアミノ酸配列を有する蛋白質で
あって、マクロファージ活性化能を有し、核因子ＮＦ−
ＩＬ６によって誘発され得る蛋白質に関する。また、前
記した蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡ、若しくは、こ
れらの遺伝子にストリージェントな条件下でハイブリダ
イズし得るＤＮＡに関する。さらに、前記した蛋白質、
及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に
関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核因子ＮＦ−ＩＬ
６の下流標的物質で、Ｃタイプレクチンの１種である新
規な蛋白質、それをコードする遺伝子、及びそれを含有
してなる医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質と糖との相互作用は、免疫系にお
いて多くの機能を有している。多くの動物レクチン（糖
結合蛋白）は、病原体の認識及びＣａ^２＋依存性糖認識
領域（Ｃ−タイプ ＣＲＤｓ）の構造的な関連性を利用
した細胞−細胞間の相互作用を調整している（Weis, W.
I., et al., (1998) Immunol Rev 163, 19-34１）。マ
クロファージは、マクロファージマンノース受容体やマ
クロファージアシアログリコ蛋白結合蛋白質（Ｍ−ＡＳ
ＧＰ−ＢＰ）などの各種のＣ−タイプレクチンを発現し
ている。マクロファージマンノース受容体は、病原体に
対する直接的な食細胞作用により第１線の防衛に関与し
ている（Tayler, M. (1993) Carbohydrate-recognition
proteins of macrophages and related cells. Blood
cell biochemistry (Horton, M., Ed.). 5 vols., Plen
um Press, New York）。

【０００３】マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、
フコースなどの糖と結合するマンノース受容体は、哺乳
類のオリゴサッカライドとして基本部分となるものでは
ないが、微生物の表面にはしばしば見られる。Ｍ−ＡＳ
ＧＰ−ＢＰは、活性化されたマクロファージの表面に発
現し、末端ガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミン
単位を認識し、そして腫瘍マクロファージ（tumoricida
l macrophages)と腫瘍細胞との相互作用に関与している
（Oda,S., et Al., (1988) J Biochem (Tokyo) 104(4),
600-5 ；li, M., et al., (1990) J Biol Chem 265(1
9), 11295-8；Sato, M., et aL., (1992) J Biochem (T
okyo) 111(3), 331-6 ）。

【０００４】一方、ＮＦ−ＩＬ６（nuclear factor-int
erleukin 6）は、最初インターロイキン−６（ＩＬ−
６）の遺伝子のプロモーター中にあるインターロイキン
−１（ＩＬ−１)反応性エレメント（−１５０ｂｐ付
近、 ACATTGCACAATCT）に結合する核因子（nuclear fac
tor）として発見された（Isshiki, H., et al., (1990)
Mol Cell Biol 10(6), 2757-64）。ＮＦ−ＩＬ６がク
ローニングされ、ヒトＮＦ−ＩＬ６は３４５個のアミノ
酸からなり、Ｃ末端にＤＮＡ結合に関与する塩基性アミ
ノ酸に富む領域を有し、並んで蛋白質−蛋白質相互作用
ドメインであるロイシンジッパー構造（ｂＺＩＰドメイ
ン）が存在する。そして、その配列がＣＣＡＡＴ／エン
ハンサー結合蛋白質（Ｃ／ＥＢＰ)と相同性があること
が示され、転写因子の塩基性ロイシンジッパーファミリ
ーの一員であることが示された（Akira,S., et al., (1
990) Embo J., 9(6), 1897-1906）。ＮＦ−ＩＬ６は、
他のグループによりＡＧＰ／ＥＢＰ、ＬＡＰ、ＩＬ−６
ＤＢＰ、ｒＮＦＩＬ−６、Ｃ／ＥＢＰβ、ＣＲＰ２とし
て報告されていたものである（Chang, C. J., et al.,
(1990) Mol Cell Biol., 10(12), 6642-53；Descombes,
P., et al., (1990) Genes Dev., 4(9), 1541-51；Pol
i, V., et al., (1990) Cell, 63(3), 643-53；Metz,
R., et al., (1991) Genes Dev., 5(10), 1754-66；Ca
o, Z., et al., (1991) Genes Dev., 5(9), 1538-52；W
illiams, S.C., et al., (1991) Genes Dev, 5(9),1553
-67）。

【０００５】ロイシンジッパー構造と高い相同性を示す
遺伝子としては、ＮＦ−ＩＬ６の他にＣ／ＥＢＰ、ＮＦ
−ＩＬ６β、Ｉｇ／ＥＢＰ、ＣＨＯＰが報告されてお
り、これらはＮＦ−ＩＬ６ファミリー（Ｃ／ＥＢＰファ
ミリーともいう。）を形成している。ＮＦ−ＩＬ６結合
モチーフは、ＩＬ−６以外にもＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ
−８、Ｇ−ＣＳＦのプロモーター領域や各種急性期タン
パク質のＩＬ−６反応性エレメント、またマクロファー
ジ活性化に伴って誘導されるリゾチームやＮＯＳ遺伝子
のエンハンサー領域にも認められることから、ＮＦ−Ｉ
Ｌ６は炎症や免疫反応において重要な役割を果たしてい
るものと考えられる。

【０００６】ＮＦ−ＩＬ６は、ＭＡＰキナーゼカスケー
ドによりリン酸化されて活性化されることが知られてい
るが、ＮＦ−ＩＬ６はＭＡＰキナーゼカスケード以外の
ＰＫＣやＰＫＡなどによってもリン酸化されることが示
されている。このことは、ＮＦ−ＩＬ６はいくつかの異
なるシグナル伝達の標的になっていると考えられる。し
かし、ＮＦ−ＩＬ６に伝達されたシグナルは生体内でど
のような遺伝子の発現を制御しているのかということ
は、未だ詳細には判明されていない。ＮＦ−ＩＬ６の転
写の標的のひとつが、マクロファージにおける白血球コ
ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）と推測されることが報告
されているが（Tanaka, T., Akira, S.,et al., (1995)
Cell 80(2), 353-61）、その余についての詳細は知ら
れていない。

【０００７】このことに関する研究は、ＮＦ−ＩＬ６ノ
ックアウトマウスを用いた研究が注目される（前掲の(1
995) Cell 80(2), 353-61）。ＮＦ−ＩＬ６ノックアウ
トマウスは、ヘテロ交配によりメンデル比よりも少ない
が正常に生まれてくる。ＮＦ−ＩＬ６ノックアウトマウ
ス（ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）マウス）は、リステリ
アモノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）やカ
ンジタアルビカンス（Candida albicans）などの病原体
の空気感染に対して非常に敏感であることが判明し、こ
れはマクロファージの細胞内殺菌能の欠如によるもので
あることが判明した。ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）マウ
スの腹腔マクロファージ（ＰＭΦ）は、リステリアモノ
サイトジェネスに対する細胞間における殺菌力を欠き、
また殺腫瘍活性や腫瘍静止活性を失っているようにみえ
る。しかし、これらの研究で使用されたこのマクロファ
ージは、細胞間のバクテリアや寄生虫を殺すのに重要な
役目を持つ窒素酸化物を正常な量生成しており、このこ
とは窒素酸化物に依存していないＮＦ−ＩＬ６に依存す
るリステリア殺菌力や殺腫瘍活性を発揮するルートが有
ることを示唆しているのである。

【０００８】また、ＮＦ−ＩＬ６蛋白質の過剰な発現
（overexpression）は、ＩＬ−６、マクロファージ遊走
性誘因物質プロテイン−１（ＭＣＰ−１）、マクロファ
ージ炎症性プロテイン−１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ
−１β、オステオポンチン、ＣＤ１４、及びリゾチーム
がいくつかの造血細胞系におけるＮＦ−ＩＬ６の下流の
遺伝子であることを明確にした。しかしながらこれに反
して、ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）マクロファージにお
けるこれらの遺伝子の発現が野生型マクロファージ（Ｗ
Ｔ）に匹敵することがある。これは生体内においてはＣ
／ＥＢＰδのような他のＣ／ＥＢＰファミリーがＮＦ−
ＩＬ６の欠損を部分的に補なっているからであると考え
られる（Hu, H. M., et al., (1998) J Immunol., 160
(5), 2334-42）。

【０００９】このように、ＮＦ−ＩＬ６はマクロファー
ジを活性化する重要な役目を演じており、炎症や感染症
などにおける免疫系の解明のみならず、免疫系を制御し
調整するための物質としてＮＦ−ＩＬ６の標的となる物
質を解明することは重要なことである。本発明者らは、
ＮＦ−ＩＬ６の転写の標的となる遺伝子を解明し、その
翻訳生成物を明らかにするために鋭意研究をしてきたと
ころ、Ｃ−タイプレクチンの一種である新規な糖蛋白質
を見出し、これをミンクル（Ｍｉｎｃｌｅ（macrophage
inducible C-type lectin）と命名した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、腹腔マクロ
ファージ（ＰＭΦ）における核因子インターロイキン６
（ＮＦ−ＩＬ６）の転写標的遺伝子から生成される新規
なＣ−タイプレクチン、「ミンクル」、それをコードす
る遺伝子及びそれを含有してなる医薬組成物を提供する
ものである。本発明の新規な蛋白質「ミンクル」は、免
疫系、特に核因子ＮＦ−ＩＬ６により転写制御される免
疫系の制御物質として有用である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列
において１個若しくは２個以上のアミノ酸が付加、置換
若しくは欠失してなるアミノ酸配列を有する蛋白質であ
って、マクロファージ活性化能を有し、核因子ＮＦ−Ｉ
Ｌ６によって誘発され得る蛋白質に関する。また、本発
明は、前記した本発明の蛋白質をコードする遺伝子ＤＮ
Ａ、好ましくは、配列表の配列番号１で示される塩基配
列を有するＤＮＡ、若しくは、これらの遺伝子にストリ
ージェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ、又
は、これらの遺伝子、好ましくはＤＮＡの少なくとも１
４塩基からなるポリヌクレオチドに関する。

【００１２】さらに、本発明は、前記した本発明の蛋白
質、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成
物、及び、当該蛋白質に対する抗体に関する。

【００１３】ＮＦ−ＩＬ６はマクロファージを活性化す
る重要な役目を演じており、炎症や感染症などにおける
免疫系の解明のみならず、免疫系を制御し調整するため
の物質としてＮＦ−ＩＬ６の標的となる物質を解明する
ことは重要なことであるが、今までＮＦ−ＩＬ６の標的
となる物質を見出すことはできなかった。本発明者ら
は、ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型マウスを用いて、サ
ブトラクションクローニング法により、ＮＦ−ＩＬ６に
よって誘発されるＣタイプレクチンの１種である新規な
蛋白質（以下、「ミンクル」という。）、及びそれをコ
ードする遺伝子を見出し、その諸性質を検討した。

【００１４】まず、本発明者らは、野生型とＮＦ−ＩＬ
６欠損（−／−）型のＰＭΦのｍＲＮＡの発現の違いを
比較するため、サブトラクションクローニングを行っ
た。野生型とＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦ
を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと１００Ｕ／ｍｌのＩＦ
Ｎ−γで１６時間刺激した。テスター及びドライバーｃ
ＤＮＡを、野生型とＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰ
ＭΦからそれぞれ抽出されたポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用い
て合成した。サブトラクションハイブリダイゼーション
は、テスターｃＤＮＡ中に優先的に存在するｃＤＮＡを
濃縮することにより行われた。個体差による間違い（fa
lse positives）を少なくするため、２つのサブトラク
ションライブラリーを用いた。各々のライブラリーにお
いて１，０００のコロニーに対してディファレンシャル
ハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンをシーク
エンスした。陽性クローンのなかで、両方のライブラリ
ーから分離されたクローンに注目した。野生型のＰＭΦ
と比較して、ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦに
おいて発現が劇的に減少する５つのｃＤＮＡを見出し
た。それらのｃＤＮＡのうちの１つは新規なものであ
り、これをその発現の特性やそれをコードする蛋白質の
１次構造に基づいて「マクロファージ誘導Ｃ−タイプレ
クチン（Ｍｉｎｃｌｅ）」と呼ぶことにした。

【００１５】ミンクルの発現は、ＬＰＳで刺激されたＰ
ＭΦのノーザンブロッティングにより評価した。ミンク
ルのｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳで刺激されていないＰＭ
Φで検出することは困難であるが、ＬＰＳ処理後２時間
で検出することができ、この結果を図１に示す。図１
は、ＬＰＳ処理後の種々の時間におけるＰＭΦでのミン
クルｍＲＮＡの発現を示したものである。即ち、野生型
とＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦを１００ｎｇ
／ｍｌのＬＰＳで図示された時間刺激し、全ＲＮＡを抽
出し、これを電気泳動し（５μｇ／レーン）、これをナ
イロン膜に移して、ミンクル特異的プローブでハイブリ
ダイズさせたものである。使用したＰＭΦがＬＰＳに効
果的に応答していることを確認するために、ＭＩＰ−２
を陽性コントロールとして用いた。図１の下段のエチジ
ウムブロマイドによる染色は、サンプルの量が等しいこ
とを確認するためのものである。

【００１６】３種類のｍＲＮＡがこのプローブとハイブ
リダイズした。この中で最も短いｍＲＮＡ（１．７ｋ
ｂ）が最も多く見出された。ミンクルのｍＲＮＡの発現
は野生型のＰＭΦでは、ＬＰＳ刺激後少なくとも１６時
間維持することができた。ＮＦ−ＩＬ６のｍＲＮＡのレ
ベルは、野生型のＰＭΦにミンクルｍＲＮＡを導入する
前にＬＰＳ処理すると、３０分以内に増加した（図１参
照）。ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦは、ＬＰ
Ｓ刺激処理後２時間でミンクルのｍＲＮＡの発現を誘導
するが、野生型のものよりかなり低いレベルであった。
両方のタイプの細胞におけるＭＩＰ−２のｍＲＮＡの量
を比較することにより、ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型
の細胞はＬＰＳ刺激に効率よく反応することが示され
た。

【００１７】次に、様々な炎症誘発因子で処理した後
に、野生型とＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦに
おけるミンクルのｍＲＮＡの発現を調べた。ＩＦＮ−
γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＬＰＳの各々で４時間
刺激した後、全てのＲＮＡを抽出し、ミンクルに特異的
なプローブを用いてノーザンブロッティングを行った。
この結果を図２に示す。図２は、種々の炎症誘発因子で
処理された野生型とＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰ
ＭΦにおけるミンクルｍＲＮＡの発現を示すものであ
る。即ち、メディウムのみ（−）、ＩＦＮ−γ（２５０
Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（２０００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ−
α（５０００Ｕ／ｍｌ）、及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）の各々で４時間刺激し、全ＲＮＡを抽出し、これを
電気泳動し（５μｇ／レーン）、これをナイロン膜に移
して、ミンクル特異的プローブでハイブリダイズさせた
ものである。使用したＰＭΦがＬＰＳに効果的に応答し
ていることを確認するために、ＭＩＰ−２を陽性コント
ロールとして用いた。図２の下段のエチジウムブロマイ
ドによる染色は、サンプルの量が等しいことを確認する
ためのものである。この結果、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、
ＴＮＦ−α、又はＬＰＳで処理された野生型のＰＭΦに
おいては、強いミンクルｍＲＮＡの誘導が観察された。
これに対して、ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦ
では非常に低い発現しか検出されなかった。また、ＩＬ
−１β、ホルボールミリステートアセテート、又はアイ
オノマイシンによる処理では、野生型及びＮＦ−ＩＬ６
欠損（−／−）型の両方のＰＭΦにおいて十分なミンク
ルｍＲＮＡを誘発することはできなかった。

【００１８】これらの結果は、いくつかの炎症誘発因子
は、ＮＦ−ＩＬ６に依存したミンクルｍＲＮＡの発現を
強く誘導することを示している。ＬＰＳによる刺激はＰ
ＭΦ中において最も強くミンクルの発現を誘導すること
から、種々の細胞株を用いてＬＰＳ処理後のミンクル発
現をテストした。その結果を図３に示す。図３は、種々
のセルラインにおけるミンクル発現についてのノーザン
ブロット分析の結果を示す。ＲＡＷ２６４．７（形質転
換された腹腔マクロファージ）、Ｍ１（骨髄芽球白血病
細胞）、ＢＣＬ１（成熟Ｂ細胞）、ＭＯＰＣ（骨髄腫
（メラノーマ））、５Ｅ３（ナチュラルキラー細胞）、
ＥＬ４（胸腺腫）、及びＮＩＨ３Ｔ３（線維芽細胞）の
各々をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間、処理した
場合（＋）と処理しない場合（−）を示す。処理後、全
ＲＮＡを電気泳動し（５μｇ／レーン）、これをナイロ
ン膜に移して、ミンクル特異的プローブでハイブリダイ
ズさせたものである。図３の下段は、Ｇ３ＰＤＨでハイ
ブリダイズさせたコントロールを示す。５Ｅ３細胞にお
いてはＧ３ＰＤＨの量が他の細胞よりも少なくでてい
る。ミンクルの発現はマクロファージＲＡＷ２６４．７
細胞に観察され、ＬＰＳの刺激後に急激に増大した。低
いレベルの出現はＭ１骨髄芽球の白血病細胞のＬＰＳ刺
激でも検出された。しかしながら他の細胞株、ＢＣＬ１
（成熟Ｂ細胞）、ＭＯＰＣ（骨髄腫（メラノーマ））、
５Ｅ３（ナチュラルキラー細胞）、ＥＬ４（胸腺腫）、
及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（線維芽細胞）では、検出できる
レベルのミンクルのｍＲＮＡは発現しなかった。更に、
ミンクルのｍＲＮＡは、脳、心臓、肺、脾臓、腎臓、骨
格筋、及び睾丸では検出されなかった。これは、マクロ
ファージに制限された発現であるかもしれないことを示
している。

【００１９】本発明者らは、２．５−ｋｂ及び１．７−
ｋｂのマウスミンクル（ｍミンクル）ｃＤＮＡをＲＡＣ
Ｅ法によりクローニングした。これらの配列を分析した
結果、両者の違いは３’−非翻訳領域におけるポリアデ
ニル化サイトの交互的な配列によるものであり、スプラ
イシングによるものではないことが明らかになった。配
列表の配列番号１に２．５−ｋｂのマウスミンクル（ｍ
ミンクル）ｃＤＮＡの塩基配列を示す。また、図４にも
２．５−ｋｂのマウスミンクル（ｍミンクル）ｃＤＮＡ
の塩基配列を示す。塩基の１番目は転写開始位置を示
し、これは後述するプライマーエクステンション法によ
って決定されたものである。図４中の下線部分はポリア
デニル化サイトを示し、塩基の下のアルファベットはコ
ードされているアミノ酸を１文字表記で示したものであ
る。アスタリスクは終止コドンを示す。１．７−ｋｂの
短いほうは、塩基の番号の１−１６４１までのものであ
る。なお、この配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／Ｅ
ＭＢＬデータベースにアクセッション番号ＡＢ０２４７
１７として寄託された。

【００２０】２．５−ｋｂ及び１．７−ｋｂの両ｃＤＮ
Ａは、２１４個のアミノ酸からなるポリペプチドをコー
ドする６４２ｂｐのオープンリーディングフレームをも
ち、当該ポリペプチドの分子量は約〜２４．４ｋＤａと
算出された。このポリペプチドのアミノ酸配列を配列表
の配列番号２に示す。このポリペプチドは、ＮＨ_２−末
端に疎水性のシグナルペプチドを持っていないが、疎水
性アミノ酸の配列から予想される２４アミノ酸からなる
膜貫通領域を含有している。ミンクルの一次構造から、
ミンクルはＮＨ_２末端の２１アミノ酸からなる細胞内領
域、及びＣＯＯＨ−末端側の１６９アミノ酸からなる細
胞外領域を有する、タイプIIの膜結合蛋白質であること
がわかった。本発明者らは、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−
１細胞のｃＤＮＡを用いて、デジェネレイティブＰＣＲ
（degenerative PCR）法とＲＡＣＥ法を組み合わすこと
によりヒトのホモロジーを同定した。同定されたヒトの
ミンクル（ｈミンクル）は２１９個のアミノ酸からな
り、このアミノ酸配列をマウスのそれと並べて図５に示
す。図５にヒトミンクルとマウスミンクルのアミノ酸配
列の比較を示す。黒部分はヒトとマウスで同じであるこ
とを示し、灰色は両者で保存されている部分を示す。下
線部分は膜貫通領域であることを示し、Ｃタイプレクチ
ン領域の開始部位を角矢印で示し、Ｎ−グリコシル化サ
イトでヒトとマウスで同じ部位を黒三角印で示し、ヒト
のみのグリコシル化サイトを白三角印で示し、プロテイ
ンキナーゼＣによるリン酸化サイトと予測される箇所を
アスタリスクで示す。ヒトミンクルのヌクレオチド配列
は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベース
にアクセッション番号ＡＢ０２４７１８として寄託され
た。

【００２１】本発明者らは、２．２−ｋｂ及び１．０−
ｋｂのヒトミンクル（ｈミンクル）ｃＤＮＡをクローニ
ングした。両方とも、２１９個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドをコードする６５７ｂｐの同一のオープンリー
ディングフレームを持っていた。ｈミンクルとｍミンク
ルのアミノ酸配列を比較すると、６７％が同一であり、
８５％の相同性を有していた（図５参照）。ｍミンクル
は１０７位のＡｓｐにＮ−グリコシル化サイトがあると
考えられ、一方ヒトミンクル（ｈミンクル）は、６２位
のＡｓｐと１０７位のＡｓｐの２箇所にサイトを有して
いると考えられる。マウス及びヒトのミンクルの細胞内
領域には、プロテインキナーゼＣにおける２つのリン酸
化の可能な位置（３位のＳｅｒ及び１２位のＴｈｒ）が
存在している（図５参照）。これらのサイトは、プロテ
インキナーゼＣのリン酸化モチーフ（Ｓｅｒ／Ｔｈｙ−
Ｘ−Ａｒｇ／ｌｙｓ）と互換性があった。

【００２２】利用可能なデーターベースによるホモロジ
ーサーチを行った結果、本発明のミンクルのアミノ酸配
列と一致するものは見出されなかった。しかし、ミンク
ルの細胞外領域は、種々のＣ−タイプレクチンと相同性
が見られた。マウスとヒトのミンクルは、それぞれ１３
６、１４１アミノ酸からなるＣＲＤを持っている。そし
て、この領域は、グループ−II Ｃ−タイプレクチンと
関連しているマクロファージＣ−タイプレクチン（ＭＣ
Ｌ）と極めて高い相同性を有している（Balch,S. G., e
t al., (1998) J. Biol. Chem., 273(29), 18656-6
4）。

【００２３】図６に、本発明のｍミンクル蛋白質（mMin
cle）のカルボキシ末端、ｍＭＣＬのＣＲＤ部、並びに
マウスＣＤ２３（mCD23）、マウス アシアログリコプ
ロテイン受容体１（mASGR-1）、及びマウスマクロファ
ージアシアログリコプロテイン結合蛋白質（mM-ASGP-B
P）の３種のグループ−IIＣ−タイプレクチン類のアミ
ノ酸配列を並べて示す。図６には、さらに、詳細な分析
が報告されているラットマンノース結合レクチンＡ（rM
BL-A）の配列を示す（Weis, W. I., et al., (1991) sc
ience, 254(5038), 1608-15； Iobst, S. T., et al.,
(1994) J. Biol.Chem., 269(22), 15505-11； Iobst,
S. T., et al., (1994) J. Biol. Chem. 269(22), 1551
2-9； Weis, W. I., et al., (1994) Structure, 2(1
2), 1227-40）。図６は本発明のｍミンクルと公知のＣ
タイプレクチンのＣａ^２＋依存性糖認識領域（Ｃ−タイ
プ ＣＲＤｓ）のアミノ酸配列の比較を示し、各配列は
ｍミンクルのＣタイプレクチン領域の開始アミノ酸から
表示されている。黒部分はｍミンクルと同じ配列である
ことを示し、灰色部分はｍミンクルと類似した配列であ
ることを示す。「ＣＬ ｄｏｍａｉｎ」はＣタイプレク
チン領域で使用されている記号を示している。表記はア
ミノ酸の１文字表記である（ＺはＥ又はＱであることを
しめす。）。保存された領域はギリシャ文字又はＯ（Φ
は芳香族、Θは脂肪族、Ωは芳香族又は脂肪族、Ｏは酸
素含有であることを示す。）で示されている。２次構造
（２゜）及びカルシウム結合領域はｒＭＢＬ−Ａによる
ワイズ（Weis, W. I., et al., (1991) science, 254(5
038), 1608-15）によって決定されたものを示してい
る。酸素リガンドに寄与するサイドチェーンへのカルシ
ウム結合サイト（１及び２）は、これらの配列の上に示
されている。

【００２４】決定されたミンクルの配列は、ｍＭＣＬの
ＣＲＤｓと４４％、ｍＣＤ２３と４０％、ｍＡＳＧＲ−
１と３８％、ｍＭ−ＡＳＧＰ−ＢＰと３６％、ｒＭＢＬ
−Ａと３１％の一致を示した。またｍミンクル蛋白は１
５３位のΔ印と１８９位のＧｌｎを除き、ここに示され
たＣ−タイプレクチンの１４個の同一箇所中の中の１２
箇所が同じであり、高度に保存されているアミノ酸配列
の１８箇所中の１８箇所が保持されている（図６参照）
（Drickamer, K. (1993) Prog Nucleic Acid Res Mol B
iol 45,207-32）。ｍミンクル蛋白は、ｒＭＢＬ−Ａ
ＣＲＤと解合してカルシウムカチオンを保持するための
すべてのアミノ酸配列を保存している。これらの結果、
本発明のミンクルはＣ−タイプレクチンの一種であると
いえる。

【００２５】プロモーター分析によりゲノムＤＮＡ断片
が得られる。このゲノムＤＮＡは、５’−フランキング
領域に加えてｍミンクルの最初の５つのエクソン領域
（ヌクレオチド１−６１１）を包含している。最初の３
つのエクソン領域はそれぞれレセプターポリペプチドの
各機能（細胞質末端、膜内外連鎖、細胞外領域）を有す
る領域に対応している。これは、また、グループ−２
Ｃ−タイプレクチンの特徴でもある（Bezouska, et a
l., (1991) J Biol Chem 266(18), 11604-9）。第４、
第５のエクソン領域の位置は、グループ−２ Ｃ−タイ
プレクチンの原形であるチキンの肝臓のレクチンのＣＤ
Ｒに見られる位置と全く一致する。

【００２６】つぎに、ミンクル遺伝子の染色体位置の確
認を行った。マウスのミンクルの染色体位置は、［（Ｃ
５７ＢＬ／６Ｊ ｘ Ｍｕｓ ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１Ｘ
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ］マウスを種間で掛け合わせた子孫を
用いた種間のバッククロス分析により決定された。図７
はマウス染色体６の末端領域におけるミンクルのマップ
を示す。図の上段は、全ての位置についてタイプ分けさ
れた９５のもどし交配（backcross）動物におけるミン
クル及びフランキング遺伝子の遺伝子対合状態の分離
（seregation）を示したものである。各々のカラムは、
（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｘ Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１の親
から遺伝したもどし交配の子孫において同定された染色
体を示す。黒塗りの四角はＣ５７ＢＬ／６Ｊのアレルの
存在を示し、白塗りの四角はＭ．ｓｐｒｅｔｕｓのアレ
ルの存在を示す。染色体の各々のタイプが遺伝している
子孫の数が各カラムの下に示されている。図７の下段に
は、ミンクルとそれに連鎖している遺伝子の位置を示す
染色体６の遺伝地図の一部が示されている。その左側の
数値はセンチモルガン単位の各位置間の遺伝的組換えの
距離であり、ヒト染色体における位置が右側に示されて
いる。

【００２７】種間の戻し交雑のマッピングは２７００位
置以上にタイプ分けされた。これは、全てのＸ染色体と
同様に常染色体にも分布された（Copeland, N. G., and
Jenkins, N. A. (1991) Trends Genet 7(4), 113-
8）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＭ．スプレタスのＤＮＡを種
々の酵素で消化し、ＲＦＬＰ（restriction fragment l
ength polymorphism）の情報を得るために、マウスミン
クルｃＤＮＡのプローブを用いたサザーンブロットハイ
ブリダイゼーションにより分析した。６．５ｋｂＢａｍ
ＨＩのＭ．ｓｐｒｅｔｕｓのＲＦＬＰ（実施例参照）
を、交雑マウスのミンクル位置を解析するために用い
た。マッピングの結果、ミンクルはＡｔｐ６ｅ、Ｓｌｃ
２ａ３及びＣｄ４にリンクしているマウス染色体６の末
梢領域にあることが示された。９５匹のマウスが各マー
カーのために分析され、分離分析（segregation analys
is）に供された（図７参照）が、１６７匹までのマウス
がこれらのマーカーのペアとしてタイプ分けされた。そ
れぞれの位置は、組み替え頻度のため更なるデータを用
いて、ペアになる組み合わせとして分析された。その位
置における各々のペアについて分析した全マウスに対す
る組み替え染色体を示す全マウスの比率、及び最も有り
得る遺伝子配列は：動原体Ａｔｐ６ｅ−２／１１０−Ｓ
ｌｃ２ａ３−１／１３６−ミンクル−１／１６７−Ｃｄ
４である。組み替え確率は［遺伝子距離をセンチモルガ
ン（ｃＭ）±標準誤差で示す．］は、−Ａｔｐ６ｅ−
１．８±１．３−Ｓｌｃ２ａ３−０．７±０．７−ミン
クル−０．６±０．６−Ｃｄ４である。

【００２８】実験で得られた生物での染色体６のマップ
と、多くのクローンされていないマウスのマップ位置の
報告より作成されたマウス遺伝地図（マウスゲノムデー
ターベースから提供される、これはＪａｃｋｓｏｎ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥにある
コンピューター化されたデーターベース）とを比較し
た。ミンクルは、この遺伝子座において変異により期待
される表現型の変異のないマウスのコンポジットマップ
の領域にマッピングされた。マウス染色体６の末端領域
は、ヒト染色体の２２及び１２と領域の相同性を有して
いる（図７参照）。これは、ヒトミンクルがこの２つの
染色体上にマップされることを示唆している。

【００２９】ｍミンクルの表面の性質を検討した。ミン
クルのアミノ酸配列は、ミンクルが前記したように、タ
イプ２の膜蛋白質であることを示唆している。ミンクル
蛋白の表面の性質を確認するため、カルボキシ末端フラ
ッグを付けたｍミンクルｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトラ
ンスフェクトした。そしてｍミンクルフラッグ蛋白は、
濾過性の細胞のない抗フラッグＭ２抗体を使ったフロー
サイトメトリー分析で検出された。図８は、マウスミン
クルフラッグ蛋白質の表面発現性（surface expressio
n）を検討したフローサイトメトリー分析の結果を示
す。ｍミンクルフラッグで形質転換した２９３細胞（左
側）と擬似的に形質転換した（mock-transfected）２９
３細胞（右側）とを、ビオチン結合抗フラッグＭ２抗体
（実線）又はコントロールバッファーのみでインキュベ
ートした。発現強度はＦＩＴＣ−ストレプトアビジンで
ラベルした後比較したものである。

【００３０】ｍミンクルフラッグがトランスフェクトさ
れた細胞がＭ２抗体で染色されることは、ｍミンクルフ
ラッグ蛋白が強い表面発現をもつことを示す（図８の左
パネル）。擬似的に（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされ
た細胞はＭ２抗体では染色されない。（図８の右パネ
ル）。

【００３１】同時に、ｍミンクルフラッグ蛋白の発現
は、ウエスタンブロット分析でも検出された。その結果
を図９に示す。ｍミンクルフラッグトランスフェクト、
または、擬似的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞
の溶解液を抗フラッグＭ２抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、これをニトロセ
ルロース膜に移し、ｍミンクルフラッグ蛋白質をビオチ
ン結合抗Ｍ２抗体で検出し、西洋ワサビパーオキシダー
ゼ−コンジュゲートストレプトアビジンでインキュベー
トした。免疫反応性を化学発光によりビジュアル化し
た。観察されたｍミンクルフラッグ蛋白の分子量は〜３
５ｋＤａに相当するものである。しかし、計算されたｍ
ミンクルフラッグは２５．４ｋＤａである。この結果は
ｍミンクル蛋白は翻訳された後、かなり修飾されること
を示唆している。

【００３２】次に、ミンクル遺伝子の転写開始部位を決
定した。ｍミンクル遺伝子の転写開始部位の決定のた
め、ｃＤＮＡのヌクレオチド８１−１１２に相当するプ
ライマーを用いてプライマー伸長分析を行った。ＬＰＳ
で刺激したＰＭΦからの全ＲＮＡを、ｃＤＮＡのヌクレ
オチド１１２−８１と相補的な^３２Ｐでラベルしたアン
チセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション
させた後、プライマーを逆転写酵素で伸長した。その生
成物を、同じオリゴヌクレオチドから生成された配列決
定のためのラダー（dideoxy-sequencing ladder）に沿
って電気泳動させた。矢印は転写開始部位を示す。ネガ
ティブコントロール反応（酵母ｔＲＮＡに代えたＰＭΦ
ＲＮＡ）生成物はバンドを示さなかった。結果を図１０
に示す。同一の反応をネガティブコントロールとして、
酵母のｔＲＮＡを用いて行った。伸長反応により得られ
た物は、同じオリゴヌクレオチドプライマーから生成さ
せたｍミンクルアンチセンス配列と並べて示した（図１
０参照）。この結果、１つの転写開始部位が決定され、
それは翻訳開始コドンの上流１２５塩基に対応する部位
であった。ヌクレオチドのこのサイドはＣ（シトシン）
であり、転写開始部位を＋１と仮に名付けた。

【００３３】５’フランキング領域のシークエンス分析
を行った。マウスゲノムＤＮＡライブラリーを^３２Ｐで
ラベルされたｍミンクルのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩｃＤ
ＮＡ断片（ヌクレオチド１２６−４９６）によりスクリ
ーニングした。単離されたクローンのシークエンシング
は、フランキング領域と最初の５つのエクソン領域を含
んでいた。ｍミンクル遺伝子の１．８−ｋｂのプロモー
ター領域が両方のストランドから完全にシークエンスさ
れた。決定された配列を図１１に示す。図１１中の角矢
印は転写開始位置を示す。四角枠はＴＡＴＡボックスを
示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の下にメチオニン（Ｍ
ｅｔ）の表示をした。種々の転写因子が結合し得る箇所
を下線で示した。なお、この配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号ＡＢ０２４７
１９として寄託された。

【００３４】ＴＦＳＥＡＲＣＨプログラムを用いたコン
ピューターサーチ（Heinemeyer, T., et al., (1998) N
ucleic Acids Res 26(1), 362-7）により、いろいろな
転写因子の可能な結合部位があることが明らかになっ
た。ＬＰＳによるこの遺伝子の発現調整に関与している
と考えられるいくつかのロケーションが明らかになる。
これらに含まれるモチーフは、ＮＦ−ＩＬ６、核因子−
ｋａｐｐａＢ（ＮＦ−κＢ）、アクチベータープロテイ
ン−１（ＡＰ−１）、及びｃ−Ｅｔｓの結合するところ
である。ＮＦ−ＩＬ６の推定上の結合モチーフは、−１
２２２−１２１０、−１１０８−１０９５、−９２９−
９１７、−６３２−６１９の位置であると考えられる。
標準的なＴＡＴＡボックスは転写開始部位の上流２９−
２４ｂｐ位置にある。

【００３５】次に、ｍミンクルプロモーターを活性化す
るＮＦ−ＩＬ６の発現の誘発について検討した。ＮＦ−
ＩＬ６がｍミンクルプロモーターをトランス作用活性化
するか否かを調べるため、いろいろな５’部分欠失した
ｍミンクルプロモーター −ルシフェラーゼプラスミド
を構築した。５’フランキング領域の１７８３ｂｐ及び
５’−ノンコーディング領域の６９ｂｐを含む１８５２
ｂｐフラグメントは、プロモーターのないルシフェラー
ゼ レポーター ベクターｐＧＬ３にフューズし、そし
てさまざまな５’部分欠失したルシフェラーゼ発現構造
を調製した。図１２は、トランスアクティベーションア
ッセイにおけるマウスミンクルプロモーターの、ＮＦ−
ＩＬ６による転写の誘発をテストした結果を示すもので
ある。図１２の左側は、ｍミンクルプロモーター−ルシ
フェラーゼ構築物を示し、上から、ｐＧＬ３−１７８３
／＋６９、−１１９０／＋６９、−２４０／＋６９、−
１６６／＋６９、−６１／＋６９、ＮＦ−ＩＬ６結合サ
イト変異構築物ｐＧＬ３−２４０ｍ、及びｐＧＬ３ベク
ターを示す。番号は転写開始位置からの相対位置を示
す。卵型の丸印はＮＦ−ＩＬ６結合サイト（−６６から
−５８）を示す。ＩＰＴＧ処理でＮＦ−ＩＬ６を発現す
るＮＦＩＬ６Ｍ１細胞に、形質転換のコントロールとし
ての２０μｇのレニラルシフェラーゼ（Renilla lucife
rase）ベクター（ｐＲＬ−ＳＶ４０）及び２０μｇのこ
れらの構築物をエレクトロポレーション法でコトランス
フェクトした。細胞はトランスフェクション後に等量の
２つに分け、ＩＰＴＧの存在下（１ｍＭ）または不存在
下に株化した。 １８時間後に、株を集め、細胞抽出液
を調製した。ルシフェラーゼ活性レベルは、コトランス
フェクトされたレニラルシフェラーゼ活性値により標準
化し、そしてプロモーターのないｐＧＬ３ベーシックベ
クターとの相関する値として示された。得られたデータ
は、３回の実験の平均値±ＳＤとして示されている。図
１２の右側に示されている刺激比（fold stimulation）
は、各々の構築物におけるＮＦ−ＩＬ６の発現に対応す
る比として、ＩＰＴＧの存在下における活性量をＩＰＴ
Ｇ不存在下の活性量で割った値である。

【００３６】ＮＦ−ＩＬ６Ｍ１細胞は、ＩＰＴＧを加え
た後４時間以内にヒトＮＦ−ＩＬ６蛋白を誘導し発現す
ることが知られている（Matsumoto, M., Sakao, et a
l.,(1998) Int Immunol 10(12), 1825-35）。ｐＧＬ３
−１７８３／＋６９、−１１９０／＋６９、−２４０／
＋６９、−１６６／＋６９構築物のトランスフェクショ
ンは、ＮＦ−ＩＬ６発現による約３〜５倍の誘発を示し
た。配列の−１６６位から−６１位の欠失は、ＩＰＴＧ
による反応性を完全に減少させた（図１２参照）。この
領域は、−６６位から−５８位の１つのＮＦ−ＩＬ６の
結合モチーフ（ＴＫＮＮＧＮＡＡＫ）を含む。変異体ｐ
ＧＬ３−２４０ｍを調製するためにｐＧＬ３−２４０／
＋６９ベクターの中にＮＦ−ＩＬ６コンセンサス配列を
導入した。ＮＦ−ＩＬ６が結合する部位と考えられる、
２つのアデニンと１つのグアニンからなる残基が全てシ
トシン残基に置き換えられた。ｐＧＬ３−２４０ｍの活
性はアッセイし、ＮＦ−ＩＬ６発現に関与しないことが
分かった（図１２参照）。この結果、−６６位から−５
８位のＮＦ−ＩＬ６の結合部位がｍミンクルのプロモー
ター活性に必要であることを示された。

【００３７】さらに、ｍミンクルプロモーターの−６６
位から−５８位へのＮＦ−ＩＬ６の結合について検討し
た。ｍミンクルのプロモーターの−６６位から−５８位
にＮＦ−ＩＬ６が反応するか否かをテストした。結果を
図１３に示す。即ち、−７６から−４５の配列に対応す
る２本鎖のオリゴヌクレオチドＰ１のを^３２Ｐで放射線
ラベルし、コントロールとしてＮＦＩＬ６ Ｍ１細胞
（レーン１）又は１２時間ＩＰＴＧ処理したＮＦＩＬ６
Ｍ１細胞（レーン２−６）から調製した核蛋白質とイン
キュベートした。ヒトＩＬ−６プロモーター（ＩＬ
６）、Ｐ１、変異Ｐ１（ｍＰ１）からの２本鎖オリゴヌ
クレオチドをコンペティターとして、Ｐ１プローブの１
００倍モル過剰に加えた（レーン３−５）。レーン６は
ＮＦ−ＩＬ６に対するウサギポリクローナル抗体を結合
反応に加えたものである。スーパーシフトされた複合物
（Ｓ）、プローブ−核蛋白質複合物（ＮＦ）、及び遊離
プローブ（Ｆ）のそれぞれの位置を図１３の右側に記載
した。

【００３８】図１３に示されるように、Ｐ１プローブは
ＩＰＴＧ処理されたＮＦ−ＩＬ６Ｍ１細胞から調製され
た核抽出液と共に培養される時、幅広い結合活性が現れ
る（図１３のレーン２）。ヒトＩＬ−６プロモーター
（ＩＬ６）、Ｐ１、及びレポーター遺伝子アッセイのと
きと同じ変異をさせた変異Ｐ１（ｍＰ１）からの先天性
のＮＦ−ＩＬ６結合性を比較のために行った。１００倍
モル過剰のラベルをされていないＩＬ６とＰ１オリゴヌ
クレオチドが核蛋白−ＤＮＡ複合物と競合した（図１３
のレーン３及び４）。しかし、ｍＰ１はこれら全てを消
すことは出来なかった（図１３のレーン５）。ＮＦ−Ｉ
Ｌ６に対するウサギのポリクロナール抗体はこれらの複
合物の生成を阻害するが、他の大きくシストした複合物
を形成する（図１３のレーン６）。

【００３９】さらに、ＮＦ−ＩＬ６蛋白がＰ１オリゴヌ
クレオチドと結合している事を確認するため、ＮＦ−Ｉ
Ｌ６Ｍ１細胞の核抽出液のかわりに精製したＧＳＴ−Ｎ
Ｆ−ＩＬ６融合蛋白を用いてテストした。結果を図１４
に示す。即ち、Ｐ１プローブをＧＳＴ蛋白質（レーン
１）又はＧＳＴ−ＮＦ−ＩＬ６融合蛋白質（レーン２−
５）とインキュベートした。この結合反応に１００倍モ
ル過剰の非ラベルＩＬ６、Ｐ１、及びｍＰ１を加えた
（レーン３−５）。プローブ−ＧＳＴ−ＮＦ−ＩＬ６融
合蛋白質複合体（ＮＦ）及び遊離プローブ（Ｆ）の位置
を図１４の右側に示す。この結果、ＤＮＡプローブと特
異的な複合物を形成することが分かった（図１４のレー
ン２）。ＤＮＡ−蛋白複合物はラベルされていないＩＬ
６とＰ１オリゴヌクレオチドとの競合により消すことが
出来るが、ｍＰ１オリゴヌクレオチドでは出来ない（図
１４のレーン３−５）。これらの結果はＮＦ−ＩＬ６が
ｍミンクルのプロモーターの−６６位から−５８位に結
合することを明らかにし、そしてそれはＮＦ−ＩＬ６が
コンセンサス配列に結合することにも一致する。

【００４０】本発明のひとつの目的は、ＩＦ−ＩＬ６の
下流の標的物を同定することを通して、マクロファージ
におけるＮＦ−ＩＬ６の機能を明確にすることにある。
サブトラクションクローニングにより、新規なＣ−タイ
プレクチン即ち、本発明のミンクルを単離した。そし
て、このものはＮＦ−ＩＬ６（−／−）マクロファージ
においては、炎症性の刺激に対応する発現では非常に減
少する。ミンクル遺伝子の発現は、バクテリアのリポポ
リサッカライド、野生型ＰＭΦにあるＩＦＮ−γ、ＩＬ
−６、ＴＮＦ−αを含むいくつかの炎症性サイトカイン
により強く誘発される。本発明においては、ミンクルｍ
ＲＮＡの発現は、炎症発生物で処理されたＰＭΦ、マク
ロファージセルラインＲＡＷ２６４．７、骨髄芽球の白
血病セルラインＭ１の中でのみ観察された。ミンクル遺
伝子の発現は炎症性のメディエーターにより刺激された
骨髄単球に属する細胞のみに制限されるかもしれない。

【００４１】マクロファージは、リウマチ性関節炎（Ch
u,C.Q., et al.,(1991) Clin Exp Immunol 86(3), 380-
6）、いろいろな腫瘍（Mantovani,A., et al.,(1992)Im
munol Today 13(7), 265-70）、傷（Leibovich,S.J., e
t al.,(1988) Prog Clin BioI Res 266,131-45）などの
炎症性サイトカイン濃度が高い様々な炎症領域に浸透す
る。ミンクルはこれらの状態を正常化し、そしてマクロ
ファージの浸透にいくつかの役目を演じている。ＮＦ−
ＩＬ６欠損（−／−）マクロファージは、ＬＰＳやＩＦ
Ｎ−γで充分活性化するよう処理されても、殺菌活性や
腫瘍の細胞毒性に欠ける。ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）
腹腔マクロファージ（ＰＭΦ）におけるミンクルの低い
レベルの誘発は、ミンクルが殺菌活性や腫瘍の細胞毒性
の役割を果たしているという可能性を示している。ミン
クルの期待される機能は、微生物や腫瘍細胞の表面の炭
化水素を認識することであり、次いでマクロファージを
活性化する。活性化されたマクロファージは、ナチュラ
ルキラー細胞がナチュラルキラーレセプター蛋白１を通
じてターゲット細胞を認識し腫瘍やウイルス細胞を殺す
ように、細菌や腫瘍細胞を溶解がして殺す（Chambers,
W. H., et al.,(1989) J Exp Med 169(4), 1373-89 ；
Ryan,J.C., et al.,(1991) J Immunol 147(9), 3244-5
0）。

【００４２】ミンクルはＮＦ−ＩＬ６の転写制御のもと
で、マクロファージを活性化することにより、このよう
な免疫のサーベイサンスプロセスに包含されている。し
かし、ミンクルの生物学的機能を正確に述べるためには
更なる研究が必要である。ミンクルはＧ−ＣＳＦに加え
ＮＦ−ＩＬ６のターゲット遺伝子であるけれども、ミン
クルのプロモーター配列はＧ−ＣＳＦのものとは全く異
なる。Ｇ−ＣＳＦのプロモーターは−１６５と−１９６
ｂｐとの間のセグメントリ、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のプロモ
ーターエレメント１（ＧＰＥ１）を含み、それはマクロ
ファージにおいて、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のＬＰＳの発現の
誘発に重要な役目を行っている（Nishizawa,M., et a
l.,(1990) Mol Cell Biol 10(5), 2002-11）。ＧＰＥ１
の引き続いた研究は、ＧＰＥ１にあるＮＦ−κ結合エレ
メントとＮＦ−ＩＬ６に近いエレメントの両方がＴＮＦ
−αとＩＬ−１βによるＧ−ＣＦＳプロモーターの誘発
に重要である（Shannon,M.F., et al.,(1992) Growth F
actors 7(3), 181-93）。

【００４３】ＮＦ−κＢｐ６５とＮＦ−ＩＬ６の両方が
ＧＰＥ１に結合して、ＤＮＡと３者の複合物を作る。ミ
ンクル遺伝子は１．７ｋｂプロモーター領域に３箇所の
ＮＦ−κＢ結合モチーフを有すると推定されるが、これ
らのサイトはＮＦ−ＩＬ６の結合に不可欠なエレメント
とは別に存在する。ＮＦ−κＢが炎症においてミンクル
遺伝子の転写をシグナル誘発する可能性をもある。しか
し、ＮＦ−κＢはミンクルプロモーター上でＮＦ−ＩＬ
６と直接相互作用をするものではない。ミンクル遺伝子
プロモーターは、Ａｐ−１やｃ−Ｅｔｓなどのような他
の炎症を活性化する転写因子が結合し得るエレメントを
潜在的に持っている。これら転写因子はＮＦ−ＩＬ６と
協力してマクロファージでのミンクル遺伝子の誘発に働
いているのかも知れない。最近の報告では、Ｃ／ＥＢＰ
α、−β、−δ、及び−εの活性はＩＬ−６及びＭＣＰ
−１の発現に関しては必要がないことが示されている
（Williams,S.C., et al.,(1998) J Biol Chem 273(2
2), 13493-501 ； Hu,H.M., etal.,(1998) J Immunol 1
60(5), 2334-42）。

【００４４】Ｃ／ＥＢＰα、−β、−δ、及び−εの異
所での発現は、Ｐ３８８リンパ芽球へのＩＬ−６及びＭ
ＣＰ−１のＬＰＳ誘発発現に充分である。Ｐ３８８リン
パ芽球は通常Ｃ／ＥＢＰ因子を欠き、炎症性サイトカイ
ンのＬＰＳ誘発を起こさない。事実Ｃ／ＥＢＰδはＮＦ
−ＩＬ６と似た発現パターンを示し、炎症の時に誘発さ
れるいくつかの遺伝子の制御に関与していることが示さ
れている（Kinoshita,S., et al.,(1992) Proc Natl Ac
ad Sci USA 89(4),1473-6）。これは、ＮＨ−ＩＬ６の
欠落がイン・ビボでのＬＰＳ処理によるＣ／ＥＢＰδの
誘発により、部分的に補償されることに似ている。他の
ＮＦ−ＩＬ６ファミリーの蛋白が、ＬＰＳで刺激された
マクロファージにおけるミンクル及びＧ−ＣＳＦの発現
ではなく、ＩＬ−６やＭＣＰ−１の発現を補償する精密
なメカニズムはまだ明確にされていない。ミンクル蛋白
の配列はグリコプロテインエンドサイトーシスに介在す
ることが多いグループ２ Ｃ−タイプレクチン類と高度
に類似している。このグループのプロトタイプはアジア
ログリコプロテインレセプターで、肝臓細胞の表面蛋白
はガラクトース末端と結合し、暴露された上をグリコプ
ロテイン が循環している。

【００４５】このレセプターは血清グリコプロテインの
直接の変化ではなく、それらのインターナリゼーション
に導かれ、エンドサイトを介してリソソームに送られ
る。ヒトアジアログリコプロテインレセプター Ｈ１サ
ブユニットは レセプターのためのインターナリゼーシ
ョンモチーフ内にあるポジション５に細胞質チロシンを
含む。（４６）急な細胞表面のインターナリゼーション
はチロシンを含むアミノ酸のショートストレッチが必要
であると一般に言われている。グループ２ Ｃ−タイプ
レクチンの他のメンバーであるＭ−ＡＳＧＰ−ＢＰ
（４、4. li, M., Kurata, H., Itoh, N., Yamashina,
I., and Kawasaki, T. (1990) J Biol Chem 265(19), 1
1295-8）、ＣＤ２３（４８、48. Kikutani, H., Inui,
S., Sato, R., Barsumian, E. L., Owaki, H., Yamasak
i, K., Kaisho, T., Uchibayashi, N., Hardy, R. R.,
Hirano, T., and et al. (1986) Cell 47(5), 657-6
5）、ｇｐ１２０Ｃ−タイプ結合レクチン（４９、49. C
urtis, B. M., Schamowske, S., and Watson, A. J. (1
992) Proc Natl Acad Sci U S A 89 (17), 8356-60）、
カッファーセルフコースレセプター（５０、50. Hoyle,
G. W., and Hill, R. L. (1988) J Biol Chem 263(1
6), 7487-92）は細胞質領域にチロシンを持っている。
しかしミンクルの細胞質領域にチロシンを持っていな
い、これはミンクル蛋白が充分にエンドサイトーシス出
来ないことを示している。他の細胞質内にチロシンを持
たないＣ−タイプレクチンはＭＣＬである、この蛋白連
鎖はミンクルと最も高い一致を示す。

【００４６】ミンクルやＭＣＬはいくつかの一般的な特
徴を示す。蛋白の配列はグループIIＣ−タイプレクチン
と高い相似性を示すこと、マクロファージ領域で転写が
非常に良く発現すること、細胞質領域にはチロシン残基
を含まないこと、ネズミの遺伝子は染色体６にマップさ
れることなどである。この様に、ミンクルとＭＣＬはグ
ループIIＣ−タイプレクチンに属するものであると分類
することが出来る。結論として、我々はマクロファージ
領域でＮＦ−ＩＬ６の調整のもと、炎症発生物に反応し
て強く誘導されるＣ−タイプレクチンであるミンクルを
単離し、その性質を明らかにしてきた。ミンクルリガン
ドの同定や、ミンクル遺伝子の標的とされる作用はイン
ビボでの生理的役割を説明する助けになるだろう。

【００４７】本発明のミンクル蛋白質はマクロファージ
にたいする活性作用を有し、免疫系の各種疾患、例え
ば、感染症や炎症、炎症性疾患などの治療・予防剤とし
て有用である。本発明の医薬組成物は本発明のミンクル
及び製薬上許容される担体からなるものであり、製薬上
許容される担体としては製剤化に再して使用される各種
の添加剤を使用することができる。本発明の医薬組成物
は、注射剤、座剤、液剤など投与形態に応じて適宜製剤
化することができる。本発明の医薬組成物の投与方法と
しては、種々の方法で投与することができるが、非経口
投与が好ましい。また、本発明の医薬組成物の投与量と
しては、患者の様態や疾患の種類にもよるが、通常の蛋
白質製剤と同程度の量を投与することができる。

【００４８】本発明は、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子の部分配列を有する遺伝子を提供する。本発明の蛋
白質をコードする遺伝子としては、配列表の配列番号１
に記載されているＤＮＡを例示することはできるが、こ
れに限定されるものではない。本発明の部分配列からな
るポリヌクレオチドは、すくなくとも１４塩基以上、好
ましくは２０塩基以上、さらに好ましくは３０塩基以上
のものが挙げられる。部分配列の好ましい部分は、当該
ポリヌクレオチドの使用目的により適宜選択することが
できる。例えば、本発明の部分ポリヌクレオチドをアン
チセンスとして使用する場合には、非翻訳領域の一部の
相補鎖からなものが好ましく、またプローブとして使用
する場合には本発明の遺伝子の特異的な配列を有する部
分が好ましい。さらに、本発明の部分配列ポリヌクレオ
チドは、ＰＣＲなどの際のポロモーターとしても使用す
ることができる。さらに、本発明は本発明の蛋白質に対
する抗体を提供する。本発明の抗体を製造する際の感作
抗原としては、本発明の蛋白質を全長のまま使用しても
よいが、そのアミノ酸配列の部分長のペプチドを使用す
ることもできる。この感作抗原をウサギ、ラット、マウ
スなどに感作させた後、常法によりポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体を得ることができる。

【００４９】

【実施例】次に、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００５０】以下の実施例において使用される試薬類
は、つぎに記載のとおりの方法で入手した。リポポリサ
ッカライド（ＬＰＳ）（大腸菌 O55:B5)チオグリコレ
ート液（Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ ｆｏｍｕｌａ）はＤｉｆｃ
ｏ（Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）から購入した。インターフ
ェロンγ（ＩＦＮ−γ）、白血球コロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＦＳ）、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−
α）はＧｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）か
ら得た。ＤＮＡ制限、修正酵素は東洋紡（大津、Ｊａｐ
ａｎ）から得た。オリゴヌクレオチドは日清紡（東京）
で合成された。イソプロピル−β−D−チオガラクトサ
イド（ＩＰＴＧ）はナカライテスク（京都、Ｊａｐａ
ｎ）で製造された。ストレプトマイシン、ペニシリンG
は明治製菓（東京）。 ［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（３００
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はアーマシャムファーマチカビオッ
チ（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ ＵＫ）から得
た。

【００５１】ＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）マウスは（１
８、18. Tanaka, T., Akira, S., Yoshida, K., Umemot
o, M., Yoneda, Y., Shirafuji, N., Fujiwara, H., Su
ematsu, S., Yoshida, N., and Kishimoto, T. (1995)
Cell 80(2), 353-61）で述べた様に遺伝子組み替えで生
まれた。ＮＦ−ＩＬ６（−／−）マウス、野生型マウス
はヘミ接合の雌と雄をかけあわせ一回の出産で生まれ
た。

【００５２】実施例１（ＰＭΦの準備） ＰＭΦは、８−１２週のマウスの腹腔に２ｍｌのステリ
ルチオグリコレートを注射後４日のち腹腔をリン酸緩衝
液サリン（ＰＢＳ）で洗浄して得られた。ＰＭΦはマク
ロファージカルチャー溶液（ＭＣＭ）中２．５X１０^６
／皿になるよう１０ｃｍのプラスチック皿に置かれた。
ＭＣＭはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅ
ａｇｌｅ’ｓメディウム（ＤＭＥＭ；ニッスイ、東京）
を１０％牛血清で溶解した物、２ｍＭ Ｌ−グルタミ
ン、５０Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、１００μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシンそして、１０Ｕ／ｍｌペニシリンＧ
よりなる。２時間の培養後皿はバラバラの細胞になるよ
う強く洗われた。新しいＭＣＭが２日めに加えられ、４
日にはＧＭ−ＣＦＳ無しのＭＣＭが培養に加えられた。
ＰＭΦは５日目にＲＮＡを回収のため適切な試薬で扱わ
れた。

【００５３】実施例２（細胞株） ねずみの白血病細胞（ＢＣＬ−１）、骨髄腫細胞（ＭＯ
ＰＣ ３１５）、胸腺腫細胞（ＥＬ−４）ヒト白血病単
球細胞が、１０％牛胎児血清、１００μｇ／ｍｌのスト
レプトマイシン、１０U／ｍｌペニシリンＧを含むＲＰ
ＭＩメヂューム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で培養された。ねずみのナチュラ
ルキラー細胞（５Ｅ３)は、１０％牛胎児血清、５００
Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を加えたＲＰＭ
Ｉ １６４０中で培養された。ＮＦＩＬ６Ｍ１細胞は２
倍濃縮のアミノ酸、ビタミン、１０％牛胎児血清４００
μｇ／ｍのゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、 ５０
μｇ／ｍのハイグロマイシンＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むミニマム
エッセンシャルメヂューム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で
培養された（２１、21. Matsumoto, M., Sakao, Y., an
d Akira, S. (1998) Int Immunol 10(12),1825-35）。
ねずみのマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）、線
維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、ヒト腎臓胚芽細胞（２９３
T）は１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０Ｕ
／ｍｌペニシリンＧを含むＤＭＥＭ中で培養された。

【００５４】実施例３（サブトラクションｃＤＮＡライ
ブラリーの構築と特別なスクリーニング） 全ての手順は主にＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡサブトラク
ションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ，Ａｌｔ
ｏ，ＣＡ)で行われた。野生型とＮＦ−ＩＬ６（−／
−）ＰＭΦの８０％混合物は、１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳ
と１００U／ｍｌＩＦＮ−γの中に１６時間置かれた。
全てのＲＮＡはポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ選択用オリゴテック
ス−ｄＴ３０ラテックスビーズ（宝、大津、Ｊａｐａ
ｎ）を用いたＲＮＡイージーキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈ
ｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で用意された。テスタ
ー、ドライバーｃＤＮＡは野生型ＰＭΦとＮＦ−ＩＬ６
（−／−）ＰＭΦの２μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡより合
成された。ＮＦ−ＩＬ６誘発遺伝情報を選ぶためＲｓａ
１ダイジェスティドテスターｃＤＮＡがオリゴヌクレオ
チドリンカーと結合され過剰のドライバーｃＤＮＡｓと
掛け合わせられた。

【００５５】ハイブリダイゼーションの後、アドヴァン
テージｃＤＮＡポリマーラスミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ)を用いてさまざまな転写が選択的に拡大された。プ
ライマリーポリマーチェインリアクション（ＰＣＲ)は
サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ９６００；Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ)上で
２７サイクルでなされた、ネステッドＰＣＲは１０サイ
クルでなされた。ネストされた物質はｐＴ７ブルーTベ
クター（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ１）に
挿入された。独立したクローンはコロニィＰＣＲで拡大
された、そして異なったスクリーニングが１０００のク
ローンに指示のようになされた。簡単には、コロニィＰ
ＣＲの生成物はハイドロゲンＮ＋メンブランス上に複製
の形での点のブロットである。それぞれのDNAブロット
はそれ自体とハイブリダイズのもの（”＋”サブトラク
トプローブ）、または、逆にサブトラクトされたｃＤＮ
Ａ（ ”−”サブトラクトプローブ）であった。”−”
サブトラクトプローブをつくるにはサブトラクションハ
イブリダイゼーションが、テスターｃＤＮＡをドライバ
ーとして、またドライバーｃＤＮＡをテスターとして行
われる。”＋”プローブのみのハイブリダイズであるク
ローンが、ラベルされた染料を用いジデオキシヌクレオ
チド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩ
ＳＭ ３７７ ＤＮＡ シークエンサー）を利用してオ
ートシークエンサーでシークエンスされた。照合がＤＤ
ＢＪブラストサーバーを利用しＤＤＢＪデーターベース
で得られる。

【００５６】実施例４（ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡ
ＣＥ（rapid amplification of cDNAends）） ｃＤＮＡエンドの急速増幅（５’−ＲＡＣＥ、３’−Ｒ
ＡＣＥ）はマラソンｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）で行われる。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと１００
Ｕ／ｍｌＩＦＮ−γで刺激された野生型ＰＭΦからの１
μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを用いて、アダプター２重結
合鎖のｃＤＮＡライブラリーが述べられた様に出来た。
充分な長さのマウスミンクルｃＤＮＡを得るには、アン
チセンスプライマーとして、２７０F（５’−ＧＡＧＡ
ＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧ−
３’）、センスプライマーとして９２Ｒ（５’−ＣＣＣ
ＴＡＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣ−
３’）が用いられた、これは５’−ＲＡＣＥ、３’−Ｒ
ＡＣＥ用の引き算クローニングのｃＤＮＡ断片の連鎖で
ある。ＰＣＲ反応は４０ｍＭトリシン−ＫＯＨ、ｐｈ
９．２、１５ｍＭＫＯＡｃ、３．５ｍＭＭｇ（ＯＡ
ｃ）、７５μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、２００μＭｄ
ＮＴＰｓ、０．２μＭの２７０Ｆまたは９２Ｒ、０．２
μＭのアダプタースＤＮＡ断片 １（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ)、５μｌの２重結合鎖のｃＤＮＡ 溶液、１μｌ の
アドヴァンテージｃＤＮＡポリメラーズミックスを含む
５０μｌ反応溶液でなされた。ＰＣＲ条件は９４℃３０
秒、さらに９４℃ ５秒と７２℃２分の５回繰り返し、
９４℃ ５秒と７０℃２分の５回繰り返し、９４℃ ５秒
と６８℃２分の２０回繰り返しである。

【００５７】出来た物質１３１２ｂｐ、１０３９ｂｐは
アガロースゲルで純粋化さＴTベクターにサブクローン
しシークエンスされた。ヒトミンクル（ｈミンクル）を
得るため、ＬＰＳ−刺激（５μｇ／ｍｌ）されたＴＨＰ
−１細胞ｍＲＮＡより抽出されたものを低級プライマー
としてＰＣＲにかけｃＤＮＡが合成される。’５プライ
マー（５’−ＧＴＧＡＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧ-
３’）と３’プライマー（５’−ＤＡＴＲＴＴＧＴＴＧ
ＧＧＹＴＣＮＣＣ−３’）はｍミンクルＣＲＤの一部を
カバーするようにデザインされている。ＰＣＲ条件は９
４℃３０秒、さらに９４℃ ５秒と５０℃３０秒の３５
回繰り返しである。出来た３１１ｂｐはｐＴ７ブルーベ
クターにサブクローンされシークエンスされた。アンチ
センスプライマー（５’−ＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＧ
ＡＣＡＡＴＴＣＴＴＧ−３’）とセンスプライマー
（５’−ＡＧＧＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＡＧＴ
ＣＴＣＴＧ−３７）はシークエンスから得られた、そし
て５’−，３’−ＲＡＣＥは、ＬＰＳ−刺激されたＴＨ
Ｐ−１細胞より得られたアダプター２重結合鎖のｃＤＮ
Ａを用いてなされた。

【００５８】実施例５（ノーザンブロット分析） 全てのＲＮＡは６．０％ホルムアルデヒドを含む１．０
％アガロースゲルで分離された。ハイボンドＮ＋メンブ
ラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）に移し変えた後、エキスプレスＨｙｂ、ハイブ
リダイゼーション溶液の中、６５℃、２時間、変性した
プローブと、ハイブリダイゼーションが行われた。メン
ブランは、６５℃、２ＸＳＳＣで１０分、２回洗われ
、６５℃で０．２ＸＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで１回洗
われた後、ＢｉｏＭａｘ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ、
Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露光された。ｍミンクル
のＲｓａ １−Ｒｓａ １ ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチ
ド１１８８−１４０４）、マウスＮＦ−ＩＬ６（Ｘ６２
６００ヌクレオチド １３５−８９７）のＳｐｈ １−
Ｓｐｈ １ｃＤＡＮ断片、マウスＭＩＰ−２（Ｘ５３７
９８ヌクレオチド １４９−８４０）のｃＤＮＡ断片、
マウスのグリセラアルデヒド−３−フォスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ；Ｍ３２５９９ヌクレオチド
５６６−１０１７）のｃＤＮＡ断片はプローブとして
使われた。ｃＤＮＡは［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３００
０Ci／ｍｍｏｌ）を用い、メガプライムラベリングシス
テム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）で放射線ラベル化された。

【００５９】実施例６（異種戻し交雑マウスのマッピン
グ） 異種戻し交雑の子孫は、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｘ Ｍ．
ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１の雌とＣ５７ＢＬ／６Ｊの雄を交
配して作られた。（２４）２０５匹にわたるＮ _２マウス
がミンクル遺伝子座のマップに使われた。（詳細はテキ
ストを参照）ＤＮＡの分離、制限酵素による分解、アガ
ロースゲルによる電気泳動、サザーンブロットによる移
し変えとハイブリダイゼーション は述べられた様にに
行われた。（２５）全てのブロットはハイボンドＮ＋ナ
イロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で用意された。ｍミンクルｃＤＮ
Ａ断片（ヌクレオチド １５４９−２５１７）はニック
トランスレーションラベリングキットを用いて［α−
^３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルされ、１．０ＸＳＳＣＰ、
０．１％ＳＤＳ、６５℃で充分洗浄された。断片３７ｋ
ｂはＢａｍＨＩ分解Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＤＮＡから検出
された、６．５ｋｂはＢａｍＨＩ Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ
ＤＮＡからら検出された。６．５ｋｂＢａｍＨＩＭ．ｓ
ｐｒｅｔｕｓ−スペシフィック断片の有無は戻し交雑し
たマウスついて行われた。Ａｔｐ６ｅ、Ｓｌｃ２ａ３、
Ｃｄ４を含むミンクルにリンクする、プローブや制限断
片長さの多発性（ＲＦＬｓ）遺伝子座の説明はすでにレ
ポートされている（２６、26. Puech, A., Saint-Jore,
B., Funke, B., Gilbert, D. J., Sirotkin, H., Cope
land, N. G., Jenkins, N. A., Kucherlapati, R., Mor
row, B., and Skoultchi, A. I. (1997) Proc NatI Aca
d Sci U S A 94(26), 14608-13）。組み替えの距離はマ
ップマネージャーバージョン２．６．５で計算された。
遺伝子単位の測定が対立遺伝子の分散パターンを説明す
るため、組み替え数を少なくして行われた。

【００６０】実施例７（フローサイトメトリック分析） ｍミンクル発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で作ら
れた。 ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍミンクルフラッグ
を作るため、正、逆のプライマーが、最適のコーザック
コンセンサス連鎖とフラッグエピトープを作るために用
いられた。正のプライマー連鎖は５’−ＧＧＴＣＧＡＣ
ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＡＡＴＣＧ−３’
であり、逆のプライマーの連鎖は５’−ＣＴＣＡＣＴＴ
ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡ
ＧＧＡＣＴＴＡＴ−３’である。ＰＣＲはＲＡＣＥをテ
ンプレートとして作られた２重鎖ｃＤＮＡを使いなされ
た。

【００６１】増幅された生成物は、ｐＴ７ブルーＴベク
ターにサブクローンされ、Ｓａｌ１分解で削除された後
シークエンスで確認された。ｍミンクルフラッグ断片は
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＸｈｏ位置に正しい方向で接
合された。トランスフェクションの前日、２９３T細胞
は６口プレートに２．０ｘ１０^５細胞／口になるよう植
え付けられた。４μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍミ
ンクルフラッグもしくは、ｐｃＤＮＡ空のベクターがリ
ン酸カルシュウム沈殿法で仮りにトランスフェクトされ
た。細胞は０．０２％ＥＤＴＡを用いて培養容器から離
れＰＢＳ中で４８時間トランスフェクションされ、サイ
トメトリーバッファー（ＰＢＳと２％牛胎児血清、０．
１％ＮａＮ_３）で洗われた。細胞は１５μｇ／ｍｌのビ
オチン接合アンチフラッグＭ２アンチボディ（ＢｉｏＭ
２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ）とともに氷上で２０分培養された。サイトメトリ
ーバッファーで洗浄後、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−スト
レプタビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）でラベルされた。細胞はトランスフェクシ
ョンから４８時間後サイトメトリック分析のため取られ
た。コントロールはＦＩＴＣ−ストレプタビジンだけで
処理された細胞を用いた。サイメトリーバッファーで最
終的に洗浄された後、ｍミンクル−フラッグ発現物はＣ
ＥＬＬｑｅｓｔソフトウエアーを用いＦＡＣＳ Ｃａｌ
ｉｂｕｒで分析された。

【００６２】実施例８（ウエスタンブロット分析） トランスフェクションの前日、２９３Ｔ細胞は１００ｍ
ｍプレートに２．０ｘ１０^６／プレートになるよう植え
られた。２０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍミンク
ルフラッグもしくは、ｐｃＤＮＡ空のベクターがリン酸
カルシュウム沈殿法で仮りにトランスフェクトされた。
細胞は０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリスＨＣｌｐ
ｈ７．４を含むリーシスバッファーで溶解された。細胞
溶解物は、プロテイン−Ｇセファロース（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１０μｇ
／ｍｌのアンチ−フラッグＭ２アンチボディとともに免
疫沈降された。免疫沈降物は、リーシスバッファーで４
回洗われ、ラエムリサンプルバッファー中に懸濁され
た。５分煮沸後、サンプルはＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル上でグラディエント（１０−２０％）され分離され
る、更にニトロセルロースメンブランに電気泳動し移さ
れる。メンブランは、ＢｉｏＭ２アンチボディとともに
培養される、更にホースラディシュパーオキシダーゼ結
合ストレプタビジン（Ｇｅｎｚｙｍｅ）で処理され、化
学蛍光検出システム（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
Ａ）で免疫活性が分析された。

【００６３】実施例９（ｍミンクルフランキング領域の
分離と遺伝子の評価） Ａ １２９／Ｓｖマウス肝臓ゲノムＤＮＡが入ったλＦ
ｉｘ２ベクターがストラタジェンから購入された。１ｘ
１０^６のプラークがｍミンクル（ヌクレオチド１２６−
４９６）の^３２ＰラベルＥｃｏ Ｒ１−Ｅｃｏ Ｒ１ｃ
ＤＮＡでスクリーニングされた。ゲノムライブラリーの
陽性のプラークは更に２回のスクリーニングで充実され
た。２つの固有のクローンから得られたＤＮＡはウィザ
ードプレップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で純粋化され
た。いろいろな制限酵素による分解で２つのクローンが
同一の連鎖を持つことが判明した。引き続きＢａｍ Ｈ
１とＳａｌ１により分解し、５つの断片（５．４ｋｂ、
５．１ｋｂ、３．２ｋｂ、０．８ｋｂ、０．６ｋｂ）が
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）にサブクローンされ
シーケンスされた。エクソン１と５’フランキング領域
を含む５．１ｋｂ Ｂａｍ Ｈ１−ＢａｍＨ１断片、は
ｐＢＳ／Ｂａｍ１−８であることを示し、プロモーター
ルシファラーゼ構築に用いられる。適切な５’−プライ
マー通常の３’−プライマーはｍミンクルのプロモータ
ー領域を増幅するため合成される。以下のプライマー
が、ｐＧＬ３−１７８３／＋６９、ｐＧＬ３−１１９０
／−６９、ｐＧＬ３−２４０／＋６９、ｐＧＬ３−６１
／＋６９を発生する、

【００６４】−１７８３（５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＧＧ
ＴＴＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡＧＧＡＧ−３’） −１１９０（５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＴＧＧＣ
ＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＧ−３’） −２４０（５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＡＡＡＴＣＧＧＧＡ
ＣＣＡＡＧＴＴＡＧＡＣ−３’） −６１（５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡ
ＡＡＴＴＣＴＧＡＣ−３’） −６９（５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡ
ＧＴＧＡＧＴＣＴＴＧ−３’）。 増幅された生成物はｐＴ７ブルーＴベクターにサブクロ
ーンされ確認のためシークエンスされた。挿入された断
片はＭｌｕ１とＢｇｌ２で切られｐＧＬ３基本ベクター
（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に同じ制限
部位で結合された。ｐＧＬ３−１６６／＋６９を作るた
め、ｐＧＬ３−２４０／＋６９がＭｌｕ１とＡａｔ１で
分解された、ブラントエンドができ再結合する。ＮＦ−
ＩＬ６結合部位の突然変異はクイックチェンジサイトデ
ィレクティドミュウタジェネシスキット（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ)により進められた。変異源のプライマーは
（下線の変異ヌクレオチドを持つ）５’−ＣＣＴＴＧＴ
ＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧ−
３’である。変異の構造はシークエンシングで確認され
た。短命なトランスフェクトがＮＦＩＬ６Ｍ１細胞にな
され、発光酵素法がなされた（２１、21. Matsumoto,
M., Sakao, Y., and Akira, S. (1998) Int Immunol10
(12), 1825-35）。

【００６５】実施例１０（プライマー伸長分析） プライマー伸長が述べられた様になされた（２７、27.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (19
89) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sp
ring Harbor, NY）。要約すると、オリゴヌクレオチド
プライマーからミンクルｃＤＮＡの８１−１１２のヌク
レオチドが合成され、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼで末端がラベルされた。ＬＰＳ刺
激されたＰＭΦより得た１０μｇのＲＮＡは１０４ｃｐ
ｍのラベルされたオリゴヌクレオチドと共に１０ｍＭパ
イプｐｈ６．４、１ｍＭＥＤＴＡｐｈ８．０、０．４Ｍ
ＮａＣｌ中で３０℃１６時間ハイブリダイズされた。エ
タノール沈降の後サンプルは５０ｍＭトリス／ＨＣｌｐ
ｈ８．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイ
トール、７５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２０Ｕ
ＲＮａｓｅインヒビターを含む反応溶液に溶かされた。
逆転写が２００Ｕスーパースクリプト２（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を加え４２
℃、３０分行われた。伸長した反応物はエタノール沈殿
され、６％ポリアクリルアミド７Ｍウレアシークエンシ
ングゲルで分析された。

【００６６】シークエンス反応を、別に放射性ラベルを
持たない同じプライマーでセットアップした、これはｍ
ミンクルのフランキング領域をカバーするｐＢＳ／Ｂａ
ｍ１−８ゲノムクローンをテンプレートとしてセットア
ップされ、同じシークエンシングゲル上で延長物質と共
に、平行して反応された。

【００６７】実施例１１（電気泳動分析） 以下の単鎖オリゴヌクレオチドは電気泳動分析のために
合成された。Ｐ１（ｍミンクルプロモーターの−７６か
ら−４５位置）、５’−ＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣ
ＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧ−３’、５’−ＧＴ
ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＣＡＡＧＧＡ
ＣＡＡＧＧ−３’；ｍＰ１、５’−ＣＣＴＴＧＴＣＣＴ
ＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧ−３’、
５’−ＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣ
ＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧ−３’；ＩＬ６（ヒトＩＬ６プロ
モーターの−１６５から−１３８位置）、５’−ＧＧＡ
ＣＧＴＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴ
−３’、５’−ＡＴＴＡＴＴＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡＡ
ＴＧＴＧＡＣＧＴＣＣ−３’。下線をしたヌクレオチド
は変異鎖を示す。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドは２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐｈ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファー中で７５℃
で５分加熱し室温の戻すことによりアニーリング出来
る。

【００６８】プローブはクレナウ断片酵素で［α−^３２
Ｐ］でラベルされる。ＮＦＩＬ６Ｍ１の核の抜き取りは
述べられた様になされた（２１、21. Matsumoto, M., S
akao, Y., and Akira, S. (1998) Int Immunol 10(12),
1825-35）。ｐＧＥＸ−４Ｔ−２にあるグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子の下流にある、
ヒトＮＦ−ＩＬ６（（７）アミノ酸２４−３４５）を挿
入したｐＧＥＸ−ＮＦＩＬ６プラスミドは、Ｓ．ハシモ
トの贈り物である。空のｐＧＥＸ−４Ｔ−２とｐＧＥＸ
−ＮＦＩＬ６プラスミドは、ＧＳＴとＧＳＴ−ＮＦ−Ｉ
Ｌ６プロテインをそれぞれ作るため大腸菌ＢＬ２１に入
れられる。ｐＧＥＸ形質転換した大腸菌は１ｍＭＩＰＴ
Ｇで誘発され、幾何級数的途中まで増殖される、その後
低張性バッファーで音波粉砕される。バクテリア溶液か
ら得られた蛋白はグルタチオン対のセファロースビーズ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）で精製される。濃縮された蛋白は、ＢＣＡ蛋白検出
試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で確認
された。核の抽出物、またはＧＳＴ溶解蛋白は１ｘ１０
^４ｃｐｍ のラベルされたＤＮＡプローブと共に、１０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐｈ７．８、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐｈ８．０、５ｍＭＭｇＣｌ
_２、１０％グリセロール、３μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）含む２５μｌのバインディングバッファー中で培養
された。比較検出が同様の方法でなされた、ただし、上
記反応液はラベルされたプローブを加える前に、１００
倍のラベルされていないオリゴヌクレオチドと共に４
℃、３０分予備培養された。スーパーシフトが２００ｎ
ｇのアンチ−Ｃ／ＥＢＰβアンチボディ（Ｃ−１９；Ｓ
ａｎａｔ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で行われ、反応液はラベル
されたプローブを加える前４℃、３０分予備培養され
た。サンプルはネイチブ５％ポリアクリルアミドゲル上
に置かれ、２５ｍＭトリス、ｐｈ８．５、１９０ｍＭの
グリシン、１ｍＭのＥＤＴＡ中で３０ｍＡで電気泳動さ
れた。ゲルは放射線感光のため乾燥された。

【００６９】

【発明の効果】本発明は、核因子ＮＦ−ＩＬ６の下流の
標的生産物を明らかにし、当該標的生産物をＣ−タイプ
レクチンに属する新規なポリペプチド、即ちミンクルと
して提供する。そして、本発明は新規なポリペプチド
「ミンクル」の諸性質を検討し、ミンクルがマクロファ
ージを活性化する作用を有するものであることを明らか
にしたものである。したがって、本発明は、マクロファ
ージの活性化作用を有し、免疫系の諸疾患、炎症性疾患
などの治療や予防に有用な新規な蛋白質を提供するもの
である。また、本発明は、本発明の「ミンクル」蛋白質
をコードする新規な遺伝子を提供する。さらに、本発明
は「ミンクル」を含有する医薬組成物を提供する。本発
明の「ミンクル」に対する抗体を提供するものでもあ
る。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <120> A novel C-type lectin and its genes <130> PA900364 <160> 2 <210> 1 <211> 2517 <212> DNA <213> Mouse <400> 1 cggtctgtta ctcttgaact tttaaaaaga gggccaagga ttcaccattc aagactcact 60 ttccaggggc tctttctaaa ctgagaagag aaggaaaagg aagaaaggca ggaaaaagga 120 agaatgaatt caaccaaatc gcctgcatcc caccacacag agagaggatg cttcaaaaac 180 tcccaagtgc tctcctggac gatagccggg gcctccatcc tgtttctcag tggctgtttc 240 atcaccagat gtgtcgtaac atatcgcagc tctcaaattt ccgggcagaa cttacagcca 300 catagaaata ttaaggagct ttcctgctac agtgaggcat caggttcagt caagaattgc 360 tgtcctttga actggaaaca ttatcaatct agttgttatt ttttctctac gacaaccttg 420 acctggtcat caagtttaaa gaattgctca gacatggggg ctcacctggt ggttatcgac 480 acacaggaag agcaggaatt cctttttcgc acaaaatcta aaaggaaaga gttttatatt 540 ggactgacag accaggtggt ggagggtcag tggcaatggg aggatgatac acctttcaca 620 gagtccctga ccttctggga tgctggggag cccaacaata tagttttggt ggaggactgt 680 gccaccataa gggactcttc aaactccagg aagaactgga atgataatcc ctgtttctac 720 agtatgcctt ggatttgtga gatgccagaa ataagtcctc aggactaagt gcaaggaaat 780 acaagggaca tggcttacat gcatgaagaa gaacaagagt gaatgtaata acaaccaaaa 840 tccaacataa gaaaatatct atcaggcatc agaaggactg cacatgtatg tattactggg 900 acataagtaa aaagacttgt tcccattgct aaaagtccac agcattgtct gatggtcttg 960 ccataacctg aaagatctct ttttagactg tacagatcaa ttctctaaca aatgcaacaa 1020 gaagaaaggg attctccttt tcacatctgt cttgcacatc tgtcttgctc atgagaattg 1080 atatgaagga agaggtagaa agcagatgtc tgtataaaga gactttaatg gtcactatgt 1140 catcctgttc tttctacatc cttggctcta gcttatctat ctatcagtac atagatcact 1200 tctgtgttct ccaacagtga ggaagatgca tctttgagtc tttaaactta cctgccgctt 1260 gggagaatgg catggccttc agcaaggaca tctccatatg gaaaggccgg tcaaacttca 1320 gttcctaaca gattgtgatc tagtccactc ttcctggagc cccattttct ctgtgttctc 1380 ttctataaac tggatttcac ctgtacttgt atctactgcg caagtagaac ctgctcagta 1440 ggttcaaagt gaaattattt aaaaattcat gttcacattt ttctgtctca ggactgcatt 1500 tattgcatga tattctgtca atatagacca tgtttcttcc agacaaagcc cattaggaac 1560 ttcagcagca gtcacacatt gtaataaaca tgtatccttg agtaggaaaa ttaaactaaa 1620 taaattaatt tgtcatatta gcactcatta cgagcacttc tattagactt tctcacaatc 1680 tgattttgaa attgataacc ttattttaaa tacaaatata tcttacaacc acacatttga 1740 cttctctttt taaaattatt tttgtttgaa aattttgtgc atttatataa ttcactttta 1800 atgaacccat ccttactctc ctcactacaa cctgctccta tccacctcac tgattttccc 1860 tcccaatttc atgtgctcct ctttgtttta aacccactct atctgctcag tgcttcctga 1920 atgcacttga gtataaggct ttctactgga ccatagcctc tcggcaacca catcccatac 1980 tccacctgct ccagcaggga acaatagcca attgaccatc ttcagctgag gatggatttc 2040 atgagctcca tgccattcat gctggaattt gggttgtttt atgtaacctt tattatattg 2100 tgctatctct tctgtatccc tagaatctct aggagcttca tattaaaaga ttctgaattc 2160 catcaaaggg cacacaaaga aatcacaaag accatgtggt ttctgtcctt gggtttattt 2220 gcaaggttca ttacactcct tgacttgtat atattgtgac atccctccat ctctaggatg 2280 aaactgaagt gatcatgata gataactttt ggatcttttc acttttctat tgctgtgatg 2340 aaacatgacc caaaactatc ttgggccggg aaaattttaa tttatcttaa cataaatttc 2400 ctatttagaa attggacagg tggggaatca tccaattgaa actcgaaaaa tgtagtgttt 2460 tgtacattag gttacagaaa aacaacttta gccacaaaaa taaagtaata aactatt 2517 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Met Asn Ser Thr Lys Ser Pro Ala Ser His His Thr Glu Arg Gly 15 Cys Phe Lys Asn Ser Gln Val Leu Ser Trp Thr Ile Ala Gly Ala 30 Ser Ile Leu Phe Leu Ser Gly Cys Phe Ile Thr Arg Cys Val Val 45 Thr Tyr Arg Ser Ser Gln Ile Ser Gly Gln Asn Leu Gln Pro His 60 Arg Asn Ile Lys Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Glu Ala Ser Gly Ser 75 Val Lys Asn Cys Cys Pro Leu Asn Trp Lys His Tyr Gln Ser Ser 90 Cys Tyr Phe Phe Ser Thr Thr Thr Leu Thr Trp Ser Ser Ser Leu 105 Lys Asn Cys Ser Asp Met Gly Ala His Leu Val Val Ile Asp Thr 120 Gln Glu Glu Gln Glu Phe Leu Phe Arg Thr Lys Pro Lys Arg Lys 135 Glu Phe Tyr Ile Gly Leu Thr Asp Gln Val Val Glu Gly Gln Trp 150 Gln Trp Val Asp Asp Thr Pro Phe Thr Glu Ser Leu Ser Phe Trp 165 Asp Ala Gly Glu Pro Asn Asn Ile Val Leu Val Glu Asp Cys Ala 180 Thr Ile Arg Asp Ser Ser Asn Ser Arg Lys Asn Trp Asn Asp Ile 195 Pro Cys Phe Tyr Ser Met Pro Trp Ile Cys Glu Met Pro Glu Ile 210 Ser Pro Leu Asp *** 214

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＬＰＳ処理後の種々の時間におけるＰ
ＭΦでの本発明のミンクルｍＲＮＡの発現を示した図面
に代わる写真である。

【図２】図２は、種々の炎症誘発因子で処理された野生
型とＮＦ−ＩＬ６欠損（−／−）型のＰＭΦにおけるミ
ンクルｍＲＮＡの発現を示す図面に代わる写真である。

【図３】図３は、種々のセルラインにおけるミンクル発
現についてのノーザンブロット分析の結果を示す図面に
代わる写真である。

【図４】図４は、本発明の２．５−ｋｂのマウスミンク
ル（ｍミンクル）ｃＤＮＡの塩基配列を示す。塩基の１
番目は転写開始位置を示し、これは後述するプライマー
エクステンション法によって決定されたものである。図
４中の下線部分はポリアデニル化サイトを示し、塩基の
下のアルファベットはコードされているアミノ酸を１文
字表記で示したものである。アスタリスクは終止コドン
を示す。

【図５】図５は、本発明のヒトミンクルとマウスミンク
ルのアミノ酸配列の比較を示す。黒部分はヒトとマウス
で同じであることを示し、灰色は両者で保存されている
部分を示す。下線部分は膜貫通領域であることを示し、
Ｃタイプレクチン領域の開始部位を角矢印で示し、Ｎ−
グリコシル化サイトでヒトとマウスで同じ部位を黒三角
印で示し、ヒトのみのグリコシル化サイトを白三角印で
示し、プロテインキナーゼＣによるリン酸化サイトと予
測される箇所をアスタリスクで示す。

【図６】図６は、本発明のｍミンクル蛋白質（mMincl
e）のカルボキシ末端、ｍＭＣＬのＣＲＤ部、並びにマ
ウスＣＤ２３（mCD23）、マウス アシアログリコプロ
テイン受容体１（mASGR-1）、及びマウスマクロファー
ジアシアログリコプロテイン結合蛋白質（mM-ASGP-BP）
の３種のグループ−IIＣ−タイプレクチン類のアミノ酸
配列を並べて示したものである。

【図７】図７は、マウス染色体６の末端領域における本
発明のミンクルのマップを示す。図７の上段は、全ての
位置についてタイプ分けされた９５のもどし交配動物に
おけるミンクル及びフランキング遺伝子の遺伝子対合状
態の分離を示したものである。図７の下段は、ミンクル
とそれに連鎖している遺伝子の位置を示す染色体６の遺
伝地図の一部を示すものである。

【図８】図８は、本発明のマウスミンクルフラッグ蛋白
質の表面発現性（surface expression）を検討したフロ
ーサイトメトリー分析の結果を示す。

【図９】図９は、本発明のｍミンクルフラッグ蛋白の発
現をウエスタンブロット分析で検出した結果を示す図面
に代わる写真である。

【図１０】図１０は、本発明のｍミンクル遺伝子の転写
開始部位を決定するために、そのｃＤＮＡのヌクレオチ
ド８１−１１２に相当するプライマーを用いてプライマ
ー伸長分析を行った結果を示す図面に代わる写真であ
る。

【図１１】図１１は、本発明のｍミンクル遺伝子の５’
フランキング領域の配列を示す。図１１中の角矢印は転
写開始位置を示す。四角枠はＴＡＴＡボックスを示し、
翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の下にメチオニン（Ｍｅｔ）
の表示をした。種々の転写因子が結合し得る箇所を下線
で示した。

【図１２】図１２は、トランスアクティベーションアッ
セイにおけるマウスミンクルプロモーターの、ＮＦ−Ｉ
Ｌ６による転写の誘発をテストした結果を示すものであ
る。

【図１３】図１３は、ｍミンクルプロモーターの−６６
位から−５８位へのＮＦ−ＩＬ６の結合について試験し
た結果を示す図面に代わる写真である。

【図１４】図１４は、ＮＦ−ＩＬ６蛋白がＰ１オリゴヌ
クレオチドと結合していることを確認するために、精製
したＧＳＴ−ＮＦ−ＩＬ６融合蛋白を用いて試験をした
結果を示す図面に代わる写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 BA01 CA09 HA01 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ42 QR08 QR62 QS25 QS34 QX02 QX07 4C084 AA01 AA02 AA03 BA01 BA08 BA22 BA23 BA34 CA18 CA26 DA18 MA02 NA14 ZB072 ZB111 ZB222 ZB351 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA80 EA22 EA29 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２で示されるアミノ酸
   配列、又は当該アミノ酸配列において１個若しくは２個
   以上のアミノ酸が付加、置換若しくは欠失してなるアミ
   ノ酸配列を有し、マクロファージ活性化能を有する蛋白
   質。
2. 【請求項２】 核因子ＮＦ−ＩＬ６によって誘発され得
   る請求項１に記載の蛋白質。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の蛋白質をコード
   する遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
   を有する請求項３に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載のＤＮＡにストリ
   ージェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３又は４に記載のＤＮＡの少なく
   とも１４塩基からなるポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 標識化されている請求項６に記載のポリ
   ヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１又は２に記載の蛋白質、及び製
   薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
9. 【請求項９】 マクロファージ活性化作用により治療・
   予防し得る疾患の処置のための請求項８に記載の医薬組
   成物。