KR20110010134A

KR20110010134A - 인간·오스테오폰틴 ｓｉＲＮＡ

Info

Publication number: KR20110010134A
Application number: KR1020107029378A
Authority: KR
Inventors: 도시미쯔 우에데
Original assignee: 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2011-01-31
Also published as: EP2290063A1; CN102099467A; EP2290063A4; WO2009147742A1; JPWO2009147742A1; US20110092575A1; CA2726885A1; AU2008357371A1

Abstract

본 발명은 인간·오스테오폰틴의 발현을 보다 특이적으로, 또한 강력하게 억제하기 위한 siRNA, 그것을 포함하는 조성물 및 의약품을 제공하는 것을 과제로 한다.

Description

인간·오스테오폰틴 ｓｉＲＮＡ{siRNA of human osteopontin}

본 발명은 인간·오스테오폰틴의 발현 억제를 위한 siRNA에 관한 것이다.

다세포 생물은, 세포-조직-기관-개체로 단계적으로 구성되어, 최소단위인 세포끼리 부착되거나, 세포외의 물질에 부착됨으로써 형성되어 있다. 조직의 구축에는, 세포-세포간의 접착과 동시에 세포-세포외 매트릭스와의 접착이 있다. 이와 같은 세포간의 접착에는, 세포외 매트릭스, 막에 존재하는 세포 접착 분자 및 세포 접착 분자의 세포내의 연결물로서의 세포골격이 중요한 역할을 하고 있다. 세포-세포외 매트릭스간 접착에 관여하는 세포 접착 분자는, 세포외 매트릭스가 결합함으로써, 세포의 분화, 시그널 전달의 역할을 담당하고 있다. 따라서, 세포 접착 분자와 세포외 매트릭스의 접착 메커니즘을 해석함으로써, 각종 질환에 있어서의 메커니즘의 해명, 더 나아가서는 치료로 연결된다.

세포외 매트릭스의 일종인 오스테오폰틴(OPN)은, 분자량 약 41 kDa의 분비형 산성 인산화 당단백질로, 분자 중앙부에는 αv 등의 인테그린과의 접착에 중요한 GRGDS 서열이 존재하고, 그 바로 뒤에는 트롬빈 개열부위(R¹⁶⁸S¹⁶⁹)가 존재한다. 또한, GRGDS 서열 바로 뒤에 존재하는 SVVYGLR 서열은 α9β1, α4β1, α4β7이라는 염증에 관여하는 인테그린과 결합한다.

OPN은 세포 접착, 세포 유주(遊走), 일산화질소(NO) 생산의 제어, 면역계로의 관여 등 다채로운 기능이 보고되어 오고 있어, 암 전이, 류마티스 관절염이나 다발성 경화증 등의 만성염증 질환, 자기면역 질환 등 많은 난치 질환 병태와 관여하는 것이 나타내어져 있다.

특히, 염증성 질환에 관해서는, 직접적인 관여가 시사되어 있다. OPN의 수용체인 α9 인테그린은 호중구 상에 발현하고 있고, α4 인테그린은 림프구 상에 발현하고 있는 것으로부터, OPN 기능을 억제함으로써 호중구를 비롯한 백혈구의 유주를 억제하는 것을 생각할 수 있어, 항염증작용이 기대되고 있다.

사실, OPN 결손 마우스는, 종양, 류마티스 관절염, 다발성 경화증(EAE), 동맥경화 등의 질환에 대해 저항성을 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1~4). 또한, OPN에 대한 중화항체를 사용하여, 류마티스 관절염이 완해(緩解)된 보고도 있다(비특허문헌 5).

이에, OPN 기능을 저해함으로써 치료효과를 기대할 수 있다고 생각하여, 신규 분자 특이적 녹다운법인 RNAi(RNA 간섭: RNA interference)법의 치료로의 응용을 검토하였다.

RNAi법이란, 짧은 간섭 dsRNA(siRNA(small interfering RNA))를 사용하여, 특정 유전자의 발현을 유전자 레벨로 신속하게 발현 억제하는 기술이다(비특허문헌 6 및 7). OPN의 mRNA 서열로부터, 타겟이 되는 서열을 복수 선택하고, 그 siRNA를 합성하여, OPN을 녹다운시킴으로써 질환 치유로 연결시키려고 생각하였다.

특허문헌 1에는, 오스테오폰틴의 부분을 코드하는 RNA의 IL-1β에 관여하는 결합조직 질환의 치료에 있어서의 사용이 기재되어 있다. 그러나, siRNA로서의 사용에 대해서는, 전혀 개시되어 있지 않다.

특허문헌 2에는, FGFR(섬유아세포 증식인자 수용체: fibroblast growth factor receptors)의 siRNA 및 FGFR이 OPN 유전자의 발현을 항진하고 있는 것이 기재되어 있다. 그러나, OPN의 siRNA에 대해서는, 전혀 개시도 시사도 없다.

또한, 이중가닥 RNA를, 벡터를 사용하여 인 비트로에서 생산시키고, 이것을 RNaseIII 핵산분해효소 패밀리의 하나인 다이서(dicer)를 사용하여 절단한 siRNA의 집단으로 되는 유전자 조작용의 키트가 시판되고 있다(SuperSilencing(등록상표) Human SPP1 siRNA 키트(Secreted phosphoprotein 1(osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1)) 비특허문헌 8). 그러나, 이 키트는 유전자 발현의 연구를 위해, siRNA를 사용하여 특정 유전자의 발현을 저해하기 위한 것으로, siRNA의 의약용도에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 또한, 상기 제조방법에 의해 얻어진 siRNA는, 분자 특이적이지 않은 짧은 RNA 프래그먼트도 포함하고 있는 것으로부터, 유전자 녹다운의 특이성이 낮다는 결점도 있었다.

최근, 오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환의 처치를 위한 의약 등으로서 유용한 OPN의 siRNA로서, 마우스, 랫트 및 인간의 OPN의 mRNA로부터 siRNA가 발견되고 있다(특허문헌 3).

특허문헌 1: 일본국 특허공개 평8-191693

특허문헌 2: 미국 특허출원공개 제2003/0143676A1호 명세서

특허문헌 3: 일본국 특허공개 제2005-323591

비특허문헌 1: Nemoto H, Rittling SR, Yoshitake H, Furuya K, Amagasa T, Tsuji K, Nifuji A, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency reduces experimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues. J Bone Miner Res. 16:652-9, 2001.

비특허문헌 2: Yumoto K, Ishijima M, Rittling SR, Tsuji K, Tsuchiya Y, Kon S, Nifuji A, Uede T, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency protects joints against destruction in anti-type II collagen antibody-induced arthritis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:4556-4561, 2002.

비특허문헌 3: Chabas D, Baranzini SE, Mitchell D, Bernard CC, Rittling SR, Denhardt DT, Sobel RA, Lock C, Karpuj M, Pedotti R, Heller R, Oksenberg JR, Steinman L. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease.Science. 294:1731-5, 2001.

비특허문헌 4: Matsui Y, Rittling SR, Okamoto H, Inobe M, Jia N, Shimizu T, Akino M, Sugawara T, Morimoto J, Kimura C, Kon S, Denhardt D, Kitabatake A, Uede T. Osteopontin Deficiency Attenuates Atherosclerosis in Female Apolipoprotein E-Deficient Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:1029-34, 2003.

비특허문헌 5: Yamamoto N, Sakai F, Kon S, Morimoto J, Kimura C, Yamazaki H, Okazaki I, Seki N, Fujii T, Uede T. Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 112:181-8, 2003.

비특허문헌 6: Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391:806-11, 1998.

비특허문헌 7: Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411:494-8, 2001.

비특허문헌 8: SuperArray사, SuperSilencing(등록상표) 제품설명, [2004년 3월 22일 검색]. 인터넷 <URL:http://www.superarray.com/sirnaqa.php>

이와 같은 상황하에서, 종래의 siRNA보다도 더욱 인간·오스테오폰틴의 항진에 기인하는 인간의 질환의 치료에 유효한 siRNA의 개발이 요망되고 있다.

본원 발명자는, 예의 연구를 행하여, 인간·오스테오폰틴의 발현을 기지의 siRNA보다 특이적으로, 또한 강력하게 억제하는 siRNA를 발견하여, 본 발명을 완성시켰다. 따라서, 본 발명은 이하의 RNA, siRNA 또는 그것을 포함하는 조성물 및 의약을 제공한다.

(1) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA, 그들의 상보가닥, 또는 그들의 유도체.

(2) 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA와, 그 각각의 상보가닥으로 되는 이중가닥 RNA, 또는 그의 유도체.

(3) 상기 (2)에 기재된 이중가닥 RNA 또는 그의 유도체를 포함하는, 오스테오폰틴의 발현을 억제하기 위한 의약조성물.

(4) 상기 (2)에 기재된 이중가닥 RNA를 유효성분으로서 포함하는, 오스테오폰틴의 발현을 억제하기 위한 의약.

(5) 상기 (2)에 기재된 이중가닥 RNA 또는 그의 유도체를 유효성분으로서 포함하는, 오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환의 처치를 위한 의약.

(6) 상기 오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환이, 종양, 간염, 동맥경화, 다발성 경화증, 관절염, 류마티즘, 또는 폐섬유증인, 상기 (5)에 기재된 의약.

(7) 상기 (1)에 기재된 RNA를 포함하는, siRNA 발현 벡터.

본 발명의 siRNA는, 종래의 인간 OPN mRNA에 대한 siRNA와 비교하여, 상이한 인간 OPN의 mRNA의 부위를 대상부위로 하고, 인간의 OPN의 유전자를 녹다운하는 효과가 현저히 높다. 따라서, 인간·오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환의 치료를 위한 의약 등으로서 보다 적합하다.

도 1은 인간 OPN siRNA의 타겟 서열 및 그의 위치, 및 본 발명의 hOPN siRNA(hOPN siRNA-5, 7, 8, 9, 10)를 나타낸다.
도 2는 실시예에 사용한 인간 OPN siRNA의 서열을 나타낸다.
도 3은 인간 OPN siRNA에 의한 HT1080 세포에 있어서의 OPN 분비 억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 인간 OPN siRNA에 의한 NRC-12 세포에 있어서의 OPN 분비 억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 인간 OPN siRNA에 의한 G361 세포에 있어서의 OPN 분비 억제효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시의 형태에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 하나의 실시형태에 있어서, 인간의 오스테오폰틴 유전자에 유래하는 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA, 그들의 상보가닥, 또는 그들의 유도체를 제공한다. 또한, 본 명세서 중, 이들의 RNA 또는 그의 유도체를 「본 발명의 RNA」로 부르는 경우가 있다.

본 명세서 중, 「오스테오폰틴」 또는 「인간·오스테오폰틴」이란, 분비성 인산 단백질 1(secreted phospho protein 1)로도 불리는 뼈의 매트릭스에 포함되는 접착 단백질의 일종으로서, 서열번호 1에 나타내는 아미노산서열로 되는 인간·오스테오폰틴 단백질을 의미한다. 오스테오폰틴은, 인테그린과 결합하는 RGD 서열을 가져, 파골세포와 골아세포 양쪽을 골조직 주변에 접착시키는 작용을 갖는다. 또한, 오스테오폰틴은, 강하게 음성으로 하전(荷電)되어 있어, 히드록시아파타이트를 침착시켜, 뼈의 칼슘을 보유·유지(保持)하는 작용을 갖는다.

인간·오스테오폰틴 유전자의 염기서열을, 서열번호 2에 나타낸다.

도 1에, 인간·오스테오폰틴 유전자의 염기서열과, 본 발명의 siRNA의 표적서열을 나타낸다.

본 명세서 중, 어느 한 RNA 서열에 대해 「그의 상보가닥」이라는 경우, 소정의 염기서열을 갖는 RNA에 대해, A:U 및 G:C 등의 염기쌍 관계를 토대로, 염기적으로 상보적인 관계에 있는 RNA를 의미한다. DNA의 상보적 이중가닥 중, 단백질을 코드하고 있는 가닥, 즉, mRNA와 동일한 서열을 갖는 가닥이 센스가닥이고, 센스가닥과 염기적으로 상보적인 관계에 있는 서열을 갖는 가닥이 안티센스가닥이다.

본 명세서 중, RNA에 대해 「그의 유도체」라고 하는 경우, RNA의 안정성을 향상시키기 위한 수식이 실시된 그 RNA의 유도체를 의미한다. 그와 같은 유도체의 예로서는, 예를 들면, 3'측에 dT를 수 개, 바람직하게는 2~4개, 보다 바람직하게는 2 또는 3개, 특히 바람직하게는 2개 부가시킨, 3'오버행형 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 콜레스테롤, 또는 2'-o-methyl 등으로 수식한 유도체, 소위 탠덤타입의 siRNA 발현 벡터에 삽입하기 위한, 2개의 프로모터, 예를 들면 U6 프로모터, 센스 RNA 및 안티센스 RNA를 결합시킨 유도체, 구체적으로는, U6 프로모터, 센스 RNA, 5개의 T, U6 프로모터, 안티센스 RNA, 5개의 T를 결합시킨 유도체, 소위 스템루프타입의 siRNA 발현 벡터에 삽입하고, 쇼트 헤어핀 RNA를 매개로 하여, siRNA를 생산하기 위한, 프로모터, 예를 들면 U6 프로모터, 센스 RNA, 루프서열 및 안티센스 RNA를 결합시킨 유도체, 구체적으로는, U6 프로모터, 센스 RNA, 루프서열, 예를 들면, gtgtgctgtcc, 안티센스 RNA를 결합시킨 유도체 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 다른 실시형태에 있어서, 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA와, 그 각각의 상보가닥으로 되는 이중가닥 RNA, 또는 그의 유도체를 제공한다.

본 명세서 중, 「siRNA(small interfering RNA)」란, 21~27 bp로 되는 이중가닥 RNA로서, RNA 간섭(RNA interference: RNAi)을 유도할 수 있는 이중가닥 RNA를 말한다. 또한, RNA 간섭이란, 이중가닥 RNA에 의해, 그 RNA와 상동적인 서열을 갖는 유전자의 발현이 억제되는 현상을 말한다.

RNAi란, 특정 서열을 갖는 유전자를 파괴할 수 있는 것으로부터, 유전자 기능의 해석이나 특정 유전자의 발현 억제에 유용하다. 또한, 세포로의 도입량이 소량인 것에 비해 비교적 장시간 효과가 지속된다는 특징을 갖는다.

본 발명의 인간의 오스테오폰틴 유전자에 유래하는 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA와, 그 각각의 상보가닥으로 되는 이중가닥 RNA, 또는 그의 유도체는, 이와 같은 RNAi 효과를 갖는 siRNA로서 사용할 수 있다. 본 명세서 중, 이들 siRNA 또는 그의 유도체를, 「본 발명의 siRNA」 또는 「본 발명의 인간 OPN siRNA」로 부르는 경우가 있다.

본 발명의 siRNA는, 통상의 방법에 의해 합성할 수 있고, 시판의 DNA/RNA 신시사이저, 예를 들면, Applied Biosystems394형으로 행할 수 있다.

본 발명은, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNA를 담지하는 siRNA 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는, 본 발명의 siRNA를 표적 세포 중에서 발현시키는 것에 사용될 수 있다.

본 발명의 siRNA 발현 벡터는, 통상의 방법에 따라 조제할 수 있다. 탠덤타입의 경우는, PCR에 의해 센스, 안티센스 서열을 포함하는 프라이머에 의해 프로모터부분을 증폭하고, 증폭 단편을 제한효소로 절단 후, 벡터의 프로모터, 예를 들면 U6 프로모터의 하류에 삽입함으로써 조제할 수 있다. 스템루프의 경우, 센스-루프-안티센스 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성 어닐링시키고, 벡터의 프로모터, 예를 들면 U6 프로모터의 하류에 삽입함으로써 조제할 수 있다.

본 발명은 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 siRNA를 포함하는 오스테오폰틴의 발현을 억제하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은, 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 siRNA를 유효성분으로서 포함하는 오스테오폰틴의 발현을 억제하기 위한 의약, 또는 본 발명의 siRNA를 유효성분으로서 포함하는 오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환의 처치를 위한 의약을 제공한다.

또한, 본 발명의 siRNA를 포함하는 조성물은, 그대로 또는 공지의 약학적으로 허용되는 담체(부형제, 증량제, 결합제, 활택제 등이 포함된다)나 관용의 첨가제 등과 혼합하여 의약조성물로서 조제하여, 인간의 질환의 처치에 사용할 수 있다. 본 발명의 siRNA는, 오스테오폰틴의 발현을 억제하는 효과를 갖기 때문에, 본 발명의 siRNA를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물은, 오스테오폰틴의 발현의 항진에 기인하는 질환, 대표적으로는, 종양, 간염, 동맥경화, 다발성 경화증, 관절염, 류마티즘, 또는 폐섬유증의 처치에 사용할 수 있다. 본 발명의 의약조성물은, 생체내에서의 안정성과 체내로의 딜리버리방법으로서, 리포솜 등의 딜리버리 담체, 부위 특이적인 항체 또는 세포종 특이적인 기능성 펩티드와의 결합 등의 기술을 응용할 수 있다. 또한, 조제하는 형태(정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제, 시럽제 등의 경구투여제; 주사제, 외용제, 좌제 등의 비경구투여제) 등에 따라 경구투여 또는 비경구투여할 수 있다. 투여량은, 유효성분의 종류, 투여경로, 투여대상 또는 환자의 연령, 체중, 증상 등에 따라 상이하여 일률적으로 규정할 수 없으나, 통상, 1일 투여 용량으로서, 수 ㎎~2 g 정도, 바람직하게는 수십 ㎎ 정도를, 1일 1~수 회에 걸쳐 투여할 수 있다.

이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 이것은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

(올리고뉴클레오티드의 조제)

리보뉴클레오시드 3'-포스포로아미다이트(GLEN 리서치)를 사용하여, DNA 자동합성기(Applied Biosystem Model394A)로 올리고리보뉴클레오티드를 합성하였다. 각 RNA 단편은 1 μ㏖ 스케일로 합성하였다. 합성 종료 후, 합성한 올리고뉴클레오티드가 결합한 CPG(Controlled Pore Glass)를 진한(濃) 암모니아수:에탄올(3:1 v/v) 혼액으로 실온에서 2시간 처리하여 올리고리보뉴클레오티드를 CPG 수지로부터 잘라내고, 추가적으로 55℃에서 16시간 가온하였다. 또한, 양성의 대조로서 hOPN siRNA-4 및 hOPN siRNA-6, 음성의 대조로서, 하기의 구조를 갖는, 각각의 siRNA 서열과 상이한 GC 함량 52% 및 47%의 스크램블서열인 Scr.Cont.C8 및 Scr.Cont.C9을 합성하였다.

Scr.Cont.C8 : 5'-ACTCTATCTGCACGCTGAC-3'(서열번호 10)

Scr.Cont.C9 : 5'-ATTGTATGCGATCGCAGAC-3'(서열번호 11)

용매를 증류 제거하고, 잔사에 1 ㎖의 1M TBAF(테트라부틸암모늄 플루오리드)/THF(테트라히드로푸란) 용액을 첨가하여, 37℃에서 16시간 교반하였다. 이것에 5 ㎖의 0.1 M 트리에틸암모늄아세테이트(pH 7.0)를 첨가한 후, C18(워터즈사제) 오픈 칼럼 크로마토그래피로 분리하였다(칼럼 사이즈 1.5×12 ㎝: 5-40% 아세토니트릴, 50 mM 트리에틸암모늄비카보네이트 수용액의 용매를 사용한 농도 구배에 의해 용출하였다). 약 30% 농도의 아세토니트릴로 용출되는 디메톡시트리틸의 발색을 갖는 분획을 모아, 이것에 5 ㎖의 0.01 N 염산을 첨가하고, 15분간 교반하여, 디메톡시트리틸기를 제거하였다. 0.01 N 암모니아수로 중화하고, 수층을 초산에틸로 세정하여, 용매를 증류 제거 후, 멸균수 1 ㎖에 용해하였다. 이 분획 중의 올리고리보뉴클레오티드를 역상 HPLC로 분리하여 분취 후, 추가적으로 이온 교환 HPLC로 분리·분취하고, 정제하였다. 얻어진 올리고뉴클레오티드를 후술하는 실험에 제공하였다.

(역상 및 이온 교환 HPLC의 조건)

역상 HPLC

칼럼: μ-본더스피아(C-18) 칼럼, Φ3.9×150 ㎜(워터즈사제)

용매: A용액 5% 아세토니트릴/0.1 M TEAA(pH 7.0);

B용액 25% 아세토니트릴/0.1 M TEAA(pH 7.0).

이온 교환 HPLC

칼럼: TSKgel DEAE 2SW 칼럼, 4.6×250 ㎜, 도소(주)제

용매: A용액 20% 아세토니트릴;

B용액 20% 아세토니트릴을 포함하는 2 M 포름산 암모늄.

(배양세포로의 OPN siRNA 도입방법)

리포펙트아민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하는 리포펙션법에 의해, 24웰 플레이트 중에서 증식시킨 대수증식기의 배양세포에, OPN siRNA를 도입하였다. 배양세포로서, 내재성으로 OPN이 발현하고 있는 HT1080 세포, NRC-12 세포, G361 세포를 사용하였다. 또한, HT1080 세포는 섬유육종 세포, NRC-12 세포는 신장암 세포, G361 세포는 흑색종 세포이다.

Opti-MEM I 배지(invitrogen) 50 μL에 리포펙트아민 2000의 2 μL를 첨가하여, 5분간 방치하였다. 별도의 튜브로, TIL 배지 50 μL에 siRNA 0.8 ㎍을 첨가하였다. 양 튜브의 내용물을 혼합하고, 20분간 방치하여, siRNA-리포펙트아민 2000 복합체를 조제하였다. 세포를 TIL 배지로 세정 후, TIL 배지 500 μL를 첨가하고, 추가적으로 siRNA-리포펙트아민 2000 복합체를 첨가하여, 이것을 24시간 배양하였다. 이어서 상청을 회수하고, ELISA로 상청 중에 있어서의 OPN 발현량을 정량하였다.

(ELISA)

인간 OPN siRNA의 RNAi 효과는, 세포로부터 분비되는 OPN의 농도를 인간·오스테오폰틴 측정 ELISA 키트(면역생물 연구소)로 측정하고, OPN 분비의 억제로 조사하였다.

(OPN siRNA의 치료효과)

상기 ELISA 키트를 사용하여, HT1080(Human Fibrosarcoma cells) 세포, NRC-12 세포, G361 세포에 있어서, 본 발명의 인간 OPN siRNA의 전이 억제능을 조사하였다. 사용한 인간 OPN siRNA의 센스가닥은, 이하의 표 1에 나타내는 바와 같다(3' 말단의 dT는 생략하였다).

도 2에, 본 실시예에서 사용한 siRNA의 서열을 보다 구체적으로 나타내었다.

또한, 대조로서, 각각의 siRNA 서열과 상이한 GC 함량 52%의 스크램블서열인 Scr.Cont.C8, GC 함량 47%의 스크램블서열인 Scr.Cont.C9, 및 리포펙트아민 2000만으로 되는 Lipo.Cont.를 사용하였다.

도 3~5에, 이 실험의 결과를 나타낸다. 본 발명의 인간 OPN siRNA(hOPN siRNA-5, 7, 8, 9, 10)는, HT1080(도 3), NRC-12(도 4), 및 G361(도 5)의 모든 세포주에 있어서, 종래기술의 인간 OPN siRNA(hOPN siRNA-4, 6)보다도 현저히 높은 OPN의 녹다운 효과를 나타내었다.

이와 같이, 본 발명의 인간 OPN siRNA는, 종래기술의 OPN siRNA보다도 유의하게 높은 OPN의 분비 억제효과를 나타내는 것으로부터, 인간·오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환의 치료를 위한 의약으로서 유리하게 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co., Ltd. <120> Human Osteopontin siRNA <130> PCT08-0032 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala 1 5 10 15 Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu 20 25 30 Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro 35 40 45 Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu 65 70 75 80 Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His 85 90 95 Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp 100 105 110 Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu 115 120 125 Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly 145 150 155 160 Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg 165 170 175 Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu His Ile Thr Ser His 180 185 190 Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala 195 200 205 Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser 210 215 220 Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Ala His Ser His 225 230 235 240 Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu 245 250 255 His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu 260 265 270 Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp 275 280 285 Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His 290 295 300 Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn 305 310 <210> 2 <211> 1447 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaggcagcag cagcaggagg aggcagacac agcatcgtcg ggaccagact cgtctcaggc 60 cagttgcagc cttctcagcc aaacgccgac caaggaaaac tcactaccat gagaattgca 120 gtgatttgct tttgcctcct aggcatcacc tgtgccatac cagttaaaca ggctgattct 180 ggaagttctg aggaaaagca gctttacaac aaatacccag atgctgtggc cacatggcta 240 aaccctgacc catctcagaa gcagaatctc ctagccccac agacccttcc aagtaagtcc 300 aacgaaagcc atgaccacat ggatgatatg gatgatgaag atgatgatga ccatgtggac 360 agccaggact ccattgactc gaacgactct gatgatgtag atgacactga tgattctcac 420 cagtctgatg agtctcacca ttctgatgaa tctgatgaac tggtcactga ttttcccacg 480 gacctgccag caaccgaagt tttcactcca gttgtcccca cagtagacac atatgatggc 540 cgaggtgata gtgtggttta tggactgagg tcaaaatcta agaagtttcg cagacctgac 600 atccagtacc ctgatgctac agacgaggac atcacctcac acatggaaag cgaggagttg 660 aatggtgcat acaaggccat ccccgttgcc caggacctga acgcgccttc tgattgggac 720 agccgtggga aggacagtta tgaaacgagt cagctggatg accagagtgc tgaaacccac 780 agccacaagc agtccagatt atataagcgg aaagccaatg atgagagcaa tgagcattcc 840 gatgtgattg atagtcagga actttccaaa gtcagccgtg aattccacag ccatgaattt 900 cacagccatg aagatatgct ggttgtagac cccaaaagta aggaagaaga taaacacctg 960 aaatttcgta tttctcatga attagatagt gcatcttctg aggtcaatta aaaggagaaa 1020 aaatacaatt tctcactttg catttagtca aaagaaaaaa tgctttatag caaaatgaaa 1080 gagaacatga aatgcttctt tctcagttta ttggttgaat gtgtatctat ttgagtctgg 1140 aaataactaa tgtgtttgat aattagttta gtttgtggct tcatggaaac tccctgtaaa 1200 ctaaaagctt cagggttatg tctatgttca ttctatagaa gaaatgcaaa ctatcactgt 1260 attttaatat ttgttattct ctcatgaata gaaatttatg tagaagcaaa caaaatactt 1320 ttacccactt aaaaagagaa tataacattt tatgtcacta taatcttttg ttttttaagt 1380 tagtgtatat tttgttgtga ttatcttttt gtggtgtgaa taaatctttt atcttgaatg 1440 taataag 1447 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-5 <400> 3 ccaaguaagu ccaacgaaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-7 <400> 4 ggucaaaauc uaagaaguu 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-8 <400> 5 gggaaggaca guuaugaaa 19 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-9 <400> 6 ttggttgaat gtgtatctat ttg 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-10 <400> 7 acuaaaagcu ucaggguua 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-4 <400> 8 aacccugacc caucucagaa g 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hOPN siRNA-6 <400> 9 aaguccaacg aaagccauga c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Scr.Cont.C8 <400> 10 actctatctg cacgctgac 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Scr.Cont.C9 <400> 11 attgtatgcg atcgcagac 19

Claims

서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA, 그들의 상보가닥, 또는 그들의 유도체.
서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에 나타내는 서열로 되는 RNA와, 그 각각의 상보가닥으로 되는 이중가닥 RNA, 또는 그의 유도체.
제2항의 이중가닥 RNA 또는 그의 유도체를 포함하는, 오스테오폰틴의 발현을 억제하기 위한 의약조성물.
제2항의 이중가닥 RNA 또는 그의 유도체를 유효성분으로서 포함하는, 오스테오폰틴의 발현을 억제하기 위한 의약.
제2항의 이중가닥 RNA 또는 그의 유도체를 유효성분으로서 포함하는, 오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환의 처치를 위한 의약.
제5항에 있어서,
상기 오스테오폰틴의 항진에 기인하는 질환이, 종양, 간염, 동맥경화, 다발성 경화증, 관절염, 류마티즘, 또는 폐섬유증인 의약.
제1항의 RNA를 포함하는 siRNA 발현 벡터.