KR20100137015A - 불안정한 생활성 물질 및 포유동물 초유를 포함한 조성물, 제조 및 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생활성 물질 및 포유동물 초유의 혼합물을 형성하는 포함하는, 적대적인 환경에 투여시 불안정한 생활성 물질의 생존능력을 개선시키는 방법, 및 생활성 물질 및 포유동물 초유의 혼합물을 포함하는, 불안정한 생활성 물질의 투여용 조성물에 관한 것이다.

Description

불안정한 생활성 물질 및 포유동물 초유를 포함한 조성물, 제조 및 치료 방법{Compositions containing labile bioactive materials and mammalian colostrum, methods of preparation and treatment}
본 발명은 생활성 물질을 포함하는 조성물 및 이의 투여 방법에 관한 것이다.
강력한 생리적인 효과를 가질 수 있는 생활성 물질은 종종 적대적인 환경, 예를 들면, 포유동물 위(gastric) 환경, 고온 환경, 또는 다습 환경에 매우 민감하다. 이 것은 종종 이의 용도를 제한하고, 이들이 경구로 편리하게 투여될 수 없거나, 또는 편리하게 저장될 수 없거나, 또는 편리하게 보온 제품계열에는 적용될 수 없다는 것을 의미한다.
*생활성 물질은 하기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다: 성장 촉진제, 항종양제, 경구 백신, 흡입제, 살아 있는 미생물 (예를 들면, 락토바실러스 종과 같은 생균제), 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 당단백질, 당 및 복합 탄수화물, 감염방지제, 항균제, 소독제, 방부제, 항우울제, 정신작용제, 기타 생활성 물질에 대한 벡터, 예를 들면 박테리아 벡터 (대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 비브리오(Vibrio), 락토바실러스(Lactobacilli), 바실러스(Bacillus), 마이코박테리아(Mycobacteria), 쉬겔라(Shigella)를 포함), 바이러스 벡터 (아데노바이러스(Adenovirus), 폭스바이러스(Poxvirus), 배큘로바이러스(Bacculovirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 및 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus)를 포함), 식물 벡터 (담배, 감자 및 바나나 포함), 효모 벡터로서 사용되는 감염제 및 유전자변형생물체, 질환 및 질환 야기 물질 (예를 들면, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 대장균(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp), 병원성 예르시니아 종(Yersinia spp.) 및 알레르기 항원)에 대한 항체를 포함하는 면역글로불린 또는 친화성 정제된 면역글로불린 및 단편, 상기 임의의 것을 포함하는 유도체 및 복합체.
생활성 물질의 기능을 손상시키는 적대 부위의 예에는 강산 또는 강알칼리 부위, 단백질분해 효소를 포함하는 부위, 건조가 일어나는 부위, 다습 부위, 고온 부위, 증가된 압력이 변성을 초래하는 부위, 예를 들면, 정제(tableting) 기계 및 DNAase 를 포함하는 부위가 포함된다.
생활성 물질의 기능을 손상시키는 특별한 적대 부위는 포유동물 위 환경인데, 이는 강산 조건, 증가된 온도, 습도, 고농도의 단백질분해 효소 및 탄수화물 분해 효소를 포함한다.
본 발명의 특별한 적용은 생물학적 기능이 포유동물 위 환경에서 손상되는 생활성제의 보존에 대한 것이다.
포유동물 위 환경에서 생활성 기능을 보존하는 수 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이에는 창자 코팅, 완충, 포르말린 안정화, 항분비제의 첨가, 음식과 함께 물질을 제공하는 것 및 생활성 물질의 초유내로의 분비를 야기하기 위한 암소의 면역화학을 변경하는 것이 포함된다.
Freichel OL 및 Lippold BC (International Journal of Pharmacology, 2001, March 23; 216 (1-2): 165-9)는 포유동물 위에서 이의 내용물을 보호하는 코팅을 제공하기 위하여 메틸히드록시 에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함하는 창자 코팅의 용도를 제시한다.
Tacket C 등 (The New England Journal of Medicine, 1986, May 12,1240- 1243)은 중탄산나트륨 완충액을 사용하여 인간 위에서 단백질분해를 감소시켰다.
Paliwal R 및 London E (Biochemistry 1996, Feb 20; 35 (7): 2374-9)는 디프테리아 독소의 형태를 안정화시키기 위한 포르말린 처리의 용도를 기재한다.
Asad M 등 (Life Science 2001, Nov 21; 70(1) : 17-24)은 위궤양 치료율을 증가시키기 위해 포유동물 위에서 산 분비를 감소시키기 위해 각각 옥시토신 및 란티니드를 사용하였다.
McClead 및 Gregory (Infections and Immunity 44: 474-478)는 암소가 초유에 분비하는 특이한 단백질이 동일한 종류의 단백질이 다른 과정에 의해 생산될 때 예상될 수 있는 것보다 위 환경에서 더욱 안정하다는 것을 보여주었다. 생활성 기능을 보존하는 상기 원리는 Abbot 미국 특허 제 5,260,037 호에 의해 이용되었는데, 이는 초유의 수확 전에 암소를 면역화하였다. 면역화는 특정 항체 (예를 들면, 헬리코박터 파이로리에 대한)의 초유(이는 과면역 초유로 불린다)내로의 분비를 야기한다.
과면역 소 초유는 또한 국제출원 PCT/AU94/00562 에서 고압 환경, 예를 들면, 정제 기계하에서 생물학적 기능의 면에서 안정하다고 기재되었다. 과면역 소 초유의 이용은 또한 하기에 의해 교시되었다:
ㆍMitra 등, Acta Paediatrica, 84: 996-1001, 1995. Hyper immune cow colostrum reduces diarrhoea due to rotavirus: a double blind, controlled clinical study.
ㆍNord 등, AIDS 4, 581-584, 1990. Treatment with bovine hyperimmune colostrum of cryptosporidial diarrhea in AIDS patients.
ㆍTacket 등, New England Journal of Medicine. Ma7 12, 1988. Protection by milk immunoglobulin concentrate against oral challenge with enterotoxigenic E. coli.
ㆍTacket 등, American Journal of Tropical Medical Hygiene. 47 (3), 276-283. 1992. Efficacy of Bovine milk immunoglobulin concentrate in preventing illness after Shigella flexeri challenge.
상기 선행 기술에서, 과면역 초유는 생활성 물질의 공급원이며, 있다면 부속 작업은 원하지 않는 성분, 예를 들면, 물, 지방, 세포성 물질, 박테리아 및 락토오스의 제거가 포함된다. 초유 또는 초유 추출액 또는 초유 성분의 첨가로 적대 환경에서 생활성 물질의 기능의 증가된 보호가 야기된다는 교시는 없다.
포유동물 위 환경에서 생활성 기능을 보존하는 상기 방법과 관련된 문제에는 하기가 포함된다:
창자 코팅을 사용한 전략은 위에서 작용하는 물질을 전달하는데는 부적합하다. 이것은 경구 백신에 의한 헬리코박터 파이로리 감염 (이는 위염의 중요 원인이다)의 제어 및/또는 수동면역 접근에서 헬리코박터 파이로리에 대한 항체의 이용에 대한 특별한 제한이다.
포유동물 위에서 단백질분해를 감소시키기 위한 완충액을 사용하는 전략은 생활성 물질의 기능의 손실이 효소, 예를 들면, 펩티다아제, 아밀라아제의 작용에 의해 야기되는 경우에 부적합하다. 상기 효소는 자주 단백질 치료학 및 생명체에 기초한 치료학에서 기능의 손실과 관련된다. 더욱이, 규칙적인 기준으로 중탄산염과 같은 완충액의 사용은 바람직하지 않다.
적대 환경에서 생활성 기능을 보존하기 위한 포르말린 처리 (또는 다른 가교 전략)의 이용은 자주 가교 반응이 물질의 구조 및 기능을 파괴하는 경우에 비효과적이다. 이러한 이유로 상기 기술은 면역 반응을 촉진시키기 위해 표면 항원을 제시하는 것을 제외하고는 거의 사용되지 않는다 (예를 들면, 디프테리아 독소, Petre 등, Developmental Biological Standards 1996; 87: 125-34).
암소에 의한 초유내로 생활성 물질의 분비를 촉진하는 방법은 수 많은 한계를 가진다.
일부 생활성 물질은 암소가 초유내로 분비하기가 어렵거나 불가능하다.
생활성 물질의 양은 가변적이고, 이것은 자주 품질 제어면에서 허용되지 않는다.
특정 생활성 물질의 최대양은 또한 낮고,전형적으로 초유내에서 면역글로불린의 5% 미만이다. 정제 요법에서 허용가능한 최대 부피는 정제당 0.5 cm3 이다 (1일 2 내지 3 개의 정제가 허용가능하다). 특정 항체의 낮은 농도는 치료적 선택을 심하게 제한한다.
더욱이, 초유를 생산하는 면역화된 암소는 또한 인간 소비를 위한 우유를 생산한다. 이것은 규제 및 식품 안전 문제의 면에서 어려움을 제공한다.
더욱이, 초유는 분만에서 암소로부터 1년에 단지 한번 수확되며, 이는 특히 생활성 성분이 암소에 의해 초유내로 분비된다면, 생산 논리 및 비용에서 문제를 야기한다.
우리는 시험관내(체외) 혼합 작업에서 불안정한 생활성 물질과 포유동물 초유 또는 이의 성분을 합함으로써 불안정한 생활성 물질의 기능을 보존하는 것이 가능하다는 놀라운 발견을 하였다. 포유동물 초유는 포유동물 초유의 가공된 형태일 수 있다.
따라서, 본 발명은 불안정한 생활성 물질 및 포유동물 초유의 혼합물을 포함하는, 불안정한 생활성 물질의 투여용 조성물을 제공한다.
불안정한 생활성 물질은 적대 환경, 예를 들면, 포유동물 위 또는 혹위, 고온 환경 또는 다습 환경의 경우에 특히 사용하는 환경에서 기능적으로 손상된 생활성 물질이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 생활성 물질 및 포유동물 초유의 혼합물을 형성하고, 상기 조성물을 생활성 물질이 위 환경 또는 다른 적대 환경과 같은 불안정한 환경에 적용하는 것을 포함하는 불안정한 생활성 물질(예를 들면, 포유동물 위 또는 다른 적대 환경에서 기능적으로 손상된 생활성 물질)을 투여하는 방법을 제공한다.
하나의 바람직한 예에서, 조성물은 경구로 투여된다.
본 발명은 또한 치료 물질과 포유동물 초유 또는 이의 성분을 혼합하는 것을 포함하는, 질병의 치료 또는 예방용 섭취 약물의 제조시, 포유동물 위 또는 다른 적대 환경에서 기능적으로 손상된, 불안정한 생활성 물질을 이용하는 방법을 제공한다.
암소에 의한 초유내로 분비된 물질의 예상된 안정성보다 높은 안정성이 많은 연구가에 의해 인식되었지만, 초유 또는 가공된 초유가 생활성 물질에 첨가되어 위 또는 혹위 또는 다른 적대 환경에서 이들의 기능을 보존할 수 있다는 제시는 없었다.
바람직하게는, 생활성 물질은 생물체의 생리적인 또는 약학적 변수에서 측정가능한 변화를 야기할 수 있는 물질이다.
특히 바람직한 하나의 구현예에서, 생활성 물질은 항생제이다. 따라서, 본 발명은 항생제 및 포유동물 초유 및 임의로 부형제를 포함하는 항생제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 면에서, 우리는 락토바실러스 종과 같은 생균제 박테리아 및 포유동물 초유를 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.
도 1 은 실시예 1 에 보고된 요소분해효소 활성의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
도 2 는 실시예 3 에 보고된 항체 활성의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
도 3 은 실시예 4 에 보고된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 생존의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
도 4 는 실시예 6 에 보고된 에리스로마이신 활성의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
도 5 는 실시예 7 에 보고된 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 생존의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
도 6 은 실시예 8 에 보고된 콜레라 독소 활성의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
도 7 은 실시예 9 에 보고된 락토바실러스 플란타룸의 초유 보호를 보여주는 차트이다.
본 발명은 바람직하게는 0.03 M NaCl 중의 0.32% 돼지 펩신 용액을 포함하고, HCl 로 pH 를 1.2 로 조절한 액체에서 37℃에서 60분 동안 물질을 인큐베이션한 후에 20% 이상 기능 감소를 보인 생활성 물질을 사용한다.
바람직하게는, 포유동물 초유는 출산후 최초 4일에 유지된 소 초유, 더욱 바람직하게는 출산후 최초 2일에 유지된 소 초유, 더더욱 바람직하게는 출산후 최초 1일에 유지된 소 초유, 가장 바람직하게는 출산후 최초에 짠 소 초유이다.
본원에 사용된 용어 초유는 초유; 가공된 초유, 예를 들면, 하나 이상의 지방, 세포 찌꺼기, 락토오스 및 카제인을 부분적으로 또는 완전히 제거하기 위해 가공된 초유; 및 예를 들면, 냉동건조, 분무건조, 또는 당업계에 공지된 기타 건조 방법에 의해 건조된 초유 또는 가공된 초유를 포함한다. 초유는 일반적으로 출산후 5일내에 암소와 같은 포유동물로부터 채취한다.
바람직하게는 포유동물 초유는 탈지작업, 더욱 바람직하게는 탈지작업 및 세포 찌꺼기를 제거하기 위한 작업, 더욱 바람직하게는 탈지작업, 세포 찌꺼기를 제거하기 위한 작업 및 염, 당, 기타 저분자량 물질 및 일부 물을 제거하기 위한 작업을 이용하여 가공되었다.
초유 및/또는 생활성 물질은 건조형태일 수 있다. 성분은 건조과정 전, 동안 또는 후에 밀접하게 혼합될 수 있다.
바람직하게는 생활성 물질 및 포유동물 초유는 혼합되고, 혼합물은 바람직하게는 동결건조에 의해 건조될 수 있는 수성 혼합물이다.
하나의 구현예에서, 생활성 물질 및 포유동물 초유 혼합물은 동결건조되고, 중량으로 동결건조된 물질의 반 이상이 첨가된 초유 또는 가공된 초유를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 중량으로 동결건조된 물질의 3/4 이상이 초유 또는 가공된 초유를 포함한다.
바람직하게는 암소로부터 수집된 소 초유는 4% 이상의 총 단백 (중량%), 더욱 바람직하게는 5%, 더욱 바람직하게는 8% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 이상을 포함한다.
바람직하게는 암소로부터 수집된 초유의 총 단백질에 대한 IgG의 비는 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이다.
바람직하게는 생활성 물질은 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: 성장 촉진제, 항종양제, 경구 백신, 흡입제, 살아 있는 미생물 (예를 들면, 락토바실러스 종과 같은 생균제), 펩티드, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 단백질, 당단백질, 당 및 복합 탄수화물, 감염방지제, 항균제, 소독제, 방부제, 항우울제, 정신작용제, 기타 생활성 물질에 대한 벡터, 예를 들면 박테리아 벡터 (대장균, 살모넬라, 비브리오, 락토바실러스, 바실러스, 마이코박테리아, 쉬겔라를 포함), 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 헤르페스바이러스, 엔테로바이러스, 파라믹소바이러스 및 오르토믹소바이러스를 포함), 식물 벡터 (담배, 감자 및 바나나 포함), 효모 벡터로서 사용되는 감염제 및 유전자변형생물체, 질환 및 질환 야기 물질 (예를 들면, 헬리코박터 파이로리, 대장균, 바실러스 종, 병원성 예르시니아 종 및 알레르기 항원)에 대한 항체를 포함하는 면역글로불린 또는 친화성 정제된 면역글로불린 및 단편, 상기 임의의 것을 포함하는 유도체 및 복합체.
생활성 물질이 단클론 또는 다클론 면역글로불린 또는 키메라 단클론 항체 또는 인간화된 단클론 항체 또는 덴드리머(dendrimer) 제시된 면역활성 단편 또는 면역활성 단편, 예를 들면, F(ab) 및 F(ab)2 단편 또는 재조합 면역활성 단편, 또는 친화성 정제된 면역글로불린 또는 이의 면역활성 단편을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 상기 면역글로불린 또는 이의 단편은 헬리코박터 파이로리, 창자독소생성 대장균, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 엔테로바이러스 71을 포함하는 병원성 생물체에 결합할 수 있다.
본 발명의 조성물 중의 초유 및 생활성 물질의 비율은 활성 물질의 성질 및 위내의 상태의 민감한 정도에 의존할 것이다. 전형적으로 활성 물질에 대한 초유의 중량비는 0.5:1 초과, 더욱 바람직하게는 2:1 초과, 더더욱 바람직하게는 5:1 초과이다. 첨가된 초유 성분의 상한은 편리하게 투여될 수 있는 치료 물질의 양의 실질적인 제한에 의해 한정된다.
본 발명의 조성물은 캡슐, 분말정제, 에어로졸 분무, 시럽, 액체 또는 기타 당업계에 공지된 형태와 같은 형태의 범위로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 위장 투여에 적합한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 담체 및 부형제의 예에는 하기가 포함된다: 실리카, 활석, 이산화티탄, 알루미나, 전분, 카올린, 분말 셀룰로오스, 미세결정형 셀룰로오스, 아밀로펙틴 N, 수크로오스, 락토오스, 덱스트로오스, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 시트르산, 탄산수소나트륨, 마그네슘 스테아레이트, 셸락, 셀룰로오스 아세테이트, 세틸 알코올, 트리에틸 시트레이트, 폴리에틸렌 글리콜.
또 다른 특별한 구현예에서, 생활성 물질은 면역원성 단백질, 백신 성분을 발현하는 백신 또는 생물체의 당단백질 또는 기타 성분을 포함한다. 백신은 병원성 생물체, 예를 들면, 헬리코박터 파이로리, 창자독소생성 대장균, 예르시니아 페스티스에 대한 것일 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 생활성 물질은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a) 질병 생물체 헬리코박터 파이로리, 창자독소생성 대장균(ETEC), 피코르나 바이러스, 특히 엔테로바이러스, 로타바이러스, 안트락스(anthrax) 및 예르시니아 페스티스에 대한 항체 및 이의 단편;
(b) 헬리코박터 파이로리, ETEC, 안트락스, 예르시니아 페스티스에 의해 생산된 독소에 대한 항체 및 이의 단편 및 리신에 대한 항체; 및
(c) 헬리코박터 파이로리, ETEC, 피코르나 바이러스, 특히 엔테로바이러스, 로타바이러스, 안트락스 및 예르시니아 페스티스에 대한 경구 백신 및 흡입 백신.
*특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 (a) 헬리코박터 파이로리 및 대장균으로부터 선택된 병원성 미생물에 대한 백신 및 (b) 포유동물 초유를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 위장 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 초유는 일반적으로 위 환경에서 백신의 활성을 증가시키기에 충분한 양으로 존재할 것이다.
특히 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 헬리코박터 파이로리에 대한 결합 단백질 및 추가로 포유동물 초유를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 위궤양 또는 헬리코박터 파이로리 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 면역글로불린 또는 이의 단편은 달걀, 바람직하게는 병원균에 대한 사멸 백신으로 면역화된 암탉으로부터 유래된다.
본 발명은 특히 위에서 작용하는 생활성제를 전달하는데 유용하다. 예를 들면, 헬리코박터 파이로리 감염에 대한 물질. 그러나, 흡입 분무의 형태로 호흡성 병원균을 제어하기 위해 사용된 생활성 물질조차도 가상 위액 또는 적대 환경에 위치할 때 활성을 잃을 수 있다. 초유 또는 가공된 초유는 이 기능 손실로부터 보호할 수 있고, 이 보호 효과는 생활성 물질이 흡입 분무로서 전달될 때 유익할 것으로 기대된다.
본 발명은 효소 작용에 의해 야기된 단백질분해외에 낮은 pH 조건에 의해 야기된 단백질분해로부터 생활성제를 보호하는데 유용하다.
생균제 분야는 지난 10년에 걸쳐 급속하게 발전해 왔다. 생균제는 위장관에서 해로운 박테리아를 제거할 수 있는 유익한 박테리아를 포함한다. 유익한 박테리아의 소화불량은 락토바실러스 종의 존재를 방해하고, 비피도박터 종은 호주에서 판매되는 상업적인 생균제로 사용되는 중요한 박테리아이다. 상기 박테리아에서 젖산 생산은 산 환경에서 번성하지 않는 해로운 박테리아를 방해한다. 락토바실러스는 또한 특정 항체를 생산할 수 있다. 예를 들면, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)는 아시도필린(acidophiline)을 생산하고, 락토바실러스 불가리쿠스(L. bugaricus)는 불가리칸(bulgarican)을 생산한다. 비피도박테리아는 또한 생균제로서 이용될 수 있다. 생균제가 소화를 돕고, 내장을 청소하는 것을 돕고, 규칙적인 장 운동을 촉진시키며, 곰팡이, 바이러스 및 기생충의 파괴에 기여하고, 장 pH 를 조절하는 것으로 보고되었다.
생균제는 또한 위장관에 산의 축적 및 내독소의 생산에 기인한 산 내장 증후군(acid gut syndrome)의 치료 또는 예방에 유용하다.
생균제의 경구 투여는 위에서의 심각한 조건을 통과하는 생균제의 결과로서 활성의 현저한 손실을 초래할 수 있다. 우리는 생균제의 높은 수준의 활성은 본 발명에 따라 경구 투여될 경우에 보존된다는 것을 발견하였다.
생균제는 부형제 및 보조제를 포함할 수 있고, 정제, 분말, 캡슐 또는 액체 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 락토바실러스 종과 같은 생균제 박테리아 및 포유동물 초유를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 위장 기능장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
박테리아의 투여량은 환자의 상태 및 기능장애의 상태에 의존하나, 전형적으로 1일 105 CFU 락토바실러스 이상이다.
본 발명은 비가교 생활성 물질의 기능을 보존하는데 유용하다.
본 발명은 하기의 면에서 과면역 초유보다 현저하게 우수한 치료제의 제형화를 가능하게 한다:
▶ 생활성 물질의 양은 엄격한 한계내로 조절될 수 있다.
▶ 초유에 대해 별도로 제조되는 생활성 물질의 양은 더 이상 암소에 의한 면역활성 물질의 가변적인 생산에 좌우되지 않는다. 이는 품질 관리면에서 매우 바람직하다.
▶ 제공된 부피로 제시될 수 있는 생활성 물질의 양은 4 초과의 인자에 의해 과면역 초유로 가능한 것 이상으로 증가될 수 있다. 예를 들면, 조류 알, 특히 면역화된 암탉 유래의 난황 유래의 과면역 면역글로불린은 친화성 정제될 수 있고, F(ab)2 단편이 제조된다. 이것은 현저하게 확대된 치료학적 선택을 제공한다.
▶ 본 발명은 인간 소비를 위한 유제품 생산의 완전성을 손상시키지 않고 치료물질의 생산을 허용한다. 예를 들면, 생활성 물질은 실험실에서 제조될 수 있고, 초유는 정상적인 암소로부터 수확된다.
▶ 소 초유 추출액은 경구 치료에서 초유의 이용이 용이하도록 호주에서 보완의학으로서 사용하기 위한 치료용품 관청(Therapeutic Goods Authority)에 의해 열거된 물질이다.
본 발명은 지금 하기 실시예에 대해 기재될 것이다. 실시예는 본 발명의 실례로서 제공되며, 이들은 본 발명의 범위를 제한하지 않는 방식으로 이해되어야 한다.
많은 실시예는 첨부된 도면에서 보여준 결과에 관하여 논의된다.
실시예
실시예 1:
생활성 단백질의 보호의 예로서 위 환경 내에 효소 활성의 초유에 의한 보호
서설:
위 환경에서 생활성 단백질 활성의 보호제로서 소 초유의 역할은 요소분해효소를 이용하여 조사하였다. 초유의 보호 특성을 조사하기 위하여, 요소분해효소 활성에 대한 가상 위액의 효과를 소 초유의 존재 및 부재에서 비교하였다.
재료 및 방법:
시약
요소분해효소: Sigma Jack Bean Urease Type III (Cat No U-1500)을 효소 공급원으로서 사용하였다. 냉동건조된 요소분해효소(16 유닛/mg 의 인용된 활성; 1 유닛은 pH 7.0, 25℃에서 분당 요소로부터 암모니아 1.0 마이크로몰을 해리한다)를 밀리큐 물에 0.3 유닛/㎕ (대략 21 mg/ml)로 용해하고, 연구에 사용될 때까지 얼음에 저장하였다.
가상 위액 ( SGF ) : (Hilger 등, 2001로부터 수정). 시그마 돼지 펩신의 0.32% 용액 (위 점막 유래의 Cat No P-7012)을 0.03M NaCl 에서 제조하고 HCl 로 pH 를 1.2 로 조절하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 총유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 저장 제제를 밀리큐 물에 300 mg/ml에서 재구성하였다. 소 초유 추출액의 제조 방법에 대해 실시예 2 를 참고한다.
가상 위액(SGF)를 이용한 요소분해효소의 처리
인큐베이션 혼합물을 요소분해효소 용액의 분취량과 동일한 부피의 재구성된 초유 또는 밀리큐 물을 합함으로써 네 벌 제조하였다. 초유 제제 및 물의 대조군 혼합물을 또한 제조하였다(2벌).
인큐베이션 혼합물 1-4: 100㎕ 의 요소분해효소 + 100㎕ 의 밀리큐 물
인큐베이션 혼합물 5-8: 100㎕ 의 요소분해효소 + 100㎕ 의 초유
인큐베이션 혼합물 9-10: 100㎕ 의 초유 + 100㎕ 의 밀리큐 물
혼합물을 튜브 1, 2, 5, 6 및 9 에 50㎕ 의 SGF 의 첨가에 의한 처리 시작 전에 5분 동안 37℃ 수조에서 예열하였다. 모방(mock) 처리를 튜브 3, 4, 7, 8 및 10 에 50㎕ 의 0.03M NaCl 의 첨가에 의해 시작하였다. 각 튜브에 0.25 부피의 냉각된 160 mM Na2CO3 의 첨가에 의해 반응을 종료하기 전에 37℃에서 15분 동안 모든 시료를 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 Eppendorf 원심분리기 5417C 에서 20,800g 에서 3 분 동안 원심분리하고, 얼음에 저장하였다. 상층액을 요소분해효소 활성에 대해 분석하였다.
요소분해효소 분석
요소분해효소 활성을 증가된 감도를 위해 결합된 효소 분석법을 사용하여 분석하였다 (Kaltwasser 및 Schlegel, 1966 로부터 변형). 이 반응에서, 요소분해효소는 요소의 가수분해를 촉매하는데:
요소 + H20 +2H+ ⇒ 2NH4 + + C02
이는 암모니아 생산을 글루탐산 탈수소효소 반응에 결합함으로써 측정된다:
2NH4 + + 2 α-케토글루타레이트 + 2 NADH ⇒ 2 글루타메이트 + 2NAD+ + 2H2O
이 반응은 NADH 의 NAD 로의 산화가 뒤따른다.
1ml 의 최종 분석 부피는 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 중에 1.6 mM α-케토글루타레이트(Boehringer Mannheim Cat No. 127 205), 1.5 mM NADH (Sigma β- NADH Cat No. N-8129), 15 유닛/ml 의 L-글루탐산 탈수소효소 (Sigma Cat No. G-4387), 10mM 요소(Boehringer Mannheim Cat No. 100 164) 및 1mM 소듐 술피드 (Sigma Cat No S-4766)의 최종 농도를 포함하였다. 상기 시약을 1cm 경로 길이 폴리스티렌 큐벳(Sarstedt Cat No 67.742)에서 혼합한 후, Beckman DU70 기록 분광분석기에서 몇 분 동안 실온으로 평형화시켰다. 분광분석기를 시료의 첨가 전에 상기 혼합물을 이용하여 영점 조정을 하였다.
각 인큐베이션 혼합물의 상층액의 10㎕ 시료를 분석 혼합물에 첨가하여 분석을 시작하였다. 반응 속도를 실온에서 4분 이하 동안 340nm 에서 10초마다 기록하였다. 반응속도를 곡선의 선형 부분으로부터 계산하고 (일반적으로 처음 1-2분 후에), 요소분해효소 활성을 가수분해된 요소 마이크로몰/분/단백질 mg 로서 표시하였다.
결과
혼합물 시료 처리 요소분해효소 활성
( 마이크로몰 요소/분/ mg 효소)
평균 SD
1-2 요소분해효소 + H2O SGF 0.027 0.022
3-4 요소분해효소 + H2O 모방 0.158 0.021
5-6 요소분해효소 + 초유 SGF 0.138 0.018
7-8 요소분해효소 + 초유 모방 0.173 0.014
기본 요소분해효소 활성
(ABS 340nm/분)
9 초유 + H2O SGF 0.021
10 초유 + H2O 모방 0.019
결과의 표 및 도 1 에 보여준 바와 같이, 희석된 요소분해효소 용액에 가상 위액의 첨가는 부차적인 활성의 감소를 보이는 효소의 비가역적인 변성을 초래하였다. SGF 후의 잔존 낮은 수준의 요소분해효소 활성은 초유 단독 (요소분해효소 없음) 대조군에서 발견된 것과 동등하였다. 주의: "모방" 처리는 가상 위액(SGF)보다 오히려 염수가 사용된 처리이다.
대조적으로, 요소분해효소 용액에 초유의 첨가는 펩신 및 산의 효과로부터 요소분해효소의 보호를 제공하였다. 초유의 존재하에, 보호된 요소분해효소는 모방 처리된 요소분해효소/초유 혼합물의 활성의 대략 80% 를 유지하였다. 상기 효소 모델을 이용하여, 소 초유는 가상 위 환경에서 단백질 활성의 보호를 제공하는 것으로 나타났다.
참고문헌
Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J and Hentges F (2001). Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin. Clin Exp Immunol, 123: 387-394.
Kaltwasser H and Schlegel HG (1966). NADH-dependent coupled enzyme assay for urease and other ammonia-producing systems. Analytical Biochem, 16: 132-138.
Scott DR, Weeks D, Hong C, Postius S, Melchers K and Sachs S (1998). The role of internal urease in acid resistance of Helicobacter pylori. Gastroenterology, 114: 58-70.
실시예 2:
가공된 소 초유 분말의 제조 방법
하기 도식은 초유를 채취하고, 이를 가공된 형태로 전환하기 위해 사용된 원리를 보여준다.
Figure pat00001
원료 초유는 젖소로부터, 가장 바람직하게는 분만 후 초유에서 수집된다. 초유는 농장에서 4℃ 에 저장된 후, -20℃ 에서 장기간 저장을 위해 수송되거나 또는 직접 습윤 제조공정(wet manufacturing)으로 보내진다.
원료 초유는 대략 37℃ 로 가온된 후, 지방을 제거하기 위해 회전 우유 분리기를 이용하여 찌꺼기를 걷어낸다. 생성된 액체는 저온살균되거나 또는 7-10 마이크론 세라믹 필터 시스템으로 미세여과된다(박테리아 및 찌꺼기를 제거하기 위함). 액체를 한외여과하여(예를 들면, Abcor 10m2 한외여과 플랜트) 대부분의 물, 락토오스 및 전해질을 제거하여 고단백 농축액을 남긴다. 생성된 고단백 농축액은 추가로 바람직하게는 동결건조 또는 분무건조에 의해 가공된다.
상기 방법은 하기 명세서에 따라 가공된 소 초유 분말을 생산한다. 하기 정의된 이 산물은 호주의 치료 제품 정부에 의해 치료 제품에 포함되기에 적합한 물질이다.
외관: 자유 유동의 담황색 분말.
성질: 물에 분산성. 습기와 접촉될 때 우유의 부드러운 냄새.
습도: 2 내지 5% m/m 범위 AS 2300.1.1 (1988)
지방: 1 내지 4 % m/m 범위 AS 2300.1.3 (1988)
재 (@550℃): 8 % m/m 이하 AS 2300.1.5 (1988)
총 질소 ( TN ): 정보에 대해** AS 2300.1.2 (1991)
비단백질 질소 ( NPN ): 정보에 대해** AS 2300.1.2.2 (1988)
진정 단백질: 60 % m/m 이상 (TN-NPN)% x 6.38
단백질: 60 % m/m 이상 AS 2300.1.2 (1991)
락토오스 (1 수화물): 15 % m/m 이하
효소 가수분해 및 산화에 이은 UV 분석 (Boehringer Mannheim)
총 면역글로불린: 20 % m/m 이상
방사상 면역확산 분석법 (m/m 은 총 조성물 질량에 의해 나누어지는 성분 질량을 의미한다)
미생물 한계: TGA 지침에 따른다
잔류물: 중금속 농업 및 수의 화학물질
유제품에 대한 ANZFA 식품 표준 코드에 속한다. 적용할 수 있는 식품 표준이 없는 경우에, 중금속에 대한 BP 시험을 적용하고 (납으로서 계산된 2ppm), 살충제 잔류물에 대한 BP 조건을 적용한다.
** 진정한 단백질에 대한 값을 계산하기 위해 사용됨
'AS' 는 '호주 표준'의 호주 표준 조직 시리즈의 서류를 언급한다- 이 경우에 유제품에 대한 품질 및 성분 시험의 표준화된 방법을 언급함.
실시예 3
산/펩신 처리 동안 항체 활성의 초유 보호
위 환경에서 단백질 활성의 보호제로서 소 초유의 역할은 항체 모델을 이용하여 조사하였다. 초유의 보호 특성을 조사하기 위해, 인플루엔자 바이러스 특이적 단클론 항체의 생활성에 가상 위액의 효과를 소 초유의 존재 및 부재하에 비교하였다.
재료 및 방법 :
시약
인플루엔자 바이러스 및 특이적인 단클론 항체: 본 연구에 사용된 유형 A 인플루엔자 바이러스는 Mem7lH-BelN (H3N3)이었다. 사용된 항체는 인산염 완충액에 1:10으로 희석된 Mem7lH-BelN 특이적인 IgG2a 단클론 (Mab 36/2) 이었다.
가상 위액 ( SGF ) : (Hilger 등, 2001로부터 수정). 시그마 돼지 펩신의 0.32% 용액 (위 점막 유래의 Cat No P-7012)을 0.03M NaCl 에서 제조하고 HCl 로 pH 를 1.2 로 조절하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 저장 제제를 밀리큐 물에 300 mg/ml에서 재구성하였다.
SGF 를 이용한 단클론 항체 36/2의 처리
인큐베이션 혼합물을 인산염 완충액(PBS)에 1:10으로 희석된 항체 분취량과 동일한 부피의 재구성된 초유 또는 밀리큐 물을 합함으로써 제조하였다. 초유 제제 및 물의 대조군 혼합물을 또한 제조하였다.
인큐베이션 혼합물 1-2: 100㎕ 의 Mab 36/2 + 100㎕ 의 밀리큐 물
인큐베이션 혼합물 3-4: 100㎕ 의 Mab 36/2 + 100㎕ 의 초유
인큐베이션 혼합물 5-6: 100㎕ 의 초유 + 100㎕ 의 밀리큐 물
혼합물을 튜브 1, 3 및 5 에 50㎕ 의 SGF 의 첨가에 의한 처리 시작 전에 5분 동안 37℃ 수조에서 예열하였다. 모방 처리를 튜브 2, 4 및 6 에 50㎕ 의 0.03M NaCl 의 첨가에 의해 시작하였다. 각 튜브에 0.25 부피의 냉각된 160 mM Na2CO3 의 첨가에 의해 반응을 종료하기 전에 37℃에서 15분 동안 모든 시료를 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 Eppendorf 원심분리기 5415D 에서 16,100g 에서 3 분 동안 원심분리하고, 얼음에 저장하였다. 상층액을 항체 활성에 대해 분석하였다.
혈구응집억제 분석
항체 활성을 혈구응집억제(HI) 분석을 이용하여 분석하였다. 혈구응집 적정 및 HI 분석을 96 웰 U-바닥 미세역가 플레이트 (Sarstedt Group, SA, Australia) 및 1% (부피/부피) 병아리 적혈구를 이용한 표준 절차에 의해 수행하였다. 혈구응집 분석을 사용하여 HI 분석에 사용된 바이러스의 혈구응집 단위(HAU)를 정량하였다. 각 인큐베이션 혼합물을 PBS 에 1:3.2 로 희석하였는데, 이는 1:100 의 Mab 36/2 의 초기 농도를 제공한다. 인큐베이션 혼합물을 웰당 최종 부피 25㎕를 위해 미세역가 플레이트를 가로질러 이중 웰에 2배 연속 희석하였다. 4 HAU 의 농도로 동일한 부피의 바이러스를 각 웰에 첨가하고, 항체 및 바이러스를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후에, 25㎕ 의 병아리 적혈구 (PBS 중의 1% 부피/부피)를 각 웰에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. HI 역가는 4 HAU 의 바이러스를 저해하는 가장 높은 항체 역가의 역수로서 취하였다. 분석을 이중으로 2회 반복하였다.
결과
시료 처리 HI 역가
평균 SD
Mab 36/2 + H2O SGF 200 0
Mab 36/2 + H2O 모방 1200 462
Mab 36/2 + 초유 SGF 9600 3695
Mab 36/2 + 초유 모방 8000 3200
Mab 36/2(1/100 희석) 무처리 800 0
기본 초유 활성
초유 + H2O SGF 250 100
초유 + H2O 모방 350 300
결과의 표 및 도 2 에 보여준 바와 같이, 가상 위액으로 Mab 36/2 의 처리는 항체의 혈구응집억제 활성에서 6 배 감소를 초래하였다.
대조적으로, 항체 제제에 초유의 첨가는 펩신 및 산의 효과로부터 항체의 보호를 제공하였다. 초유의 존재하에, 보호된 항체는 활성의 감소를 보여주지 않았다.
상기 항체 모델을 이용하여, 초 소유는 가상 위 환경에서 항체 활성의 보호를 제공하는 것으로 드러났다.
참고문헌
Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J and Hentges F (2001). Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin. Clin Exp Immunol, 123: 387-394.
Deliyannis G, Jackson D, Dyer w, Bates J, Coulter A, Harling-McNabb L, Brown L, (1998). Immunopotentiation of humoral and cellular responses to inactivated influenza vaccines by two different adjuvants with potential for human use. Vaccine, 16: 2058-2068.
Anders EM, Hartley C, Jackson D (1990). Bovine and mouse serumP inhibitors of influenza A viruses are mannose-binding lectins. Proc NatlAcad USA, 87: 4485-4489.
실시예 4:
산/펩신 처리 동안 락토바실러스 플란타룸 생존의 초유 보호
서설 :
위 환경에서 박테리아 생존의 보호제로서 소 초유의 역할을 락토바실러스 생존 플레이트 수(count) 분석을 이용하여 조사하였다.
초유의 보호 특성을 조사하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸에 대한 가상 위액의 효과를 소 초유의 존재 및 부재하에 비교하였다.
재료 및 방법:
시약
락토바실러스 플란타룸 : 본 연구에 사용된 락토바실러스 플란타룸 균주는 생균제에 사용된 균주이며, [Microbial Research Unit Royal Children Hospital, Parkville, Victoria] 의 컬쳐 컬렉션으로부터 취하였고, 16S 서열결정(리보좀 서브유닛으로부터 DNA 의 서열결정)에 의해 타이핑하였다. 균주를 37℃ CO2 인큐베이터에서 48 내지 72 시간 동안 말 혈액 한천 (horse blood agar: HBA) 플레이트에서 배양하였다. 락토바실러스의 접종액을 HBA 플레이트로부터 2개 이상 콜로니를 취하고, 0.5 McFarland 표준과 동등한 혼탁도에 이르도록 2mL 의 염수를 접종함으로써 제조하였다.
가상 위액 ( SGF ) : (Hilger 등, 2001로부터 수정). 시그마 돼지 펩신의 0.32% 용액 (위 점막 유래의 Cat No P-7012)을 0.03M NaCl 에서 제조하고 HCl 로 pH 를 1.2 로 조절하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 방사선 처리하였다. 저장 제제를 밀리큐 물에 300 mg/ml에서 재구성하였다.
SGF 를 이용한 락토바실러스의 처리
인큐베이션 혼합물을 락토바실러스 플란타룸 접종액의 분취량과 동일한 부피의 재구성된 초유 또는 밀리큐 물을 합함으로써 제조하였다. 초유 제제 및 물의 대조군 혼합물을 또한 제조하였다.
인큐베이션 혼합물 1-2: 100㎕ 의 락토바실러스 + 100㎕ 의 밀리큐 물
인큐베이션 혼합물 3-4: 100㎕ 의 락토바실러스 + 100㎕ 의 초유
인큐베이션 혼합물 5-6: 100㎕ 의 초유 + 100㎕ 의 밀리큐 물
혼합물을 튜브 1, 3 및 5 에 50㎕ 의 SGF 의 첨가에 의한 처리 시작 전에 5분 동안 37℃ 수조에서 예열하였다. 모방 처리를 튜브 2, 4 및 6 에 50㎕ 의 0.03M NaCl 의 첨가에 의해 시작하였다. 각 튜브에 0.25 부피의 냉각된 160 mM Na2CO3 의 첨가에 의해 반응을 종료하기 전에 37℃에서 15분 동안 모든 시료를 인큐베이션하였다.
락토바실러스 생존 플레이트 수
처리 후의 락토바실러스 생존을 생존 플레이트 수 기술을 이용하여 분석하였다. 인큐베이션 혼합물의 10배 희석액을 처리 후 즉시 염수에서 제조하였다. 100㎕ 의 각 희석액을 이중 플레이트에 분산하였다. 플레이트를 48 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트당 콜로니의 수를 계산하였다. 인큐베이션 혼합물 중의 mL 당 콜로니 형성 단위(cfu) 수를 희석된 현탁액의 cfu/mL 수에 희석 배수를 곱함으로써 계산하였다.
결과
시료 처리 플레이트 수
( log 10 cfu / mL )
평균 SD
락토바실러스 + H2O SGF 3.99 0.36
락토바실러스 + H2O 모방 6.99 0.24
락토바실러스 + 초유 SGF 7.01 0.19
락토바실러스 + 초유 모방 6.96 0.27
기본 초유 활성
초유 + H2O SGF 0 0
초유 + H2O 모방 0 0
결과의 표 및 도 3 에 보여준 바와 같이, 락토바실러스 접종액에 가상 위액의 첨가는 락토바실러스 생존에서 1000 배 감소를 초래하였다.
대조적으로, 락토바실러스 접종액에 초유의 첨가는 펩신 및 산의 효과로부터 박테리아의 보호를 제공하였다. 초유의 존재하에, 보호된 락토바실러스는 생존의 감소를 보여주지 않았다. 상기 생존 수 기술을 이용하여, 소 초유는 가상 위 환경에서 생균제 생존의 보호를 제공하는 것으로 드러났다.
참고문헌
Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J and Hentges F (2001). Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin. Clin Exp Immunol, 123: 387-394.
Miles A, Misra S (1938). The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg, 38: 732-749.
실시예 6:
산/펩신 처리 동안 에리스로마이신 활성의 초유 보호
서설 :
위 환경에서 생활성 부분의 활성의 보호제로서 소 초유의 역할을 항생제 모델을 이용하여 조사하였다. 초유의 보호 특성을 조사하기 위하여, 에리스로마이신 활성에 대한 가상 위액의 효과를 소 초유의 존재 및 부재하에 비교하였다.
재료 및 방법:
시약
에리스로마이신 : Boehringer Mannheim 에리스로마이신 (C37H57NO13)을 항생제 공급원으로서 사용하였고, 1mg/mL 의 저장 농도로 95% 에탄올에 용해하고, 4℃에서 저장하였다. 본 연구를 위해, 에리스로마이신 스톡을 밀리큐 물에 100㎍/mL 로 희석하고, 사용시 까지 얼음에 저장하였다.
가상 위액 ( SGF ) : (Hilger 등, 2001로부터 수정). 시그마 돼지 펩신의 0.32% 용액 (위 점막 유래의 Cat No P-7012)을 0.03M NaCl 에서 제조하고 HCl 로 pH 를 1.2 로 조절하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 저장 제제를 밀리큐 물에 300 mg/ml에서 재구성하였다.
SGF 를 이용한 에리스로마이신의 처리
인큐베이션 혼합물을 에리스로마이신 용액의 분취량과 동일한 부피의 재구성된 초유 또는 밀리큐 물을 합함으로써 제조하였다. 초유 제제 및 물의 대조군 혼합물을 또한 제조하였다.
인큐베이션 혼합물 1-2: 100㎕ 의 에리스로마이신 + 100㎕ 의 밀리큐 물
인큐베이션 혼합물 3-4: 100㎕ 의 에리스로마이신 + 100㎕ 의 초유
인큐베이션 혼합물 5-6: 100㎕ 의 초유 + 100㎕ 의 밀리큐 물
혼합물을 튜브 1, 3 및 5 에 50㎕ 의 SGF 의 첨가에 의한 처리 시작 전에 5분 동안 37℃ 수조에서 예열하였다. 모방 처리를 튜브 2, 4 및 6 에 50㎕ 의 0.03M NaCl 의 첨가에 의해 시작하였다. 각 튜브에 0.25 부피의 냉각된 160 mM Na2CO3 의 첨가에 의해 반응을 종료하기 전에 37℃에서 15분 동안 모든 시료를 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 Eppendorf 원심분리기 5415D 에서 16,100g 에서 3 분 동안 원심분리하고, 얼음에 저장하였다. 상층액을 에리스로마이신 활성에 대해 분석하였다.
에리스로마이신 민감성 분석
에리스로마이신 활성을 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 디스크 확산 민감성 시험을 이용하여 분석하였다. 바실러스 서브틸리스(ATCC 6633) 접종액을 말 혈액 한천 (HBA) 에서 배양한 밤새 배양물로부터 2개 이상의 콜로니를 취하고, 0.5 McFarland 표준과 동등한 혼탁도에 이르도록 2mL 의 염수를 접종함으로써 제조하였다. 분석용 HBA 플레이트를 균일한 접종액을 수득하기 위해 플레이트의 전체 표면에 걸쳐 3 방향으로 균일하게, 표준화된 용액에 담군, 멸균 면봉을 스트리킹함으로써 접종하였다. 플레이트를 디스크를 적용하기 전에 3 내지 5 분 동안 건조시켰다.
각 처리를 밀리큐 물로 1:2 로 연속 희석하여, 각각에 대해 6 개의 희석액을 얻었다. 20㎕의 각 희석액을 이중 블랭크 민감성 디스크 상에 로딩하였다 (Oxoid, Hampshire, England). 상기 디스크를 이중 플레이트 상에 위치하기 전에 30분 이상 동안 건조시켰다. 각 플레이트는 단일 처리의 6 개의 희석액에 해당하는 6 개의 균일하게 위치한 디스크를 포함하였다. 처리 시료와 동등한 농도로 밀리큐 물에 희석된 무처리 에리스로마이신을 또한 대조군으로 사용하여 표준 곡선을 수득하였다. 플레이트를 37℃에서 16-18 시간 동안 인큐베이션하였다.
16-18 시간 동안 인큐베이션 후에, 에리스로마이신에 대한 바실러스 서브티리스의 민감성을 디스크 주위에 나타나는 억제 지역의 직경을 측정함으로써 결정하였다. 상기 지역은 디스크에서 주변 한천으로의 항생제의 확산에 기인한다. 표준 곡선을 연속 희석된 무처리 에리스로마이신 대조군에 기인한 지역의 직경을 이용하여 생성하였다. 시료의 직경을 이용하여 무처리 대조군과 비교하여 잔존하는 에리스로마이신 활성의 백분율을 수득하였다. 분석을 이중으로 3회 반복하였다.
결과
시료 처리 에리스로마이신 활성
( 무처리 대조군과 비교한 %)
평균 SD
에리스로마이신 + H2O SGF 8 3
에리스로마이신 + H2O 모방 114 14
에리스로마이신 + 초유 SGF 140 20
에리스로마이신 + 초유 모방 123 9
에리스로마이신 + H2O 무처리 100 0
기본 에리스로마이신 활성(%)
초유 + H2O SGF 0 0
초유 + H2O 모방 0 0
결과의 표 및 도 4 에 보여준 바와 같이, 100㎍/mL 용액에 가상 위액의 첨가는 에리스로마이신 활성에서 92% 감소를 초래하였다.
대조적으로, 에리스로마이신 용액에 초유의 첨가는 펩신 및 산의 효과로부터 에리스로마이신의 보호를 제공하였다. 초유의 존재하에, 보호된 에리스로마이신은 100% 활성을 유지하였고, 실제로 무처리 대조군과 비교할 경우 개선된 활성을 보여주었다(도 1 및 2 참고). 상기 증가된 활성은 또한 모방 처리된 에리스로마이신 및 초유 용액에 대해 명백하였다. 초유 단독은 기본 항생제 활성을 보여주지 않아, 첨가된 초유를 통한 증가된 활성은 초유에 존재하는 기본 에리스로마이신에 의해 설명될 수 없다. 상기 항생제 모델을 이용하여, 소 초유는 가상 위 환경에서 항생제 활성의 보호를 제공하는 것으로 드러났다.
참고문헌
Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J and Hentges F (2001). Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin. Clin Exp Immunol, 123: 387-394.
Barry AL and Thornsberry C (1991). Susceptibility tests: diffusion test procedures. In Balos A, Hauser WJ, Herman KL, Isenberg HD, and Shadomy HJ. Manual of Clinical Microbiology5t"Edition, American Society for Microbiology, Washington, pp 1117-1125.
The British Society for Antimicrobial Chemotherapy (1991) A Guide to Sensitivity Testing. The British Society for Antimicrobial Chemotherapy, San Diego.
실시예 7:
산/펩신 처리 동안 락토바실러스 카제이 쉬로타( LACTOBACILLUS CASEI SHIROTA) 생존의 초유 보호
서설 :
위 환경에서 생균제 생존의 보호제로서 소 초유의 역할을 락토바실러스 생존 플레이트 수 분석을 이용하여 조사하였다. 초유의 보호 특성을 조사하기 위하여, 야쿠르트 발효액으로부터 분리된 락토바실러스 카제이 쉬로타에 대한 가상 위액의 효과를 소 초유의 존재 및 부재하에 비교하였다.
재료 및 방법:
시약
락토바실러스 카제이 쉬로타 : 본 연구에 사용된 락토바실러스 카제이 쉬로타 균주는 생균제 산물인 야쿠르트로부터 분리되었다. 균주를 37℃ CO2 인큐베이터에서 48 내지 72 시간 동안 말 혈액 한천 (HBA) 플레이트에서 배양하였다. 락토바실러스의 접종액을 HBA 플레이트로부터 2개 이상 콜로니를 취하고, 0.5 McFarland 표준과 동등한 혼탁도에 이르도록 2mL 의 염수를 접종함으로써 제조하였다. 상기 접종액을 모든 처리를 위해 사용하였다.
가상 위액 ( SGF ) : (Hilger 등, 2001로부터 수정). 시그마 돼지 펩신의 0.32% 용액 (위 점막 유래의 Cat No P-7012)을 0.03M NaCl 에서 제조하고 HCl 로 pH 를 1.2 로 조절하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 방사선 처리하였다. 저장 제제를 밀리큐 물에 300 mg/ml에서 재구성하였다.
SGF 를 이용한 락토바실러스의 처리
인큐베이션 혼합물을 락토바실러스 카제이 쉬로타 접종액의 분취량과 동일한 부피의 재구성된 초유 또는 밀리큐 물을 합함으로써 제조하였다. 초유 제제 및 물의 대조군 혼합물을 또한 제조하였다.
인큐베이션 혼합물 1-2: 100㎕ 의 락토바실러스 + 100㎕ 의 밀리큐 물
인큐베이션 혼합물 3-4: 100㎕ 의 락토바실러스 + 100㎕ 의 초유
인큐베이션 혼합물 5-6: 100㎕ 의 초유 + 100㎕ 의 밀리큐 물
혼합물을 튜브 1, 3 및 5 에 50㎕ 의 SGF 의 첨가에 의한 처리 시작 전에 5분 동안 37℃ 수조에서 예열하였다. 모방 처리를 튜브 2, 4 및 6 에 50㎕ 의 0.03M NaCl 의 첨가에 의해 시작하였다. 각 튜브에 0.25 부피의 냉각된 160 mM Na2CO3 의 첨가에 의해 반응을 종료하기 전에 37℃에서 15분 동안 모든 시료를 인큐베이션하였다.
락토바실러스 생존 플레이트 수
처리 후의 락토바실러스 생존을 생존 플레이트 수 기술을 이용하여 분석하였다. 인큐베이션 혼합물의 10배 희석액을 처리 후 즉시 염수에서 제조하였다. 100㎕ 의 각 희석액을 이중 플레이트에 분산하였다. 플레이트를 48 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트당 콜로니의 수를 계산하였다. 인큐베이션 혼합물 중의 mL 당 콜로니 형성 단위(cfu) 수를 희석된 현탁액의 cfu/mL 수에 희석 배수를 곱함으로써 계산하였다. 분석을 이중으로 2회 수행하였다.
결과
시료 처리 플레이트 수
( log 10 cfu / mL )
평균 SD
락토바실러스 + H2O SGF 1.46 2.06
락토바실러스 + H2O 모방 7.43 0.09
락토바실러스 + 초유 SGF 7.01 0.18
락토바실러스 + 초유 모방 6.97 0.03
기본 초유 활성
초유 + H2O SGF 0 0
초유 + H2O 모방 0 0
결과의 표 및 도 5 에 보여준 바와 같이, 락토바실러스 카제이 쉬로타 접종액에 가상 위액의 첨가는 락토바실러스 생존에서 10,000 배 이상 감소를 초래하였다.
대조적으로, 락토바실러스 접종액에 초유의 첨가는 펩신 및 산의 효과로부터 생균제 박테리아의 보호를 제공하였다. 초유의 존재하에, 보호된 락토바실러스는 생존의 감소를 보여주지 않았다. 상기 생존 수 기술을 이용하여, 소 초유는 가상 위 환경에서 생균제 생존의 보호를 제공하는 것으로 드러났다.
참고문헌
Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J and Hentges F (2001). Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin. Clin Exp Immunol, 123: 387-394.
Miles A, Misra S (1938). The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg, 38: 732-749.
실시예 8:
산/펩신 처리 동안 콜레라 독소 활성의 초유 보호
서설 :
위 환경에서 보조제 활성의 보호제로서 소 초유의 역할을 점막 보조제를 이용하여 조사하였다. 초유의 보호 특성을 조사하기 위하여, 콜레라 독소 활성에 대한 가상 위액의 효과를 소 초유의 존재 및 부재하에 비교하였다.
재료 및 방법:
시약
콜레라 독소 및 Y1 부신 세포 : 시그마 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 콜레라 독소 (Cat No C-8052)를 보조제의 공급원으로서 사용하였다. 콜레라 독소를 밀리큐 물에 3.12㎍/mL 의 농도로 희석하고, 사용시 까지 얼음에 저장하였다. Y1 마우스 부신세포를 10% 송아지 혈청(FCS) 및 겐타마이신으로 보충된 DMEM 성장 배지에 웰당 2 X 104 세포의 농도로 96 웰 미세역가 플레이트에 접종하였다.
가상 위액 ( SGF ) : (Hilger 등, 2001로부터 수정). 시그마 돼지 펩신의 0.32% 용액 (위 점막 유래의 Cat No P-7012)을 0.03M NaCl 에서 제조하고 HCl 로 pH 를 1.2 로 조절하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 저장 제제를 밀리큐 물에 300 mg/ml에서 재구성하였다.
SGF 를 이용한 콜레라 독소의 처리
인큐베이션 혼합물을 3.12㎍/mL 콜레라 독소 스톡의 분취량과 동일한 부피의 재구성된 초유 또는 밀리큐 물을 합함으로써 제조하였다. 초유 제제 및 물의 대조군 혼합물을 또한 제조하였다.
인큐베이션 혼합물 1-2: 100㎕ 의 콜레라 독소 + 100㎕ 의 밀리큐 물
인큐베이션 혼합물 3-4: 100㎕ 의 콜레라 독소 + 100㎕ 의 초유
인큐베이션 혼합물 5-6: 100㎕ 의 초유 + 100㎕ 의 밀리큐 물
혼합물을 튜브 1, 3 및 5 에 50㎕ 의 SGF 의 첨가에 의한 처리 시작 전에 5분 동안 37℃ 수조에서 예열하였다. 모방 처리를 튜브 2, 4 및 6 에 50㎕ 의 0.03M NaCl 의 첨가에 의해 시작하였다. 각 튜브에 0.25 부피의 냉각된 160 mM Na2CO3 의 첨가에 의해 반응을 종료하기 전에 37℃에서 15분 동안 모든 시료를 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 Eppendorf 원심분리기 5415D 에서 16,100g 에서 3 분 동안 원심분리하고, 얼음에 저장하였다. 상층액을 여과 멸균하고, 독소 활성에 대해 분석하였다.
Y1 부신 세포 생물분석
콜레라 독소 활성을 Y1 부신 세포 생물분석을 이용하여 분석하였다. Y1 마우스 부신 세포를 웰당 2 X 104 세포의 농도로 96 웰 미세역가 플레이트에 접종하였다. 48 시간 후에, 세포를 PBS 로 3회 세척하였다. 성장 배지를 1% FCS 및 겐타마이신(100㎕)로 보충되고, 처리 튜브의 이중 시료를 포함하고, 1:10 의 초기 희석 후에 연속적으로 2 배 희석된 DMEM 으로 교체하였다. 콜레라 독소는 Y1 부신 세포를 이의 통상의 신장된 형태에서 더욱 구형으로 변하게 한다. 이 변화는 농도 의존성이다. 세포를 18 시간 동안 인큐베이션한 후, 위상차 현미경을 이용하여 전형적인 라운딩을 조사하였다. 분석의 종말점은 50% 이상의 세포 라운딩을 보여주는 가장 높은 희석으로 정의된다. 분석을 이중으로 2회 반복하였다. 10ng/mL 의 초기 농도로 콜레라 독소의 2배 희석을 동일한 플레이트에서 분석하고, 결과를 이용하여 분석의 민감도를 결정하였다.
결과
시료 처리 독성 역가
( log2 )
평균 SD
콜레라 독소 + H2O SGF 0 0
콜레라 독소 + H2O 모방 8 0
콜레라 독소 + 초유 SGF 8 0
콜레라 독소 + 초유 모방 7.5 0.71
콜레라 독소(10ng/mL) 무처리 8 0
기본 초유 활성
초유 + H2O SGF 2.5 0.71
초유 + H2O 모방 3 0
결과의 표 및 도 6 에 보여준 바와 같이, 가상 위액을 이용한 콜레라 독소의 처리는 콜레라 독소의 생물학적 활성의 완전한 상실을 초래하였다.
대조적으로, 콜레라 독소 제제에 초유의 첨가는 펩신 및 산의 효과로부터 독소의 보호를 제공하였다. 초유의 존재하에, 보호된 콜레라 독소는 활성의 감소를 보여주지 않았다. 상기 콜레라 독소 분석을 이용하여, 소 초유는 가상 위 환경에서 점막 보조제의 보호를 제공하는 것으로 드러났다.
참고문헌
Hilger C, Grigioni F, De Beaufort C, Michel G, Freilinger J and Hentges F (2001). Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin. Clin Exp Immunol, 123: 387-394.
Tauschek M, Gorrell R, Strugnell R, Robins-Browne R (2002). Identification of a protein secretory pathway for the secretion ofhet-labile enterotoxin by an enterotoxigenic strain of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 7066-7071.
실시예 9:
생체내 마우스 모델에서 락토바실러스 플란타룸의 보호
서설 :
위 환경에서 생균제 생존의 보호제로서 소 초유의 역할을 생체내 마우스 모델을 이용하여 조사하였다. 초유의 보호 특성을 조사하기 위하여, 마우스를 초유의 존재 및 부재하에 락토바실러스 플란타룸, 또는 양성 대조군으로서 탄산수소나트륨으로 공급하였다.
재료 및 방법:
시약
락토바실러스 플란타룸 : 본 연구에 사용된 락토바실러스 플란타룸 균주는 실시예 4 에 언급된 균주이다. 균주를 37℃ CO2 인큐베이터에서 48 내지 72 시간 동안 말 혈액 한천 (HBA) 플레이트에서 배양하였다. 락토바실러스의 접종액을 2 개 이상의 플레이트로부터 박테리아의 합쳐진 론(lawn)을 수확하고, McFarland 4 표준과 동등한 혼탁도에 이르도록 50mL 의 염수를 접종함으로써 제조하였다. 박테리아를 침전시키고, 상층액을 제거하였다. 박테리아 펠렛을 2.5mL 의 염수에 재현탁하였다. 이 접종액을 바이오방어(bioshield), 탄산수소나트륨 또는 염수로써 1:1 혼합하여 1 X 109 cfu/mL 의 최종 박테리아 농도를 수득하였다.
초유 추출액(또한 바이오방어로서 표시됨): 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 방사선 처리하였다. 시료 제제를 밀리큐 물에 20, 40 및 100 mg/ml 의 농도에서 재구성하였다.
탄산수소나트륨: 탄산수소나트륨을 또한 밀리큐 물에 20, 40 및 100 mg/ml에서 재구성하였다.
락토바실러스를 이용한 마우스의 감염
마우스를 이들의 위가 비어 있다는 것을 확인하기 위해, 접종 전 3 시간 동안 음식을 주지 않았다. 마우스를 100㎕의 각각의 제제인 약 1 X 108 cfu 의 락토바실러스 접종액(각 제제에서 실제 락토바실러스 수를 생존 플레이트 수로 결정하였다)를 이용하여 식사를 줌으로써 접종하였다. 그룹당 각각 3 마리의 마우스를 갖는 7 그룹의 마우스가 있었고, 마우스를 하기 제제를 공급하였다:
락토바실러스 + 염수
락토바실러스 + 20mg/mL 바이오방어
락토바실러스 + 40mg/mL 바이오방어
락토바실러스 + 100mg/mL 바이오방어
락토바실러스 + 20mg/mL 탄산수소나트륨
락토바실러스 + 40mg/mL 탄산수소나트륨
락토바실러스 + 100mg/mL 탄산수소나트륨
마우스를 실험의 과정 동안 음식을 제거하였으나, 임의로 오토클레이브한 물은 허용하였다. 생체내 락토바실러스의 보호를 3 시간 후에 대장에 정착하는 락토바실러스 플란타룸의 수를 계산함으로써 분석하였다. 대장(맹장 및 결장)을 각각의 마우스로부터 무균으로 2mL 의 염수내로 수확하였다. 시료의 무게를 달고, 균질화하고, 염수에서 10배 희석액을 제조하였다. 100㎕ 의 각각의 희석액을 락토바실러스 선택 배지(10㎍/mL 반코마이신 및 12.5㎍/mL 폴리믹신 B를 포함하는 말 혈액 한천)상에 분산하였다. 플레이트를 48 시간 동안 5% CO2 에서 인큐베이션하고, 플레이트 당 콜로니의 수를 계산하였다. 락토바실러스 플란타룸은 이들의 불투명한 백색 외관때문에 마우스의 정상적인 군집에 정상적으로 존재하는 다른 락토바실러스로부터 용이하게 구별가능하다. 장의 그램당 콜로니 형성 단위(cfu) 수를 계산하였다.
결과
도 7 에 보여준 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸의 생존은 바이오방어 및 탄산수소나트륨의 존재하에 증가하였다. 고농도의 바이오방어 또는 탄산수소나트륨은 증가된 생존을 야기하여 더욱 양호한 보호를 야기하였다.
실시예 10:
습한 조건하에 락토바실러스 플란타룸 생존의 초유 보호
서설 :
상이한 습도 조건에서 생균제 생존의 보호제로서 소 초유 추출액의 역할을 락토바실러스 생존 플레이트 수 분석을 이용하여 조사하였다. 초유 추출액의 보호 특성을 조사하기 위하여, 락토바실러스 플란타룸의 생존을 3 개의 일정한 습도 환경에서 14 일 동안 저장 후에 비교하였다.
재료 및 방법:
시약
락토바실러스 플란타룸 : 본 연구에 사용된 락토바실러스 플란타룸(L.p.) 균주는 실시예 4 에 언급된 균주이다. 균주를 37℃ CO2 인큐베이터에서 48 내지 72 시간 동안 말 혈액 한천 (HBA) 플레이트에서 배양하였다. L.p.의 접종액을 HBA 플레이트로부터 2 개 이상의 콜로니를 취하고, 0.5 McFarland 표준과 동등한 혼탁도에 이르도록 2mL 의 염수를 접종함으로써 제조하였다. 상기 접종액을 모든 처리를 위해 사용하였다.
동결건조 배지: 본 실험에 사용된 동결건조 배지(FDM)는 Conrad 등 (2000)으로부터 유래되었다. 2배 농축된 FDM 을 멸균 0.6mM 인산칼륨 pH7.2 중에 40% w/v α,α-트리할로오스 이수화물 (시그마) 및 5.7% w/v 소듐 테트라보레이트 데카히드레이트 (시그마)를 이용하여 제조하였다. 이 FDM 의 pH 는 초기에 고체 시트르산(시그마)을 이용하여 pH 6.5 로 조절한 후, 암모늄 히드록시드(시그마 29.5%)를 이용하여 pH8.5 로 변경하였다. 2배 농축된 FDM 을 0.2㎛ 로 멸균 여과하였다.
초유: 탈지, 냉동건조된 소 초유 추출액 (Anadis Limited "Gastran" Batch G01)은 비면역화된 암소로부터 공급받고, 저장 제제를 2배 농축된 FDM에 40 mg/ml에서 재구성하였다.
시료의 제조 : 하기 혼합물의 각각의 4 개의 분취량을 동결건조 전에 제조하였다:
(a) L.p. + 2x FDM (0.5mL + 0.5mL)
(b) L.p. + 2x FDM 중의 40 mg/mL 초유 (0.5mL + 0.5mL)
상기 시료를 혼합한 후, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 드라이아이스에 동결시켰다. 시료를 밤새 동결건조하였다.
상이한 상대 습도에서 락토바실러스 플란타룸의 안정성
3 개의 항습 체임버를 상이한 용액을 포함하는 밀봉된 박스를 이용하여 설치하였다. LiCl(시그마)의 포화용액은 11.3% 의 상대습도(RH)(수분 활성 aw = 0.113)를 유지하였다. 물 중의 글리세롤 (BDH Analar) 80% w/w 용액은 50% RH (aw = 0.50)를 나타냈고, KCl(BDH Analar) 포화 용액은 85% RH (aw = 0.85)를 유지하였다 (Forney & Brandi 1992 및 Merck Index 참고). 동결건조 후에, 각 시료를 사발 및 막자를 이용하여 미세 분말로 부드럽게 분쇄하였다. 2 개의 시료(L.p. + FDM 및 L.p. + FDM 중의 초유)를 20℃에서 14 일 동안 각 체임버에서 열린 와이드 마우스(wide-mouth) 바이얼에서 인큐베이션하였다. 각 혼합물의 대조군 시료를 닫힌 바이얼에서 20℃에서 저장하였다.
락토바실러스 생존 플레이트 수
상이한 상대습도에서 인큐베이션 후에 락토바실러스 생존을 생존 플레이트 수 기술을 이용하여 분석하였다. 인큐베이션 혼합물의 10배 희석액을 0.05%의 계면활성제 트윈 20을 포함하는 염수에서 제조하였다. 100㎕의 각 희석액을 이중 플레이트에 분산하였다. 플레이트를 48 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트당 콜로니 수를 계산하였다. 인큐베이션 혼합물 중의 mL 당 콜로니 형성 단위(cfu) 수를 희석된 현탁액의 cfu/mL 수에 희석 배수를 곱함으로써 계산하였다. 상기 수를 대조군 시료의 백분율로서 표시하였다.
결과
상대습도 시료 L. p 의 생존
11.3% L.p + FDM + 초유 100%
11.3% L.p + FDM 99.3%
50% L.p + FDM + 초유 61.3%
50% L.p + FDM 36.7%
85% L.p + FDM + 초유 18.1%
85% L.p + FDM 8.5%
소 초유의 추출액은 배지 및 다습 조건에 노출 동안 냉동건조된 생균제인 락토바실러스 플란타룸의 생존을 증가시켰다.
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결국, 다양한 다른 변형 및/또는 변경이 본원에 요약된 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않고 행해질 수 있다는 것이 이해된다.

Claims (18)

  1. 적대 환경에서 불안정한 생활성 물질의 생존을 개선시키는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 생활성 물질 및 포유동물 초유의 시험관내(체외) 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 생활성 물질은 경구 백신, 살아 있는 미생물, 기타 생활성 물질에 대한 벡터로 사용되는 감염제, 질환에 대한 항체 및 그의 단편, 질환 야기 물질에 대한 항체 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하고, 상기 적대 환경은 위 또는 혹위 환경 또는 다습 환경인 것인, 적대 환경에서 불안정한 생활성 물질의 생존을 개선시키는 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생활성 물질은 시험관내 혼합물을 형성하지 않는 상태에서는, 0.03M NaCl 중의 0.32% 돼지 펩신 용액을 포함하고 HCl로 pH 1.2로 조절된 액체에서 37℃에서 60분 동안 인큐베이션한 후에 기능의 20% 이상의 감소를 보여주는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생활성 물질은 면역글로불린, 단클론 또는 다클론 항체, 키메라 항체, 인간화된 단클론 항체 및 덴드리머(dendrimer) 제시된 면역활성 단편 또는 면역활성 단편 중의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생활성 물질은 F(ab) 및 F(ab)2 단편, 재조합 면역활성 단편, 친화성 정제된 면역글로불린 및 이의 면역활성 단편 및 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 면역활성 단편을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생활성 물질은 하나 이상의 생균제를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생활성 물질은 락토바실러스 종(Lactobacillus spp) 및 비피도박터 종(Bifidobacter spp) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  7. 적대 환경에서 불안정한 생활성 물질의 생존을 개선시키는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은 생활성 물질 및 포유동물 초유의 시험관내 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 생활성 물질은
    (a) 질병 생물체 헬리코박터 파이로리(H. pylori), 창자독소생성 대장균(ETEC), 엔테로바이러스(Enterovirus), 로타바이러스(rotavirus), 안트락스(anthrax) 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)에 대한 항체 및 이의 단편;
    (b) 헬리코박터 파이로리, ETEC, 안트락스, 예르시니아 페스티스에 의해 생산된 독소에 대한 항체 및 이의 단편 및 리신에 대한 항체; 및
    (c) 헬리코박터 파이로리, ETEC, 엔테로바이러스, 로타바이러스, 안트락스 및 예르시니아 페스티스에 대한 경구 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 적대 환경은 위 또는 혹위 환경 또는 다습 환경인 것인, 적대 환경에서 불안정한 생활성 물질의 생존을 개선시키는 시험관내 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생활성 물질은 헬리코박터 파이로리 또는 엔테로바이러스 71에 대한 경구 백신 또는 항체 또는 항체 단편으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 생활성 물질은 초유 또는 조류 알로부터 유래된 다클론 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  10. (a) 헬리코박터 파이로리 및 대장균으로부터 선택된 병원성 미생물에 대한 백신 및 (b) 포유동물 초유의 혼합물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 환자에게 경구로 투여하는 것을 포함하고, 상기 혼합물은 상기 백신과 상기 포유동물 초유의 시험관내 혼합에 의해 형성되는 것인, 인간을 제외한 환자에서 위장 질환의 치료 또는 예방 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 초유의 중량은 상기 생활성 물질의 중량의 0.5배 초과인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 초유의 중량은 상기 생활성 물질의 중량의 2배 초과인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 초유는 출산 후 2일 이내에 유지된 소 초유를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 소 초유는 출산일에 유지된 초유를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 초유는 액체 형태이고, 상기 초유와 생활성 물질의 시험관내 혼합물을 형성한 후에 상기 혼합물이 건조되어 고체를 형성하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 초유는 건조된 것인 방법.
  17. 제4항에 있어서, 수집된 초유 중의 총 단백질에 대한 IgG의 비율이 10% 이상인 것인 방법.
  18. (a) 항생제, 생활성 단백질 및 점막 보조제로부터 선택되는 생활성 물질 및 (b) 포유동물 초유의 혼합물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 환자에게 경구로 투여하는 것을 포함하고, 상기 혼합물이 상기 생활성 물질과 상기 포유동물 초유의 시험관내 혼합에 의해 형성되는 것인, 인간을 제외한 환자에서 위장 질환의 치료 또는 예방 방법.
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