KR20100121468A

KR20100121468A - 암과 관련된 질환의 치료에 유용한 6,7-디알콕시 퀴나졸린 유도체

Info

Publication number: KR20100121468A
Application number: KR1020107015858A
Authority: KR
Inventors: 라마나드함 제이요티 프라사드; 부장가 라오 아딥하틀라 칼리 사트야; 볼레팔리 나게쉬와라 라오; 난나파네니 벤카이아흐 쵸우다리
Original assignee: 낫코 파마 리미티드
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2010-11-17
Also published as: EP3012251B1; CA2711737C; DK2229369T3; PL2229369T3; CN101918374A; SI2229369T1; EA201001173A1; MA32081B1; AU2008347940A1; ES2593321T3; HUE030640T2; US20110034459A1; PT2229369T; UA101010C2; ZA201005116B; CA2711737A1; SG187490A1; NZ586946A; LT2229369T; AP2886A

Abstract

퀴나졸린계의 화합물들이 제공하는 무한한 가능성의 관점에서, 본 발명자들은 신규한 구조적 형상을 갖는 다수의 신규화합물들에 대한 합성 및 스크리닝을 착수하였다. 그 결과 놀랍게도, 4번 위치에 3-에티닐 아닐리노 그룹을 갖고 구체적으로는 6 및 7번 위치에 치환된 알콕시 그룹을 갖는 퀴나졸린은, 다른 알려진 퀴나졸린계 약물들과 비교하여, 더욱 강화된 그리고 특이적 항증식성 특성을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 놀랍게도 본 발명에 따른 화합물들은 독성이 현저히 낮고, 이러한 안전성 프로파일은 치료 분야에서 대단히 유리하게 작용한다. 본 발명에서 설명된 신규 화합물들은 일반적 구조식 (I)과 같이 나타낼 수 있고, 아직까지 합성된 바 없으며, 치료분야에서의 유용성 및 안전성 프로파일이 밝혀지지 않았다. (A) 구조일 때, 화합물 I는 NRC-2694이다.

Description

암과 관련된 질환의 치료에 유용한 6,7-디알콕시 퀴나졸린 유도체{6,7-DIALKOXY QUINAZOLINE DERIVATIVES USEFUL FOR TREATMENT OF CANCER RELATED DISORDERS}

본 발명은 6,7-디알콕시 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 항암 활성을 나타내어, 인간에 대한 치료 방법으로 유용하다. 본 발명은 또한 상기 퀴나졸린 유도체 및 이를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

건선 및 암과 같은 세포 증식 질환에 대한, 과거의 대부분의 치료 방식들은 DNA 합성을 저해하는 화합물을 활용하는 것이었다. 그러한 화합물들은 세포에 대하여 독성이 있으며, 분화하는 종양세포를 신속히 구분하는 선택도를 나타내는 경우에만 유용한 효과를 거둘 수 있다.

최근에는, DNA 일부가 종양유전자로 형질전환되어 세포가 암에 걸릴 수 있으며, 즉 활성화 상태의 유전자가 악성 암세포의 형성을 유도한다는 것이 발견되었다 (Bradshas, Mutagenesis, 1986, 1:19). 몇몇 종양유전자는 티로신 키나아제 효소를 인코딩하며, 특정 성장인자 수용체들 역시 티로신 키나아제 효소에 해당된다 (Larsen et al., Ann. Reports in Med. Chem. 1989, Chapt. 13).

수용체 티로신 키아나제는 세포 복제를 개시하는 생화학적 신호의 전달에 중요하다. 이들은 상피성장인자(epidermal growth factor)과 같은 성장인자에 대한 세포외 결합영역, 및 단백질 내 포스포릴레이트 티로신 아미노산에 대한 키나아제로서 기능하는 세포내 부위를 포함하며, 이를 통해 세포 생장에 영향을 준다. 또한, 그러한 키나아제들은 유방암과 같은 공통적인 인간 암 (Saimbury et al., Brit, J. Cancer, 1988, 58;458), 결장, 직장 및 위암과 같은 위장암 (Bolen et al., Oncogene Res., 1987,1:149)에 종종 존재하는 것으로 알려져 있다. 티로신 키나아제 활성 (TK 활성; Tyrosine Kinase activity)는 일반세포 보다는 악성세포에서 보다 자주 관측된다 (Hunter, Cell, 1987, 50:823).

보다 최근에는, TK 활성을 갖는 상피세포 성장인자 수용체(EGFR; Epidermal Growth Factor Receptor)가 뇌, 폐 평면상피세포, 방광, 위, 가슴, 머리와 목, 식도, 갑상선 등과 같은 많은 인간 암에서 과발현되는 것으로 보고된 바 있다(W.J. Gullick, Brit. Med. Bull. 1991, 47;87). 상피세포 성장인자 수용체(EGFR; Epidermal Growth Factor Receptor), 수용체 티로신 키아나제(RTK; Receptor Tyrosine Kinase) 그룹의 멤버로 Erb1/HER1, Erb/HER2, Erb/HER3 및 Erb/HER4의 네 개의 수용체들을 포함한다.

EGFR-TK 활성을 저해하는 주요 기작은 소합성 분자를 이용하는 것이다(Arteaga CL, Exp. Cell Res., 2003, 284:122-130). 제피티닙(Iressa^TM, Astra Zeneca), 엘로티닙(OSI-774, Tarceva^TM), PD-183805, PKI-166, EKB-569, PD-168393, CGP-59362와 같은 특정 퀴나졸린 유도체들은, 여러 형태의 암에 대한 적용가능한 치료 옵션으로 광범위하게 조사되었다(Baselga et al., Oncology 2002, 63:6-16, Cohen RB., Clin. Colorectal Cancer, 2003, 2:246-251). 유럽 특허출원들, 즉 EP 0566226, EP 0602851 A1, EP 0635507 A1, EP 0635498 A1, EO 0520722 A1은, TK 저해 특성으로 인해 항암 특성을 갖는 특정 퀴나졸린 유도체들을 개시한다.

미국특허 US 5475001, US 5457105, US 5616582, US 5770599, US 5747498, US 6900221 등은 퀴나졸린 핵의 4-번 위치에 치환된 아닐리노 모이어티(moiety) 및 6- 과 7-번 위치의 다양한 기능화된 알킬 그룹 등과 같은 구조적 형상을 갖는 퀴나졸린 유도체들에 대하여 다룬다.

구체적으로 US 5457105, US 5616582는 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 (제피티닙)에 대하여, 그리고 US 5747498 및 US 690221는 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 (엘로티닙)에 대해서 다룬다. WO 2005/070909, WO 2007/060691 A2 및 WO 06/090413은 이러한 두가지의 알려진 항암제들에 대한 다양한 합성 또는 다형태(polymorphic form)에 대하여 다룬다.

도 1은 엘로티닙 HCl과 NRC 2694를 처리한 A549의 웨스턴 블롯 분석의 결과로, 농도 의존적으로 EGFR 수준이 감소되는 것으로 관찰되었다.
도 2는 엘로티닙 HCl과 NRC 2694를 처리한 H1299 세포의 매트리겔 인베이젼 분석 결과로, 용량 의존적으로 인베이젼이 감소되는 것으로 관찰되었다.
도 3은 A549 인간 폐 종양을 이식한 누드 마우스에서 엘로티닙 HCl과 NRC 2694의 경구 및 복강내 주사 투여에 의해 유도된 종양 크기의 감소를 나타낸 것이다.
도 4는 경구 또는 복강내 주사 경로로 다양한 농도의 엘로티닙 HCl과 NRC 1694를 처리한 A549 루시페라아제 발현 세포들을 포함하는 누드 마우스로부터 수거한 폐이다.
도 5는 엘로티닙 HCl과 NRC 2694를 처리한 후 폐를 포함한 누드 마우스 종양의 H&E 염색된 부위를 나타낸 것이다.
도 6은 경구 및 복강내 주사 경로를 통해 다양한 농도의 엘로티닙 HCl을 처리한 A549 루세페라아제 발현 세포들이 이식된 누드 마우스이다.
도 7은 경구 및 복강내 주사 경로를 통해 다양한 농도의 NRC 2694를 처리한 A549 루세페라아제 발현 세포들이 이식된 누드 마우스이다.
도 8은 인비트로(in vitro)에서 HER-1,2,3,4 및 VEGFR과 같은 다른 수용체들에 관련된 NCR NCEs의 효과에 대한 연구로서, A549 세포에 NRC 2694를 처리한 후에 Erb1, Erb2, Erb3 및 Erb4의 수준이 감소된 것으로 관찰되었다.

상기 퀴나졸린계의 화합물들이 제공하는 무한한 가능성의 관점에서, 본 발명자들은 신규한 구조적 형상을 갖는 다수의 신규 화합물들의 합성 및 스크리닝에 착수하였다. 그 결과 놀랍게도, 4번 위치에 3-에티닐 아닐리노 그룹을 갖고 구체적으로는 6 및 7번 위치에 치환된 알콕시 그룹을 갖는 퀴나졸린은, 다른 알려진 퀴나졸린계 약물들과 비교하여, 더욱 강화된 그리고 현저한 항증식성 특성을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 놀랍게도 본 발명에 따른 화합물들은 독성이 현저히 낮고, 이러한 안전성 프로파일(profile)은 치료 분야에서 대단히 유리하게 작용한다. 본 발명에서 설명된 신규 화합물들은 아래의 구조를 갖는 화학식 I과 같이 나타낼 수 있고, 아직까지 합성된 바 없으며, 치료분야에서의 유용성 및 안전성 프로파일이 밝혀지지 않았다.

[화학식 I]

상기 식에서,

R¹은

,

,

이고,

R²는 OCH₃, OC₂H₅임.

R¹이

이고 R²가 OCH₃인 경우에, 상기 화학식 I의 화합물은 NRC-2694이다.

NRC-2694의 모노 HCl 염(mono HCl salt)은 NRC-2694A이다. NRC-2694의 디HCl 염(diHCl salt)은 NRC-2694B이다. 본 발명에 따른 신규 화합물 특히 NRC-2694는 예상하지 못한 우수한 항암/항증식성 특성을 가지며, 구체적으로는 아래에 기술된 바와 같이 이러한 등급의 주요 제제와 비교하여 추가적인 치료상의 유용성을 제공한다.

1) 낮은 억제 농도( Lower inhibitory concentration ): MTT 증식 분석법에서 억제농도(IC₅₀)가 40-90 ng/ml (100-200 nm) 범위의 수치를 나타내며, 반면 엘로티닙 HCl은 836 ng/ml (1945 nm)의 값을 갖는다. 이는 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis) 및 매트리겔 인베이젼 분석(matrigel invasion assay)에 의해 확인된다.

2) 완전한 종양 퇴행( Complete tumor regression ): 완전한 종양 퇴행(complete tumor regression)은, 10 mg/kg 용량으로 A549 인간 폐 종양 세포를 이식한 누드 마우스에서 화합물의 경구 투여에 의해 관찰된다. 비교 연구에서, 심지어 100 mg/kg 용량에서도, 엘로티닙 HCl은 완전한 종양 퇴행(complete tumor regression)을 유도하지 못하였다. A549를 이식한 마우스의 폐 조직에 대한 외관 시험 및 루시페라아제 발현 실험에서 동일한 관찰 결과를 확인하였다.

3) 약리 효과( Drug effectiveness ): 유효량 평가는 본 발명에 따른 대표적 화합물, 즉 NRC-2694에 대해 6.3 mg/kg의 수치(ED₅₀)를 나타내는 반면, 이에 대해 엘로티닙 HCl에 의해 얻어진 수치는 22 mg/kg이다.

NRC-2694는 100% 치료 효과(curative effect)가 관찰되는데 반해, 엘로티닙 HCl의 경우에는 단지 50-60%이다.

4) 부가적인 고유의 특징들( Additional unique indications ): 본 발명의 일실시예에 따른 화합물인 NRC-2694는 ErbB2, ErbB3, ErbB4 및 VEGFR 수용체의 발현 수준을 저하시키는 것과 같은 추가적인 특징들을 나타낸다. 이러한 특별하고도 매우 유망하며, 놀라운 결과는 전적으로 예상하지 못한 것이고, 엘로티닙 HCl에서 보여지지 않았다.

5) 안전성 프로파일( Safety profile ): 본 발명에 따른 NRC-2694와 같은 화합물의 안전성 프로파일은 꽤 유망하고 예상외로 광범위하며 매우 유용하다. 이에 따라, NRC-2694는 500 mg/kg의 최대내성용량(MTD; Maximum Tolerated Dose)을 가지며, 이에 대해 엘로티닙 HCl은 2000 mg/kg이다.

NRC-2694에 의해 제공되는 광범위한 적정사용농도(therapeutic window)는 2000 mg/kg의 LD₀ 값에 의해 설명되며, 이에 대해 엘로티닙 HCl은 500 mg/kg의 값을 가진다. LD₅₀ 값은 NRC-2694에 대해서는 정확하지 않지만, 엘로티닙 HCl은 805 mg/kg의 값으로 측정된다.

이하의 실시예들은 본 발명에 따른 화합물들을 제조하기 위한 과정 및 우수한 생물학적 효율을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범주 또는 목적이 그들만으로 제한되는 것은 아니다.

[반응식 1]

실시예 -1

N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4- 퀴나졸린아민 (I, NRC -2694)의 제조

i) 4- 클로로 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4- 퀴나졸린 ( IIIa )의 제조

기계적 교반기, 환류 응축기, 균압 투입 깔대기(pressure equalizing addition funnel), 및 온도계 소켓이 구비된, 세척 및 건조된 5-리터 4구 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름 (3000 ml), 디메틸 포름아미드 (30 ml)를 충진한 후, PCT 출원공개공보 WO 2005/070909A1의 실시예 1에 개시된 방법에 의해 얻은, 7-메톡시-6-(3-모르폴리노 프로폭시)-3,4-디하이드로-퀴나졸린-4-온 (IIa) (150g)을 첨가하였다. 옥사릴 클로라이드(oxalyl chloride) (120 g)를 천천히 첨가하고, 반응물을 환류 온도(reflux temperature)로 가열한 후 약 5 시간 동안 환류 온도를 유지하였다. 반응은 HPLC 테스트에 의해 완료되었음을 확인하였다. 용매 클로로포름과 초과 옥사릴 클로라이드는 저압 진공(mild vacuum)을 적용하여 증류하였다. 반응물을 약 40℃로 냉각한 후, 클로로포름 (300 ml)를 첨가하고, 다시 저압 진공을 적용하여 용매를 증류 제거하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고 아세틸로니트릴 (3000 ml)를 첨가하고 10-15 분 동안 저어준 다음 질소 기압하에서 유지하여 다음 공정을 진행하였다.

ii ) N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4- 퀴나졸린아민 (I, NRC-2694)의 제조

상기 단계-(i)에 따른 아세토니트릴에 클로로 화합물을 함유하는, 기계적 교반기, 환류 응축기 및 온도계 소켓이 구비된, 5-리터 4구 둥근 바닥 플라스크에; 3-에티닐 아닐린 (69 g)을 약 10-15 분 동안 천천히 첨가하고, 반응물을 환류 온도로 가열한 후 환류 온도에서 약 4 시간 동안 유지하였다. 반응은 HPLC 테스트에 의해 완료되었음을 확인하였다. 그런 다음, 반응물을 약 25-35℃로 냉각하고 여과한 후, 여과후 남은 덩어리 물질(cake)을 아세토니트릴 (500 ml)로 세척하고 건조하였다.

상기 건조된 조 화합물(crude compound)는 또 다른 5-리터 둥근 바닥 플라스크에 담고 물 (2500 ml)을 채우고, 60-65℃까지 천천히 온도를 상승시킨 후, 희석된 수산화나트륨 용액을 이용하여 반응물의 pH를 10-12로 조절하였다. 분리된 고체 생성물을 여과하고 물로 세척한 후 70-75℃에서 건조하여 황백색(off-white) 고체인 N-(3-에티닐페닐)-6-(3-모르필린 프로폭시)-7-메톡시-4-퀴나졸아민 173.0 g을 얻었다.

iii ) 톨루엔으로부터 N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4- 퀴나졸린아민 (I, NRC -26944) 제조의 재결정화

기계적 교반기, 환류 응축기 및 온도계 소켓이 구비된 5-리터 4구 둥근 바닥 플라스크에 톨루엔 (3750 ml)을 충진하고, 상기 실시예 (1)에서 설명된 공정에 의해 얻어진 N-(3-에티닐페닐)-6-(3-모르폴리노 프로폭시)-7-메톡시-4-퀴나졸린아민 (50 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 90-95℃로 가열하여 고체 성분을 완전히 용해시켰다. 그런 다음, 카본처리 후 여과하였다. 여과액은 25-35℃로 냉각하고 약 1 시간 동안 유지한 후, 여과 및 건조하여 백색 결정형 고체로서 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 40.15 g을 얻었다.

mp: 185-187℃

순도: 99.72% (HPLC)

IR(KBr)(cm^-1): 3280.9, 2954.6, 2810.3, 1620.1, 1604.2, 1572.1, 1527.7, 1505.2, 1484, 1430.5, 1388.2, 1247.5, 1211.2, 1140.3, 1110.4, 1010.3, 953.4, 859.6, 784.2 Cm^-1

¹HNMR

(300MH_Z; DMSO-d₆): 9.57 (s, 1H); 8.48 (s, 1H); 7.99 (s, 1H); 7.86 to 7.92 (d, 2H); 7.34 to 7.44 (t, 1H) 7.18 to 7.21 (s, 2H); 4.15 to 4.21 (t, 4H); 3.92 (s, 3H) 3.5 to 3.6 (t, 4H); 2.4 to 2.52 (m, 5H); 1.95 to 2.01 (m, 2H).

Mass : 419.4 (M + 1)

실시예 -2

아세토니트릴로부터 N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4-퀴나졸린아민의 재결정화

기계적 교반기, 환류 응축기 및 온도계 소켓이 구비된 2-리터 3구 둥근 바닥 플라스크에 아세토니트릴 (1000 ml)을 충진한 후, 상기 실시예-(1)에서 설명된 방법에 따라 얻어진 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 (25 g)을 첨가하였다. 반응물을 65-70℃로 천천히 가열하여, 고체 물질을 완전히 용해시키고 카본처리 후 여과하였다. 여과액은 또다른 둥근 바닥 플라스크로 옮긴 후, 10-15℃로 천천히 냉각시키고, 그 온도에서 30 분간 유지하였다. 반응물은 여과하고, 여과후 남은 덩어리 물질(cake)을 냉각된 아세토니트릴로 세척하고 건조시켜 백색 결정형 고체로서 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 20.50 g을 얻었다.

mp: 186-187℃

순도: 99.68% (HPLC)

실시예 -3

에틸 아세테이트로부터 N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4-퀴 나졸린아민 의 재결정화

기계적 교반기, 환류 응축기 및 온도계 소켓이 구비된 3-리터 3구 둥근 바닥 플라스크에 에틸 아세테이트 (2000 ml)을 충진한 후, 상기 실시예-(1)에서 설명된 방법에 따라 얻어진 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 (25 g)을 첨가하였다. 반응물을 65-70℃로 천천히 가열하여, 고체 물질을 완전히 용해시키고 카본처리 후 여과하였다. 여과액은 또 다른 둥근 바닥 플라스크로 옮긴 후 10-15℃로 천천히 냉각시키고, 그 온도에서 30 분간 유지하였다. 결정형 물질을 여과하고, 여과후 남은 덩어리 물질(cake)을 냉각된 아세토니트릴로 세척하고 건조시켜 백색 결정형 고체로서 N-(3-에티닐페닐)-6-(3-모르폴리노 프로폭시)-7-메톡시-4-퀴나졸린아민 20.95 g을 얻었다.

mp: 185-187℃

순도: 99.7% (HPLC)

실시예 -4

N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4- 퀴나졸린아민 모노 하이드로클로라이드 ( NRC -2694A)의 제조

기계적 교반기, 환류 응축기, 온도계 소켓 등이 구비된 500 ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 이소프로필 알코올 (250 ml)을 충진한 후, 상기 실시예-1에 따른 방법으로 얻어진 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 (5 g)을 첨가하였다. 반응물의 온도를 65-70℃로 상승시켜, 모든 고체상 물질을 용해시키고 카본처리 후 여과하였다. 여과액은 약 55 내지 60℃로 냉각시키고, 모노 하이드로클로라이드 염이 분리될 때까지, 이소프로필 알코올 용액에 용해된 1몰당량의 HCl-가스를 가하였다. 반응물은 약 2 시간 동안 환류 온도에서 유지한 다음, 상온으로 냉각하고 여과 및 건조시켜 백색 결정형 물질인 N-(3-에티닐페닐)-6-(3-모르폴리노 프로폭시)-7-메톡시-4-퀴나졸린아민 모노 하이드로클로라이드 5.1 g을 얻었다.

순도: 99.8% (HPLC)

HCl 함량

(chemical): 8.19%(이론값: 8.10%)

IR(KBr)(cm^-1) 3407, 3305, 3259.5, 2934, 2619, 1625.9, 1593.8, 1579.9, 1530.8, 1512,

1476.9, 1392.2, 1356.8, 1282.1, 1242.1, 1207.9, 1141.3, 1100.8,

1076.1, 1042.1, 1026.5, 1011.5, 957.7, 941.5, 922.1, 857.3, 852, 838.1,

796, 782.4.

실시예 -5

N-(3- 에티닐페닐 )-7- 메톡시 -6-[3-(4- 모르폴리닐 ) 프로폭시 ]-4- 퀴나졸린아민 디 하이드로클로라이드 ( NRC -2694B)의 제조

기계적 교반기, 환류 응축기 및 온도계 소켓이 구비된 500 ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 이소프로필 알코올 (250 ml)을 충진한 후, 상기 실시예-1에 따른 방법으로 얻어진 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 (5 g)을 첨가하였다. 반응물의 온도를 65-70℃로 상승시켜, 모든 고체상 물질을 용해시켰다. 카본처리 후 여과하였다. 여과액은 약 55 내지 60℃로 냉각시키고, 디하이드로클로라이드 염이 분리될 때까지, 이소프로필 알코올 용액에 용해된 2몰당량의 HCl-가스를 가하였다. 반응물은 약 2 시간 동안 환류 온도에서 유지한 다음, 상온으로 냉각하고 여과 및 건조시켜 백색 결정형 물질인 N-(3-에티닐페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 디 하이드로클로라이드 5.5 g을 얻었다.

순도: 99.78% (HPLC)

HCl 함량

(chemical): 14.9%(이론값: 14.83%)

IR(KBr)(cm^-1): 3406.8, 3194.1, 2942.7, 2681.9, 2623.6, 1633.7, 1566.2, 1528.6, 1512.5, 1438.6, 1359.6, 1282.3, 1218.3, 1157.1, 1132.7, 1105.9,

1075.6, 1001.9, 942.1, 875.3, 816.1,787.2

실시예 -6

최대내성용량 ( MTD ; Maximum Tolerated Dose ) 및 급성 독성( acute toxicity ) 평가 (표 1 및 2):

MTD에 대한 초기 연구는 수컷 및 암컷 스위스 알비노 마우스 (중량 20-25 gm)를 대상으로 실시되었다.

상기 연구는 OECD 가이드라인 룰 420(OECD guidelines rule 420) 기준하에서 이루어졌으며, 상기 연구는 생물학적 주기에 영향 받지 않도록 오전 9시에서 오후 5시 사이에 실시되었으며, 화합물 엘로티닙과 NRC-2694는 2% 검 아카시아에 현탁하여 5, 50, 300 및 2000 mg/kg (po) 용량으로 경구 투여하였다. 중간 투여량은 사망여부에 따라 조절하였다. 동물 개체들에 대하여, 약물투여 후 6 시간까지 매시간별로 전체적인 행동 변화를 관찰하였다. 나아가 72 시간까지 사망 여부를 관찰하였다. 생존한 개체들은 g.i.t.를 통한 약물의 흡수를 확인하기 위해서 부검하였다.

엘로티닙과 NRC-2694의 급성 독성은 수컷 및 암컷 마우스에 대해 실시하였다. 500, 750, 1000 및 2000 mg/kg 용량으로 경구 투여하였다. 각 5 마리씩 그룹을 나누었다. 화합물 투여후 14 일 동안 사망여부를 관찰하였다. 생존한 개체들은 g.i.t.를 통한 약물의 흡수를 확인하기 위해서 부검하였다.

LD₅₀은 리치필드 & 윌콕슨(Litchfield and Wilcoxon)을 이용하여 측정하였다 (J. Pharmacol.Exp. Ther.1949, 96: 99-113).

독성 연구의 결과는 표-1 및 2에 정리하였다. 엘로티닙 HCl의 최대내성용량(MTD)은 500 mg/kg (po)인데 반해, NRC-2694는 2000 mg/kg (po)으로 나타났다. 유사하게, LD₀는 엘로티닙 HCl이 500 mg/kg (po)이고 NRC-2694는 2000 mg/kg인 것으로 나타났다. 결과적으로, 엘로티닙 HCl과 비교하여 NRC-2694는 예측범위를 벗어나고 놀라울 정도로 낮은 독성과 안전성 프로파일이 인정되었다.

엘로티닙 . HCl 과 NRC -2694의 비교( mtd ) - 초기 인용 연구(마우스)

화합물	MTD mg/kg (po)
엘로티닙 HCl	500
NRC 2694	2000

마우스에 대한 급성 LD ₅₀ 연구 ( 일회투여량 7 일 관찰)

화합물	LD₀ mg/kg (po)^*	LD₅₀ mg/kg (po)
엘로티닙 HCl	500	805
NRC 2694	2000	-

^*LD₀ : 7 일 경과 시점에서 사망은 관찰되지 않음.

실시예 -7

인비트로 ( in vitro ) 및 인비보 ( in vivo ) 평가 연구 및 치료 효능( therapeutic efficacy ) 평가

샘플: 엘로티닙은 대조군 비교 약물로 사용하였으며, 본 발명에 따른 신규 화합물의 생물학적 활성은 양성 대조군으로서 상기 약물과 비교 테스트하였다.

i) MTT 증식분석( MTT proliferation assay ):

MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 분석은, 1983년 모스만(Mosmann)에 의해 처음 설명되었으며, 생균의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase enzyme)가 페일 옐로우 MTT의 테트라졸륨 고리를 분해하여 대체로 세포막에 불침투성인 다크 블루 포마잔 결정(formazan crystal)을 형성하고, 그 결과 건강한 세포 내에 축적되도록 하는 활성에 근거한 것이다. 계면활성제(detergent) 첨가에 의한 세포의 가용화는 결정을 유리시키고, 용해될 수 있도록 한다. 생존 세포의 수는 생성된 포마잔 생성물의 수준에 직접 비례한다. 상기 색상은 간단한 비색분석(colorimetric assay)을 사용하여 정량화할 수 있다. 이러한 분석은 0-1000 ng/ml 농도의 엘로티닙과 테스트 화합물들을 이용하여 A549와 H1299 세포 내에서 이루어졌다. 상기 프로토콜은 ATCC와 제조 지침(Catalog No.: 30-1010K)에 근거하였다.

MTT 증식분석으로부터, 본 발명에 따른 화합물의 저해 농도 (IC₅₀)는 40-90 ng/ml (100-200 nm) 범위에서 달리 나타나는 것으로 측정되었으나, 양성 대조군으로 사용한 ‘엘로티닙 하이드로클로라이드’는 836 ng/ml (1945 nm)의 높은 값을 갖는 것으로 나타났다. 결과적으로, 본 발명에 따른 신규 화합물들은 엘로티닙 하이드로클로라이드에 비해서 10 배 이상 효능이 강한 것으로 확인된다.

ii) 웨스턴 블롯 분석( Western blot analysis ): (도-1)

MTT 증식분석을 통해 측정된 이상적인 약물 농도는, 적절한 배지에서 72 시간 동안 1x10⁶ H1299 또는 A549 세포를 처리하는데 사용되었고, 세포 용해물은 환원 조건의 10% SDS PAGE 겔 상에서 추출 및 분별하였다. 상기 겔은 처리된 나일론 멤브레인 (Biorad) 상으로 블롯하여 EGFR, PI3K 및 AKT에 대해 면역프로브화하였다.

용량 의존적 방법에서 EGFR 발현에 현저한 변화가 관찰되었다. 80 ng (190 nm) 농도에서 NRC-2694는, 800 ng (1860 nm) 농도의 엘로티닙과 비견될 정도의 EGFR 발현 억제를 야기하였다. 따라서, NRC-2694의 10 배 수준의 효능이 이를 통해 입증된다.

iii) 매트리겔 인베이젼 분석( Matrigel invasion assay ): (도-2)

NRC 화합물의 다양한 농도에서(MTT 분석에 의해 결정된) H1299 및 A549 세포의 인비트로 침습성(invasiveness)은, 개량된 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay)을 이용하여 측정하였다. 세포는 48 시간 동안 이러한 화합물들로 처리하였다. 1x10⁶ 세포를 0.2% BSA으로 보충한 비혈청 배지(serum-free medium) 600 ul에 현탁하고, 매트리겔 (0.7 mg/ml)로 코팅된 트랜스웰 챔버(Corning Costar Fisher Scientific cat #07-200-158, Pittsburgh PA)의 위쪽에 위치시켰다. 챔버의 아래쪽은 혈청 배지 200 ul로 채우고 세포는 24 시간 동안 옮겨두었다. 인큐베이션 이후, 세포를 고정시키고 Hema-3로 염색하여, 앞서 설명된 방법 (Mohanam et al. 1993)으로 정량하였다. 이동된 세포는 퍼센트 이베이젼(percent invasion)으로 정량하였다. 화합물 NRC-2694는 농도 의존적 방법에서 인베이젼이 현저히 감소하는 것으로 나타났다.

iv) 누드 마우스에서 폐 종양에 대한 피하 인비보 측정: (도-3)

누드 마우스는 오른쪽 뒷다리 측면에 2x10⁶ A549 세포를 이식하였다. 마우스에 양성 대조군으로 사용된 엘로티닙 HCl을 포함하여 테스트 화합물들을 경구 또는 복강내 주사(ip)하고, 종양(>2 mm)을 관찰하였다. 엘로티닙 HCl의 일회 투여량은 100 mg/kg을 기본 용량으로 하였다.

종양 크기를 측정하였으며, 10 mg/kg 용량으로 NRC-2694를 처리한 마우스에서 종양의 완전한 퇴행(complete regression of tumour)이 관찰되었다. 그러나, 비록 100 mg/kg 투여량 수준에서 엘로티닙 HCl을 유사하게 처리한 대조군에서는 여전히 종양이 존재하였다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물(NRC-2694)이 10 배 우수한 효능을 갖는다는 것을 확인하였다.

v) 처치후 누드 마우스로부터 수거한 폐 조직에 대한 평가: (도-4)

경구/복강내 주사 경로로 다양한 농도의 엘로티닙 HCl과 NRC-2694로 처리한 A549 루시페라아제 발현 세포를 이식한 누드 마우스로부터 수거한 폐에 대해서, 잔여 종양을 측정하였다.

NRC-2694로 처리한 그룹에서는 종양의 완전한 퇴행(complete regression of tumours)이 관찰되었으나, 반면 엘로티닙 HCl로 처리한 그룹에서는 여전히 종양이 존재하였고, 따라서 본 발명에 따른 화합물의 기대하지 못한 놀랍도록 우수한 효능이 확인되었다.

vi) 폐 조직 내 종양의 가시화에 의한 검사: (도-5)

A549 세포를 폐 내에 주입하여 누드 마우스에 이식하였다. 상기 마우스는 2.5 및 20 mg/kg 투여량으로 엘로티닙 HCl과 NRC 2694를 경구/복강내 주사 경로로 처리하였다. 매일 약물을 처리하여 30 일이 경과한 시점에서, 마우스를 희생시켜 폐를 수거하였다. 폐 조직은 10% 버퍼된 포름알데히드 내에 고정하고, 파라핀을 채운 다음 절개하였다. 절개부는 고체 부분을 시각화 또는 종양을 분산시키기 위해 정해진 프로토콜에 따라 H&E 염색하였다.

NRC 2694를 처리한 그룹은 모든 투여 수준에서 엘로티닙 HCl을 처리한 경우보다 훨씬 우수하며, 따라서 NRC 2694의 뛰어난 효능이 확인되었다.

vii) A549 루시페라아제 발현 세포를 이식한 누드 마우스: (도 6 및 7)

경구/복강내 주사 경로로 다양한 농도의 엘로티닙 HCl 및 NRC 2694를 처리한 A549 루시페라아제 발현 세포를 이식한 누드 마우스에 대해 종양을 관찰하였고, 관찰된 그림은 도 6 및 7에 나타내었다. NRC 2694를 처리한 그룹이 엘로티닙 HCl을 처리한 그룹에 비해 훨씬 더 양호한 것으로 관찰되었다. 경구 및 복강내 주사 경로 모두에서, NRC 2694로 처리하여 42 일이 경과한 시점에서는 더 이상 종양이 관찰되지 않았으나, 엘로티닙 HCl을 처리한 그룹에서는 여전히 잔여 종양이 존재하였다.

viii) 누드 마우스에 대한 인비보 ( in vivo ) 연구를 통한 치유 효과:

본 연구에서 사용된 동물의 수에 대한 치료된 동물의 수의 비율로 치유 효과를 정리하여 표-3에 나타내었다.

폐 종양에 대한 NRC -2694 및 엘로티닙 HCl 의 치유 효과

약물	농도 mg/kg	치유 비율
엘로티닙 IP(복강내 주사)	2.5 5 10 20	1/5 2/5 2/5 3/5
엘로티닙 oral(경구 투여)	2.5 5 10 20	2/5 0/5 1/5 2/5
NRC 2694 IP	2.5 5 10 20	1/5 1/5 3/5 5/5(100%)
NRC 2694 oral	2.5 5 10 20	1/5 2/5 3/5 3/5

상기 비율은 NRC 2694의 경우에는 100%에 가깝지만 엘로티닙 HCl의 경우에는 40-60% 사이인 것으로 보인다.

ix) ED ₅₀ 의 평가:

ED₅₀ 값은 폐 절개부 및 종양 퇴행 연구를 기초로 평가하였다. 경구 투여시, NRC 2694에 대해서는 6.3 mg/kg의 값으로 산출되었고, 반면 엘로티닙 HCl에 대해 얻어진 수치는 22 mg/kg이었다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물의 우수한 효능이 확인되었다.

x) 인비트로( in vitro )에서 HER -1, HER -2, HER -3, HER -4 및 VEGFR 과 같은 다른 수용체들에 대한 연구(도-8):

EGFR 군(Erb/HER)의 다양한 다른 수용체들에 대한 NRC 2694의 효과를 측정하기 위해서, 인간 폐 종양 세포 A549에 다양한 농도의 NRC 2694를 처리하였고, 비교 실험을 위해서 엘로티닙 HCl도 처리하였다. Erb-1, Erb-2, Erb-3, Erb-4 및 VEGFR의 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다.

NRC 2694는 Erb B2, Erb B3, Erb B4 및 VEGFR 수준을 효과적으로 저하시키는 것으로 관찰되었으나, 엘로티닙 HCl에 대해서는 그러한 징후는 보이지 않았다. 앞서 언급된 수용체들의 발현 수준에서 추가적인 저해 징후는, 본 발명의 주요 부분, 즉 NRC 2694의 예측범위를 벗어난 그리고 놀라운 특성을 명백히 나타내는 것이다.

xi) 결론:

본 발명에 따른 화합물의 예측범위를 넘어선, 놀라운 그리고 우수한 항-종양 특성들과 추가적인 치료 가능성은, 앞서 언급된 엘로티닙 HCl과의 비교 실험을 통해, 확인된다.

실시예 -8

다음은 예시적인 설명을 위해, 화합물 NRC-269 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 용례를 나타낸 것으로, 인간에 대한 예방 목적의 치료를 위한 것이다.

정제(tablet)	mg/tablet
화합물 NRC-2694	50
락토오스 무수물(USP)	156
미정질 셀룰로오스(Avicel pH102)	15
소듐 라우릴 설페이트	5
소듐 스타치 글리코라이트	10
포비돈 K-30	3
하이드록시 프로필 셀룰로오스 (LH-11)	10
마그네슘 스테아레이트	1

Claims

화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
[화학식 I]

상기 식에서,
R¹은
,
,
이고,
R²는 OCH₃, OC₂H₅임.
제 1 항에 있어서,
R¹은
이고, R²는 OCH₃(NRC-2694)인 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제 2 항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 염은 모노하이드로클로라이드(monohydrochloride) (NRC-2694A)인 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제 2 항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 염은 디하이드로클로라이드(dihydrochloride) (NRC-2694B)인 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 EGF-타입 수용체 티로신 키나아제 효소(EGF-type receptor tyrosine kinase enzyme)에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 Erb-2, Erb-3, Erb-4를 포함하는 Erb 그룹 수용체 티로신 키나아제 민감성 암에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제2항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 NRC-2694 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 EGF 타입 수용체 티로신 키나아제 효소에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제2항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 NRC-2694 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 Erb-2, Erb-3, Erb-4를 포함하는 Erb 그룹 수용체 티로신 키나아제 민감성 암에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제2항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 NRC-2694 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 VEGF 타입 수용체 키나아제 민감성 암에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제3항 및 제4항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 NRC-2694A 및 NRC-2964B 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 EGF 타입 수용체 키나아제 민감성 암에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제3항 및 제4항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 NRC-2694A 및 NRC-2964B 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 Erb-2, Erb-3, Erb-4를 포함하는 Erb 그룹 수용체 티로신 키나아제 민감성 암에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
제3항 및 제4항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 NRC-2694A 및 NRC-2964B 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효함량으로 온혈동물에 투여(administration)하는 것을 포함하는, 온혈동물에서 VEGF 타입 수용체 키나아제 민감성 암에 대한 억제효과를 나타내는 방법.
다음의 공정을 포함하는 제 1 항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하는 방법:
a) 화학식 II의 퀴나졸린을 포스포릴 클로라이드 또는 옥사릴 클로라이드와 반응시켜 화학식 III의 4-클로로 퀴나졸린을 얻는 반응;
[화학식 II]

[화학식 III]

b) 상기 화학식 III의 4-클로로퀴나졸린을 3-에틸닐 아닐린과 반응시켜 화학식 I의 퀴나졸린 유도체를 얻는 축합반응;
[화학식 I]

상기 식에서,
R¹은
,
,
이고,
R²는 OCH₃, OC₂H₅임.
다음의 공정을 포함하는 제 2 항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하는 방법:
a) 화학식 II(a)의 퀴나졸린을 포스포릴 클로라이드 또는 옥사릴 클로라이드과 반응시켜 화학식 III(a)의 4-클로로 퀴나졸린을 얻는 반응;
[화학식 II(a)]

[화학식 III(a)]

b) 상기 화학식 III(a)의 4-클로로 퀴나졸린을 3-에틸닐 아닐린과 반응시켜 퀴나졸린 유도체 NRC-2694를 얻는 축합반응;
실시예 1-3에 개시된 퀴나졸린 유도체 NRC-2694를 제조하는 방법.
실시예 4에 개시된 모노하이드로클로라이드 염 NRC-2694A를 제조하는 방법.
실시예 5에 개시된 디하이드로클로라이드 염 NRC NRC-2694B를 제조하는 방법.
제 1 항 및 실시예 6에 개시된 화학식 I의 퀴나졸린 유도체의 최대내성용량(MTD; Maximum Tolerated Dose) 및 급성 독성(acute toxicity)을 평가하는 방법.
제 1 항 및 실시예 7에 개시된 화학식 I의 퀴나졸린 유도체의 인비트로(in vitro), 인비보(in vivo) 및 치료 효능(therapeutic efficacy)을 평가하는 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 퀴나졸린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물.