KR102383200B1 - 피리미딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

피리미딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피리미딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 유도체는 야생형 EGFR에 대하여 상대적으로 약한 EGFR 활성억제효과를 나타내면서, EGFR 돌연변이에 대하여 높은 억제능을 나타내므로, EGFR 돌연변이가 발생된 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피리미딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{pyrimidine derivatives, preparation method thereof, and pharmaceutical composition for use in preventing or treating cancer containing the same as an active ingredient}
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 피리미딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암의 발생은 화학물질, 방사선, 바이러스를 포함하는 여러 가지 환경적인 요인과 종양 유전자, 종양 억제 유전자, 세포사멸(apoptosis)과 DNA 복구에 관련된 유전자의 변화 등에 관련되어 있는데, 최근 이러한 암의 분자적 메커니즘을 이해함에 따라 새로운 치료법인 표적 항암치료가 가능하게 되었다.
표적 치료제들은 일반적으로 암세포가 특징적으로 가지고 있는 분자를 표적으로 하여 그 효과를 나타낼 수 있도록 만들어지며, 분자적 표적이 되는 것은 암세포의 신호전달경로(signal transduction pathway), 혈관신생(angiogenesis), 세포간질(matrix), 세포주기조절인자(cell cycle regulator), 세포사멸(apoptosis) 등에 관련된 유전자들이다. 현재 치료에서 중요한 표적 치료제로 사용되고 있는 것으로는 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 억제제를 비롯한 '신호전달경로 억제제'와 '신생혈관생성 억제제'들이 있다.
단백질 티로신 키나아제(protein tyrosine kinase)는 많은 악성 종양에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 특히 erbB 패밀리의 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)인 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)는 비소세포폐암종(NSCLC), 유방암, 신경교종, 두경부의 편평 세포 암종, 대장암, 곧창자 생암종, 두경부암, 위암 및 전립선암을 포함한 많은 상피세포 종양에서 비정상적으로 활성화되어 있고, 상기 EGFR-티로신 키나아제의 활성화가 지속적인 세포 증식, 주변 조직에 대한 침범, 원격 전이, 혈관 형성을 일으키며 세포 생존을 증가시킴이 알려진 바 있다.
구체적으로, 상기 EGFR은 ErbB 티로신키나아제 수용체군(tyrosine kinase receptors family; EGFR, HER-2, ErbB-3, ErbB-4) 중의 하나로, 세포외 리간드결합영역(extracelluar ligand-binding domain)과 티로신 키나아제영역(tyrosine kinase domain)을 포함한 세포내 영역(intracellular domain)을 가지고 있는 막경유 티로신키나아제(transmembrane tyrosine kinase)이다. 호모다이머(homodimer) 또는 헤테로다이머(heterodimer)를 이룬 수용체에 리간드가 결합하면 세포내의 티로신키나아제가 활성화되고 이렇게 EGFR에 의해 자극된 신호는 포스파티딜이노지톨 3-키나아제(phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPK, JAK/STAT) 신호전달 경로를 활성화한다(Nat Rev Cancer 2007;7:169-81).
EGFR은 특히, 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)의 절반이상에서 과발현되어 치료의 표적으로 많은 연구들이 시행되었다. EGFR 티로신키나아제 활성을 억제하는 EGFR TKI(tyrosine kinase inhibitor)가 개발되었으며, 대표적인 약제로는 제피티닙(IRESSA™), 에를로티닙(TARCEVA™), 라파티닙(TYKERB™, TYVERB™)이 있다.
한편, 2004년 EGFR의 활성화 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC:non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고되었다(Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39).
구체적으로, 상기 EGFR 돌연변이는 크게 민감성(sensitizing) 돌연변이와 내성(resistant) 돌연변이로 구분되는데 엑손 19의 결손(deletion)과 엑손 21의 L858R 점 돌연변이(point mutation)가 가장 중요한 민감성 돌연변이로서 약 85∼90%를 차지하고 있고 엑손 19 del 돌연변이가 TKI에 대한 민감성이 더 좋은 것으로 알려져 있다. 반면 엑손 20의 T790M 점 돌연변이는 가장 중요한 내성 돌연변이로서 획득 내성 환자의 50% 이상에서 발견되는 것으로 알려져 있다(Clin Cancer Res 2006;12:6494-6501.).
지금까지 동정된 체세포 돌연변이에는 엑손 19 내 틀내 결손 또는 엑손 20 내 삽입뿐만 아니라, 발현된 단백질 내에서 단일 핵산 잔기가 변형된 점 돌연변이(예컨대, L858R, G719S, G719C, G719A, L861Q)가 포함된다(Fukuoka et al. JCO 2003; Kris et al JAMA 2003 and Shepherd et al NEJM 2004).
EGFR 돌연변이를 갖는 NSCLC 환자에게서 제피티닙/에를로티닙의 초기 임상 효과에도 불구하고, 대부분의 환자에게서 결국에는 이들 제제에 대한 요법을 받는 동안 진행성 암이 발병한다. 재발된 표본의 초기연구에서 제피티닙 및 에를로티닙을 EGFR 키나아제 활성의 비효과적인 억제제가 되게 하는 이차 EGFR 돌연변이, T790M가 동정되었다(Kobayashi et al NEJM 2005 and Pao et al PLOS Medicine 2005). EGFR T790M 돌연변이가 제피티닙 또는 에를로티닙에 대해 내성을 획득한 환자 유래 종양의 대략 50%(24/48)에서 발견됨이 후속 연구에서 입증되었다(Kosaka et al CCR 2006; Balak et al CCR 2006 and Engelman et al Science 2007). 이러한 이차 유전적 변형은 키나아제 억제제로 치료된 환자에게서 '게이트키퍼(gatekeeper)' 잔기 및 이것과 연관된 이차 내성 대립 유전자와 유사한 위치에서 야기된다(예를 들어, 이마티닙 내성 CML에서 ABL 내 T315I).
EGFR 돌연변이인 EGFR_del19 또는 EGFR_L858R이 비소세포폐암과 두경부암의 주요한 원인이라는 것은 오래 전부터 알려져 왔고, 이들의 치료약물인 이레사, 타세바가 개발되어 현재 임상에서 사용되고 있다. 하지만, 이러한 약물을 환자에 사용하였을 때 약물의 구조에 기반을 두는 EGFR 2차 돌연변이가 생기는 획득내성(acquired resistance)이 관찰되었고, 이것이 실제 약제내성의 주요원인이라는 것도 밝혀졌다. EGFR 1세대 저해제를 평균 10개월 정도 사용하게 되면 EGFR 키나아제의 게이트키퍼(gatekeeper)에 위치한 T790M 돌연변이라는 획득내성이 발생하여 EGFR 1세대 저해제들이 약효를 내지 못하는 것이다. 즉, EGFR_del19_T790M 또는 EGFR_L858R_T790M 이중돌연변이가 발생하여 기존 치료제가 약효를 나타내지 못하게 된다.
이러한 사실을 기반으로 약효가 우수하면서 새로운 구조를 가지고 있는 2세대, 3세대 약물 개발에 대한 필요성이 대두되고 있다.
또한 EGFR_del19 또는 EGFR_L858R 돌연변이가 아닌 희귀 EGFR 돌연변이에 대한 적절한 치료약제도 없는 상황인데, 특히 EGFR Exon20insertion 돌연변이에 대한 적절한 치료약제가 없다. EGFR Exon20insertion 돌연변이는 매우 다양한데 EGFR D770delinsGY, EGFR H773_V774insH, EGFR Y764_V765insHH, EGFR D770insASV 및 EGFR D770_N771insSVD 등이 포함된다.
이에, 야생형(WT) EGFR에 대해 상대적으로 낮은 억제를 보임과 동시에, 특정 활성화 또는 내성 돌연변이체 형태의 EGFR에 대해 더 높은 억제를 나타내는 억제제의 개발이 요구되고 있다.
이에, EGFR 다중돌연변이를 억제하는 암 치료제를 개발하기 위하여 노력하던 중, 본 발명에 따른 피리미딘 유도체가 야생형 EGFR에 대하여 상대적으로 낮은 억제를 나타내면서, EGFR 돌연변이에 대하여 높은 억제능을 나타냄으로써, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피리미딘 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피리미딘 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피리미딘 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피리미딘 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피리미딘 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019106707319-pat00001
상기 화학식 1에서,
R은 -ORa 또는 -NRb1Rb2이고,
Ra는 -(CH2)m-NRb1Rb2이고, 여기서 m은 1 내지 3이고,
Rb1 및 Rb2는 각각 독립적으로 수소 또는 비치환된 또는 NRc1Rc2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬이고, 또는, Rb1 및 Rb2는 이들이 결합된 질소와 함께 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 비치환된 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬 또는 NRc1Rc2로 치환된 5 내지 7 원자의 헤테로시클로알킬을 형성하고,
Rc1 및 Rc2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬이고, 또는, Rc1 및 Rc2는 이들이 결합된 질소와 함께 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 비치환된 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6알킬로 치환된 5 내지 7 원자의 헤테로시클로알킬을 형성한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure 112019106707319-pat00002
상기 반응식 1에서 R은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 암 또는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료에 있어서의, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 피리미딘 유도체는 야생형 EGFR에 대하여 상대적으로 약한 EGFR 활성억제효과를 나타내면서, EGFR 돌연변이에 대하여 높은 억제능을 나타내므로, EGFR 돌연변이가 발생된 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 기존 EGFR TKI(tyrosine kinase inhibitor) 약물인 오시머티닙(osimertinib)의 Ba/F3 EGFR exon20 insertion 돌연변이에 대한 세포성장 억제능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1로 표시되는 화합물의 Ba/F3 EGFR exon20 insertion 돌연변이에 대한 세포성장 억제능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112019106707319-pat00003
상기 화학식 1에서,
R은 -ORa 또는 -NRb1Rb2이고,
Ra는 -(CH2)m-NRb1Rb2이고, 여기서 m은 1 내지 3이고,
Rb1 및 Rb2는 각각 독립적으로 수소 또는 비치환된 또는 NRc1Rc2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬이고, 또는, Rb1 및 Rb2는 이들이 결합된 질소와 함께 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 비치환된 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬 또는 NRc1Rc2로 치환된 5 내지 7 원자의 헤테로시클로알킬을 형성하고,
Rc1 및 Rc2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬이고, 또는, Rc1 및 Rc2는 이들이 결합된 질소와 함께 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 비치환된 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6알킬로 치환된 5 내지 7 원자의 헤테로시클로알킬을 형성한다.
상기 화학식 1에 있어서,
상기 R은
Figure 112019106707319-pat00004
,
Figure 112019106707319-pat00005
,
Figure 112019106707319-pat00006
,
Figure 112019106707319-pat00007
,
Figure 112019106707319-pat00008
,
Figure 112019106707319-pat00009
,
Figure 112019106707319-pat00010
,
Figure 112019106707319-pat00011
또는
Figure 112019106707319-pat00012
일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물들을 들 수 있다:
<1> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드;
<2> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드;
<3> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드;
<4> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드;
<5> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드;
<6> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드;
<7> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드;
<8> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드; 및
<9> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미도)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.
용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다. 이때, 상기 용매가 물인 경우는 "수화물"이라 지칭한다.
용어 "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer) 등의 구조 이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성체, 기하이성질체(트랜스, 시스) 등의 입체 이성질체, 광학 이성질체(enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112019106707319-pat00013
상기 반응식 1에서 R은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
이하, 상기 반응식 1로 표시되는 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 상기 반응식 1로 표시되는 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜, 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계이다. 구체적으로, 화학식 2로 표시되는 화합물의 할로겐과 화학식 3으로 표시되는 화합물의 1차 아민이 반응하여 화학식 1로 표시되는 화합물이 형성되는 단계이다.
상기 반응식 1의 반응은 할로겐과 아민을 결합시켜 아민본드를 형성할 수 있는 조건이라면 특히 한정되지 않는다.
본 발명에서는 산 조건을 사용하였으며, 상기 산으로는 TFA(Trifluoroacetic acid)을 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 산의 농도는 1 N일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반응식 1에서 사용가능한 용매는 특히 한정되는 것은 아니나, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 포함하는 저급 알코올; 테트라하이드로퓨란(THF); 디옥산; 에틸에테르, 1,2-다이메톡시에탄 등을 포함하는 에테르용매; 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 메틸렌클로라이드, 디클로로에탄, 물, 아세토나젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 에틸아세테이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시크레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트, 아세토나이트릴 등이 있으며, 이를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 저급 알코올인 n-부탄올를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 반응식 1의 반응온도는 80℃ 내지 95℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 반응이 진행되는 정도에 따라 적절히 반응온도를 조절할 수 있다.
그리고, 상기 반응식 1의 반응시간은 10분 내지 24시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 반응이 진행되는 정도에 따라 적절히 반응시간을 조절할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 상기 암은 EGFR에 대하여 돌연변이가 발현된 암일 수 있다.
이때, 상기 EGFR 돌연변이는 EGFR del19, EGFR L858R, EGFR del19/T790M, EGFR L858R/T790M, EGFR del19/T790M/C797S, EGFR L858R/T790M/C797S, EGFR D770delinsGY, EGFR H773_V774insH, EGFR Y764_V765insHH, EGFR D770insASV 및 EGFR D770_N771insSVD로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 야생형 EGFR에 대하여 상대적으로 약한 EGFR 활성억제효과를 나타내면서, EGFR 돌연변이에 대하여 선택적으로 높은 억제능을 나타내고, 특히, 이중 돌연변이인 EGFR del19/T790M에 대하여 높은 억제능을 나타낸다(실험예 1 및 표 2 참조).
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 Ba/F3세포주에서 EGFR 돌연변이에 대하여 선택적으로 높은 세포성장 억제능을 나타내는데, 특히, 삼중 돌연변이인 EGFR del19/T790M/C797S 또는 EGFR L858R/T790M/C797S에 대하여 기존 EGFR TKI(tyrosine kinase inhibitor) 약물인 오시머티닙(Osimertinib)보다 높은 세포성장 억제능을 나타내므로, 오시머티닙보다 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다(실험예 2, 표 3 및 표 4 참조).
본 발명의 실시예 1 화합물은 Ba/F3세포주에서 EGFR 돌연변이에 대하여 선택적으로 높은 세포성장 억제능을 나타내는데, 구체적으로 EGFR D770delinsGY, EGFR H773_V774insH, EGFR Y764_V765insHH, EGFR D770insASV 또는 EGFR D770_N771insSVD에 대하여 기존 EGFR TKI 약물인 오시머티닙보다 높은 세포성장 억제능을 나타내므로, 오시머티닙보다 우수한 항암효과를 나타냄을 알 수 있다(실험예 3 및 표 5 참조).
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은, EGFR 돌연변이에 대하여 높은 억제능을 나타내므로, EGFR del19, EGFR L858R, EGFR del19/T790M, EGFR L858R/T790M, EGFR del19/T790M/C797S, EGFR L858R/T790M/C797S, EGFR D770delinsGY, EGFR H773_V774insH, EGFR Y764_V765insHH, EGFR D770insASV, EGFR D770_N771insSVD 등의 EGFR 돌연변이가 발현된 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 특히, 삼중 돌연변이인 EGFR del19/T790M/C797S 또는 EGFR L858R/T790M/C797S에 대한 억제능이 현저히 우수한바, EGFR del19/T790M/C797S 또는 EGFR L858R/T790M/C797S가 발현된 암의 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 상기 암은 EGFR에 대하여 돌연변이가 발현된 암일 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은, EGFR 돌연변이에 대하여 높은 억제능을 나타냄으로써, 암 특히, EGFR 돌연변이가 발현된 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 식품, 음료 등의 건강기능보조 식품에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
나아가, 상기 외에 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
그리고, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 EGFR 돌연변이 관련 질환은 암, 건선, 습진, 아테롬성 동맥 경화증, 구농포성 발진, 피부건조증, 만성 설사, 간 경화증, 심근섬유증 및 만성 신부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 또는 EGFR 돌연변이 관련 질환의 예방 또는 치료에 있어서의, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1-1> N-(2-((2,5- 디클로로피리미딘 -4-일)아미노)페닐) 메탄설폰아미 드의 제조
하기 반응식 2로 표시되는 방법을 통해 N-(2-((2,5-디클로로피리미딘-4-일)아미노)페닐)메탄설폰아미드을 제조하였다.
[반응식 2]
Figure 112019106707319-pat00014
단계 1: 2,5-디클로로-N-(2-니트로페닐)피리미딘-4-아민의 제조
2-니트로아닐린(10 g, 72.4 mmol)을 DMF(100 mL)에 용해하여 교반한 용액에 NaH(3.47 g, 144.8 mmol)를 첨가하고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이후 2,4,5-트리클로로피리미딘(16.0 g, 86.8 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 상기 반응혼합물을 얼음물(300 mL)로 급냉(quench)시키고, 15분 동안 교반하였다. 침전된 고체를 여과하고, 진공 하 건조하여, 2,5-디클로로-N-(2-니트로페닐)피리미딘-4-아민(17 g, 85% 수율, 황색 고체)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.23 (s, 1 H), 8.49 (s, 1 H), 8.10 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1 H), 7.91 - 7.71 (m, 2 H), 7.53 - 7.43 (m, 1 H).
단계 2 : N-(2,5-디클로로피리미딘-4-일)벤젠-1,2-디아민의 제조
상기 단계 1에서 제조한 2,5-디클로로-N-(2-니트로페닐)피리미딘-4-아민(17 g, 59.6 mmol)을 THF/H2O(1:1, 300 mL)에 용해하여 교반한 용액에 iron powder(16.6 g, 298 mmol) 및 NH4Cl(15.9 g, 298.1 mmol)을 상온에서 첨가하였다. 상기 반응혼합물을 5시간 동안 65℃까지 가열하였다. 본 반응은 TLC로 관찰하였다. 가열 후의 반응혼합물을 실온까지 식히고, 셀라이트(Celite)로 여과하고, 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 세척하였다. 유기층은 분리되고, brine으로 세척되었으며, Na2SO4로 건조되고, 감압 하에 증발되어 N-(2,5-디클로로피리미딘-4-일)벤젠-1,2-디아민(10 g, 65% 수율, 황색 고체)를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 9.02 (s, 1 H), 8.26 (s, 1 H), 7.06 - 6.95 (m, 2 H), 6.77 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1 H), 6.58 (td, J = 7.5, 1.4 Hz, 1 H), 4.98 (s, 2 H); LCMS: 256.8 [M+H+].
단계 3 : N-(2-((2,5-디클로로피리미딘-4-일)아미노)페닐)메탄설폰아미드의 제조
상기 단계 2에서 제조한 N-(2,5-디클로로피리미딘-4-일)벤젠-1,2-디아민(3 g, 11.5 mmol)을 DCM(50 mL)에 용해하여 교반한 용액에 Et3N(5 mL, 35.0 mmol)을 상온에서 첨가하였다. 상기 반응혼합물을 0℃까지 식히고, 메실 클로라이드(mesyl chloride)(2.3 mL, 23.0 mmol) 적가방식(dropwise)으로 첨가하였다. 이후 반응혼합물을 상온까지 따뜻하게 하고, 14시간 동안 두었다. 본 반응은 TLC로 관찰하였다. 상기 반응혼합물을 포화된 NaHCO3 수용액(30 mL)으로 급냉(quench)시키고, DCM(30 mL)로 추출하였다. 유기층은 물, brine으로 세척되고, Na2SO4로 건조되고, 감압 하에 증발되었다. 수득된 원액(crude)는 메탄올(50 mL)에 용해되고, K2CO3(2.0 g)이 첨가되고, 12시간 동안 교반되었다. 상기 교반액은 감압 하에 증발되었다. 이후 수득된 원액은 H2O(100 mL)로 희석되고, DCM(100 mL)로 추출되었다. 수용액층은 분리되고, 1N HCl(pH ~ 5 내지 4)로 산성화되고, DCM으로 추출되었다. 유기층이 분리되고, Na2SO4로 건조되고, 감압농축되어, N-(2-((2,5-디클로로피리미딘-4-일)아미노)페닐)메탄설폰아미드(2.5 g, 64% 수율, 엷은 적색 고체(pale red solid))를 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 10.03 (s, 1 H), 8.33 (s, 1 H), 8.24 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1 H), 7.19 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1 H), 6.83 (td, J = 7.7, 1.6 Hz, 1 H), 6.58 (td, J = 7.6, 1.4 Hz, 1 H), 2.64 (s, 3 H); LCMS: 334.8 [M+H+].
< 제조예 1-2> tert - 부틸 (4- 플루오로 -2- 메톡시 -5- 니트로페닐 ) 카바메이트의 제조
하기 반응식 3로 표시되는 방법을 통해 tert-부틸(4-플루오로-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트를 제조하였다.
[반응식 3]
Figure 112019106707319-pat00015
단계 1 : 4-플루오로-2-메톡시-5-니트로아닐린의 제조
농축 H2SO4(50 mL)에 4-플루오로-2-메톡시아닐린(4.7 g, 33.0 mmol)을 portionwise로 첨가하였고, 얼음물 수조 내에서 식혔고, 온도가 15℃ 미만을 유지하도록 했다. 상기 혼합물을 고체가 용해될 때까지 교반하였다. 포타슘 니트레이트(potassium nitrate)(3.36 g, 33.0 mmol)을 portion wise로 첨가하고, 온도가 10℃ 미만을 유지하도록 했다. 이후 혼합물을 밤새 교반하고, 얼음/물에 부었다. 이후 혼합물은 농축 NH4OH로 염기성화되었다. 고체가 여과되었고, 이를 DCM에 용해하였으며, 물로 세척하고, Na2SO4로 건조되며, 감압농축되었다. 생성물인 원액은 플래시 실리카 크로마토그래피(flash silica chromatography)로 정제되고, MeOH 1 내지 10%를 성분으로 하는 DCM으로 용출되었다. 순수 분획물을 증발하여 건조함으로써, 4-플루오로-2-메톡시-5-니트로아닐린(4.5 g, 76% 수율, 황색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.38 - 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.11 - 6.97 (d, J = 13.4 Hz, 1 H), 5.24 (s, 2 H), 3.91 (s, 3 H); LCMS: 187.2 [M+H+].
단계 2 : tert-부틸(4-플루오로-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트의 제조
상기 단계 1에서 제조한 4-플루오로-2-메톡시-5-니트로아닐린(4.5 g, 24.1 mmol) 및 DMAP(300 mg, 2.41 mmol)을 DCM에 용해시켜 교반한 용액에 (Boc)2O(5.8 g, 26.2 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 상기 반응혼합물은 상온으로 천천히 따뜻하게 하고, 12시간 동안 두었다. 이후 반응혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO3 수용액으로 급냉하였다. 분리된 유기층은 물 및 brine으로 세척되고, Na2SO4로 건조되고, 감압농축되었다. 수득된 원액은 용리제(eluent)가 헥세인(hexanes)/에틸 아세테이트(ethyl acetate)(7:3)인 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고, tert-부틸(4-플루오로-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트(4.0 g, 58% 수율, 황색 고체)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.91 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 6.99 (s, 1 H), 6.78 - 6.68 (d, J = 12.1 Hz, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 1.56 (s, 9 H); LCMS: 287.2 [M+H+].
< 제조예 1-3> N-(5-아미노- 2((2-(디메틸아미노)에틸(메틸) 아미노)-4- 메톡시페닐 )아크릴아미드의 제조
하기 반응식 4로 표시되는 방법을 통해 N-(5-아미노-2((2-(디메틸아미노)에틸(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
[반응식 4]
Figure 112019106707319-pat00016
단계 1 : tert-부틸 (4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트의 제조
상기 제조예 1-2에서 제조한 tert-부틸(4-플루오로-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트(300 mg, 1.04 mmol)를 DMF(5 mL)에 용해시키고 교반한 용액에 N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민(106 mg, 1.04 mmol) 및 세슘 카보네이트(cesium carbonate)(183 mg, 1.56 mmol)을 상온에서 첨가하였다. 상기 반응혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다. 이후 반응혼합물을 상온으로 식히고, 얼음물로 급냉하였다. 침전된 고체를 여과하고, 진공 하 건조하여, tert-부틸 (4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트(250 mg, 65% 수율, 황색 고체)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.16 (s, 1 H), 8.11 (s, 1 H), 6.74 (s, 1 H), 3.90 (s, 3 H), 3.24 - 3.19 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.80 (s, 3 H), 2.46 - 2.40 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.13 (s, 6 H), 1.45 (s, 9 H); LCMS: 369.0 [M+H+].
단계 2 : tert-부틸(5-아미노-4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시페닐)카바메이트의 제조
상기 단계 1에서 제조한 tert-부틸 (4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시-5-니트로페닐)카바메이트(250 mg, 0.64 mmol)를 메탄올(15 mL)에 용해하여 교반한 용액에 아르곤(Ar, Argon) 대기 하에서 10% Pd/C(6.8 mg, 0.06 mmol)을 첨가했다. 상기 반응혼합물을 상온에서 4시간 동안 1 atm 수소 가스 압력 하에서 교반했고, 감압농축하여, tert-부틸(5-아미노-4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시페닐)카바메이트(210 mg, 91% 수율, 갈색 고체)를 얻었다.
LCMS: 339.2 [M+H+]
단계 3 : tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시페닐)카바메이트의 제조
상기 단계 2에서 제조한 tert-부틸(5-아미노-4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시페닐)카바메이트(200 mg, 0.59 mmol) 및 트리에틸아민(0.16 mL, 1.18 mmol)을 DCM에 용해하여 교반한 용액에 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride)(0.047 mL, 0.59 mmol)을 -30℃에서 첨가하였다. 상기 반응혼합물은 상온으로 천천히 따뜻하게 하였고, 3시간 동안 두었다. 이후 반응혼합물은 DCM으로 희석되고, 포화 NaHCO3 수용액으로 급냉되었다. 유기층이 분리되고, 물 및 brine으로 세척되고, Na2SO4로 건조되며, 감압농축되었다. 수득된 원액은 용리제가 DCM/MeOH(9.5:0.5)인 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제되었고, tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시페닐)카바메이트(150 mg, 65% 수율, 황백색 고체(off white solid))를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.03 (s, 1 H), 8.47 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 6.93 (s, 1 H), 6.49 - 6.34 (m, 1 H), 6.27 - 6.18 (dd, J = 17.0, 2.2 Hz, 1 H), 5.78 - 5.69 (dd, J = 10.0, 2.2 Hz, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 2.91 - 2.82 (t, J = 5.9 Hz, 2 H), 2.66 (s, 3 H), 2.33 (bs, 2 H), 2.22 (s, 6 H), 1.45 (s, 9 H); LCMS: 393.0 [M+H+].
단계 4 : N-(5-아미노-2((2-(디메틸아미노)에틸(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드의 제조
상기 단계 3에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-2-메톡시페닐)카바메이트(150.0 mg, 0.38 mmol)을 DCM에 용해시켜 교반한 용액에 DCM(1 mL)에 용해된 25% TFA를 상온에서 첨가하였다. 상기 혼합물은 12시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응혼합물은 TLC로 관찰되었다. 이후, 원액상태인 N-(5-아미노-2((2-(디메틸아미노)에틸(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드는 감압농축되었고, 다른 정제는 없었다.
LCMS: 293.2 [M+H+].
< 제조예 2-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -4-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-2-메톡시페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-2-메톡시페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00017
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 N,N-디메틸피페리딘-4-아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-2-메톡시페닐)카바메이트(78% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.95 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 7.83 (s, 1 H), 6.76 (s, 1 H), 6.69 - 6.57 (m, 1 H), 6.26 - 6.17 (dd, J = 16.9, 2.0 Hz, 1 H), 5.78 - 5.67 (m, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.05 - 2.96 (m, 2 H), 2.69 - 2.57 (m, 2 H), 2.28 (s, 7 H), 1.88 - 1.79 (m, 2 H), 1.76 - 1.61 (m, 2 H), 1.45 (s, 9 H); LCMS: 419.0 [M+H+].
< 제조예 2-2> N-(5-아미노-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4- 메톡시페닐 )아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00018
전구체로 상기 제조예 2-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-2-메톡시페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
LCMS: 319.0 [M+H+].
< 제조예 3-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -2- 메톡시 -4-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일)피페리딘-1-일)페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00019
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 1-메틸-4-(피페리딘-4-일)피페라진을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)카바메이트(65% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.94 (s, 1H), 8.16 (s, 1 H), 7.85 (s, 1 H), 6.75 (s, 1 H), 6.71 - 6.57 (m, 1 H), 6.27 - 6.16 (dd, J = 16.9, 2.1 Hz, 1 H), 5.75 - 5.67 (dd, J = 10.3, 2.0 Hz, 1 H), 3.79 (s, 3 H), 3.06 - 2.95 (d, J = 11.4 Hz, 2 H), 2.91 - 2.58 (m, 10 H), 1.93 - 1.78 (bs, 2 H), 1.77 - 1.62 (bs, 2 H), 1.45 (s, 9 H); LCMS: 474.2 [M+H+].
< 제조예 3-2> N-(5-아미노-4- 메톡시 -2-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00020
전구체로 상기 제조예 3-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드를 제조하여, 정제 없이 이후 단계에 사용하였다.
< 제조예 4-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -2- 메톡시 -4- 모폴리노페닐 ) 카바메 이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-모폴리노페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00021
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 모폴린을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-모폴리노페닐)카바메이트(77% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.99 (s, 1 H), 6.73 (s, 1 H), 6.51 - 6.42 (d, J = 16.5 Hz, 1 H), 6.27 - 6.17 (m, 1 H), 5.82 - 5.74 (m, 1 H), 3.99 (bs, 4 H), 3.89 (s, 3 H), 2.12 - 2.93(bs, 4 H), 1.54 (s, 9 H); LCMS: 378.0 [M+H+].
< 제조예 4-2> N-(5-아미노-4- 메톡시 -2- 모폴리노페닐 )아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00022
전구체로 상기 제조예 4-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-모폴리노페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
LCMS: 278.0.2 [M+H+].
< 제조예 5-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -2- 메톡시 -4-(4- 메틸피페라진 -1-일)페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00023
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 1-메틸피페라진을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)카바메이트(77% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.09 (s, 1 H), 8.31 (s, 1 H), 6.94 (s, 1 H), 6.74 (s, 1 H), 6.49 - 6.35 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 6.33 - 6.22 (dd, J = 17.4, 10.0 Hz, 1 H), 5.80 - 5.68 (d, J = 10.2 Hz, 1 H), 3.85 (s, 3 H), 3.03 (bs, 4 H), 2.96 - 2.77 (m, 4 H), 2.55 (s, 3 H), 1.54 (s, 9 H); LCMS: 391.0 [M+H+].
< 제조예 5-2> N-(5-아미노-4- 메톡시 -2-(4- 메틸피페라진 -1-일)페닐)아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00024
전구체로 상기 제조예 5-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
LCMS: 291.2 [M+H+].
< 제조예 6-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -4-(2-(디메틸아미노) 에톡시 )-2- 메 톡시페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-(2-(디메틸아미노)에톡시)-2-메톡시페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00025
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 2-(디메틸아미노)에탄-1-올을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-(2-(디메틸아미노)에톡시)-2-메톡시페닐)카바메이트(71% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.75 (s, 1 H), 9.00 (s, 1 H), 6.83 (s, 1 H), 6.57 (s, 1 H), 6.48 - 6.39 (dd, J = 16.9, 1.9 Hz, 1 H), 6.34 - 6.21 (dd, J = 16.9, 10.0 Hz, 1 H), 5.71 - 5.65 (dd, J = 10.0, 1.9 Hz, 1 H), 4.14 - 4.07 (m, 2 H), 3.83 (s, 3 H), 2.65 - 2.55 (m, 3 H), 2.37 (s, 6 H), 1.53 (s, 12 H); LCMS: 380.2 [M+H+].
< 제조예 6-2> N-(5-아미노-2-(2-(디메틸아미노) 에톡시 )-4- 메톡시페닐 )아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00026
전구체로 상기 제조예 6-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-4-(2-(디메틸아미노)에톡시)-2-메톡시페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를 제조하여, 정제 없이 이후 단계에 사용하였다.
< 제조예 7-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -2- 메톡시 -4-(2- 모폴리노에톡시 )페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(2-모폴리노에톡시)페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00027
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 2-모폴리노에탄-1-올을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(2-모폴리노에톡시)페닐)카바메이트(79% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 8.88 (s, 1 H), 6.80 (s, 1 H), 6.51 (s, 1 H), 6.49 - 6.39 (d, J = 15.9 Hz, 1 H), 6.27 - 6.17 (m, 1 H), 5.81 - 5.67 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.24 (s, 2 H), 3.90 (bs, 4 H), 3.84 (s, 3 H), 3.09 - 2.55 (bs, 6 H), 1.53 (s, 9 H); LCMS: 422.0 [M+H+].
< 제조예 7-2> N-(5-아미노-4- 메톡시 -2-(2- 모폴리노에톡시 )페닐)아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00028
전구체로 상기 제조예 7-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(2-모폴리노에톡시)페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
LCMS: 322.2 [M+H+].
< 제조예 8-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -2- 메톡시 -4-( 메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노 )페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00029
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 N-메틸-2-(4-메틸피페라진-1-일)에탄-1-아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)카바메이트(70% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.15 (s, 1 H), 9.02 (s, 1 H), 6.94 (s, 1 H), 6.70 (s, 1 H), 6.52 - 6.45 (d, J = 3.4 Hz, 1 H), 6.24 - 6.08 (m, 1 H), 5.81 - 5.70 (m, 1 H), 3.85 (s, 3 H), 3.06 - 2.98 (m, 2 H), 2.89 - 2.69 (m, 8 H), 2.65 (s, 3 H), 2.53 (s, 2 H), 2.50 (s, 3 H), 1.54 (s, 9 H); LCMS: 447.0 [M+H+].
< 제조예 8-2> N-(5-아미노-4- 메톡시 -2-( 메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노 )페닐)아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00030
전구체로 상기 제조예 8-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
LCMS: 348.2 [M+H+].
< 제조예 9-1> tert -부틸 (5- 아크릴아미도 -2- 메톡시 -4-( 메틸(2-모폴리노에틸)아미노 )페닐)카바메이트의 제조
[tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)카바메이트]
Figure 112019106707319-pat00031
N1,N1,N2-트리메틸에테인-1,2-디아민 대신 N-메틸-2-모폴리노에탄-1-아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1-3의 단계 1 내지 3에 따라 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)카바메이트(69% 수율)를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 9.15 (s, 1 H), 9.12 (s, 1 H), 6.94 (s, 1 H), 6.52 - 6.42 (m, 1 H), 6.25 - 6.07 (m, 1 H), 5.74 (d, J = 11.8 Hz, 1 H), 3.84 (s, 3 H), 3.81 - 3.71 (t, J = 5.9 Hz, 4 H), 3.41 (s, 3 H), 3.04 (s, 2 H), 2.74 - 2.65 (m, 2 H), 2.64 (s, 3 H), 2.45 (bs, 4 H), 1.54 (s, 9 H); LCMS: 435.2 [M+H+].
< 제조예 9-2> N-(5-아미노-4- 메톡시 -2-( 메틸(2-모폴리노에틸)아미노 )페닐)아크릴아미드의 제조
[N-(5-아미노-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드]
Figure 112019106707319-pat00032
전구체로 상기 제조예 9-1에서 제조한 tert-부틸 (5-아크릴아미도-2-메톡시-4-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)카바메이트를 사용한 것을 제외하고, 상기 제조예 1-3의 단계 4에 따라 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드를 제조하였다.
LCMS: 335.2 [M+H+].
< 실시예 1> N-5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노-2-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노-2-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를 하기 반응식 5에 나타난 바와 같은 방법으로 제조하였다.
[반응식 5]
Figure 112019106707319-pat00033
상기 제조예 1-1에서 제조한 N-(2-((2,5-디클로로피리미딘-4-일)아미노)페닐)메탄설폰아미드(100 mg, 0.3 mmol)를 1N TFA를 포함한 n-부탄올(30 mL)에 용해시켜 교반한 용액에 상기 제조예 1-3에서 제조한 N-(5-아미노-2((2-(디메틸아미노)에틸(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드(71.5 mg, 0.3 mmol)을 상온에서 첨가하였다. 반응 튜브를 테플론-라인드 캡(Teflon-lined cap)으로 봉하고, 반응혼합물을 90℃에서 밤새 교반하였다. 교반액을 감압농축하였다. 잔여물을 DCM에 용해하고, 포화 NaHCO3 수용액, 물 및 brine으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 감압 하에 증발하였다. 수득된 원액은 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH/9:1 내지 8.5:1.5)로 정제하여, N-5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노-2-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드(40 mg, 23% 수율, 황백색 고체)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.03 (s, 1H), 9.29 (s, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.39 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 8.12 (s, 1 H), 8.07 - 8.01 (m, 1 H), 7.431 - 7.22 (m, 1 H), 7.06 - 7.04 (dd, J = 6.6, 3.1 Hz, 2 H), 6.96 (s, 1 H), 6.42 - 6.32 (m, 1 H), 6.23 - 6.19 (dd, J = 16.9, 2.1 Hz, 1 H), 5.76 - 5.73 (dd, J = 10.1, 2.1 Hz, 1 H), 3.76 (s, 3H), 2.94 (s, 3 H), 2.91 - 2.88 (t, J = 5.8 Hz, 2 H), 2.70 (s, 3 H), 2.38 (s, 3 H), 2.26 (s, 6 H); LCMS: 590.0 [M+H+].
< 실시예 2> N-(5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 2-2에서 제조한 N-(5-아미노-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 27%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.97 (s, 1 H), 8.58 (s, 1 H), 8.17 - 8.08 (m, 3 H), 8.08 - 7.99 (m, 1 H), 7.33-7.26 (dd, J = 7.3, 2.2 Hz, 1 H), 7.13 - 7.01 (m, 2 H), 6.79 (s, 1 H), 6.72 - 6.61 (dd, J = 16.9, 10.2 Hz, 1 H), 6.25 - 6.14 (dd, J = 17.0, 2.1 Hz, 1 H), 5.77 - 5.67 (dd, J = 10.0, 2.0 Hz, 1 H), 3.76 (s, 3 H), 3.10 - 3.00 (m, 2 H), 2.74 - 2.59 (m, 2 H), 2.31 (s, 7 H), 1.91 - 1.80 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 1.78 - 1.63 (m, 2 H); LCMS: 615.2 [M+H+].
< 실시예 3> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 3-2에서 제조한 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 30%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 8.11 (s, 1 H), 7.95 (s, 1 H), 7.83 - 7.77 (d, J = 7.4 Hz, 1 H), 7.49 - 7.43 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.35 - 7.26 (m, 2 H), 6.93 (s, 1 H), 6.61 - 6.51 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1 H), 6.43 - 6.36 (d, J = 16.9 Hz, 1 H), 5.89 - 5.83 (d, J = 10.3 Hz, 1 H), 3.89 (s, 3 H), 3.30 - 3.10 (m, 5 H), 2.99 (s, 3 H), 2.89 (s, 6 H), 2.15 - 2.07 (d, J = 12.2 Hz, 2 H), 1.97 - 1.82 (m, 2 H); LCMS: 670.2 [M+H+].
< 실시예 4> N-(5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 4-2에서 제조한 N-(5-아미노-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 31%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 8.10 (s, 1H), 7.93 (s, 1 H), 7.82 - 7.74 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.49 - 7.43 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.39 - 7.26 (m, 2 H), 6.92 (s, 1 H), 6.61 - 6.51 (dd, J = 17.0, 10.1 Hz, 1 H), 6.42 - 6.32 (d, J = 17.0 Hz, 1 H), 5.89 - 5.81 (d, J = 10.4 Hz, 1 H), 3.89 (s, 7 H), 3.00 (s, 3 H), 2.98 - 2.91 (t, J = 4.6 Hz, 4 H); LCMS: 575.2 [M+H+].
< 실시예 5> N-(5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 5-2에서 제조한 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 41%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 8.13 (s, 1 H), 7.85 - 7.78 (m, 1 H), 7.48 - 7.40 (m, 1 H), 7.33 - 7.24 m, 1 H), 6.89 (s, 1 H), 6.63 - 6.52 (dd, J = 17.0, 10.3 Hz, 1 H), 6.43 - 6.33 (d, J = 16.9 Hz, 1 H), 5.90 - 5.84 (d, J = 10.0 Hz, 1 H), 3.91 (s, 3 H), 3.67 - 3.58 (d, J = 11.9 Hz, 2 H), 3.30 - 3.21 (m, 4 H), 3.18 - 3.10 (d, J = 12.0 Hz, 2 H), 3.01 (s, 3 H), 2.98 (s, 3 H); LCMS: 587.2 [M+H+].
< 실시예 6> N-(5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 6-2에서 제조한 N-(5-아미노-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드를 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 29%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 8.11 (s, 1 H), 7.90 (s, 1 H), 7.87 - 7.79 (m, 1 H), 7.47 - 7.40 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.31 - 7.21 (m, 2 H), 6.87 (s, 1 H), 6.58 - 6.39 (m, 2 H), 5.93 - 5.85 (d, J = 9.8 Hz, 1 H), 4.56 - 4.58 (t, J = 5.0 Hz, 2 H), 3.95 (s, 3 H), 3.65 - 3.58 (t, J = 4.8 Hz, 2 H), 3.02 (s, 6 H), 2.98 (s, 3 H); LCMS: 576.8 [M+H+].
< 실시예 7> N-(5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 7-2에서 제조한 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 22%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 8.13 (s, 1 H), 7.83 - 7.75 (m, 2 H), 7.49 - 7.41 (m, 1 H), 7.33 - 7.24 (m, 2 H), 6.88 (s, 1 H), 6.60 - 6.49 (dd, J = 17.0, 9.9 Hz, 1 H), 6.48 - 6.40 (d, J = 16.8 Hz, 1 H), 5.95 - 5.88(d, J = 9.9 Hz, 1 H), 4.61 - 4.54 (t, J = 5.1 Hz, 2 H), 4.03 (bs, 4 H), 3.95 (s, 3 H), 3.67 - 3.60 (t, J = 4.9 Hz, 2 H), 3.33 (bs, 4 H), 2.97 (s, 3 H); LCMS: 619.2 [M+2H+].
< 실시예 8> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 8-2에서 제조한 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 27%).
1H NMR (500 MHz, Methanol-d 4) δ 8.16 (s, 1 H), 7.88 (s, 1 H), 7.82 - 7.76 (d, J = 7.0 Hz, 1 H), 7.50 - 7.44 (m, 1 H), 7.34 - 7.27 (m, 2 H), 7.00 (s, 1 H), 6.64 - 6.55 (dd, J = 16.9, 10.0 Hz, 1 H), 6.52 - 6.46 (d, J = 17.0 Hz, 1 H), 5.99 (d, J = 10.1 Hz), 3.96 (s, 3 H), 3.51 - 3.45 (bs, 2 H), 3.41 - 3.35 (bs, 4 H), 3.23 - 3.14 (bs, 4 H), 3.08 (s, 2 H), 2.97 (s, 3 H), 2.87 (s, 3 H), 2.82 (s, 3 H); LCMS: 645.0 [M+2H+].
< 실시예 9> N-(5-((5- 클로로 -4-((2-( 메틸설폰아미도 )페닐)아미도)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드의 제조
본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물인 N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미도)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드를, 상기 제조예 9-2에서 제조한 N-(5-아미노-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1에 따라 제조하였다(수율 26%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.34 - 9.21 (m, 2 H), 8.48 (s, 1 H), 8.22 (s, 1 H), 8.17 - 8.09 (m, 2 H), 8.06 - 7.98 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.36 - 7.27 (dd, J = 7.7, 1.8 Hz, 1 H), 7.16 - 7.02 (m, 2 H), 6.92 (s, 1 H), 6.67 - 6.54 (m, 1 H), 6.26 - 6.15 (dd, J = 17.0, 2.0 Hz, 1 H), 5.80 - 5.69 (d, J = 12.2 Hz, 1 H), 3.77 (s, 3 H), 3.56 (t, J = 4.7 Hz, 4 H), 2.02 - 2.90 (m, 5 H), 2.68 (s, 3 H), 2.43 - 2.28 (m, 6 H); LCMS: 632.2 [M+H+].
하기 표 1에 실시예 1 내지 9에서 제조한 화합물의 화학구조식을 정리하여 나타내었다.
실시예 화학구조 실시예 화학구조
1
Figure 112019106707319-pat00034
 2
Figure 112019106707319-pat00035
3
Figure 112019106707319-pat00036
 4
Figure 112019106707319-pat00037
5
Figure 112019106707319-pat00038
 6
Figure 112019106707319-pat00039
7
Figure 112019106707319-pat00040
 8
Figure 112019106707319-pat00041
9
Figure 112019106707319-pat00042
< 실험예 1> 야생형 EGFR 및 EGFR 돌연변이 효소 억제능
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 야생형 EGFR 및 EGFR 돌연변이 효소에 대한 억제능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
본 발명의 화합물에 대한 야생형 및 EGFR 돌연변이 효소에 대한 활성측정은 Cisbio 사에서 판매하는 HTRF 시스템을 활용하여 다음과 같이 실험하였다. EGFR 야생형 및 EGFR del19/T790M 돌연변이 효소는 Carna Biosciences 에서 제공하는 재조합 단백질을 구매하여 사용하였다.
활성측정에 사용된 assay buffer의 조성은 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 7.5 mM MgCl2, 3 mM KCl, 0.01% Tween 20, 0.1% BSA, 1 mM DTT 이었다. 여기에 50 mM 농도의 ATP 와 0.5 mM 농도의 biotin으로 표지된 펩타이드 기질을 사용하여 효소반응을 진행하였다. 화합물의 EGFR 활성억제효과 분석은 하기의 분석 반응 레시피에 따라 진행되었다.
Component 1: 4 mL 의 EGFR 야생형 또는 돌연변이 효소
Component 2: 2 mL 의 화합물 용액
Component 3: 4 mL ATP 와 biotin 표지 펩타이드
효소반응은 component 1 과 component 2 를 먼저 섞어준 후에 component 3을 첨가하여 시작한다. 37℃에서 2시간 반응 후에 Cisbio 사에서 제공되는 streptavidin-XL665 와 europium 표지된 anti-phosphotyrosine antibody로 이루어진 측정용액 10 mL를 효소반응 용액에 추가하고 1시간 동안 상온에서 반응한다. 최종적으로 Perkin-Elmer 사의 Envision 장비를 이용하여 615 nm 와 665 nm 에서의 형광 값의 비율을 구하여 효소활성을 정량적으로 측정하고 화합물의 억제능을 확인한다. 7가지 화합물 농도에서 측정된 측정값을 Prism 프로그램(버전 5.01, Graphpad Software, Inc.)을 사용하여 분석하고 화합물의 억제능 지표인 IC50값을 산출하였다.
EGFR wt. IC50(μM) EGFR del19/T790M IC50(μM)
오시머티닙 0.0031 <0.001
실시예 1 <0.001 <0.001
실시예 2 0.064 <0.001
실시예 3 0.01 <0.001
실시예 4 0.37 <0.001
실시예 5 0.018 <0.001
실시예 6 0.0016 <0.001
실시예 7 0.0094 <0.001
실시예 8 0.029 <0.001
실시예 9 0.00065 <0.001
상기 표 4에 나타낸 바와 같이,
본 발명의 모든 실시예 화합물이 야생형 EGFR에 대하여 상대적으로 약한 EGFR 활성억제효과를 나타내면서, EGFR 돌연변이에 대하여 선택적으로 높은 억제능을 나타내고, 이는 기존 EGFR TKI(tyrosine kinase inhibitor) 약물인 오시머티닙의 경우와 유사한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물은 EGFR 돌연변이를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 2> Ba /F3 세포주에서의 야생형 Ba /F3 EGFR 및 Ba /F3 EGFR 돌연변이 세포성장 억제능 측정
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 Ba/F3 세포주에서의 야생형 Ba/F3 EGFR 및 Ba/F3 EGFR 돌연변이에 대한 세포성장 억제능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
본 발명의 화합물의 야생형 및 돌연변이 Ba/F3 EGFR 세포주에 대한 활성측정은 Promega 사에서 판매하는 CellTiter-Glo 시스템을 활용하여 다음과 같이 실험하였다. CellTiter-Glo assay은 세포 배양 상태에서 세포에 존재하는 ATP를 측정하여 세포 viability를 확인하는 방법이다. Ba/F3 EGFR 야생형 및 Ba/F3 EGFR del19, Ba/F3 EGFR L858R, Ba/F3 EGFR del19/T790M, Ba/F3 EGFR L858R/T790M, Ba/F3 del19/T790M/C797S, Ba/F3 EGFR L858R/T790M/C797S 돌연변이 세포주는 크라운 바이오사이언스사에서 제공하는 세포주를 구매하여 사용하였다. Ba/F3 EGFR 야생형 및 Ba/F3 EGFR del19, Ba/F3 EGFR L858R, Ba/F3 EGFR del19/T790M, Ba/F3 EGFR L858R/T790M, Ba/F3 del19/T790M/C797S, Ba/F3 EGFR L858R/T790M/C797S 돌연변이 세포주는 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 들어있는 RPMI 에 puromycine 1ug 을 넣어 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다.
화합물의 EGFR 세포성장 억제능 효과 분석은 하기의 분석 반응 레시피에 따라 진행되었다.
2500 cells/ 90 μL 을 96 well 세포배양 plate 에 계대하여 배양하고 24시간 후에 화학식 1로 표시되는 화합물을 0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 (μM) 로 처리하였다. 72시간 동안 반응 후 화합물을 처리한 plate를 30분 동안 상온에 방치 한 후 reagent를 100 μL 더 처리 하고 10분 동안 상온에서 shaking하였다. 최종적으로 장비를 이용하여 570 nm 에서의 형광 값의 비율을 구하여 정량적으로 측정하고 화합물의 세포성장 억제능을 확인한다. 8가지 화합물 농도에서 측정된 측정값을 Prism 프로그램(버전 5.01, Graphpad Software, Inc.)을 사용하여 분석하고 화합물의 세포성장 억제능 지표인 IC50값을 산출하였다.
Ba/F3 EGFR
wt. IC50(μM)		 Ba/F3 EGFR
del19 IC50(μM)		 Ba/F3 EGFR
L858R IC50(μM)
오시머티닙 0.92 0.002 0.007
실시예 1 1.8 0.001 0.002
실시예 2 0.5 0.009 0.053
실시예 3 0.49 0.004 0.028
실시예 4 0.41 0.005 0.002
실시예 5 0.23 0.008 0.017
실시예 6 0.024 0.001 0.003
실시예 7 0.4 0.009 0.034
실시예 8 0.27 0.009 0.028
실시예 9 0.012 0.001 0.001
Ba/F3 EGFR del19/T790M
IC50(μM)		 Ba/F3 EGFR
L858R/T790M
IC50(μM)		 Ba/F3 EGFR
del19/T790M/C797S
IC50(μM)		 Ba/F3 EGFR
L858R/T790M/C797S
IC50(μM)
오시머티닙 0.003 0.002 0.33 0.81
실시예 1 0.003 0.008 0.12 0.12
실시예 2 0.015 0.035 0.24 0.39
실시예 3 0.005 0.012 0.16 0.22
실시예 4 0.025 0.017 0.32 0.47
실시예 5 0.001 0.021 0.092 0.72
실시예 6 0.002 0.008 1 0.99
실시예 7 0.006 0.01 0.99 0.1
실시예 8 0.028 0.013 0.01 0.84
실시예 9 0.001 0.001 0.96 0.9
상기 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이,
본 발명의 모든 실시예 화합물이 Ba/F3 세포주에서 야생형 EGFR에 대하여 상대적으로 약한 활성억제효과를 나타내면서, 삼중 돌연변이인 EGFR del19/T790M/C797S, EGFR L858R/T790M/C797S를 포함한 EGFR 돌연변이에 대하여 선택적으로 높은 세포성장 억제능을 나타내고, 특히 기존 EGFR TKI 약물인 오시머티닙의 경우보다 우수한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물은 EGFR 돌연변이를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 3> Ba /F3 세포주에서의 Ba /F3 EGFR exon20 insertion 돌연변이 세포성장 억제능
본 발명에 따른 실시예 1로 표시되는 화합물의 Ba/F3 세포주에서의 Ba/F3 EGFR exon20 insertion 돌연변이에 대한 세포성장 억제능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
본 발명의 화합물에 대한 돌연변이 Ba/F3 EGFR 세포주에 대한 활성측정은 Promega 사에서 판매하는 CellTiter-Glo 시스템을 활용하여 다음과 같이 실험하였다. CellTiter-Glo assay은 세포 배양 상태에서 세포에 존재하는 ATP를 측정하여 세포 viability를 확인하는 방법이다. Ba/F3 EGFR D770delinsGY, H773_V774insH, Y764_V765insHH, V769_D770insASV, D770_N771insSVD 돌연변이 세포주는 Dana-Farber Cancer Institute의 Pasi A Janne 실험실에서 구매하여 사용하였다. Ba/F3 D770delinsGY, H773_V774insH, Y764_V765insHH, V769_D770insASV, D770_N771insSVD 돌연변이 세포주는 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 들어있는 RPMI에 puromycine 1 μg/ml 을 넣어 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다.
화합물의 BaF3 cells overexpressing exon20 insertion mutations의 세포성장 억제능 효과 분석은 하기의 분석 반응 레시피에 따라 진행되었다.
1500 cells/ 100 μL을 96 well 세포배양 plate에 계대하여 배양하고 24시간 후에 실시예 1로 표시되는 화합물을 0, 30, 100, 300, 1000 (nM)로 처리하였다. 72시간 동안 반응 후 화합물을 처리한 plate를 30분 동안 상온에 방치한 후 CellTiter Glo 2.0 reagent를 100 μL 더 처리하고 10분 동안 상온에서 shaking 하였다. 최종적으로 Luminometer 장비를 이용하여 luminescence 값을 측정하여 vehicle (control) 대비 화합물에서의 세포성장 억제능을 확인하였다. 5가지 화합물 농도에서 측정된 측정값을 Prism 프로그램(버전 5.01, Graphpad Software, Inc.)을 사용하여 분석하고 화합물의 세포성장 억제능 지표인 IC50값을 산출하였다.
Ba/F3 EGFR V769_D770insASV IC50(μM) Ba/F3 EGFR D770delinsGY IC50(μM) Ba/F3 EGFR H773_V774insH IC50(μM) Ba/F3 EGFR Y764_V765insHH IC50(μM) Ba/F3 EGFR D770_N771insSVD IC50(μM)
오시머티닙 0.124 0.159 0.191 0.136 0.149
실시예 1 0.026 0.021 0.06 0.029 0.027
상기 표 5에 나타난 바와 같이,
본 발명에 따른 실시예 1로 표시되는 화합물은 Ba/F3 세포주에서의 Ba/F3 EGFR exon20 insertion 돌연변이에 대하여 높은 세포성장 억제능을 나타내고, 이는 기존 EGFR TKI(tyrosine kinase inhibitor) 약물인 오시머티닙의 경우보다 우수한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 피리미딘 유도체 화합물은 EGFR 돌연변이를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.
<제제예 1> 산제의 제조
화학식 1로 표시되는 유도체 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<제제예 2> 정제의 제조
화학식 1로 표시되는 유도체 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 3> 캡슐제의 제조
화학식 1로 표시되는 유도체 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제제예 4> 주사제의 제조
화학식 1로 표시되는 유도체 100 ㎎
만니톨 180 ㎎
Na2HPO4ㆍ2H2O 26 ㎎
증류수 2974 ㎎
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
<제제예 5> 건강식품의 제조
화학식 1로 표시되는 유도체 500ng
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70mg
비타민 E 1.0mg
비타민 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2mg
비타민 C 10mg
비오틴 10mg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50mg
판토텐산 칼슘 0.5mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제제예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<제제예 6> 건강음료의 제조
화학식 1로 표시되는 유도체 500ng
구연산 1000mg
올리고당 100g
매실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900ml
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure 112019106707319-pat00043

    상기 화학식 1에서,
    R은 -ORa 또는 -NRb1Rb2이고,
    Ra는 -(CH2)m-NRb1Rb2이고, 여기서 m은 1 내지 3이고,
    Rb1 및 Rb2는 각각 독립적으로 수소 또는 비치환된 또는 NRc1Rc2로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬이고, 또는, Rb1 및 Rb2는 이들이 결합된 질소와 함께 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 비치환된 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬 또는 NRc1Rc2로 치환된 5 내지 7 원자의 헤테로시클로알킬을 형성하고,
    Rc1 및 Rc2는 각각 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1- 6알킬이고, 또는, Rc1 및 Rc2는 이들이 결합된 질소와 함께 N, O 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 비치환된 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-6알킬로 치환된 5 내지 7 원자의 헤테로시클로알킬을 형성한다.
  2. 제1항에 있어서,
    R은
    Figure 112019106707319-pat00044
    ,
    Figure 112019106707319-pat00045
    ,
    Figure 112019106707319-pat00046
    ,
    Figure 112019106707319-pat00047
    ,
    Figure 112019106707319-pat00048
    ,
    Figure 112019106707319-pat00049
    ,
    Figure 112019106707319-pat00050
    ,
    Figure 112019106707319-pat00051
    또는
    Figure 112019106707319-pat00052
    인 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    <1> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-((2-(디메틸아미노)에틸)(메틸)아미노)-4-메톡시페닐)아크릴아미드;
    <2> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)-4-메톡시페닐)아크릴아미드;
    <3> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)아크릴아미드;
    <4> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-모폴리노페닐)아크릴아미드;
    <5> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드;
    <6> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4-메톡시페닐)아크릴아미드;
    <7> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-모폴리노에틸)아미노)페닐)아크릴아미드;
    <8> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(메틸(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)아미노)페닐)아크릴아미드; 및
    <9> N-(5-((5-클로로-4-((2-(메틸설폰아미도)페닐)아미도)피리미딘-2-일)아미노)-4-메톡시-2-(2-모폴리노에톡시)페닐)아크릴아미드.
  4. 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
    화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure 112019106707319-pat00053

    상기 반응식 1에서 R은 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
  5. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 EGFR(epidermal growth factor receptor) 돌연변이를 억제하는 것인 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 EGFR 돌연변이는 EGFR del19, EGFR L858R, EGFR del19/T790M, EGFR L858R/T790M, EGFR del19/T790M/C797S, EGFR L858R/T790M/C797S, EGFR D770delinsGY, EGFR H773_V774insH, EGFR Y764_V765insHH, EGFR D770insASV 및 EGFR D770_N771insSVD로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 혈액암 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는, 하기 질환 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    암, 건선, 습진, 아테롬성 동맥 경화증, 구농포성 발진, 피부건조증, 만성 설사, 간 경화증, 심근섬유증 및 만성 심부전.
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