KR20100105166A - 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 피부 상태개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상 또는 피부 탄력인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계 및 상기 배양액을 수거하는 단계를 포함하는 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

양수세포, 중간엽줄기세포, 컨디션드 배지, 세포성장, 재생능력, 미용치료제

Description

양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 피부 상태개선용 조성물 {Compositions for Improving Skin Conditions Using Fetus-derived Mesenchymal Stem Cells from Amniotic Fluids}

본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상 또는 피부 탄력인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계 및 상기 배양액을 수거하는 단계를 포함하는 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 적합한 환경 및 자극을 통해 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며, 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포로서, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)의 3종이 가장 잘 알려져 있다. 줄기세포는 특징적인 현상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가지고 있으므로, 각종 장기에 대한 기능회복을 위한 세포자원으로서 연구의 대상이 되고 있다.

지금까지 알려진 바에 의하면 성체줄기세포는 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려져 있다. 성체줄기세포는 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 284, 143-147, 1999; Science 287, 1442-1446, 2000), 골격근(skeletal muscle) (Proc . Natl Acad . Sci . USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)과 지방조직(Fat tissue) (Tissue Eng 7, 211-228, 2001; J. Cell . Physiol . 206, 229-237, 2006)에서 분리하였으며, 이들은 각각 유사한 계통으로 분화가 가능하다.

성체 줄기세포의 종류인 골수에서 유래한 중간엽줄기세포는 오래전부터 사용되어 오고 있고 효과도 입증이 된 세포이다. 또한, 최근에는 지방조직이나 다른 조직에서 분리한 세포들도 골수유래 중간엽줄기세포와 비슷한 특성을 가지고 있다는 연구 결과가 나오고 있다. 그러나 분리 및 다량의 세포 획득이 어려워 다른 대체할 수 있는 소스가 시급히 필요하다.

이에, 본 발명자들은 산모나 태아에게 해롭지 않게 쉽게 분리 가능한 양수에 초점을 맞추어 연구하였다.

수정란이 수정 후 자궁벽에 착상한 다음 수일이 지나게 되면 배아는 양수로 채워진 양막낭에 둘러싸이게 된다. 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 물질들이 섞여 있으므로, 양수를 분석함으로써 태아의 염색체에 이상이 있는지, 세균에 감염되지 않았는지 등을 알 수 있다. 또한 양수는 태아가 자유롭게 움직이게 할 뿐만 아니라, 외부에서 오는 충격과 자극으로부터 태아를 보호하고, 세균 감염을 막으며, 또한 태아의 체온 조절을 도와준다.

태아가 태어나기 전에 양수를 통하여 태아의 건강에 대한 여러 가지 정보를 알아보는 검사를 하는데, 이 때 임신이 시작되는 순간부터 출산 직후까지 모체에 해를 끼치지 않고 양수를 추출할 수 있다. 이렇게 검사에 사용된 세포는 검사 후 폐기하게 되는데 환자의 동의를 얻을 경우 폐기하지 않고 연구용 목적으로 사용할 수 있다. 따라서 양수 세포는 기존에 연구되어 오던 다른 성체줄기세포에 비해 쉽게 다량의 세포를 획득할 수 있다는 장점을 가진다. 그러나 아직까지 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 일정기간 동안 배양하여 배지를 추출하고 이를 섬유아세포에 넣어주었을 때 세포 성장을 증가시키는 현상이 일어나는지에 대해 개시된 바가 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 양수 내 태아 유래 세포에서 중간엽줄기세포을 분리하였으며 그 특징을 규명하였다. 또한, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용하여 만든 컨디션드 배지에 어떠한 성분들이 있는지 밝히고 섬유아세포에서 컨디션드 배지의 효과를 확인하였다. 나아가, 본 발명자들은 마우스 인 비보(in vivo) 및 임상 실험을 통해 상기 컨디션드 배지 조성물의 피부 탄력 및 피부 재생의 효과를 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계 및 상기 배양액을 수거하는 단계를 포함하는 상기 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상 또는 피부 탄력인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽줄기세포는 양수 내 태아 유래의 중간엽줄기세포를 의미한다.

산모로부터 얻은 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 가지 화학물질들이 포함되어 인체에 있는 대부분의 세포를 생성할 수 있고 채취가 쉬운 편이다. 또한, 양수에는 이종(heterogenous) 모양의 세포들이 존재하는데, 본 발명자들은 그 중에서 중간엽줄기세포의 특징인 섬유아세포와 같은 모양을 가지는 동종(homogenous) 의 중간엽줄기세포가 존재한다는 것을 확인하였다.

본 발명은 양수 내 세포가 태아에서 유래하였음을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 양수 내 세포를 핵형분석을 통하여 태아에서 유래한 세포임을 확인이 가능하다. 양수에는 태아의 것 뿐만 아니라 산모의 세포도 일부 존재할 수 있어, 본 발명에서는 양수 내 세포가 태아에서 유래한 세포라는 것이 염색체 분석을 통하여 남성임을 확인함으로써 가능하였다 (도 2).

바람직하게, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10, 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 을 포함한다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 (a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고 (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며 섬유아세포의 전형적인 모양인 선형태(spindle- shape)의 형태학적 특성을 나타내고, 및 (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어,“분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다. 바람직한 양태로서, 본 발명의 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 지방세포(Adipocyte), 골세포(Osteoblast) 및 연골세포(Chondrocyte)로의 분화능을 가진다.

본 발명의 구체적인 실시예로서, 상기 지방세포로의 분화 배지는 하이 글루코우즈 DMEM, 1 mM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 3-아이소부틸-1-메틸-카페인(3-isobutyl-1-methyl-xanthine), 10 ng/ml 인슐린(insulin), 100 mM 인도메타신(indomethacin)과 10% FBS를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예로서, 상기 골세포로의 분화 배지는 하이 글루코우즈 DMEM, 100 mM 덱사메타손(dexamethasone), 10 mM β-글리세로포스페이트, 0.2 mM 아스코르베이트와 10% FBS를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예로서, 상기 연골세포로의 분화 배지는 하이 글루코우즈 DMEM, 0.1 M 덱사메타손(dexamethasone), 50g/ml AsA, 100 g/ml 소디윰 퓨로베이트(sodium pyruvate), 40 g/ml 프롤린(proline), 10 ng/ml TGF-1과 50 mg/ml ITS프리믹스[6.25 g/ml 인슐린(insulin), 6.25 g/ml 트랜스페린(transferrin), 6.25 g/ml 셀레니어스 엑시드(selenius acid), 1.25 mg/ml BSA와 5.35 mg/ml 리놀레릭 엑시드(linoleic acid)]를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서는 상기 각 분화별 배지에서의 양수 내 태아 유래의 중간엽줄기세포를 7일 내지 28일 동안 배양하였으며, 이러한 방법으로 양수 내 태아 유래 세포가 중간엽줄기세포의 성격을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 4). 따라서, 본 발명에서는 양수 내 태아 유래 세포가 중간엽줄기세포의 성질을 가진 세포이며, 이를 골수 이외의 또 다른 세포의 원천으로 이용하는 것이 가능해진다.

본 발명의 조성물은 피부 상태 개선, 특히 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상에 대한 치유, 피부 재생 및 피부 탄력 개선에 효과가 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 피부 유래 섬유아세포에 인위적인 상처(wound)를 가한 후 본 발명의 조성물을 처리한 결과, 세포 이동(migration) 되는 정도가 더 높고 상처 치유(wound healing) 관련 유전자들의 발현이 정량적으로 높게 발현되므로 상처 치유(wound healing) 효과가 우수함을 확인할 수 있었다 (도 8).

또한, 마우스 피부에 인위적인 상처를 낸 후 본 발명의 조성물을 도포한 결과 상처부위가 점점 줄어들었으므로 상처 봉합 효과(wound closure) 및 피부 재생 효과가 우수함을 확인할 수 있었다 (도 9).

또한, 본 발명의 조성물을 이용한 임상실험에서, 본 발명의 조성물을 마이크 로테라피 후 마이크로바늘로 자극을 주었더니 피부의 탄력이 증가되고 톤이 밝아지며, 잔주름이 줄어들고, 모공이 축소되는 것을 확인할 수 있었다. 같은 방법으로 6~7주 정도 후 관찰한 결과 여드름 흉터의 붉은기가 호전되며 상처 재생이 빠른 것으로 확인되어, 본 발명의 조성물이 미백, 주름, 피부 손상에 대한 치유, 피부 재생 및 피부 탄력 개선에 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다 (도 9).

따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물이다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리 세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical

application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환 자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1-100 ㎎/kg 의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양액을 수거하는 단계를 포함하는 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

보다 바람직하게, 본 발명은 (a) 산모로부터 얻은 양수 내에서 태아 유래 세포를 분리하는 단계; (b) FBS 및 bFGF 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계; (c) 상기 수득된 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및 (d) 상기 컨디션드 배지 배양액을 수거하는 단계를 포함하는 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 단계 (a) 에서, 양수는 임신이 시작되는 순간부터 출산 직후까지 모체에 해를 끼치지 않고 추출할 수 있다. 양수는 태아가 태어나기 전에 태아의 건강에 대한 여러 가지 정보를 알아보기 위한 검사에 이용되는데, 이렇게 검사에 사용된 후 폐기되는 세포들을 환자의 동의를 얻어 연구용 목적으로 사용할 수 있으므로 쉽게 다량의 세포를 획득할 수 있다. 산모로부터 얻은 양수를 원심분리하여 양수 내 태아 유래 세포를 분리할 수 있다.

상기 단계 (b) 에서는, 양수에서 분리한 세포들을 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득할 수 있다. 계대배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM( Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 양수에서 분리한 세포들을 FBS 및 bFGF 를 함유하는 기본 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있으며, 바람직하게는 10% FBS가 포함된 로우 글루코즈 DMEM 배지에 4ng/ml bFGF를 첨가하여 배양함으로써 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예로서, 상기 로우 글루코즈 DMEM 배지는 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토 마이신과 4ng/ml bFGF 용액을 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 (c) 에서는, 상기 수득된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조한다.

본 발명에서 용어, "컨디션드 배지(conditioned medium)" 란 세포를 액체현탁배양하여 세포분열최성기인 대수성장기에 도달했을 때 분열세포를 원심분리 또는 여과하여 제거하고 배양액만 채취하여 이를 배양기질에 혼합한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장요소(growth factor)를 이용하는 것으로서, 저밀도의 세포 플레이팅이나 원형질체 배양에 많이 이용된다.

본 발명의 목적상, 본 발명에서의 컨디션드 배지 조성물이란 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양한 배지에서 태아 유래 중간엽줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 조성물로서, 태아 유래 중간엽줄기세포에서 유래한 성장인자 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있는 조성물을 말하며, 바람직하게는 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종 양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 을 포함한다.

본 발명에서는 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지를 얻기 위하여, 양수에서 분리하여 수득한 중간엽줄기세포를 아미노산 또는 그 유사체와 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 Ham's F-12 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청 배양배지를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 Ham's F-12 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청배지는 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-12 영양소 혼합액을 대략 1: 0.5 ~ 2의 비율로 첨가한다. 이 때 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가하는 것이 가능하다. 본 혼합액은 세포의 성장과 항상성 유지를 돕고 중간엽줄기세포의 초기배양 후 계대배양에 있어 세포의 안정성과 유지력 증진에 관여되는 여러 가지의 무기질과 아미노산들, 태아 유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 성장인자의 더 높은 생산을 촉진할 수 있는 비타민 계열의 영양소들과 다른 인자들이 일정한 비율로 혼합하여 형성된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 산모로부터 얻은 양수 내에서 분리한 태아 유래 세포를 FBS 및 bFGF 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득한 후, DMEM/F-12 무혈청 배지에서 양수 세포의 수를 다르게 하여 3일 동안 배양하여 얻은 배양액을 원심분리 및 여과하여 컨디션드 배지를 제조 하였다 (도 5).

상기 단계 (d) 에서는, 상기 컨디션드 배지 배양액을 수거하여 본 발명에서 목적하는 피부 상태 개선용 조성물을 제조한다. 상기 컨디션드 배지 배양액의 수거는 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있으며, 원심분리 또는 여과하여 수거할 수 있다.

본 발명은 양수 내 태아유래 세포로부터 배양을 하여 다분화능이 있는 중간엽줄기세포를 얻을 수 있기 때문에 골수 중간엽줄기세포 이외의 또 하나의 원천이 가능하도록 한다. 즉, 본 발명은 양수 내 태아 유래 세포는 다분화성 중간엽줄기세포로서의 가능성을 제시하고 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 얻음으로써 세포성장 및 피부 재생 능력이 우수한 조성물 개발을 가능하게 한다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 산모로부터 얻은 양수 내 태아유래 세포주의 배양 및 배양 조건을 이용 한 동종의 중간엽줄기세포 모양을 확인

산모로부터 얻은 양수 내에는 많은 부유물들이 많이 있다. 그것을 분리하기 위하여 양수를 T-flask에 담고 37℃에서 배양(incubation)을 하였다. 다음날 바닥에 붙은 세포만 제외하고 나머지는 제거를 하였다. 바닥에 붙은 세포를 트립신을 이용하여 바닥에서 분리를 시킨 후 원심분리를 하여 모은 후, 로우 글루코즈 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 4ng/ml bFGF로 구성된 기본 배지에 재부유시켜 100mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩하였다. 12~24시간 후 새 배지로 바꿔 주었다. 양수 내 태아유래 세포주는 다양한 형태의 모양을 (heterogenous population) (도 1A: a-d) 가지며 2~3번의 계대 배양 후에는 한 가지의 섬유아세포 모양만을 가지게 됨을 확인할 수 있었다 (도 1A:e). 도 1과 같은 형태에서배지는 2~3일에 한 번씩 바꿔주었으며 세포 밀도가 80~90%정도 일 때 계대 배양을 하였다.

실시예 2: 핵형 분석을 통해 양수 내 태아유래 세포라는 것을 확인

양수 내 태아유래 세포인지 알아보기 위해 핵형 검사를 하였다.

핵형분석은 염색체의 수, 크기, 모양 등을 핵형이라고 하며 태아의 염색체를 검사하여 염색체 돌연변이, 성별을 알 수 있다. 핵형분석을 하기 위해서 1~2시간 동안 콜세미드(Colcemid)로 세포 분열을 중기에 중지시키고 지 밴딩 염색법(G-banding staining)으로 관찰하여 염색체를 분석하였다. 이렇게 핵형분석을 통해 알아본 결과, 양수 내 태아유래 세포는 정상염색체를 가지고 있고 성염색체가 XY로 나타나는 것으로 보아 산모가 아닌 태아에게서 유래된 세포임을 확인할 수 있었다 (도 2).

실시예 3: 양수 내 태아유래 세포가 중간엽줄기세포와의 유사성 확인

양수 내 태아유래 세포가 다분화성의 중간엽줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 확인하였다.

먼저, 유세포 분석기를 통해서 면역학적 표현형을 분석한 후 양수 내 태아유래 세포가 사람 골수유래 중간엽줄기세포와 같이 비교하였을 때 CD13, CD29, CD44가 발현 되는 것을 확인하였다(도 3). 그리고 이런 표면의 발현은 중간엽줄기세포에 특이적인 마커이긴 하지만 세포들마다 다른 특성들이 존재할 수도 있기 때문에 중간엽줄기세포의 성격을 나타내는 대표적인 특성인 뼈, 지방, 연골세포로의 분화능을 살펴보았다.

양수 내 태아유래 세포는 인간 골수유래 중간엽줄기세포와 마찬가지로 분화를 시킨 후, 뼈는 골이 형성이 되면서 특이적으로 발현되는 유전자인 오스테오폰틴(osteopontin)과 오스테오칼신(osteocalcin)으로 확인하고, 지방은 지방 형성에 관련된 유전자인 리포프로테인 리파아제(lipoprotein lipase ; LPL), 패틱 액시드 바인딩 프로테인 2(fatty acid binding protein ; aP2)와 페록시좀 프로리퍼레이터 엑티베이티드 리셉터 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ; PPARγ)로 확인하고, 연골은 연골이 형성되면서 대표적인 유전자 타입 2 콜라겐(Type II collagen), 타입 1 콜라겐(Type I collagen)과 어그리칸(aggrecan)으로 분화가 되었다는 것을 역전사 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 확인하였다. 뼈로 분화를 시키면 칼슘염의 생성되는 것을 확인하기 위해서 알리자린 레드 에스 염색법(Alizarin red S staining)으로, 지방으로 분화를 시키면 지방액포(Lipid droplet)가 생기고 이것을 염색을 하기 위해서 오일 레드 오 염색법(Oil red O staining)과 연골로 분화를 시키면 연골 특이적으로 분비하는 기질을 염색하기 위해서 알시안 블루 염색법(Alcian blue staining)을 이용하여 각 분화별 특이적인 염색법으로 확인하였다(도 4). 따라서 본 발명에서는 양수 내 태아유래 세포는 골수유래 중간엽줄기세포와 유사한 특성을 가지는 세포라는 것이 확인되었다.

실시예 4: 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포에서 조건별 컨디션드 배지 제조

확립된 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포로부터 세포 수별 컨디션드 배지의 생산 조건을 확립하였다.

먼저, 확립된 중간엽줄기세포를 100mm 세포 배양 접시에서 트립신 처리를 하여 바닥에서 분리하였다. 떨어진 세포를 모아서 15ml 튜브에 담고 원심분리를 하였다. 모아진 세포를 5~10ml 배지에 풀어준 다음 잘 섞어 주었다. 튜브 안에 세포부유물 중 20㎕를 혈구계산기(hematocytometer)를 이용하여 세포 수를 측정한 후, 로우 글루코즈 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 4ng/ml bFGF로 구성된 기본 배지에 5x10⁴, 1x10⁵, 2.5x10⁵, 5x10⁵ 개의 세포를 100mm 세포 배양 접시에 시딩하였다. 12시간 후, 컨디션드 배지인 DMEM/F12 serum-free 배지로 바꿔주고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후, 각각의 수별 배양액을 튜브 에 옮겨 담은 후 원심분리를 하고 0.20시린지 필터(syringe filter)를 하여 컨디션드 배지를 생산하였다. DMEM/F12 serum-free 배지에서 3일 동안 배양한 후에 CM을 얻을 때의 세포의 모습을 도 5A에 나타내었는데, cm²당 세포의 count를 4가지로 나눠서 seeding을 하였을 때의 CFU-assay 결과를 확인할 결과(도 5B), 100/cm²에서 가장 높은 수치를 나타내는 것을 알 수 있었으며, 세포의 cm²당 개수에 따라 다른 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 인비트로 ( in vitro ) 상에서 컨디션드 배지 효과 확인

양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 이용하여 세포 수를 세어 5x10⁴, 1x10⁵, 2.5x10⁵, 5x10⁵ 개로 각각의 DMEM/F12 serum-free 배지로 바꿔 주어 3일 동안 배양하여 컨디션드 배지를 만들어 섬유아세포의 성장에 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 하였다. 3일 동안 CM에서 배양하였을 때의 세포의 모습과 이 때의 세포의 성장 정도를 비교하였더니 CM(2.5x10⁵)에서 세포의 성장이 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다 (도 6A). 이를 다시 증명하기 위해 CM을 피부 유래 섬유아세포에 처리하여 배양하였을 때의 세포의 성장주기를 PI stain을 통해 확인하였고, 그 결과 이전의 실험결과와 마찬가지로 CM(2.5x10⁵)에서 S phase (증식 기간)에 가장 높은 13.83%로 확인이 되었다 (도 6B). 세포의 성장주기 중에 S phase와 관련된 유전자 들의 발현을 Real-time PCR로 확인한 결과 CM을 처리한 그룹의 세포들의 유전자 발현이 증가하는 양상을 보임을 확인할 수 있었고, 특별히 CM(2.5x10⁵)에서 발현이 높게 나타나는 것으로 보아, 25만개의 양수세포에서 유래한 CM이 세포의 성장을 높게 증가시키는 것으로 확인할 수 있었다 (도 6C). 이러한 실험 결과를 바탕으로 세포의 증식에 관련된 단백질들의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써 최적의 배양조건을 확립할 수 있었다.

실시예 6: 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포에서 조건별 컨디션드 배지 성분 확인

양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 이용하여 얻은 컨디션드 배지의 성분을 분석하기 위하여 antibody arrary을 이용하여 어떠한 단백질들이 발현되는지를 보고 그 양의 변화를 측정하였다. 컨디션드 배지가 아닌 DMEM/F12 serum-free 배지에서는 성장인자 및 단백질의 발현이 되지 않았으며 (도 7A), DMEM/F12 serum-free의 컨디션드 배지의 성분을 분석한 결과 세포 성장인자 및 증식에 관여하는 단백질중 총 36개에서 TGFβ, VEGF, EGF, TNFα, IL8, IL6, MMP3 등 27개로 많은 성장요소 인자들이 함유되어 있는 것을 확인 하였다 (도 7B).

실시예 7: 피부 섬유아세포에서 컨디션드 배지의 wound healing 효과

양수에서 유래한 줄기세포로부터 생산한 컨디션드 배지를 가지고, wound healing 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해, 피부에서 유래한 섬유아세포에 인위적인 Wound를 가한 후 컨디션드 배지를 처리한 결과 12시간이 되었을 때 컨디션드 배지를 처리한 세포에서 migration되는 정도가 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있고, CM(2.5x10⁵)에서 그 경향이 더 두드러지게 나타나는 것을 알 수 있었다. 이때의 Migration rate를 상대적으로 비교한 결과 컨디션드 배지(2.5x10⁵)에서 가장 높은 수치를 보이고 있는 것을 확인할 수 있어, 양수 유래의 줄기세포에서 얻은 컨디션드 배지의 wound healing 효과가 탁월하게 나타나는 것을 증명할 수 있었다 (도 8). Migration rate을 측정했던 시기에 wound healing에 관련된 유전자들의 발현을 Real-time PCR로 확인한 결과 컨디션드 배지가 아닌 DMEM/F12 serum-free와 비교하여 컨디션드 배지(2.5x10⁵)에서 정량적으로 가장 높게 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 25만개의 양수세포에서 유래한 컨디션드 배지에서 wound healing의 효과가 가장 높음을 증명할 수 있었다 (도 8B).

실시예 8: 마우스 in vivo 에서 컨디션드 배지의 피부재생 효과

양수 내 태아유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지를 피부에 상처를 준 마우스에서 피부 재생능력에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 마우스 피부에 punching을 29-30 mm² 주어 인위적인 상처부위를 낸 후 일반 DMEM/F12 serum-free 배지와 컨디션드 DMEM/F12 serum-free 배지를 상처부위에 발라 주어 그 상처부위의 wound closure를 측정하였다. 일반 DMEM/F12 serum-free 배지는 상처부위가 8일까지 피부재생이 되지 않았으나 컨디션드 DMEM/F12 serum-free 배지에서는 일반 배지 보다 상처부위가 점점 줄어드는 것을 확인하였다 (도 9A). 피부 재생의 효과를 나타내기 위해 wound closure 측정값을 도표화 하였다 (도 9B).

실시예 9: 임상실험을 통해 컨디션드 배지 효과 확인

양수 내 태아유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지를 임상 실험에 사용 하여 피부 재생능력에 영향을 미치는지 알아보았다. 주 1회씩 컨디션드 배지를 마이크로테라피 후 마이크로바늘로 자극을 주었다. 8주 정도 후 관찰한 결과, 피부의 탄력도 증가되고 톤이 밝아지며, 잔주름이 줄어들고, 모공이 축소되는 것을 볼 수 있었다 (도 10A). 같은 방법을 통하여 6~7주 정도 후 관찰한 결과 여드름 흉터의 붉은기가 호전되며 상처 재생이 빠른것을 눈으로 직접 확인할 수 있었다 (도 10B).

도 1은 양수 내 태아 유래 세포주는 다양한 모양의 (heterogenous population: 왼쪽)형태를 나타내며 2~3번의 계대배양(sub-culture)을 통하여 동일한 모양(homogenous enrichment: 오른쪽: 4 passage)의 중간엽줄기세포로 바뀌는 것을 나타낸 것이다.

도 2는 산모에서의 분리한 양수내 태아유래 세포의 핵형분석(karyotype)한 결과이다. 성염색체가 XY로 나왔으며 이것은 산모가 아닌 양수 내 태아에게서 유래된 것임을 보여주는 결과이다.

도 3은 세포의 면역학적 표현형을 유세포 분석기를 통해 양수 내 태아유래 세포(B)가 인간 골수유래 중간엽줄기세포(A)와 비슷한 특징을 가지고 있음을 분석한 결과를 보여주는 것이다.

도 4는 양수 내 태아유래 세포가 다분화능을 가진 골수유래 중간엽줄기세포와 비슷한 분화능을 가지고 있음을, 지방(A), 뼈(B), 연골(C)로의 분화를 통해서 확인한 결과를 보여주는 것이다.

도 5는 확립된 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 생산을 하기 위해 DMEM/F12-serum free 배지를 사용하였고(A), 각각, 세포 모습을 5x10⁴ (a), 1x10⁵ (b), 2.5x10⁵ (c)와 5x10⁵ (d) 개의 세포 수에 따라 현미경으로 관찰한 모습을 나타낸 것이다. (B)는 cm²당 각각의 세포를 seeding을 하였을 때의 CFU-assay 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 확립된 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포에서 얻은 조건별 컨디션드 배지에 존재하는 다량의 성장인자들이 섬유아세포의 성장에 미치는 효과를 보여주는 것이다.

도 7은 확립된 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포로부터 컨디션드 배지의 생산을 통해 단백질 성분 분석을 antibody arrary을 통해 다량의 성장인자가 생산되고 있는 것을 보여주는 것이다. (A) DMEM/F12-serum free 배지 (B) DMEM/F12-serum free 컨디션드 배지.

도 8은 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포에서 얻은 컨디션드 배지를 이용하여 피부 섬유아세포에서 wound healing의 효과가 있음을 보여주는 것이다.

도 9는 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포에서 얻은 컨디션드 배지를 이용하여 마우스 피부에 상처를 준 후 in vivo 실험을 한 결과 재생능력에 효과가 있음을 보여주는 것이다.

도 10은 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포에서 얻은 컨디션드 배지를 이용하여 임상실험을 한 결과 재생능력에 효과가 있음을 보여주는 것이다.

Claims (8)

1. 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상 또는 피부 탄력인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타냄을 특징으로 하는 조성물. :

   (a) CD13, CD29 및 CD44 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타냄;

   (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; 및

   (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.
3. 제1항에 있어서, 상기 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액은 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포부착인자- 1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15 를 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양액을 수거하는 단계를 포함하는, 제1항의 조성물을 제조하는 방법.
8. (a) 산모로부터 얻은 양수 내에서 태아 유래 세포를 분리하는 단계;

   (b) FBS 및 bFGF 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계;

   (c) 상기 수득한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및

   (d) 상기 컨디션드 배지 배양액을 수거하는 단계를 포함하는, 제1항의 조성물을 제조하는 방법.

Images