KR20100103539A

KR20100103539A - 당뇨병성 신장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20100103539A
Application number: KR1020107014291A
Authority: KR
Inventors: 콴 주; 싱후아 시; 단 탕; 자오구앙 젱; 바오 헤; 팅팅 두안; 페이 구; 후이콴 쳉; 시아오링 후앙; 얀시아 후앙; 루샹 왕
Original assignee: 광저우 콘썬 메디신 알앤디 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-04-01
Publication date: 2010-09-27
Also published as: EP2380570A4; JP5383709B2; KR101214751B1; CN101780069B; CN101780069A; EP2380570B1; WO2010081264A1; JP2011527284A; EP2380570A1; HK1145454A1; US20110053872A1

Abstract

본 발명은 당뇨 합병증, 주로 당뇨병성 신장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 본 약학 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1~99.5 중량%의 칼리코신 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드 중 하나 또는 둘 모두, 및 통상적인 약물 담체를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 품질 관리와 투여의 편의성을 가지고서, 당뇨병성 신장질환을 현저히 예방하고 치료할 수 있어, 당뇨병성 신장질환을 가진 환자를 위한 새로운 약물 후보를 제공한다.

Description

당뇨병성 신장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 그의 제조방법 {Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic nephropathy and the preparation method thereof}

본 발명은 중의약 분야에 관한 것이며, 구체적으로는 당뇨병성 신장질환(DN)의 예방과 치료를 위한 약물의 제조에서, 칼리코신(calycosin: CAL) 및/또는 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드(calycosin-7-O-β-D-glucoside: CAG)의 용도에 관한 것이다.

신장 사구체에서 모세혈관의 혈관병증에 의해 야기되는 진행성 신장 질환인 DN은 당뇨병의 가장 심각한 합병증 중 하나이다. DN은 초기의 혈관사이 세포(mesangial cell) 증식 및 이어지는 세포외 기질 단백질의 축적 및 이로 인한 신장 사구체의 고도의 여과 및 단백뇨를 특징으로 한다. 그 주요 임상적 증상은 단백뇨, 진행성 신장 병변, 고혈압 및 부종이며, 이는 사망의 주요 원인 중 하나인 말기 신부전을 유발할 수 있다. 통계 자료에 따르면, 약 30-40%의 당뇨병 환자가 신장 병변을 가진다. 미국과 유럽에서는 각각 말기 신장 질환의 1차 및 2차 원인이 되었다. 현재, 말기 신장 질환을 가진 중국인들의 15%가 당뇨병환자이다. 그러나, 당뇨병 발생이 계속 증가하고 인구의 노화가 계속되면서, 이 수치는 계속 증가할 것이다.

현재도 여전히, DN에 대한 효과적인 치료 효과를 가진 약물이 거의 없는 한편, 인슐린 및 캡토프릴(captopril)과 같은 혈당저하 제제(안지오텐신 전환 효소 억제제, ACEI) 및 항고혈압 제제가 임상 시험에서 널리 이용된다. 그러나, 이들 약물을 장기 사용하면 많은 심각한 부작용, 즉, 고칼륨혈증, 또는 심지어 기능성 또는 기관성 신장 동맥 협착으로 인한 급성 신부전을 일으킬 수 있다. 따라서, DN의 안전하고 효과적인 예방 및 치료를 위한 새로운 약물의 개발이 매우 중요하다.

DN은 또한 당뇨병성 사구체경화증으로 알려져 있다. 신장 사구체에서, 혈관사이 세포는 중앙 위치를 차지하며, 전체 신장 사구체 세포 집단의 약 30-40%를 구성한다. 사구체 혈관사이 세포는 많은 다양한 생리학적 기능, 즉, 구조적 지지 및 혈관사이 세포외 기질(ECM)의 분비, 사이토카인에 대한 반응 및 사이토카인의 분비, 거대분자 및 면역 복합체의 식균작용을 할 수 있다. 혈관사이 세포 증식, ECM의 확장 및 침착이 DN에서 핵심적인 병리학적 특징이다.

황기(Radix Astragali)는 중의약으로 널리 사용된다. 황기의 주요 적응증은 울혈(blood stasis)의 분산 및 통증 완화, 혈액 순환 촉진 및 채널 개방, 열의 제거 및 짜증의 완화, 등이다. 최근에는, 더 많은 실험과 임상 시험들이 황기의 추출물이 DN의 진행에 유익한 효과를 가질 수 있음을 입증하였다. 이러한 발견은 또한 황기가 중의약에서 당뇨병의 치료를 위해 널리 사용되어 왔다는 사실과 일치한다. 현재, 대부분의 연구가 약초 조 추출물(herb crude extracts)에 초점을 맞추고 있지만, 어느 생물활성 성분이 효과를 나타내는지는 여전히 불분명하다. 따라서, DN을 예방하고 치료하기 위한, 명확한 구조가 특정되고 품질 관리의 편의성을 가진, 현대 중의약 제제를 개발하기 위하여 황기에 대한 추가 연구를 수행하는 것이 중요하다.

황기에 대한 종래의 화학적 연구는 이소플라보노이드가 주요 화학 성분 중 하나이며 이것이 자유 라디칼 스캐빈저, 면역, 항바이러스 및 항종양 활성의 조절을 비롯한 다양한 생물학적 효과를 가짐을 보여주었다. 칼리코신(CAL) 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드(CAG)는 황기의 두 가지 주요 이소플라보노이드이다. 중국 특허 CN01126608.2호는 CAL 및 CAG가 항심근허혈 활성을 나타냄을 보고하였다. 중국 특허 CN200510110641.3호는 CAG가 콕사키 바이러스를 억제하고 바이러스성 심근염을 치료할 수 있음을 보고하였다. 또한, 황기는 항산화제 (Biomed Environ Sci, 2005, 18(5): 297-301), 혈관 내피 세포에 대한 보호 효과 (Chin J Pharm, 2008, 43(8): 594-597; Pharmacol Clin Chin Mater Med, 2000, 16(4): 16-18), 및 칼슘 채널 차단 활성 (Acta Pharmacol Sin, 2006, 27(8): 1007-1012), 적혈구 변형성 변경 (Nat Prod Res Develop, 1999, 6(2): 1-5), 및 골관절염의 완화 (Osteoarthritis Cartilage, 2007, 15(9): 1086-1092)를 비롯한 몇가지 다른 생물학적 효과를 보유하였다.

상기한 바처럼, 황기는 다양한 생물학적 효과를 나타냈으나, DN을 예방하고 치료하기 위한 CAL 및 CAG의 효과에 대해서는 어떤 정보도 구할 수 없다.

본 발명의 목적은 DN의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이며, 약학 조성물의 활성 성분은 CAL 및/또는 CAG이다.

상기 목적을 이루기 위하여, 기술적 해결수단은 하기와 같다.

DN의 예방 및 치료용 약학 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1~99.5 중량%의, CAL 및 CAG 중 하나 또는 둘 모두, 및 통상적인 약물 담체를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 화합물의 양은 조성물의 총 중량을 기준으로 5 내지 90 중량%로 존재해야 한다.

바람직하게는, DN의 예방 및 치료용 약학 조성물은 CAL 및 CAG 둘 모두, 및 통상적인 약물 담체로 구성되며, CAL과 CAG의 함량비는 1:5-5:1이다.

약물 담체는 약학 분야에서 통상적이며, 예를 들어, 물과 같은 희석제 또는 부형제; 전분, 수크로스와 같은 충전제; 셀룰로오스 유도체, 알긴산, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 접착제; 글리세롤과 같은 습윤제; 한천, 탄산칼슘 및 중탄산나트륨과 같은 붕해제; 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 향상제; 팔미틸 알코올과 같은 계면활성제; 카올린 및 비누 점토와 같은 흡착 담체; 탈크, 스테아르산칼슘 및 스테아르산마그네슘, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제 등이다. 또한, 풍미제 및 감미제와 같은 기타 보조제가 또한 첨가될 수 있다.

약학 조성물은 통상적인 방법에 의해 통상적인 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적인 제형은 주로 경구 제제, 예를 들어, 정제, 과립, 알약, 분말, 과립 또는 캡슐과 같은 고형 제형, 및 물 또는 오일 현탁액 또는 엘릭시르와 같은 액상 제형 등이다.

본 화합물 또는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 심각성, 약물 형태, 투여 경로와 기간에 따라 변하며, 당업자가 선택할 수 있다. 그러나, 쥐에 대한 본 화합물의 유효량이 2-10 mg/kg 중량/횟수이므로, 일반적으로 신체 표면적의 비에 따라 본 화합물의 20-100 mg/60 kg 중량/횟수 범위의 양으로 투여하는 것이 권장된다.

본 발명의 다른 목적은 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이며, 이 목적을 위한 기술적 해결수단은 하기와 같다.

약학 조성물의 제조방법은 CAL과 CAG 중 하나 또는 둘 모두와 통상적인 약물 담체를 혼합하는 것이다.

CAL 및 CAG는 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 제조할 수 있다:

A. 분쇄된 황기를 환류하에서 80% 에탄올로 추출하고 여과한 다음, 알코올 추출물을 모은 후 진공에서 농축시킨다. 이어서 농축물을 밤새 4 ℃에서 냉장시킨다.

B. 단계 A에 의해 수득한 상청액을 거대다공성 수지 컬럼에 넣어 물로 용출시키고, 이어서 TLC를 이용하여 CAG가 검출되지 않을때까지 50% 에탄올로 용출시킨다.

C. 50% 에탄올 분획 용매를 농축시키고, 이어서 상당하는 에틸 아세테이트를 이용하여 추출하고, 에틸 아세테이트 추출물을 모은 후 진공에서 농축시킨다.

D. 추출물을 실리카겔에서 크로마토그래피하고, 클로로포름-메탄올의 용매 시스템으로 구배를 이용하여 용출시키고, 동일한 분획을 TLC 분석에 의해 모아 결정화한 후, 흡인 여과에 의해 결정을 수득한다. 마지막으로, CAL 및 CAG를 메탄올에서의 재결정화에 의해 수득한다.

CAL과 CAG는 또한 상기 방법에 따라 다른 중의약으로부터 수득할 수 있다.

본 발명은 또한 I, II, III, IV 형 DN을 비롯한 DN의 예방과 치료용 약물의 제조에서 CAL 및/또는 CAG의 용도를 제공한다.

발명의 효과

본 발명의 약학 조성물은 하기의 유용한 의의를 가진다:

1. 본 발명은 약리학적 실험을 통해 CAL 및/또는 CAG가 DN의 예방과 치료에 있어서 새로운 의학적 용도를 가짐을 발견하였으며, DN 환자를 위한 새로운 약물 후보를 제공하였다.

2. 명확한 구조가 특정되고 품질 관리의 편의성을 가지고서, 본 약학 조성물의 효과는 황기의 수성 추출물보다 우수하였다.

3. 본 약학 조성물은 당뇨병에 의해 유발된 사구체 손상 및 당뇨병 자체의 치료와 예방의 현저한 효과를 나타냈으며, 그 이유는 본 약학 조성물이 혈청 크레아티닌의 증가를 현저히 방지하고, 소변 생성 및 소변 단백질을 유도할 수 있기 때문이다.

4. 본 약학 조성물은 알약, 과립, 정제 등과 같은 다양한 편리한 경구 제형으로 가공될 수 있다.

도 1은 고 포도당에 의해 유도된 ECM 성장에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과를 보여주며(PAS, 200X), 여기서 A: 정상 포도당 군; B: 고 포도당 군(25 mM); C: 황기 군(RA, 50 mg/ml 수성 추출물); D: CAL 군(100 nM); E: CAL 군(10 nM); F: CAL 군(1 nM); G: CAG 군(100 nM); H: CAG 군(10 nM); I: CAG 군(1 nM); J: CAL:CAG 군(10 ㎍/ml:5 ㎍/ml); K: CAL:CAG 군(5 ㎍/ml:10 ㎍/ml)이다.
도 2는 고 포도당에 의해 유도된 TGFβ-1 발현에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과를 보여주며(200X), 여기서 A: 정상 포도당 군; B: 고 포도당 군(25 mM); C: 음성 대조 군; D: CAL 군(100 nM); E: CAL 군(10 nM); F: CAL 군(1 nM); G: CAG 군(100 nM); H: CAG 군(10 nM); I: CAG 군(1 nM); J: 황기 군(RA, 50 mg/ml 수성 추출물); K: CAL:CAG 군(10 ㎍/ml:5 ㎍/ml); L: CAL:CAG 군(5 ㎍/ml:10 ㎍/ml)이다.

실시예

본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명된다. 그러나, 본 발명은 어떤 방식으로도 이들 실시예에 의해 제한되지 않음이 이해되어야 한다.

실시예 1. 황기로부터 CAL 및 CAG 의 제조

몽골 황기(Astragalus membranaceus var. monghulicus)의 건조 뿌리(10 kg)를 환류하에서 80% 에탄올로(80L x 3) 3회 (2h, 1h, 1h) 추출하였다. 알코올 추출물을 모으고 이어서 진공에서 농축시켰다. 농축물을 물에 용해시킨 후 밤새 4 ℃에서 냉장시켰다. 상청액을 D101 거대다공성 수지 컬럼에 넣어 물로 용출시키고, 이어서 TLC를 이용하여 CAG가 검출되지 않을 때까지 50% 에탄올로 용출시켰다. 50% 에탄올 분획 용매를 농축시킨 후, 에틸 아세테이트를 이용하여 7회 추출한 후, 추출물을 농축시키고 실리카겔(200~300 메쉬)에서 크로마토그래피하고, 클로로포름-메탄올 (50:1, 25:1, 12:1, 6:1, 3:1, 1.5:1, 1:1)의 용매 시스템으로 구배를 이용하여 용출시켰다. 동일한 분획을 모아 결정화하였다. 마지막으로, 백색 침상 결정(CAL) 및 분말(CAG)을 메탄올을 이용한 재결정화에 의해 수득하였다. 그들의 구조를 MS 및 NMR에 의해 확인하였으며, 순도는 HPLC 분석에 의해 98%를 초과하였다. 그들의 구조는 하기에 나타내었다:

CAL: 분자량: 284, 분자식: C₁₆H₁₂O₅, 화학명: 3'-하이드록시-4'-메톡시이소플라본

CAG: 분자량: 446, 분자식: C₂₂H₂₂O₁₀, 화학명: 3'-하이드록시-4'-메톡시이소플라본-7-O-β-D-글루코피라노사이드.

이하에서, 제제화 방법 및 부형제의 종류가 개시될 것이지만, 본 발명은 그들로 제한되지 않는다. 대표적인 제조예는 하기와 같았다.

실시예 2. 과립의 제조

CAG 1 mg

전분 500 mg

미세결정 셀룰로오스 500 mg

분말 제제는 상기 성분들을 혼합하고 밀봉 패키지를 충전하여 제조하였다.

실시예 3. 정제의 제조

CAG 20 mg

락토오스 127 mg

옥수수 전분 50 mg

스테아르산마그네슘 3 mg

정제 제제는 상기 성분들을 혼합하고 정제화하여 제조하였다.

실시예 4. 캡슐의 제조

CAL 30 mg

CAG 70 mg

락토오스 40 mg

덱스트린 15 mg

전분 45 mg

3% HPMC 적절양

캡슐 제제는 상기 성분들을 혼합하고 통상적인 젤라틴 제조방법에 의해 젤라틴 캡슐을 충전함으로써 제조하였다.

실시예 5. 과립의 제조

CAG 50 mg

전분 400 mg

미세결정 셀룰로오스 550 mg

실시예 6. 캡슐의 제조

CAL 120 mg

CAG 60 mg

덱스트린 10 mg

전분 10 mg

실시예 7. 정제의 제조

CAL 200 mg

HPMC 2 mg

실시예 8. 정제의 제조

CAG 200 mg

HPMC 2 mg

실시예 9. 캡슐의 제조

CAL 80 mg

CAG 20 mg

락토오스 40 mg

덱스트린 15 mg

전분 45 mg

3% HPMC 적절양

본 발명에서는, CAL 및/또는 CAG를 실험에 사용하여 DN의 예방 및 치료 효과를 확인하였으며, 이것을 황기의 수성 추출물과 비교하였다.

실험예 1. 고 포도당 또는 AGEs -유도된 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 CAL 및/또는 CAG 의 효과

혈관사이 세포는 신장 사구체에서 가장 활성인 세포인 한편, 혈관사이 세포의 병리학적 변화는 DN의 발달에서 중심 위치를 차지하며, 또한 DN의 표적 세포이다. 따라서, 고 포도당 또는 AGEs-유도된 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과를 인비트로에서 조사하였다.

1. 재료 및 시약

쥐 혈관사이 세포주 HBZY21(Wuhan Institute of Cell Biology), 새로 태어난 소 혈청(Hangzhou Sijiqin Serum Factory), MTT(Amresco), 다이메틸설폭사이드(Shanghai Jiuqi Chemical Reagent Co. Ltd.), CO₂인큐베이터(NAPC05410，PERCISION SCIENTIFIC), XSZ-D2 역상 현미경(Chongqing Optical Instrument Factory), 수퍼클린 벤치(superclean bench) (Suzhou Baishen network system Co. Ltd.), 마이크로플레이트 분광광도계(SPECTRA max190，AD Co. Ltd. USA), 임상용 원심분리기(LDZ5-2, Beijing Clinical Centrifuge Factory).

2. 방법

2.1 실험 모델

지수 성장기의 혈관사이 세포를 5% CO₂-95% 공기에서 37 ℃에서 DMEM(5 mM 포도당)에서 50000 cm^-2의 밀도로 96-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 태아 소 혈청없이 보충된 DMEM에서 24시간 동안 사전 항온처리한 후, 세포를 다양한 농도의 포도당 또는 AGEs로 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 동안 각각 처리하였다. 혈관사이 세포 증식은 MTT에 의해 측정하였으며 결과는 0.25 mg/ml AGEs 또는 25 mM 포도당에 의해 24시간 동안 처리된 혈관사이 세포가 최상의 실험 모델 조건임을 보여주었다.

2.2 고 포도당에 의해 유도된 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 효과

상기 방법에 따라, 태아 소 혈청없이 보충된 DMEM에서 24시간 동안 사전 항온처리한 후, 세포를 25 mM 포도당으로 사전처리하고, 이어서 나타낸 다양한 농도의 시약으로 처리하였다: 정상 포도당 군 (NG, 5.5 mM 포도당); 고 포도당 군(HG, 25 mM 포도당); CAL 군(CAL, 10, 100 nM); CAG 군(CAG, 10, 100 nM); CAL + CAG 군(CAL:CAG, 10 ㎍/ml:5 ㎍/ml, 5 ㎍/ml:10 ㎍/ml); 황기 군(RA, 50 mg/ml 수성 추출물). 이어서 플레이트를 24시간 동안 항온처리하였다. MTT 환원 분석에 의해 증식을 검사하였다. 실험 조건을 6벌로 시험하였다(실험 조건 당 96-웰 플레이트의 6웰).

2.3 AGEs에 의해 유도된 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 효과

세포를 0.25 mg/ml AGEs로 사전처리한 후, 나타낸 다양한 농도의 시약으로 처리하였다: 정상 포도당 군 (NG, 5.5 mM 포도당); AGEs 군(AGEs, 0.25 mg/ml AGEs); CAL 군(CAL, 10, 100 nM); CAG 군(CAG, 10, 100 nM); CAL + CAG 군(CAL:CAG, 10 ㎍/ml:5 ㎍/ml, 5 ㎍/ml:10 ㎍/ml); 황기 군(RA, 50 mg/ml 수성 추출물). 이어서 플레이트를 24시간 동안 항온처리하였다. MTT 환원 분석에 의해 증식을 검사하였다. 실험 조건을 6벌로 시험하였다(실험 조건 당 96-웰 플레이트의 6웰).

3. 결과

3.1 고 포도당-유도된 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

표 1에 나타난 바처럼, NG 군에 비교할 때, 25 mM 포도당(HG) 단독은 24시간 동안 처리 후 쥐 혈관사이 세포 증식을 증가시켰다(p<0.05). 그러나, CAL 및/또는 CAG, 황기의 첨가는 10 내지 100 nM 범위의 농도에서 투여량-의존 방식으로 고 포도당-유도 쥐 혈관사이 세포 증식을 억제하였다. 또한, 100 nM CAL, 100 nM CAG, 및 CAL + CAG 군(CAL:CAG, 5 ㎍/ml:10 ㎍/ml)의 효과는 모두 황기 군보다 우수하였다. CAL + CAG 군(CAL:CAG, 5 ㎍/ml:10 ㎍/ml)의 효과는 CAL 및 CAG 군보다 우수하였다. 이들 결과는 CAL 및/또는 CAG가 초기 DN에 유익한 효과를 가질 수 있음을 나타냈다.

고 포도당-유도 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과
군	투여량	OD 값 (λ=490nm)
정상 포도당 군	--	0.35±0.04^*
고 포도당 군	--	0.43±0.06
황기 군	50mg/ml	0.38±0.02^*
CAL 군	10nM	0.34±0.02^*
CAL 군	100nM	0.33±0.05^*#
CAG 군	10nM	0.35±0.04^*
CAG 군	100nM	0.33±0.03^*#
CAL:CAG 군 (2:1)	10 ㎍/ml:5 ㎍/ml	0.35±0.05^*
CAL:CAG 군 (1:2)	5 ㎍/ml:10 ㎍/ml	0.33±0.04^*#

vs 고 포도당 군 ^* p<0.05; vs 황기 군 ^# p<0.05

3.2 AGEs-유도된 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

표 2에 나타난 바처럼, NG 군에 비교할 때, 0.25 mg/ml AGEs 단독은 24시간 동안 처리 후 쥐 혈관사이 세포 증식을 증가시켰다(p<0.05). 그러나, CAL 및/또는 CAG, 및 황기의 첨가는 각각, AGEs-유도 쥐 혈관사이 세포 증식을 억제하였다. 또한, CAL 및/또는 CAG의 효과는 모두 황기 군보다 우수하였다. CAL + CAG 군의 효과는 CAL 군보다 우수하였다. 이들 결과는 CAL 및/또는 CAG가 초기 DN에 유익한 효과를 가질 수 있음을 나타냈다.

AGEs-유도 쥐 혈관사이 세포 증식에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과
군	투여량	OD 값 (λ=490nm)
정상 포도당 군	--	0.35±0.04^*
AGEs 군	--	0.42±0.05
황기 군	50mg/ml	0.35±0.05^*
CAL 군	10nM	0.42±0.04
CAL 군	100nM	0.34±0.04^*
CAG 군	10nM	0.34±0.06^*
CAG 군	100nM	0.33±0.04^*
CAL:CAG 군 (2:1)	10 ㎍/ml:5 ㎍/ml	0.36±0.05^*
CAL:CAG 군 (1:2)	5 ㎍/ml:10 ㎍/ml	0.33±0.03^*

vs AGEs 군^* p<0.05

실험예 2. 고 포도당 유도 쥐 ECM 확장에 대한 CAL 및/또는 CAG 의 효과

혈관사이 세포외 기질(ECM)의 확장 및 침착은 DN에서 주요 병리학적 특징이며, 이것은 DN을 비롯한 만성 신장 질환의 치료를 위한 중요한 표적이다.

1. 재료 및 시약

TGFβ-1 항체(Canta Cruz); 이-항체(Di-antibody) (Shenzhen Jingmei Bio-engineering Co., Ltd.); SABC 면역조직화학 염색 키트(Wuhan Boster Co.); DAB 염색 시스템(Gene Tech Biotechnology Co., Ltd.); 면역조직화학 박스(Immunohistochemical Box) (Fuzhou Maixin Biological Technology Development Co.).

2. 방법

처리는 실험예 1의 2.1 섹션과 동일하였다. 기질 증식의 측정은 하이드록시프롤린의 함량 및 TGFβ-1의 발현을 결정하여 측정하였다.

세포를 점착시키기 위하여 커버슬립을 24-웰 플레이트에 사전에 두었다. 세포를 실험예 1에 나타낸 다양한 농도의 시약으로 처리하였다. 세포를 커버슬립으로 덮은 후, 상청액을 이용하여 하이드록시프롤린을 결정하고 세포의 슬라이드를 면역조직화학 및 PAS 염색으로 처리하여 염색하였다. TGFβ-1 항체없이 배양한 세포를 음성 대조군으로 취하였다.

3. 결과

3.1 고 포도당에 의해 유도된 쥐 혈관사이 세포의 세포 배양 유체에서 하이드록시프롤린의 함량에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

표 3에 나타난 바처럼, NG 군과 비교할 때, 25 mM 포도당(HG)은 쥐 혈관사이 세포의 세포 배양 유체에서 하이드록시프롤린의 함량을 증가시킬 수 있었다(p<0.05). 그러나, CAL 및/또는 CAG, 및 황기의 첨가는 각각 하이드록시프롤린의 함량 증가를 억제하였다. 또한, 100 nM CAL 및 100 nM CAG의 효과는 모두 황기 군보다 우수하였다. CAL + CAG 군(CAL:CAG, 5 ㎍/ml:10 ㎍/ml)의 효과는 다른 CAL + CAG 군(CAL:CAG, 10 ㎍/ml:5 ㎍/ml)보다 우수하였다.

고 포도당에 의해 유도된 쥐 혈관사이 세포의 세포 배양 유체에서 하이드록시프롤린의 함량에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과
군	투여량	함량 (㎍/ml)
정상 포도당 군	--	4.18±0.37^***
고 포도당 군	--	10.06±1.20
황기 군	50mg/ml	7.58±1.95^*
CAL 군	10nM	7.15±1.19^*
CAL 군	100nM	6.65±1.74^**#
CAG 군	10nM	6.25±1.20^**#
CAG 군	100nM	6.00±1.53^**##
CAL:CAG 군 (2:1)	10 ㎍/ml:5 ㎍/ml	7.05±1.04^*
CAL:CAG 군 (1:2)	5 ㎍/ml:10 ㎍/ml	6.10±1.13^*##

vs 고 포도당 군 ^* p<0.05, ^**p<0.01; vs 황기 군 ^# p<0.05, ^## p<0.01

3.2 고 포도당에 의해 유도된 ECM 성장에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

도 1 및 2에 나타난 바처럼, CAL 및/또는 CAG, 및 황기의 첨가는 고 포도당에 의해 유도된 ECM 성장 및 TGFβ-1의 발현을 억제하였다. CAL 또는 CAG (10, 100 nM)의 효과는 황기 군보다 우수하였으며, CAL과 CAG를 배합하여 사용하면 단독으로 사용하는 것보다 우수하였다.

실험예 1과 2의 결과로부터, CAL 및/또는 CAG는 쥐 혈관사이 세포 증식, ECM 성장 및 TGFβ-1 발현을 억제할 수 있었다. 이들 결과는 CAL 및/또는 CAG의 DN에 대한 치료 효과를 지지하였다.

실험예 3. 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨병성 신장질환 모델 쥐에 대한 CAL 및/또는 CAG 의 효과

1. 재료 및 시약

스트렙토조토신에 의해 유도된 DN 모델 위스타(Wistar) 쥐는 서던 메디칼 유니버시티(Southern Medical University)의 동물 시험 센터에 의해 공급되었으며, 바이오베이스-펄(BIOBASE-PEARL) 구별 자동 생화학 분석기(Shandong BIOBASE Co.)를 이용하였다.

2. 방법

DN 모델 위스타 쥐를 나타낸 대로 11 군으로 임의로 나누었으며 각 군에는 10마리의 쥐가 할당되었다: 정상 포도당 군; 모델 군; CAL 군 (6, 2, 0.7 mg/kg); CAG 군 (9, 3, 1 mg/kg); CAL+CAG 군 (CAL:CAG, 2 mg/kg:1 mg/kg, 1 mg/kg:2 mg/kg); 황기 군 (5 g/kg); 아미노구아니딘 군 (100 mg/kg).

약물 또는 염화나트륨을 14주 동안 매일 한번씩 위내 투여하였다. 투여 후, 대사 케이지(metabolic cage)에 의해 전체 부피 소변을 수집하였다. 소변 생성, 전체 단백질, 마이크로알부민 및 크레아티닌의 함량을 결정하였으며, 자동 생화학 분석기를 이용하여 혈액 내의 생화학 지표자를 결정하였다. 이어서 포르말린 고정한 신장을 조직병리학적 검사를 위해 보관하였다.

3. 결과

3.1 STZ DN 모델 쥐에서 소변 생성, 전체 단백질, 마이크로알부민 및 크레아티닌에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

표 4에 나타난 바처럼, 중간 또는 높은 투여량으로 CAL 및/또는 CAG를 위내 투여하면 소변 생성, 전체 단백질, 마이크로알부민 및 크레아티닌의 함량을 감소시킬 수 있었으며, CAL 또는 CAG의 효과는 황기 군보다 우수하였으며, CAL과 CAG를 배합하여 사용하면 단독으로 사용하는 것과 동일하거나 더 우수하였다.

STZ DN 모델 쥐에서 소변 생성, 전체 단백질, 마이크로알부민 및 크레아티닌에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과
군	투여량(mg/kg)	소변 생성 (ml)	소변 단백질 (mg)	마이크로알부민 (mg)	소변 크레아티닌 (mM)
대조 군	--	9.2±1.5^**	18.5±7.7^**	0.29±0.07^**	12.4±2.2^**
모델 군	--	65.6±25.3	79.4±29.2	1.63±0.85	1.0±0.3
아미노구아니딘 군	100	36.2±21.8^*	43.2±29.9^*	1.00±0.27^*	4.0±2.3^**
황기 군	5000	45.3±20.4^*	54.1±24.5^*	1.05±0.52^*	2.1±1.0^*
CAL 군	0.7	59.9±21.8	69.1±20.4	1.57±0.56	1.4±0.6
	2	41.3±16.8^*	54.0±17.4^*	0.93±0.55^*	2.9±1.2^**
	6	35.9±22.2^*	46.2±21.3^*#	0.92±0.42^*	4.3±2.0^**##
CAG 군	1	58.9±20.5	67.1±18.4	1.52±0.56	1.3±0.6
	3	42.3±12.8^*	55.0±13.4^*	0.90±0.45^*	2.7±1.1^**
	9	33.9±20.2^*#	44.2±20.6^*#	0.93±0.22^*	4.2±1.6^**#
CAL:CAG 군 (2:1)	3	35.3±13.0^*#	50.9±23.7^*	0.89±0.35^*	2.7±0.6^**
CAL:CAG 군 (1:2)	3	30.7±24.7^*#	43.5±15.8^*#	0.88±0.26^*	2.8±0.7^**

vs 모델 군 ^* p<0.05, ^** p<0.01; vs 황기 군: ^# p<0.05, ^## p<0.01

3.2 STZ DN 모델 쥐에서 혈청 생화학 지표자에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

표 5에 나타난 바처럼, 황기, CAL 및/또는 CAG의 위내 투여는 혈청 내의 트라이글리세라이드, MDA, Scr, BUN, AGEs 및 LDL의 함량을 감소시킬 수 있었으며, SOD 활성을 현저히 증가시켰다. CAL 또는 CAG의 효과는 항기 군보다 우수하였으며, CAL과 CAG를 배합하여 이용하면 단독으로 사용하는 것보다 더 우수하였다.

STZ DN 모델 쥐에서 혈청 생화학 지표자에 대한 CAL 및/또는 CAG 의 효과
군	투여량 mg/kg	트라이글리세라이드 mmol/L	SOD U/ml	MDA nmol/mL	Scr umol/L	BUN mmol/L	AGEs	LDL mmol/L
대조 군	--	1.89±0.22^**	525±26^**	4.4±0.7^**	71.7±19.2^**	6.5±0.7^**	264±53^**	0.78±0.30^**
모델 군	--	3.36±0.72	481±25	9.3±2.6	96.3±13.4	7.9±1.3	351±59	2.12±0.67
아미노구아니딘 군	100	3.35±0.87	516±20^**	5.9±1.7^**	77.7±20.3^*	6.6±0.8^*	283±78^*	2.01±0.58
CAL 군	0.7	3.23±0.76	498±33	7.8±2.3	91.0±31.1	7.0±1.0	290±59	1.91±0.55
	2	2.76±0.80^*	513±41^*	6.8±1.9^*	76.6±24.5^*	6.6±1.2^*	289±56^*	1.51±0.53^*
	6	2.57±0.80^*	520±29^**	6.8±1.3^*	75.2±17.1^**	6.5±1.5^*	281±78^*	1.43±0.36^*
CAG 군	1	3.20±0.71	490±23	7.9±1.6	89.0±21.1	6.9±0.9	288±44	1.94±0.44
	3	2.66±0.72^*	502±31^*	6.5±1.4^*	73.5±22.5^*	6.7±0.8^*	281±46^*	1.60±0.43^*
	9	2.43±0.70^*	512±19^**	6.5±1.2^*	74.2±16.0^**	5.9±1.6^*	275±68^*	1.23±0.26^*
CAL:CAG 군 (2:1)	3	2.81±0.77^*	503±24^*	6.7±1.5^*	76.8±23.4^*	6.9±1.0	278±51^*	1.47±0.45^*
CAL:CAG 군 (1:2)	3	2.64±0.75^*	500±27^*	6.6±1.1^*	73.0±23.9^**	6.2±0.9^*	280±50^*	1.43±0.32^*

vs 모델 군 ^* p<0.05, ^** p<0.01;

SOD: 수퍼옥사이드 디스뮤타아제; MDA: 말론알데히드; Scr: 혈청 크레아티닌; BUN: 혈액 우레아 질소; AGEs: 진행 당화 최종 생성물; LDL: 말단 당화 지질.

3.3 STZ DN 모델 쥐에서 병리조직학적 지표자에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과

표 6에 나타난 바처럼, 황기, CAL 및/또는 CAG의 위내 투여는 ECM 성장 및 TGFβ-1 발현을 현저히 억제할 수 있었으며, 병리학적 손상 점수를 감소시킬 수 있었다. CAL 또는 CAG의 효과는 황기 군보다 우수하였으며, CAL과 CAG를 배합하여 사용하면 단독으로 사용하는 것보다 약간 우수하였다.

STZ DN 모델 쥐에서 병리조직학적 지표자에 대한 CAL 및/또는 CAG의 효과
군	투여량(mg/kg)	TGFβ-1(%)	병리-점수	ECM 점수(PAS%)
대조 군	--	3.4±1.5^**	0.3±0.5^**	22.1±4.4^**
모델 군	--	23.7±5.6	3.4±1.3	36.2±3.6
아미노구아니딘 군	100	11.7±5.7^**	2.1±1. 0^*	26.5±4.3^**
황기 군	5000	16.3±5.4^*	1.9±2.0^*	32.8±4.3
CAL 군	0.7	19.3±6.3^*	2.7±1.0	33.1±5.1
	2	17.6±5.8^*	1.8±1.3^*	29.8±5.6^**
	6	8.8±3.2^**	1.6±1.1^**	27.0±5.5^**
CAG 군	1	20.0±4.3^*	2.8±0.9	32.5±4.1
	3	16.2±4.7^*	1.9±1.1^*	28.9±5.4^**
	9	9.1±2.2^**#	1.7±0.9^**	26.9±4.5^**
CAL:CAG 군 (2:1)	3	17.4±4.0^*	2.0±1.6^*	29.1±5.5^**
CAL:CAG 군 (1:2)	3	12.9±3.6^**#	1.8±0.9^*	27.3±4.7^**

vs 모델 군 ^*p<0.05, ^** p<0.01; vs 황기 군 ^# p<0.05

결국, 모든 상기 실험 결과는 CAL 및/또는 CAG가 DN의 발생과 발달을 예방 및 치료하며, STZ DN 모델 쥐에 대한 보호 효과를 나타낼 수 있음을 보여주었다. 아울러, 그들은 또한 AGEs에 의해 야기된 신장 산화성 스트레스 수준 및 섬유증을 감소시킬 수 있었으며, 그 효과는 황기의 수성 추출물에 비하여 월등하였다.

Claims

활성 성분으로서 칼리코신 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드 중 하나 또는 둘 모두, 및 통상적인 약물 담체를 포함하며, 활성 성분은 0.1-99.5 중량%의 백분율인, 당뇨병성 신장질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 약학 조성물은 활성 성분으로서 칼리코신 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드 둘 모두와, 통상적인 약물 담체를 포함하며, 칼리코신 대 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드의 중량비는 1:5 내지 5:1의 범위인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 통상적인 약물 담체는 희석제, 부형제, 충전제, 접착제, 습윤제, 붕해제, 흡수 향상제, 계면활성제, 흡착 담체, 윤활제, 풍미제 및 감미제 중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 부형제는 물이며; 충전제는 전분, 수크로스 또는 락토오스이며; 접착제는 셀룰로오스 유도체, 알지네이트, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이며; 습윤제는 글리세린이며; 붕해제는 한천, 탄산칼슘 또는 중탄산나트륨이며; 흡수 향상제는 4차 암모늄 화합물이며; 계면활성제는 팔미틸 알코올이며; 흡착 담체는 카올린 점토 또는 비누 점토이며; 윤활제는 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘 또는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제3항에 있어서, 약학 조성물의 제형은 정제, 과립, 알약, 분말, 과립, 캡슐 또는 액상 제제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
칼리코신 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드 중 하나 또는 둘 모두와 통상적인 약물 담체를 혼합하여 약학 조성물을 얻는 단계를 포함하는, 제1항의 약학 조성물의 제조방법.
제5항에 있어서, 칼리코신 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드의 제조는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
A. 분쇄된 황기를 환류하에서 80% 에탄올로 추출하고 여과한 다음, 알코올 추출물을 모은 후 진공에서 농축시키고, 이어서 농축물을 밤새 냉장시키는 단계;
B. 단계 A에 의해 수득한 상청액을 거대다공성 수지 컬럼에 넣어 물로 용출시키고, 이어서 TLC를 이용하여 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드가 검출되지 않을때까지 50% 에탄올로 용출시키는 단계;
C. 50% 에탄올 분획 용매를 농축시키고, 이어서 상당하는 에틸 아세테이트를 이용하여 추출하고, 에틸 아세테이트 추출물을 모은 후 진공에서 농축시키는 단계;
D. 추출물을 실리카겔에서 크로마토그래피하고, 클로로포름-메탄올의 용매 시스템으로 구배를 이용하여 용출시키고, 동일한 분획을 TLC 분석에 의해 모아 결정화한 후, 흡인 여과에 의해 결정을 수득하고, 메탄올에서의 재결정화에 의해 칼리코신 및 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드를 수득하는 단계.
당뇨병성 신장질환의 예방 및 치료용 약물의 제조에서 칼리코신 및/또는 칼리코신-7-O-β-D-글루코시드의 사용방법.