CN111166738B - 毛蕊异黄酮衍生物在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛蕊异黄酮衍生物在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用。申请人通过实验发现，该毛蕊异黄酮衍生物能够有效下调EWSAT1和TRAF6的表达水平，与以往文献研究结果相对比，式(I)所示化合物比毛蕊异黄酮更能抑制内皮细胞增殖，因而更有希望成为雌激素的替代品。本发明所述的毛蕊异黄酮衍生物具有下述式(I)所示结构：

(I)。

Description

毛蕊异黄酮衍生物在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种毛蕊异黄酮衍生物在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

随着社会经济的快速发展，人们的生活水平逐步提高，随之而来的是癌症的发生率逐年升高，已经成为严重影响人类健康的第一杀手。癌细胞具有无限增殖的能力，在其不断地增殖是需要大量的营养物质和氧气的供应，而这些营养物质和氧气的供应则是通过血管的运输而实现的。血管生长是一个称为血管生成的过程，是一个复杂而协调的过程，涉及多个细胞细胞因子和信号通路。多种因素刺激血管内皮细胞的增殖，分化和转移，促进新血管的形成，提供充足的氧气以及肿瘤生长所需的营养素，为肿瘤提供了良好的生长环境，并加速了肿瘤的生长和扩散。因此，抑制血管的形成已成为治疗癌症的关键步骤。所以，临床上希望发现一种能够抑制血管内皮细胞增殖的药物。

基因组学研究表明人类绝大多数基因被转录成非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。ncRNAs包括以miRNA为代表的短小RNA和长链非编码RNA。长链非编码RNA(longnon-coding RNAs，lncRNAs)是一类转录本长度在200nt～100kb之间的ncRNAs分子。近年大量研究表明，LncRNAs参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。近年来研究表明EWSAT1在多种癌症中高表达，且参与癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭等。

TRAF6(肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子6)通过其TRAF域和包含非常规E3连接酶活性的RING指域介导了广泛的蛋白质相互作用。哺乳动物中的TRAF6蛋白是高度保守的，由N端Zn RING指结构域，一系列五个Zn指结构域，卷曲螺旋TRAF-N结构域和C端TRAF-C结构域组成。许多研究表明，TRAF6在发育，体内平衡和癌症中很重要。有文献报道，TRAF6是EWSAT1下游的靶点之一，但其在HUVECs(人脐静脉内皮细胞)中是否也存在调节关系目前也尚未有公开报道。

毛蕊异黄酮(calycosin)是从黄芪中提取和分离出来的一种异黄酮类化合物(马晓丰等，蒙古黄芪中黄酮类成分的研究，中草药，第36卷第9期,2005年9月，p1293-1296)，其结构式如下式所示：

已有的研究表明，毛蕊异黄酮具有抗氧化应激、抗病毒和调节细胞凋亡等作用，但其不足之处在于其有效浓度较大，靶点不明确。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的毛蕊异黄酮衍生物在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用。

本发明的技术方案为：下述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用；

本发明技术方案中涉及的式(I)所示化合物的化学名称为：3-(4-甲氧基-3-(乙氧羰基乙氧基)苯基)-7-(乙氧羰基乙氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，分子量为456.4。该式(I)所示化合物可自行设计路线进行合成，具体可按以下合成路线进行合成：

其中，化合物1的化学名称为：7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物为2为氯乙酸乙酯。

具体的合成方法为：

取化合物1置于丙酮溶解,加入缚酸剂和碘化物，搅拌溶解后再加入化合物2，之后加热条件下反应，反应完全后停止加热，冷却，向冷却的反应物中加入冰水，过滤，收集沉淀，将沉淀用入乙酸乙酯溶解并用无水硫酸钠干燥，所得溶液蒸发除去溶剂，残渣用乙醇重结晶，得到淡黄色固体即式(I)所示化合物。其中，化合物1和化合物2的摩尔比为化学计量比，在实际的操作中，化合物2可以稍微过量；所述的缚酸剂为现有技术中的常规选择，优选为三乙胺、吡啶、碳酸钠或碳酸钾等，其用量与化合物1物质的量之比优选为1：1；所述的碘化物为碘化钠和/或碘化钾，其用量优选为化合物1物质的量的0.5-1.5倍。

本发明还提供一种抑制内皮细胞增殖的药物，该药物由治疗上有效剂量的下述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料组成；

本发明所述抑制内皮细胞增殖的药物的剂型可以是药学上可接受的剂型，具体可以是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂或注射剂等常规剂型。

申请人通过实验发现，上述式(I)所示化合物能够有效下调EWSAT1和TRAF6的表达水平，与以往文献研究结果相对比，式(I)所示化合物比毛蕊异黄酮更能抑制内皮细胞增殖，因此，式(I)所示化合物比毛蕊异黄酮更有希望成为雌激素的替代品。

附图说明

图1为用不同浓度的式(I)所示化合物和Calycosin(毛蕊异黄酮)对内皮细胞HUVECs作用48h的量效曲线图，*p＜0.05vs control；其中，(a)为Calycosin，(b)为式(I)所示化合物。

图2为不同浓度的式(I)所示化合物和Calycosin对HUVECs的促凋亡的结果图；其中，(a)为不同浓度的Calycosin对HUVECs的克隆影响的染色照片，(b)为不同浓度的式(I)所示化合物对HUVECs的克隆影响的染色照片，(c)和(d)分别为Calycosin和式(I)所示化合物作用后细胞凋亡染色的结果，凋亡小体越多，说明药物作用的越明显。

图3为不同浓度的式(I)所示化合物和Calycosin对HUVECs的迁移能力的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为不同浓度的Calycosin对HUVECs在不同时间划痕区域变化的显微镜照片，(b)为不同浓度的Calycosin作用HUVECs细胞在12h的迁移能力柱状图，(c)为不同浓度的Calycosin作用HUVECs细胞在24h的迁移能力柱状图；(d)为不同浓度的式(I)所示化合物对HUVECs在不同时间划痕区域变化的显微镜照片，(e)为不同浓度的式(I)所示化合物作用HUVECs细胞在12h的迁移能力柱状图，(f)为不同浓度的式(I)所示化合物作用HUVECs细胞在24h的迁移能力柱状图。

图4为不同浓度的式(I)所示化合物和Calycosin对HUVECs的侵袭能力的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为不同浓度的Calycosin与HUVECs细胞在孵育48h后的染色照片，(b)为不同浓度的式(I)所示化合物与HUVECs细胞在孵育48h后的染色照片，(c)为不同浓度的Calycosin与HUVECs细胞在孵育48h后的侵袭能力柱状图，(d)为不同浓度的式(I)所示化合物与HUVECs细胞在孵育48h后的侵袭能力柱状图。

图5为体外实验不同浓度的式(I)所示化合物对EWSAT1和TRAF6的mRNA的表达水平的影响，*p＜0.05vs control；其中，(a)为不同浓度的的式(I)所示化合物对EWSAT1的mRNA表达水平的柱状图，(b)为不同浓度的式(I)所示化合物对TRAF6的mRNA表达水平的柱状图。

图6为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中TRAF6的蛋白表达水平及TAK1,IκBα及Cjun的磷酸化水平的柱状图，*p＜0.05vs control；其中，(a)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中TRAF6的WB图，(b)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中TRAF6基因表达量的柱状图，(c)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中p-TAK1的WB图；(d)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中p-TAK1基因表达量的柱状图，(e)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中p-Cjun的WB图，(f)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中p-Cjun基因表达量的柱状图；(g)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中p-IκBα的WB图，(h)为不同浓度的式(I)所示化合物影响HUVECs中p-IκBα基因表达量的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：本申请以下各实验例中用到的式(I)所示化合物的合成：

具体按以下合成路线合成得到：

其中，化合物1的化学名称为：7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物为2为氯乙酸乙酯。

具体的合成方法为：

取1g(3.52mmol)化合物1(毛蕊异黄酮)置于50ml圆底烧瓶中用40ml丙酮溶解,然后加入3g无水K₂CO₃和0.5gNaI，常温搅拌1h后再滴加0.91g(7.43mmol)化合物2(氯乙酸乙酯)，之后置于45℃水浴中搅拌回流4h(TCL监测反应，展开剂为氯仿：甲醇＝60：1，体积比)；然后停止加热，继续搅拌直至冷却。向冷却的反应物中加入冰水，过滤，收集沉淀，将沉淀用入乙酸乙酯溶解并用无水硫酸钠干燥，所得溶液蒸发除去溶剂，残渣用10ml乙醇溶解后置于-20℃冰箱中过夜重结晶，得到淡黄色固体1082.00mg，产率70.50％

对本实施例所得淡黄色固体产物用核磁共振进行表征，其氢谱和碳谱如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.44(s,1H),8.05(d,J＝8.9Hz,1H),7.37–7.08(m,5H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),5.00(s,2H),4.78(s,2H),4.19(dq,J＝14.2,7.1Hz,4H),3.82(s,3H),3.34(s,1H),1.22(d,J＝7.2Hz,6H).

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ174.94,169.18,168.54,162.42,157.57,154.31,149.34,147.01,127.54,124.62,123.60,122.83,118.55,115.39,115.01,112.58,102.08,65.98,65.56,61.35,61.06,56.15,40.60,40.39,40.19,39.98,39.77,39.56,39.35,14.51.

因此，可以确定本实施例所得淡黄色固体产物即为式(I)所示化合物，其结构式如下述式(I)所示：

下面结合实验进一步说明式(I)所示化合物在制备抑制内皮细胞增殖的药物中的应用。

以下各实验例中所有数据用mean±SEM表示，统计学比较采用单因素方差分析并用Tukey’s test进行组间比较。

试验药物：按本发明实施例1所述方法制得的式(I)所示化合物(下面以CAG002作为其简称)，溶于DMSO中制成浓度为100mM的储备液，储于4℃备用。

试剂：Kaighn’s modification of Ham’s F12 medium(F-12K)，小牛血清(FBS)，活性炭/葡聚糖处理的小牛血清(CS-FBS)，磷酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素(P/S)和0.25％(W/V)胰蛋白酶/1mM EDTA(Trypsin-EDTA)购于Invitrogen(USA)。内皮细胞生长素(ECGS)，肝素，ERα特异性抑制剂(MPP)，GPR30抑制剂G15均购于Sigma(St Louis，MO)。MTT检测试剂盒由Roche(Mennheim，Germany)提供。TRAF6、TAK1、IκBα及Cjun、及磷酸化TAK1、IκBα及Cjun抗体，辣根过氧化酶(HRP)标记的抗兔和抗鼠IgG二抗均从Cell SignalingTechnology(Beverly，MA)购得。

细胞培养：人脐静脉内皮细胞(HUVECs，ATCC，Manassas)采用F-12K培养，其中含2mM的L-谷氨酸、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml肝素、30μg/mlECGS和10％FBS，于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，乳腺癌细胞MCF-7用1640培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。实验前一天换为含1％CS-FBS无酚红的去激素培养基，实验均在去激素培养基中进行。

实验例1：MTT法检测内皮细胞增殖

取长至90％融合的HUVECs，清洗、消化后制成细胞悬液。计数后，按5x10³/孔接种于96孔板。培养24h待细胞完全贴壁后，移去上层培养液，每孔加入100μl低血清去激素培养液(0.5％CS-FBS)培养24h，以同步细胞状态。实验组设不同浓度的CAG002(0.1μM～32μM)加药组别，每组6个复孔，按200μl/孔加入含药低血清培养液。同时设置对照，空白对照组为0.1％DMSO的培养液，阳性对照为Calycosin。

MTT结果显示，CAG002随着浓度的增加，其对HUVECs的抑制效果逐渐增强，其中药物浓度为32μM时，抑制增殖效果最为明显，与空白对照相比抑制增殖率达70.67％(p<0.05)，如图1所示。而Calycosin 32μM时，抑制增殖率达到30％。相比来说，CAG002的抑制效果更好。

实验例2：平板克隆实验

将HUVEC以低密度接种在6孔板中(500个细胞/孔，一式三份)，并培养两周。然后，将细胞用PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛固定15分钟，并用革兰氏染色溶液染色20分钟。实验结果表明，CAG002随浓度的增加，HUVECs克隆的细胞数明显减少，在16μM时效果最明显。

实验例3：

将细胞接种到6孔板中(12×10⁴细胞/孔)，培养至不同浓度的CAG002(0、4、8和16μM)持续48小时。使用Hoechst 33258染色剂观察接种在6孔板中的凋亡细胞的核形态。将细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，在4℃的4％多聚甲醛中固定20分钟，用PBS洗涤3次，用Hoechst 33258(500μl/孔)(Beyotime生物技术研究所凋亡染色试剂盒)染色5分钟，再次用PBS洗涤3次，盖上防褪色溶液，然后使用上述荧光显微镜观察(放大倍数，×400)。同时以Calycosin为阳性对照，从上述MTT实验结果可知，Calycosin对HUVEC的作用效果是从32μM开始有抑制作用的，所以Calycosin的实验选取的药物浓度组为0，16，32和64μM。结果如图2所示。

从实验结果中可以看出，凋亡细胞的数量随着药物剂量的增加而增多，高剂量的CAG002中的凋亡小体明显要多。

实验例4：划痕实验

在6孔板中培养相同数量的细胞，直到达到95％融合为止。用无菌的10μL移液器吸头刮擦细胞片，形成伤口。通过用PBS洗涤孔来除去漂浮的细胞。然后每孔中加入相应的药物浓度的药物。每天用倒置显微镜(Leica，德国)观察刮擦区域的变化，持续4天。测量伤口宽度以计算细胞迁移能力。同时以Calycosin为阳性对照。结果如图3所示。

划痕实验的结果得出，CAG002可以对HUVECs的迁移能力产生抑制的影响，呈药物剂量依赖式增加。

实验例5：Transwell实验

使用带有8μm聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜的24孔Millicell悬浮细胞培养插入物(Millipore，贝德福德，马萨诸塞州，美国)评估细胞侵袭。随后，将每组的5×10⁴个细胞悬浮在200μl无血清培养基中，并接种到上室中。然后，加入CAG002，并将500μl含10％FBS的完全培养基添加至下腔室。在37℃下孵育48小时后，将非侵入性细胞小心地从过滤器上表面去除。将下腔室(在过滤器表面以下)的侵袭细胞固定在100％甲醇中，用0.1mg/mL结晶紫溶液(Beyotime Biotechnology，上海，中国)染色，并在显微镜下计数。对每个孔计数五个随机视野，并确定平均值。同时以Calycosin为阳性对照。结果如图4所示。

从结果中可以看出，HUVECs的侵袭能力随着药物浓度的增加随之下降，在高浓度下，CAG002明显的抑制了HUVECs的侵袭能力。

实验例6：基因功能分析

提供样本，送至相关单位分析差异表达的lncRNA，然后将结果输入到数据库中进行筛选相关靶基因，然后进行筛选其相关下游靶点及其相关通路。

在试验中发现一些基因在HUVECs中异常高表达，而药物作用后的HUVECs，EWSAT1的表达相对于其他基因的变化明显，且随着药物和CAG002)剂量的增加表达随之下降。我们在近期的研究报道中看到，TRAF6在HUVECs中的表达异常偏高，且参与HUVECs的一些增殖等活动。在选定了EWSAT1后，对其下游进行靶点预测和筛选，也发现了TRAF6是EWSAT1下游靶点之一，而TRAF6其下游主要是参与的通路有TAK1-Cjun/IκBα。

实验例7：实时定量PCR实验

首先，使用TRIzol(Gibco-BRL)从HUVECs中提取RNA。总共20ng RNA用于逆转录，使用逆转录cDNA合成试剂盒(Fermentas，美国)进行。EWSAT1，TRAF6和GAPDH的定量通过qRT-PCR进行。然后，用CAG002分别(0、4、8和16μM)处理HUVECs。48小时后，提取RNA并反转录成cDNA。通过qRT-PCR定量分析了不同浓度的CAG002处理过的HUVECs中EWSAT1和TRAF6的表达水平，并将GAPDH作为内参基因计算EWSAT1和TRAF6的mRNA的相对表达水平。结果如图5所示。

从实时定量PCR的结果来看，CAG002下调了EWSAT1的mRNA的表达水平，同时TRAF6的mRNA表达水平也相应下调，这说明CAG002可以通过抑制EWSAT1的表达调控TRAF6的表达进而影响HUVECs的生长。

实验例8：免疫印记杂交(Western Blot)实验

HUVECs用CAG002处理后48小时，收集细胞裂解物，并使用Bio-Rad测定试剂盒(TBio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，并将其转移到0.22μm的聚偏二氟乙烯(T PVDF)膜上。然后，用含有5％脱脂奶粉的TBST(Tris-缓冲盐水，pH 7.6，0.05％Tween 20)封闭膜2小时。然后将膜与指定浓度的下列一级抗体在4℃下孵育过夜：TRAF6，1：1000；p-TAK1，1：5000；TAK1，1：5000；p-IκBα，1：3000；IκBα，1：5000；p-Cjun，1：5000；和Cjun，1：5000。用TBST洗涤3次后，将印迹与二抗在室温下孵育1小时，然后在电化学发光Western印迹检测试剂中显影。基于条带的相对强度，将蛋白质的表达水平与对照的表达水平进行比较。结果如图6所示。

通过实验结果分析，本申请人发现CAG002可以通过抑制TRAF6的蛋白表达水平从而抑制下游TAK1、Cjun和IκBα的磷酸化表达水平。

结论：

在细胞的功能性实验结果中，CAG002对HUVECs的增殖，凋亡，侵袭和迁移能力都有不同的影响，同时，近期研究表明，EWSAT1在很多癌细胞中都有异常的表达，而TRAF6也被报道过在HUVCEs参与各种重要的代谢活动。CAG002可以通过抑制EWSAT1的表达从而调控下游TRAF6及其相关通路磷酸化的水平进而影响HUVECs的生长情况。CAG002有希望成为毛蕊异黄酮的代替品。

MTT实验表明CAG002能抑制HUVECs增殖，且随浓度的增加，效果越明显，并且，根据文献研究结果相比较，CAG002抑制HUVECs的效果要明显好于毛蕊异黄酮；而凋亡染色、划痕和transwell实验中，CAG002对HUVECs有明显的抑制效果。因此提示，CAG002可以影响血管内皮细胞的增殖，凋亡、侵袭和迁移的能力。

实时定量PCR及免疫印记杂交的结果显示CAG002能下调HUVECs的EWSAT1、TRAF6mRNA水平，及下调TRAF6蛋白水平和其下游TAK1、Cjun和IκBα的蛋白磷酸化水平。Cjun是丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的一部分，是介导细胞增殖凋亡的的一类重要信号，可通过胞浆和核中其下游的信号分子发挥调节内皮细胞增殖凋亡的作用。IκBα则是NF-κB信号通路的一份子，其信号通路可以参与细胞的侵袭和迁移的能力的调控，同时也参与着细胞增殖凋亡的调控。因此本发明考察了CAG002对EWSAT1活性的影响，发现了它下调TRAF6蛋白水平及其下游的磷酸化水平，从而影响了HUVECs的增殖、凋亡、侵袭和迁移的能力。

Claims (4)

1.下述式(I)所示化合物在制备抑制内皮细胞增殖药物中的应用；

(I)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：该药物由治疗上有效剂量的下述式(I)所示化合物和药学上可接受的辅料组成；

(I)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为药学上可接受的剂型。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂或注射剂。

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