KR20100094556A - 항원에 대한 면역 반응 증강을 위한 글리코실세라마이드의 용도 - Google Patents
항원에 대한 면역 반응 증강을 위한 글리코실세라마이드의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 항원 및 상기 조성물의 투여에 의한, 상기 항원에 대한 개체의 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 증강된 면역 반응은 체액성 면역 반응, CD4+ T 세포 반응, CD8+ T 세포 반응일 수 있거나, 또는 항원 제시 세포의 활성화를 초래할 수 있다. 또한, 식 I의 화합물을 포함하는 조성물과 항원의 근육내 투여에 의한 면역 반응 증강 방법도 제공한다.
Description
본 출원은 2007년 12월 5일자 미국 가출원 번호 60/992,460에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
백신의 기본 목적은 병리 상태에 대한 지속적인 면역성을 제공하기 위한 것이다. 이상적으로는, 백신은 기능적으로 활성인 항체를 제공하여, 세포 매개 면역을 형성하고, 매우 특이적인 반응성과 "기억"을 가진 T 및 B 림프구를 활성화시켜, 이후에 항원이 들어오면 이에 대한 예방을 제공한다.
보강제(adjuvant)는 면역 반응을 비특이적으로 증대시키는 백신 첨가제이다. 보강제가 면역계를 증강시키는 기작은 매우 다양하다. 보강제는 "면역조절" 시스템 또는 "항원 전달" 시스템으로 분류될 수 있다. 면역조절성 보강제는 림포카인생산의 변형을 통해 면역 세포의 작용을 조절함으로써, 면역 시스템을 촉진한다. 한편, 항원 전달 시스템은 적합한 면역 세포에 항원을 전달하는 작용을 한다. 또한, 보강제는 면역 반응의 속도와 기간을 증가시키거나, 항체 결합력(antibody avidity), 특이성, 이소타입 또는 서브클래스 분포를 조절하거나, 세포 매개 면역을 자극하거나, 점막 면역을 촉진하거나 또는 면역 미성숙 또는 노화된 개체에서의 면역 반응을 강화할 수 있다. 보강제는 선천성, 체액성 또는 세포 매개 면역 반응 또는 이의 조합에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명자들은, 특정 클래스의 합성 글리코리피드가 백신 조제물과 조합하여 사용되었을 때 개체 투여시 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 모두를 활성화시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 이에, 본 발명은 하기 식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 식 (I)에서,
R1 및 R2는 독립적으로 -H 또는 -OH이고, x는 18 내지 26의 정수이고, n은 10 내지 15의 정수이다. 또한, 식 I의 화합물과 항원을 포함하는 조성물도 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 식 I의 화합물 및 항원을 포함하는 조성물을 투여함으로써 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 증강된 면역 반응은 체액성 면역 반응, CD4+ T 세포 반응, CD8+ 세포독성 T 세포 반응, 또는 항원 제시 세포(APC)의 활성화일 수 있다. 개체의 면역 반응은 적절한 대조군에 비해 증강된다.
다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 근육내로 투여된다.
도 1은 PBS-96, PBS-14 또는 PBS-11을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 정맥내(IV) 주사한 마우스의 혈액에서 OVA-특이적인 타겟 세포의 특이적인 세포 용혈율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 αGalCer, PBS-57, PBS-96 또는 PBS-14를 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IV 주사한 마우스의 혈액에서 OVA-특이적인 타겟 세포의 특이적인 세포 용혈율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 αGalCer, PBS-57, PBS-96 또는 PBS-14를 Ova와 함께 또는 Ova 없이 근육내(IM) 주사한 마우스의 혈액에서 OVA-특이적인 타겟 세포의 특이적인 세포 용혈율을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 다양한 농도의 PBS-57을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다. 도 4b는 다양한 농도의 PBS-14를 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다. 도 4c는 다양한 농도의 PBS-96을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다. 도 4d는 다양한 농도의 αGalCer을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다.
도 5는 PBS-57, PBS-96, PBS-14 또는 PBS-11 100 ng을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다.
도 6은 PBS-11, PBS-57, PBS-96 또는 PBS-14를 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IV 주사한 마우스의 혈액에서의, Ova 특이적인 타겟 세포의 특이적 세포 용혈을 나타낸 그래프이다.
도 7은 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액에서의, Ova 특이적인 타겟 세포의 특이적 세포 용혈을 나타낸 그래프이다.
도 8은 표시된 보강제 10 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액에서의, Ova 특이적인 타겟 세포의 특이적 세포 용혈을 나타낸 그래프이다.
도 9는 표시된 보강제 1 ㎍을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스에서, SIINFEKL 펜타머에 대한 반응성 CD8+ T 세포 비율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스에서, SIINFEKL 펜타머에 대한 반응성 CD8+ T 세포 비율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액의 IgG1 역가를 나타낸 그래프이다.
도 12는 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액의 IgG2a 역가를 나타낸 그래프이다.
도 13은 PBS-14, PBS-96, PBS-11, PBS-57 및 αGalCer의 구조식이다.
도 2는 αGalCer, PBS-57, PBS-96 또는 PBS-14를 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IV 주사한 마우스의 혈액에서 OVA-특이적인 타겟 세포의 특이적인 세포 용혈율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 αGalCer, PBS-57, PBS-96 또는 PBS-14를 Ova와 함께 또는 Ova 없이 근육내(IM) 주사한 마우스의 혈액에서 OVA-특이적인 타겟 세포의 특이적인 세포 용혈율을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 다양한 농도의 PBS-57을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다. 도 4b는 다양한 농도의 PBS-14를 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다. 도 4c는 다양한 농도의 PBS-96을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다. 도 4d는 다양한 농도의 αGalCer을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다.
도 5는 PBS-57, PBS-96, PBS-14 또는 PBS-11 100 ng을 접종한 후 24시간 후 마우스 혈청내 IFNγ의 축적을 나타낸 그래프이다.
도 6은 PBS-11, PBS-57, PBS-96 또는 PBS-14를 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IV 주사한 마우스의 혈액에서의, Ova 특이적인 타겟 세포의 특이적 세포 용혈을 나타낸 그래프이다.
도 7은 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액에서의, Ova 특이적인 타겟 세포의 특이적 세포 용혈을 나타낸 그래프이다.
도 8은 표시된 보강제 10 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액에서의, Ova 특이적인 타겟 세포의 특이적 세포 용혈을 나타낸 그래프이다.
도 9는 표시된 보강제 1 ㎍을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스에서, SIINFEKL 펜타머에 대한 반응성 CD8+ T 세포 비율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스에서, SIINFEKL 펜타머에 대한 반응성 CD8+ T 세포 비율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액의 IgG1 역가를 나타낸 그래프이다.
도 12는 표시된 보강제 100 ng을 Ova와 함께 또는 Ova 없이 IM 주사한 마우스의 혈액의 IgG2a 역가를 나타낸 그래프이다.
도 13은 PBS-14, PBS-96, PBS-11, PBS-57 및 αGalCer의 구조식이다.
보강제는 다양한 방식으로 백신 조제물내에서 항원 면역원성을 강화한다. 또한, 유효한 보강제는 항원 투여에 의해 발생되는 면역 반응을 증강시키기 위해 매우 다양한 항원과 조합하여도 유용할 것이다. 예컨대, 독소의 경우, 우수한 체액성 면역 반응이 요구된다. 세포내 박테리아의 경우, 주로 세포독성 T 세포와 Th1 세포에 의해 매개되는 세포 매개 반응이 중요하다. 바이러스 감염의 경우에는, 체액성 및 세포성 면역 반응이 감염을 방제하는데 기본이 된다. 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포 매개성 면역 반응을 증강시키는 보강제의 능력은 장기간 지속되는 면역의 발현 가능성을 증가시킨다.
보강제 특성과 관련된 지질 종을 조사하였다. 다수의 천연 및 합성 지질 분자들은 항원 제시 세포에 의해 처리되며 CD1 세포에 의해 NKT 세포에 제시된다. 시험관내 및 생체내에서 NKT 세포 활성화를 연구하기 위해 사용되는 원형(prototypical) 화합물은 KRN7000인데, 이것은 해양 해면동물 스폰지 아겔라스 마우리티아누스(Agelas mauritianus)로부터 유래된 α-갈락토시세라미드("αGalCer")이다. 최근에 동정된 또다른 화합물로는 PCT 출원번호 PCT/US07/66250에 개시된 내인성 글리코리피드인 이소글로보트리헥소실세라마이드("iGB3") 및 변형된 6 "아미노 6" 데옥시갈락토실세라마이드가 있으며, 상기 PCT는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이들 화합물들은 NKT 세포를 활성화하고, 시험관내에서 사이토카인 반응을 상향조절한다. 그러나, 생체내 백신 접종에서는 이러한 화합물에 대한 지질 보강제성(adjuvanticity) 효능은 거의 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 아미노기와 포화된 지방산쇄를 함유하는 식 I의 글리코스핑고리피드가 놀랍게도 생체내에서 세포 매개성 면역 반응과 체액성 면역 반응 모두를 자극하는 능력을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 또한, 식 I의 화합물은 약한 명목상의 항원(nominal antigen)에 대한 면역 반응을 자극하여 항체를 생산할 수 있으며, 동시에 특이적인 표면 항원을 발현하는 세포의 세포 매개 세포 용혈을 제공한다. 식 I의 2종의 화합물, PBS-96 및 PBS-14는 생체내에서 세포 매개 면역 반응과 체액성 면역 반응 모두를 자극하는 것으로 확인되었다. 또한, 이들 화합물들은 약한 명목상의 항원에 대한 면역 반응을 자극하여 항체를 생산하고 세포 매개 반응을 일으킨다. 또한, 이들 화합물들은 근육내 또는 저용량으로 투여하였을 때 PBS-57 및 αGalCer에 비해 보다 왕성한 반응을 자극하는 것으로 확인되었다.
일 구현예에서, 본 발명은 식 I의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 식 I에서,
R1 및 R2는 독립적으로 -H 또는 -OH이고, x는 18 내지 26의 정수이고, n은 10 내지 15의 정수이다. 식 I의 화합물은 갈락토스 또는 글루코스 분자의 C6 위치에 아미드기와, 화합물의 세라마이드 부분에 포화된 아실쇄를 가지고 있는 것이 적합하다. 상기 조성물은 생리학적으로 허용가능함 담체를 더 포함할 수 있다. "생리학적으로 허용가능한" 담체는 생체내 투여(예, 경구, 경피 또는 비경구 투여) 또는 시험관내 사용, 즉 세포 배양에 적합한 모든 담체이다. 생체내 투여에 있어 적합한 생리학적으로 허용가능한 담체는 특히 물, 완충액 및 글루코스 용액이다. 조성물의 추가적인 성분으로는, 생리학적으로 허용가능한 담체 외에도, 안정화제, 보존제, 희석제, 유화제 또는 윤활제 등의 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제로는 Tween 20, DMSO, 슈크로스, L-히스타딘, 폴리소르베이트 20 및 혈청이 있다. 적합하게는, 식 I의 화합물은 리포좀내에 제형화된다. 적합하게는, 리포좀은 포스파티딜 콜린(PC)/포스파티딜 글리세롤(PG)/콜레스테롤이 8 μmole/2 μmole/5 μmole/1 mg으로 구성된 SUV 타입이다. 당업자라면, 개체에게 투여를 위해 식 I의 화합물을 다양한 방식으로 제형화할 수 있음을 인지할 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 식 I의 화합물 및 항원을 포함하는 조성물을 투여함으로써 개체에서 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 본원에서, "개체"는 포유류, 예컨대 마우스 또는 보다 적합하게는 인간이다. "면역 반응을 증강시키는"은 화합물이 적합한 대조군에 비해 항원에 대한 개체의 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 증강시키는 능력을 의미한다. 또한, 항원 제시 세포의 활성화 증가는 또한, 개체의 면역 반응 증강으로서 포함된다. 면역 반응이 대조군에 비해 증강되었는지를 보기 위한 목적으로, 항원과 화합물을 백신 접종한 개체의 샘플에서의 신호는 항원 단독을 백신 접종한 개체의 샘플에서의 신호와 정량적으로 비교할 수 있다. 항원에 대한 면역 반응은 당해 분야의 당업자들에게 명확한 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 예로, 면역 반응은 세포독성 특이적인 세포 용혈 분석, 펜타머 결합 분석 또는 ELISA 분석에 의해 측정하며, 이의 수행은 당해 분야의 당업자들에겐 일상적이다.
특정 구현예에서, 면역 반응은 적절한 대조군 대비 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 750% 또는 적어도 1000% 증강이다. 적절한 대조군은 본 발명의 조성물이 아닌 항원을 투여받은 개체이다. 증강율%은 하기 식으로 계산할 수 있다.
[(식 I의 화합물을 포함하는 조성물 처리 후의 개체의 면역 반응 수치) - (대조군의 면역 반응 수치)/(식 I의 화합물을 포함하는 조성물 처리 후 개체의 면역 반응 수치)] x l00.
본원에서, 용어 "투여", "병용-투여" 및 "병용투여"는 보강제 및 항원의 동시(concurrently), 즉 동시에 함께 또는 순차적 투여, 즉 보강제 투여 후 항원의 투여 또는 항원 투여한 후 보강제의 투여를 의미한다. 보강제 또는 항원을 투여한 후, 다른 화합물을 실질적으로 그 후에 바로 또는 그 후 유효 기간 후에 투여할 수 있으며, 상기 유효 기간은 성분들의 투여로부터 최대한의 이익을 실현시키는 시간의 양이다. 다른 구현예로, 보강제 및 항원은 공동-제형화(co-formulate)될 수 있다.
항원은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 또는 탄수화물 모이어티 또는 이들의 조합, 예컨대 당단백질일 수 있다. 항원은 적합하게는 감염성 물질(예, 병원성 미생물), 종양, 내인성 분자(예, "자가 분자")이거나, 또는 연구 목적의, 명목상의 항원, 예컨대 오브알부민(본원에서는 "OVA"라 함)으로부터 유래된다. 적합하게는, 항원은 백신내에 포함된다. 백신 조성물은, 적절하게는, 식 I의 화합물을 포함하도록 제형화된다. "백신"은 개체에게 투여되었을 때, 세포 매개 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 조성물이다. 본 발명에서 사용되는 약학 조성물은 적합하게는 식 I의 화합물과 백신을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 약학 조성물은 적합하게는 PBS-96 및 항원, 또는 PBS-14 및 항원을 포함한다. PBS-96 및 PBS-14의 구조는 도 13에 나타나 있다. PBS-96 및 PBS-14는 시험관내 및 생체내에서 NKT 세포를 활성화한다. PBS-96 및 PBS-14 둘다 화합물의 세라마이드 위치에 포화된 아실쇄와 갈락토스의 C6 위치에 아미드기를 포함한다. PBS-96 및 PBS-14는 항원에 대한 CD8+ T 세포를 증가시키고, PBS-96 및 PBS-14는 생체내 IFNγ의 분비를 유도한다. 또한, PBS-96 및 PBS-14는 놀랍게도 저농도로 사용하고 또한 근육내 주사하였을 때 다른 글리코스핑고리피드 보다 우수하다.
식 I의 화합물을 포함하는 조성물은 당해 분야의 당업자에게 공지된 무활성 성분과 다양한 제조 방법을 이용하여 제형화할 수 있다. (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., (2000), 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 또한, 본 발명의 조성물은 항원을 면역 세포에 표적화하기 위한 적합한 항원 전달 시스템을 포함할 수 있다. 항원 전달 시스템은 당해 분야에 공지되어 있으며, MVA(Modified virus ankara), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 백일해나 시가 독소의 전좌된 서브유닛, 또는 항원이 캡슐화된 리포좀을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 백신 조성물내 식 I의 화합물의 유효량은 당업자가 결정할 수 있지만, 전형적으로는 체중 1 kg 당 약 1,000 cc일 수 있지만, 전형적으로는 체중 1 kg 당 약 1 ng 내지 10,000 ㎍의 범위이다. 일부 구현예에서, 유효량은 체중 1 kg 당 약 10 ng 내지 1,000 ㎍이다. 다른 구현예에서, 유효량은 체중 1 kg 당 약 100 ng 내지 500 ㎍의 범위이다. 다른 구현예에서, 유효량은 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 250 ㎍의 범위이다. 연구 목적에서, 마우스에 적합한 용량은 투여 경로에 따라 100 ㎕ 당 식 I의 화합물 1 ng 내지 1 ㎍이다. 예로, 용량 약 100 ng은 마우스의 정맥내 주사에 적합하며, 적게는 용량 10 ng이 근육내 주사에 유효한 것으로 확인되었다. 식 I의 화합물을 포함하는 조성물은 1회 투여로 투여되거나 또는 몇 주 또는 몇 개월의 기간 동안 여러번 나누어 투여될 수 있다.
하나 이상의 항원이 조성물에 포함되거나, 또는 독립적으로 제형화될 수 있다. 본원에서 "항원"은 그 항원이 투여된 개체에서 면역 반응을 자극하는 분자를 의미한다. 항원의 투여량은 특정 항원, 개체의 연령과 면역 상태, 그리고 당업자들이 결정할 수 있는 다른 관련 인자에 따라 결정된다는 것은 자명할 것이다.
미생물 전체 또는 이의 일부(예, 막 고스트(ghost); 미정제 막 조제물, 세포 용혈물 및 그외 미생물 조제물)를 항원으로서 사용할 수 있다. 적합하게는, 항원은 약독화 또는 사멸된 감염성 물질로부터 유래된다. 항원이 유래될 수 있는 적합한 감염성 물질로는 병원체 및 미생물, 예컨대 박테리아, 기생물 및 바이러스가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 측면에서, 적합한 항원은, 비제한적으로, HIV/ AIDS(레트로비리대, 예, HIV-1 및 HIV-2 분리물의 gp120 분자, HTLV-I, HTLV-II), 인플루엔자 바이러스(오르쏘믹소비리대, 예, 타입 A, B 및 C), 헤르페스(예, 헤르페스 심플렉스 바이러스, HSV-1 및 HSV-2 당단백질 gB, gD 및 gH), 로타바이러스 감염원(레오비리대(Reoviridae)), 호흡기 감염원(파라인플루엔자 및 호흡기 세포융합 바이러스), 폴리오마이엘리티스(Poliomyelitis)(피코나비리대, 예, 폴리오바이러스 리노바이러스), 홍역 및 유행성 이하선염(파라믹소비리대), 루벨라(토가비리대, 예, 루벨라 바이러스), 간염(예, A, B, C, D, E 및/또는 G 타입의 간염), 사이토메갈로바이러스(예, gB 및 gH), 위장염(칼리시비리대(Caliciviridae)), 황열 및 서나일 열(Yellow and West Nile fever)(플라비비리대), 광견병(랍도비리대(Rhabdoviridae)), 한국 출혈열(분야비리대(Bunyaviridae)), 베네주엘라 열(Venezuelan fever)(아레나비리대(Arenaviridae)), 사마귀(파필로마바이러스), 유인원 면역결핍 바이러스, 뇌염 바이러스, 대상 포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 및 그외 코로나비리대, 비르나비리대 및 필로비리대 등의 다른 과의 바이러스 등의, 인간 질환과 관련있는 바이러스 병원체로부터 수득 또는 유래된다.
적합한 박테리아 및 기생 동물의 항원은 또한 공지의 질환-유발원으로부터 수득 또는 유래될 수 있으며, 비제한적으로, 디프테리아, 백일해, 파상풍, 결핵, 세균성 또는 진균성 폐렴, 중이염, 임질, 콜레라, 장티푸스, 수막염, 단핵증, 플라그, 세균성 적리, 살모넬라증, 레지오넬라병, 라임 질병, 나병, 말라리아, 십이지장충, 사상충증, 주혈 흡충병, 트리파노소마증, 리슈마니어증, 람블편모충증, 아메바증, 사상충증(filariasis), 보렐리아병 및 선모충병 등의 질환에 대한 백신 접종하기 위해 조성물에 사용할 수 있다. 또다른 항원은 쿠루병, 크로이츠펠트 야코브병(CJD), 스크래피, 전염성 밍크 뇌질환 및 만성 소모성 질환 등의 비정규적 병원체, 또는 광우병과 관련있는 프리온 등의 단백질성 감염 입자로부터 수득하거나 유래될 수 있다.
항원이 유래될 수 있는 추가적인 특이 병원체로는, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 클라미디아, 나이세이라 고노로에아(N. gonorrhoeae), 시겔라, 살모넬라, 비브리오 콜레라, 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 슈도모나스, 보르데텔라 퍼튜시스(Bordetella pertussis), 브루셀라, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 스트렙토코커스(A 및 B형), 뉴모코커스(pneumococcus), 메닝오코쿠스(meningococcus), 헤모필러스 인플루엔자(b형), 톡소플라스마 곤대(Toxoplasma gondii), 모락셀라 카테르할리스(Moraxella catarrhalis), 도노바노시스(donovanosis) 및 액티노마이코시스(actinomycosis)가 있으며; 진균 병원체로는 칸디다증, 아스페르길루스증이 있으며, 기생성 병원체로는 티니어(Taenia), 흡충류(flukes), 회충, 아메바증, 편모충증, 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 시스토소마(Schistosoma), 뉴머시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 트리코모니아시스(trichomoniasis) 및 트리코모나스증(trichinosis)이 있다. 또한, 본 발명은 족부 및 구강 질환, 코로나바이러스, 파스퇴렐라 멀코시다(Pasteurella multocida), 헬리코박터, 스트롱일러스 불가리스(Strongylus vulgaris), 액티노바실러스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumonia), 소 바이러스 설사 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), E. coli, 및 보데텔라 퍼튜시스(Bordetella pertussis), 파라퍼투시스(parapertussis) 및 브로키셉티카(brochiseptica) 등의, 다수의 수의학적 질환에 대해 적합한 면역 반응을 제공하기 위해 사용할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명에서 사용할 수 있는 조성물에 포함되는 항원은 종양 유래 항원 또는 동종 또는 이종의 전체 종양 세포이다. 적합하게는, 종양 항원은 종양 특이 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)이다. 몇가지 종양 항원 및 이의 발현 패턴들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 치료될 종양 타입을 기초로 선택할 수 있다. 종양 항원의 비제한적인 예로는, cdk4 (흑색종), β-카테닌(흑색종), 카스파제-8(편평 상피 세포암), MAGE-1 및 MAGE-3(흑생종, 유방, 신경교종), 티로시나제(흑색종) 표면 Ig 이디오타입(예, BCR)(림프종), Her-2/neu(유방, 난소), MUC-I(유방, 췌장) 및 HPV E6 및 E7(경부암)을 포함한다. 추가적인 적합한 종양 항원으로는 전립선 특이 항원(PSA), 시알릴(sialyl) Tn(STn), 열 충격 단백질 및 관련 종양 펩타이드(예, gp96), 강글리오사이드 분자(예, GM2, GD2, 및 GD3), 카르시노엠브리오 항원(carcinoembryonic antigen: CEA) 및 MART-1이 있다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 의도한 투여 경로에 적합하도록 약학 조성물을 적절하게 제형화한다. 적합한 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대 정맥내, 피부내, 피하, 근육내, 경구(예, 흡입), 장(entera), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 있다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 식 I의 화합물은 근육내 투여 후 놀랍게도 면역 반응의 왕성한 증가를 제공하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 구현예는 항원에 대한 체액성 면역 반응을 자극하는 방법이다. 상기 방법은 식 I의 화합물과 항원을 개체에게 전술한 바와 같이 병용-투여하는 것을 포함한다. 본원에서, "체액성 면역 반응"은 B 세포에 의한 항체 생산과, 이에 수반되는 부속 프로세스를 포함하며, 예로는 Th2 활성화 및 사이토카인 생산, 생식 세포의 센터 형성 및 이소타입 스위칭, 친화성 성숙 및 기억 세포 생산이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 체액성 면역 반응의 활성화 여부를 결정하기 위한 목적으로, 항원과 식 I의 화합물을 투여받은 개체의 샘플에서의 신호를 항원 단독 투여받은 개체의 샘플의 신호와 정량적으로 비교할 수 있다. 체액성 면역 반응은 병원체 또는 독소 중화, 고전적인 보체 활성화 및 식세포작용 및 병원체 소거의 옵소닌 촉진 등의, 항체의 작용자 기능을 측정함으로써 평가할 수 있다. 식 I의 화합물과 항원의 병용-투여에 대한 반응으로 형성되는 항체는, 임의 타입, 예컨대, IgM, IgA, 또는 IgG (예, IgG1 또는 IgG2)일 수 있다. 체액성 면역 반응은 당해 분야에 공지된 모든 정량 방법, 예컨대 ELISA, 단일 방사성 면역확산 분석(SRID), 효소 면역분석(EIA), 또는 헤모어글루틴화 저해 분석(HAT)에 의해 평가할 수 있다.
본 발명의 다른 예는, 개체에게서 CD4+ T 림프구를 활성화하는 방법이다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, CD4+ T 세포 또는 "T 헬퍼 세포"는 항원 제시 세포의 표면에 클래스 II 주조직 적합성 마커(MHC)를 제시하는 항원을 인지하는 세포이며, 림포카인을 분비하여 면역 시스템의 세포 매개 및 항체에 매개 반응들을 둘다 자극한다. CD4+ T 세포의 활성화는 림포카인의 분비, 면역글로불린 이소타입의 스위칭, 항체 반응의 친화성 성숙, 대식세포 활성화 및 천연 살상(NK) 및 세포독성 T 세포(CTL)의 활성 강화를 촉진한다. 림포카인은 그것의 활성 및/또는 다른 세포의 활성에 영향을 주는 림프구에 의해 분비되는 단백질이다. 림포카인으로는 인터루킨 및 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL- 12, 또는 IFNγ가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. CD4+ T 림프구의 활성화 여부를 측정할 목적으로, 항원과 식 I의 화합물로 백신 접종받은 개체의 샘플의 신호를 항원 단독 백신 접종받은 개체의 샘플의 신호와 정량적으로 비교할 수 있다. CD4+ T 세포의 활성화를 분석하는 방법은 당해분야에 공지되어 있다.
본 발명의 다른 구현예는, 개체에서 CD8+ T 림프구의 활성화 방법이다. CD8+ T 림프구는 클래스 I MHC 분자(모든 유핵 세포 상에 존재함)에 의해 제시되는 항원을 인지한다. MHC 클래스 I 펩타이드 복합체의 형성은 용혈성 과립구를 타겟 세포로 전달되게 하여, 타겟 세포의 용혈을 초래한다. CD8+ T 세포의 활성화를 분석하기 위해 사용되는 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며, ELISPOT, ELISA, 테트라머/펜타머 결합에 대한 FACS 분석 및 세포독성 분석이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예로, Hermans et al, 2004, Journal of Immunologic Methods, 285:25-40에 개시된 바와 같이, 마우스 모델을 사용하여 CD8+ T 세포의 활성화를 형광 분석으로 모니터링함으로써 세포-매개 세포독성을 측정할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 이러한 분석에서, 마우스를 테스트 화합물이 첨가 또는 무첨가된 백신으로 0일째에 면역화한다. 마우스의 제2 세트로부터 비장 세포를 분리하고, 이 세포를 2가지의 개별 세포-표지 형광 염료나, 또는 고농도 또는 저농도의 단일 형광 염료, 예컨대 CFSE 또는 CMTMR로 표지함으로써, 동계(syngeneic) 타겟 세포를 제작한다. 타겟 세포 제1세트는 항원-특이 펩타이드와 함께 로딩하고, 타겟 세포 제2세트는 관련없는 펩타이드와 함께 로딩한다. 2가지의 타겟 세포 집단을 동량으로 혼합하여, 면역화된 마우스에 주사한다. 24시간 후, 마우스를 희생시켜, 비장세포와 혈액 샘플을 채취한다. 각 세트의 타겟 세포의 비율은 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석한다. CD8+ 림프구의 활성화는, 항원 및 테스트 화합물로 백신 접종한 샘플에서의 타겟 세포의 수를 항원 단독으로 백신 접종한 개체 유래 샘플에서의 타겟 세포의 수와 비교함으로써 결정한다.
본 발명의 다른 측면들은 하기 비제한적인 실시예들과 첨부된 도면들을 들어 명확하게 설명될 것이다.
실시예들
실시예
1: 마우스 모델에
PBS
-96,
PBS
-14 및
PBS
-11의
정맥내
주사에 의한
CD8
+ T 세포 반응 증강 테스트
마우스 모델을 사용하여, 테스트 보강제를 항원과 함께 정맥내 투여하였을 때 도출되는 생체내 특이적인 세포독성 T 세포 반응(CD8+)을 테스트하였다. 0일에, 마우스 3마리로 이루어진 8개 그룹에, 항원(오브알부민, Ova, 등급 VII, Sigma, St. Louis, MO)을 보강제와 함께 또는 보강제 첨가 없이, 보강제 단독, 또는 담체 단독(대조군)을 총 100 ㎕의 PBS 용액에 용해시켜 정맥내(꼬리 정맥)에 면역화하였다. 테스트 보강제 화합물은 1 ㎍ PBS-96, 1 ㎍ PBS- 14, 1 ㎍ PBS-11이며, 50 ㎍의 오브알부민(OVA) 항원과 함께 또는 항원없이 사용하였다.
제2 세트 C57/B1/6J CD45.2 암컷 마우스로부터 비장 세포를 분리하여 저농도(0.6 μM, 8 분간 37℃) 또는 고농도(6 μM, 8 분간 37℃)의 CFSE(형광 염료) 중 어느 하나로 세포를 표지하여, 동계 타겟 세포를 제조하였다. 고농도 CFSE로 표지된 집단에 37℃에서 60분간 5 μM SIINFEKL 펩타이드(Ova-특이 펩타이드, NeoMPS, Inc, San Diego, CA)를 프리-로딩하였다. 저농도의 CFSE로 표시된 집단에 37℃에서 60분간 5 ㎕ LCMV gp33-41 펩타이드(비-Ova 펩타이드, NeoMPS, Inc, San Diego, CA)를 프리-로딩하였다. 타겟 세포를 저농도 CFSE 로딩 세포 대 고농도 CFSE 로딩 세포 47:53의 최종 비율로 혼합하고(총 100 ㎕에 2x107개의 세포), 10일에 면역화된 마우스 각각에 정맥내 주사하였다. 11일에 마우스를 희생시키고, 비장 세포와 안와 누(orbital sinus)로부터 혈액 샘플을 채집하였다. 펩타이드-전달한(pulsed) 타겟 세포(고농도 CFSE 표지)의 대조군 집단에 상대적인 평균 생존율을 유세포 측정 분석에 의해 계산하였다. 세포독성 활성은 특이적인 용혈율(100 - 펩타이드-전달받은 타겟의 평균 생존율)로 나타내었다. 도 1은 면역화된 마우스의 혈액에서의 타겟 세포의 특이적인 용혈율을 나타낸다. Ova 및 PBS-96 또는 PBS-14의 조합을 투여한 경우에서만 Ova-특이적인 타겟 세포의 세포독성 용혈이 발생하였다. 대조군으로, PBS-11의 투여시에는 세포의 특이적인 용혈은 발생하지 않았다.
실시예
2: 마우스 모델에서
정맥내
및
근육내
주사하였을 때의
PBS
-96,
PBS
-14, PBS-11,
PBS
-57 및 α
GalCer
에 의한
CD8
+ T 세포 반응 증강 비교
테스트 보강제 화합물이 항원과 조합 투여시 생체내에서 특이적인 세포독성 T 세포 반응(CD8+)을 유도하는 능력이 있는지를 보기 위해, 테스트 보강제 화합물을 실시예 1에 기술된 방법으로 더욱 분석하였다. 0일에 정맥내(IV)(그룹 1-9, 각 그룹 당 마우스 3마리) 또는 근육내(그룹 10-18, 각 그룹 당 마우스 6마리)로 면역화한 18개의 마우스 그룹은 다음과 같다:
- 그룹 1: 400 ㎍의 Ova를 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 2: 1 ㎍의 αGalCer을 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 3 : 1 ㎍의 PBS-57을 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 4: 1 ㎍의 PBS-14를 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 5: 1 ㎍의 PBS-96을 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 6: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ αGalCer을 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 7: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-57을 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 8: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-14를 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 9: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-96을 PBS 용액 100 ㎕로 IV 투여;
- 그룹 10: 400 ㎍의 Ova을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 11 : 1 ㎍의 αGalCer을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 12: 1 ㎍의 PBS-57을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 13: 1 ㎍의 PBS-14를 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 14: 1 ㎍의 PBS-96을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 15: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ αGalCer을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 16: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-57을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 17: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-14를 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여;
- 그룹 18: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-96을 PBS 용액 50 ㎕로 IM 투여.
타겟 세포를, 최종 비율 50:50의 저농도 CFSE 로딩 세포 : 고농도 CFSE 로딩 세포(각 농도에서, 100 ㎕ 당 총 1x107개의 세포)와 혼합하고, 10일에 면역화된 마우스 각각에 정맥내 주사하였다. 11일에, 마우스를 희생시키고, 안와 누로부터 혈액 샘플을 채혈하였다. OVA-특이적인 타겟 세포의 세포 용혈을 말초 혈액 세포의 유세포 측정으로 모니터링하였다. 특이적인 세포 용혈을 전술한 바와 같이 결정하였다.
도 2는 마우스의 정맥내 주사 결과를 나타낸다. Ova 단독 처리한 마우스에서의 Ova-특이적인 세포독성의 평균 반응은 11.8 ± 14.4 %이었고, Ova + αGalCer 그룹은 79.9 ± .8 %이었으며, Ova + PBS-57 처리한 마우스 그룹은 88.1 ± 6.2 %였고, Ova + PBS-14 처리한 마우스 그룹은 83.3 ± 6.1 %, Ova + PBS96 처리한 마우스 그룹은 89.2 ± 10.3 %이었다. 결과는, PBS-14 및 PBS-96이 시험관내 OVA-특이적인 세포독성 반응을 유도하는데 PBS-57 만큼 유효함을 나타내었다.
도 3은 마우스의 근육내 주사 결과를 나타낸다. Ova 단독 처리한 마우스 그룹에서의 OVA-특이적인 세포독성 평균 반응은 1.60 ± 14.33 %이고, OVA + αGalCer 처리 마우스 그룹은 -5.85 ± 11.01 %, Ova + PBS-57 처리 마우스 그룹은 56.11 ± 13.34 %, Ova + PBS-14 처리 마우스 그룹은 52.07 ± 29.56%, OVA + PBS-96 처리 마우스 그룹은 50.29 ± 42.6 %이었다. 이러한 결과는, PBS-96과 PBS-14 모두 근육내 및 정맥내에서 PBS-57 만큼 유효한 면역 반응을 유도하며, PBS-14, PBS-96 및 PBS-57이 근육내 주사 후 αGalCer 보다 효과적임을 입증한다.
실시예
3: 테스트
보강제
화합물에 의한
생체내
IFN
γ 자극
보강제 테스트 화합물이 생체내 사이토카인 분비를 자극하는 능력을 테스트하기 위해, C57BL/6 마우스에 여러가지 농도의 화합물을 정맥내 투여하고, 24시간 후 ELISA에 의해 혈청내 IFNγ의 생산을 측정하였다. 마우스 3마리로 구성된 그룹들에 하기와 같이 0일에 정맥(꼬리 정맥)내 접종하였다:
그룹 1: PBS 단독 100 ㎕ 투여
그룹 2: 1 ㎍의 αGalCer를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 3: 100 ng의 αGalCer를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 4: 1 ng의 αGalCer를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 5: 0.1 ng의 αGalCer를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 6: 100 ng αGalCer + 400 ㎍ Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 7: 1 ㎍의 PBS-57을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 8: 100 ng의 PBS-57을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 9: 1 ng의 PBS-57을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 10: 0.1 ng의 PBS-57을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 11 : 100 ng PBS-57 + 400 ㎍ Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 12: 1 ㎍의 PBS-14를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 13: 100 ng의 PBS-14를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 14: 1 ng의 PBS-14를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 15: 0.1의 PBS-14를 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 16: 100 ng PBS-14 및 400㎍ Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 17: 1 ㎍의 PBS-96을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 18: 100 ng의 PBS-96을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 19: 1 ng의 PBS-96을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 20: 0.1 ng의 PBS-96을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 21 : 100 ng PBS-96 및 400 ㎍ Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
접종하고 24시간 후에, 마우스에서 혈액 샘플을 채혈하여, ELISA 키트로 IFNγ 수준을 결정하였다. 2가지 ELISA 키트를 사용하였고, Quantikine 마우스 IFNγ(RD systems)를 이용하여 모든 샘플을 테스트하였고, ELISA mIFNγ (Diaclone)으로 테스트 그룹 1, 2, 3, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 17, 18 및 21을 테스트하였다. 혈청 모두 ELISA로 사용하기 전에 다음과 같이 희석하였다:
- 그룹 1: 1/1 그룹 2: 1/50 그룹 3: 1/50
- 그룹 4: 1/20 그룹 5: 1/10 그룹 6: 1/50
- 그룹 7: 1/50 그룹 8: 1/50 그룹 9: 1/20
- 그룹 10: 1/10 그룹 11: 1/50 그룹 12: 1/50
- 그룹 13: 1/50 그룹 814: 1/20 그룹 15: 1/10
- 그룹 16: 1/50 그룹 17: 1/50 그룹 18: 1/50
- 그룹 19: 1/20 그룹 20: 1/10 그룹 21 : 1/50
결과는 혈청내 IFNγ 농도(pg/ml)로 나타내었고, 희석 인자를 감안하였다. 도 4는 RD 시스템에 의한 Quantikine 마우스 IFNγ 키트를 이용하여 결과를 나타낸다. 도 4A는 PBS-57로 면역화한 마우스에서의 IFNγ 수준을 나타낸 것이다. 도 4B는 PBS-14로 면역화한 마우스에서의 IFNγ 수준을 나타낸 것이다. 도 4C는 PBS-96으로 면역화한 마우스에서의 IFNγ 수준을 나타낸 것이다. 도 4D는 αGalCer로 면역화한 마우스에서의 IFNγ 수준을 나타낸 것이다. 0.1 ng에서, 모든 후보 보강제들이 사이토카인 분비를 유도하였지만, αGalCer로 면역화된 마우스는 PBS-57, PBS-14 또는 PBS-96으로 면역화한 마우스 보다 3내 또는 4배 적게 IFNγ를 생산하였다(각각 1540.57±397.53 pg/ml, 4398.05±880.86 pg/ml, 6669.31±1231.82 pg/ml, 5823.33±720.69 pg/ml). 1 ng에서, 테스트 보강제 화합물, PBS-57, PBS-14 및 PBS-96(각각, 평균 11425.98±833.04 pg/ml, 7481.15±3454.03 pg/ml 및 6271.95±3737.53 pg/ml)은 αGalCer(평균 3802.99±586.02 pg/ml) 보다 강한 반응을 보였다. 테스트 보강제 화합물, PBS- 57, PBS-96 및 PBS-14 100 ng의 경우, 모두 αGalCer 보다 IFNγ를 더 많이 생산하였다(PBS-57: 21432.76±4312.76 pg/ml, PBS-96: 19679.89±1443.48 pg/ml, PBS-14: 19582.18±3421.20 pg/ml, 및 αGalCer: 7714.37±3529.07 pg/ml, 평균값). 테스트 화합물 1 ㎍의 경우, PBS-57은 100 ng 용량(21432.76±4312.76 pg/ml)에 비해 약한 반응(3353.45±867.57 pg/ml)을 보였지만, PBS-14 또는 PBS-96은 여전히 100 ng 용량(각각 19582.18±3421.20 pg/ml 및 19679.89±1443.48 pg/ml)에 비해 왕성한 반응을(각각 (16392.53±5957.70 pg/ml and 17720.1 1±2869.97 pg/ml) 보였다.
마우스 다른 세트를 사용하여, 전술한 방법에 의한 생체내 사이토카인 분비를 자극하는 보강제 화합물의 능력을 비교하였다. 5개의 C57BL/6 마우스 그룹에, PBS-57, PBS-14, PBS-96 또는 PBS-11 100 ng을 PBS 100 ㎕ 중에, 또는 PBS 100 ㎕ 단독으로 정맥내 주사하였다. 24시간 후, 혈청내 IFNγ 생산을 ELISA로 측정하였다. 도 5는 PBS-11, PBS-96, PBS-14 및 PBS-57 100 ng으로 면역화한 마우스의 결과를 나타낸다.
전체 PBS-14 및 PBS-96 투여시 PBS-57과 유사한 IFNγ 반응이 나타났으며, 놀랍게도 PBS-11 투여시 강한 반응을 보였다.
실시예
4:
PBS
-11,
PBS
-96,
PBS
-14 및
PBS
-57에 의한
CD8
+ T 세포 반응의 증강 비교
항원과 조합하여 생체내 특이적인 세포독성 T 세포 반응(CD8+)을 유도하는 테스트 보강제 화합물의 능력을 확인하기 위해, 테스트 화합물을 실시예 1에 기술된 방법에 의해 테스트하였다. 9개의 마우스 그룹을 0일에 하기와 같이 정맥내(IV) 면역화하였다:
- 그룹 1: 400 ㎍의 Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 2: 1 ㎍의 PBS-11을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 3: 1 ㎍의 PBS-57 새로운 제형을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 4: 1 ㎍의 PBS-14를 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 5: 1 ㎍의 PBS-96을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 6: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-11을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 7: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-57 새로운 제형을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 8: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-14를 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
- 그룹 9: 400 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-96을 PBS 100 ㎕ 중에 투여.
타겟 세포를, 최종 비율 50:50의 저농도 CFSE 로딩 세포 : 고농도 CFSE 로딩 세포(각 농도에서 1x107개의 세포, 100 ㎕ 당 총 2x107개의 세포)와 혼합하고, 10일에 면역화된 마우스 각각에 정맥내 주사하였다. 11일에, 마우스를 희생시키고, 안와 누로부터 혈액 샘플을 채혈하였다. OVA-특이적인 타겟 세포의 세포 용혈을 말초 혈액 세포의 유세포 측정으로 모니터링하였다. 특이적인 세포 용혈을 전술한 바와 같이 결정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다. 평균 Ova-특이적인 세포 용혈은, Ova 단독 처리 마우스 그룹의 경우 11.8 ± 14.4%, Ova + PBS-11 처리한 마우스 그룹의 경우 32.3 ± 2.5%, Ova + PBS-57 처리한 마우스 그룹의 경우 88.1 ± 6.2%, Ova + PBS-14 처리한 마우스 그룹의 경우 83.3 ± 6.1 %, Ova + PBS-96 처리한 마우스 그룹의 경우 89.2 ± 10.3%였다. 이러한 결과는, PBS-14 및 PBS-96은 항원과 조합하여 정맥내 투여한 후 생체내 세포독성 반응을 유도하는데 PBS-57 만큼 효과적임을 나타낸다.
실시예
5.
근육내
주사
후 보강제
함량 감소에 따른
CD8
+ T 세포 반응 증강 비교
테스트 보강제 화합물이 면역 반응을 증강시키는 상대적인 능력을 결정하기 위해, 실시예 2에 기술된 방법과 비슷한 실험을 수행하였다. 본 실험에서, 0일에, 마우스에, OVA 항원 50 ㎍과 조합하여, 하기와 같이 보강제를 함량을 감소(각각 100 ng 및 10 ng)시키면서 정맥내 주사하였다:
실험 A:
그룹 1: 50 ㎍의 Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 2: 100 ng αGalCer
그룹 3: 100 ng PBS-11
그룹 4: 100 ng PBS-14
그룹 5: 100 ng PBS-57
그룹 6: 100 ng PBS-96
그룹 7: 50 ㎍ Ova + 100 ng αGalCer;
그룹 8: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-11
그룹 9: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-14
그룹 10: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-57
그룹 1 1 : 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-96
실험 B:
그룹 1 : 50 ㎍의 Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여
그룹 2: 10 ng αGalCer;
그룹 3: 10 ng PBS-11
그룹 4: 10 ng PBS-14
그룹 5: 10 ng PBS-57
그룹 6: 10 ng PBS-96
그룹 7: 50 ㎍ Ova + 10 ng αGalCer;
그룹 8: 50 ㎍ Ova + 10 ng PBS-11
그룹 9: 50 ㎍ Ova + 10 ng PBS-14
그룹 10: 50 ㎍ Ova + 10 ng PBS-57
그룹 11: 50 ㎍ Ova + 10 ng PBS-96
타겟 세포를 실험 10일째에 투여하고, 11일에 채혈하였다. 각각의 보강제 100 ng을 사용한 실험 A의 결과는 도 7에 나타내고, 실험 B의 결과는 도 8에 나타낸다. 도 7 및 8에서, PBS-14 및 PBS-96은 놀랍게도 다른 보강제들 보다 근육내 투여시 저용량의 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 증강시키는데 더욱 우수한 것으로 나타났다. OVA + PBS-14 또는 PBS-96 10 ng을 근육내 투여한 후, CD8+ T 세포에 의한 타겟 세포의 특이적인 세포 용혈율은 여전히 60%를 웃돌았지만, OVA + 동량의 PBS-57, PBS-11 또는 αGalCer 투여 후, 타겟 세포의 특이적인 용혈율은 대조군과 구분되지 않았다.
실시예
6.
근육내
주사
후 보강제
함량 감소에 따른
CD8
+ T 세포 반응 증강 비교
전술한 실시예에 기술된 생체내 세포독성 분석을 이용하여 수득한 결과들을 검증하기 위해, 유사한 실험을 수행하였고, 펜타머 분석을 이용한 OVA-특이적인 CD8+ T 세포 비율을 측정함으로써 CD8+ T 세포 활성화를 결정하였다. 간략하게는, 0일에, 다음과 같이, 마우스에 마우스 1마리당 지정된 양의 OVA와 테스트 보강제 화합물 1 ㎍ 또는 100 ng을 근육내 주사하였다:
실험 A:
그룹 1: PBS 100 ㎕;
그룹 2: 50 ㎍의 Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
그룹 3: 50 ㎍ Ova + 1 ㎍ αGalCer;
그룹 4: 50 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-11
그룹 5: 50 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-14
그룹 6: 50 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-57
그룹 7: 50 ㎍ Ova + 1 ㎍ PBS-96
실험 B:
그룹 1: PBS 100 ㎕;
그룹 2: 50 ㎍의 Ova을 PBS 100 ㎕ 중에 투여;
그룹 3: 50 ㎍ Ova + lOO ng αGalCer;
그룹 4: 50 ㎍ Ova + lOO ng PBS-11
그룹 5: 50 ㎍ Ova + lOO ng PBS-14
그룹 6: 50 ㎍ Ova + lOO ng PBS-57
그룹 7: 50 ㎍ Ova + lOO ng PBS-96
14일에 2차 주사를 마우스에 투여하였고, 21일에 마우스에서 채혈하였다. 림프구를 수집하고, H-2Kb SIINFEKL 펜타머 및 CD8 항체를 이용한 FACS 분석으로 분석하여 OVA 반응성인 CD8+ T 세포를 검출하였다. 실험 A의 결과는 도 9에 나타내고, 실험 B의 결과는 도 10에 나타낸다. 도 9에서, PBS-14, PBS-96 및 PBS-57은 1 ㎍ 투여시 백신 접종 후 OVA 특이적인 CD8+ T 세포의 퍼센트를 증가시켰지만, PBS-11과 αGalCer은 효과가 없었다. 도 10에서, PBS-14 및 PBS-96은 100 ng의 저용량 투여시, PBS-57, PBS-11 및 αGalCer에 비해, 항원에 대한 T 세포 반응 증가에 훨씬 더 우수한 것으로 나타났다.
실시예
7.
보강제
및 항원을
근육내
면역화한 후
체액성
반응의 증강 비교
체액성 및 CD4+ T 헬퍼 세포 면역 반응이 테스트 보강제 + 항원의 투여에 의해 증강되는지를 평가하기 위해, IgG1 및 IgG2a 항체 반응을 OVA + 테스트 보강제 또는 OVA로 백신 접종한 마우스에서 측정하였다. 마우스(그룹 당 6마리)에 OVA 50 ng을 단독으로, 또는 하기와 같이 지정된 보강제(양성 대조군으로서 프레운드의 보강제 사용함) 100 ng과 조합하여 근육내 주사하였다:
그룹 1: 500 ㎍ Ova + CFA/IFA (양성 대조군)
그룹 2: 50 ㎍ Ova
그룹 3: 50 ㎍ Ova + 100 ng αGalCer
그룹 4: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-11
그룹 5: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-14
그룹 6: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-57
그룹 7: 50 ㎍ Ova + 100 ng PBS-96
주사한 후 14일째에, 채혈하고, OVA 이소타입의 IgG1 또는 IgG2a에 특이적인 마우스 단일클론 항체를 이용하여 IgG1 및 IgG2a에 대한 ELISA를 수행하였다. 결과는 말초 혈액내 항체 역가, ng/ml로 나타내었다. IgG1에 대한 결과는 도 11에 나타내고, IgG2a의 결과는 도 12에 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, PBS-14, PBS-96 및 PBS-57 모두 활발한 IgG1 역가를 도출할 수 었었고, OVA 단독 또는 OVA + PBS-11 또는 OVS + αGalCer 조합한 경우 보다 OVA 특이적인 IgG1 역가를 증가시킬 수 있었다. 놀랍게도, PBS-14와 PBS-96은 프레운드 보강제와 더불어 OVA 특이적인 IgG2a 역가를 증가시켰으며, PBS-57 보다 훨씬 높았다.
본 발명의 조성물 및 방법은 예시적인 구현예로 기술되어 있지만, 당해 분야의 당업자에게는 본원에 기술된 조성물 및 방법, 방법의 단계 또는 단계 순서에 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 이탈되지 않으면서 변형을 가할 수 있음은 자명할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 생리적으로 모두 관련있는 특정 물질을 본원에 기술된 물질과 치환할 수 있지만, 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 유사한 치환 및 변형들 모두 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 포함된다. 또한, 본원에 나열되거나 기술된 모든 특허 및 공개문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다.
본 명세서와 첨부된 청구항에서, 단수형 "하나(a, an, the)"는 명확하게 표시된 경우를 제외하고는 복수 지칭도 포함한다. 즉, 예컨대, "폴리뉴클레오티드"를 포함하는 조성물은 2종 이상의 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다. 또한, 용어 "또는"는 일반적으로 명확하게 표시된 경우를 제외하고는 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다. 본 명세서에 원용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들의 수준을 나타낸다. 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원들은 각각의 공개 문헌이나 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 표시된 바와 동일한 수준으로 원용에 의해 본원에 명확하게 포함된다. 특허 내용과 통합된 특허, 공개 문헌 및 참조 문헌 사이에 상충되는 경우, 특허 내용에 따라야 한다.
또한, 본원에 인용된 모든 수치 값은 하한 내지 상한의 모든 값을 포함하며, 즉, 하한치와 상한치 사이의 모든 가능한 수치 값의 조합이 본 출원에 명확하게 명시되는 것으로 특히 이해된다.
Claims (25)
- 식 I의 화합물을 포함하는 조성물:
상기 식 (I)에서,
R1은 -H 또는 -OH이고, R2는 -H 또는 -OH이고, x는 18 내지 26의 정수이고, n은 10 내지 15의 정수이다. - 제1항에 있어서, x는 23인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, x는 21인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, n은 13인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항의 조성물과 항원을 포함하는 약학 조성물.
- 항원에 대한 개체의 면역 반응을 증강시키는 방법으로서,
항원과 제1항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 항원에 대한 개체의 면역 반응은 상기 항원에 대한 대조군의 면역 반응에 비해 증강되는 것을 특징으로 하는 방법. - 항원에 대한 개체의 면역 반응을 증강시키는 방법으로서,
항원과 제1항의 조성물을 개체에게 근육내 투여하는 단계를 포함하며,
상기 항원에 대한 개체의 면역 반응은 상기 항원에 대한 대조군의 면역 반응에 비해 증강되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 개체의 면역 반응은 상기 대조군에 비해 적어도 50% 증강되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 개체의 면역 반응은 상기 대조군에 비해 적어도 100% 증강되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 개체의 면역 반응은 상기 대조군에 비해 적어도 1000% 증강되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항원과 제1항의 조성물은 동시 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 복막내, 코내 및 흡입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 항원에 대한 개체의 체액성 면역 반응을 증강시키는 방법으로서,
항원과 제1항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 항원에 대한 개체의 체액성 면역 반응은 상기 항원에 대한 대조군의 면역 반응에 비해 증강되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제14항에 있어서, 상기 체액성 면역 반응은 IgG 항체 생산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 체액성 면역 반응은 IgA 항체 생산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 항원에 대한 개체의 CD4+ T 세포 반응을 증강시키는 방법으로서,
항원과 제1항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 항원에 대한 개체의 면역 반응은 상기 항원에 대한 대조군의 CD4+ T 세포 반응에 비해 증강되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제17항에 있어서, 상기 증강된 CD4+ T 세포 반응은 CD4+ T 림프구의 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 CD4+ T 림프구의 활성화는 Th1 면역 반응 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 CD4+ T 림프구의 활성화는 Th2 면역 반응 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 CD4+ T 림프구의 활성화는 Th1 면역 반응 증가 및 Th2 면역 반응 증가 둘다를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 항원에 대한 개체의 CD8+ T 세포 반응을 증강시키는 방법으로서,
항원과 제1항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 항원에 대한 개체의 면역 반응은 상기 항원에 대한 대조군의 CD8+ T 세포 반응에 비해 증강되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제22항에 있어서, 상기 증강된 CD8+ T 세포 반응은 CD8+ T 림프구의 활성화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 CD8+ T 림프구의 활성화는 세포독성 반응의 증가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 개체의 항원 제시 세포의 활성화를 증강시키는 방법으로서,
항원과 제1항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 항원에 대한 개체의 면역 반응은 상기 항원에 대한 대조군의 항원 제시 세포의 활성화에 비해 증강되는 것을 특징으로 하는 방법.
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