KR20060030047A - 항원보강제를 함유하는 기능적으로 재구성된 바이러스막 - Google Patents

항원보강제를 함유하는 기능적으로 재구성된 바이러스막 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병균 또는 종양 세포의 막 단백질과 같은 항체에 대한 백신에 관한 것이다. 또한 본 발명은 좋게는 바이러스의 천연 지질, 바이러스의 융합 단백질, 양친매성 항원보강제 및 1 이상의 임의의 추가적인 항원을 함유하는 지질 이중층 막인, 막 융합 활성을 가지는 재구성된 바이러스막을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 재구성 바이러스막을 포함하는 약학적 조성물 또한 본 발명에 해당한다.
재구성된 바이러스막, 항원보강제, 양친매성

Description

항원보강제를 함유하는 기능적으로 재구성된 바이러스막{FUNCTIONALLY RECONSTITUTED VIRAL MEMBRANES CONTAINING ADJUVANT}
본 발명은 병원균 또는 종양 세포의 막단백질과 같은 항원에 대하여 유도되는 백신에 관한 것이다. 또한 본 발명은 막 융합능(fusion activity)을 가지고 바이러스의 천연 지질, 양친매성 항원 및 양친매성 항원보강제(adjuvant)를 함유하는 지질 이중층막인 재구성(reconstituted) 바이러스막을 생성하는 방법 및 상기 재구성된 바이러스막을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
관행적으로, 껍질보유(enveloped) 바이러스에 대한 백신은 죽은 약독화(attenuated) 바이러스 또는 생 약독화 바이러스들을 함유하고, 또는 그러한 성분의 제제 (예를 들면 분리 바이러스 또는 소단위 제제)를 포함한다. 백신 접종에서, 상기 제제는 보통 주사로 주입한다. 주사 후에, 상기 백신에 존재하는 단백질 또는 바이러스들은 가지 세포(dendritic cell) 또는 포식세포와 같은 면역계의 항원 전달 세포에 의하여, 그리고 면역계의 작동 세포에 백신의 항원 부분을 전달함으로써 취하게 된다. 백신은 항원 전달 세포가 피하에 풍부하기 때문에 주사하였을 때 효과적이다. 그러나, 현재는 예컨대 코에 있는 점막층에 또한 유사 세포가 존재하는 것이 명백해졌다 (Ogra et al.2001). 면역 반응을 일으키게 하기 위하여 점막층에 존재하는 이러한 포식세포를 유도하려면, 피하에 존재하는 세포에 대한 것보다 더 강한 자극이 필요하다 (Janeway et al. 2001).
백신 중에 포함된 몇몇 바이러스 또는 단백질, 예컨대 인플루엔자 또는 홍역 바이러스의 주입으로 동일한 바이러스에 의한 나중의 감염을 막는데 충분히 강한 면역 반응을 유도하지만, 다른 많은 반응 호흡기 세포융합 바이러스의 경우에는 그러하지 아니하다. 물리적 또는 화학적 방법으로 면역 반응을 강화시키기 위한 수많은 시도가 있었다. 그러한 실험으로부터 도출되는 가장 중요한 원리가 있다: (1) 물리적 자극에서, 바이러스 단백질의 다발의 카피들은 입자들 중에서 결합하기 위하여 필요하다. 상기 입자들은 전체 바이러스, 재구성된 바이러스막 또는 극미립자 담체 상의 단백질일 수 있다. 입자들은 개별적인 소단위보다 면역계를 더 자극시킨다 (Ogra et al.2001 ; Janeway et al. 2001). (2) 한편으로, 화학적 자극은 면역계의 식세포 또는 작동 세포가 항원 전달 세포의 표면에 존재하는 수용체를 통하여, 예를 들면 항원보강제, 상기 수용체가 인지하는 화학적 화합물의 사용을 통하여, 일정한 신호를 받아들이는 것이 필요하다.
충분한 부가의 물리화학적 자극을 주어, 바이러스 단백질이 예컨대 코에 있는 점막에 적용하는 경우라도 강한 면역 반응을 유도할 수 있다 (Ogra et al.2001). 화학적 또는 물리적 방법 또는 이 두 가지 원리의 조합과 같은 방법에 의하여 면역 반응을 자극하는 현재의 대부분의 방법과 조성물은 아래에 기술할 중요한 단점이 있다.
당해 기술 분야에서 개발된 특별한 종류의 백신 조성물에는 지질 이중층에 바이러스 당단백질을 함유하고 있는 "바이로솜(virosome)류"가 알려져 있다. 바이로솜은 일반적으로 세제로 껍질보유 바이러스로부터 막단백질 및 지질을 추출하고, 이어서 지질을 첨가하고, 추출된 바이러스막단백질 및 지질로부터 상기 세제를 제거함으로써 생성되며, 특성 지질 이중층은 지질 이중층으로부터 튀어나온 단백질과 함께 이루어진, 재구성된 바이러스막을 포함할 수 있다 (Stegmann et al. 1987). 바이로솜은 또한 순수 바이러스 단백질과 합성 지질 또는 천연 지질로부터, 또는 이중층을 형성하는 다른 물질로부터 형성된 막을 포함할 수 있다. 바이로솜의 특징적인 면은 천연(native) 바이러스 외피의 기능 작용과 표면 구조, 조성물을 밀접하게 모방한다는 것이다. 상기 바이로솜의 특히 중요한 특성은 천연 바이러스 외피의 수용체 결합 능력 및 막 융합능을 보존하고 있어, 바이러스가 들어갈 수 있는 세포에 바이로솜도 들어갈 수 있고, 이러한 동일 세포에 의한 면역계에 노출된다는 것이다. 수용체 결합 능력 및 막 융합능의 보존은 상기 바이로솜의 면역원성 성질을 완전하게 표현하기 위하여 필수적이다 (Arkema 2000 ; Bungener 2002).
일부 바이러스 항원에서는, 바이로솜이 예를 들면 비강으로 전달된 백신의 경우보다 더 강한 방어 면역 반응을 유도할 수 있다 (WO 88/08718 및 WO 92/19267에 예증). 그러나 다른 바이로솜 제형은 사멸 바이러스 또는 소단위 제제와 비교하여 오직 최저의(marginally) 개선된 면역원성을 나타낸다 (Gluck et al. 1994에 예증). 상기의 인용예에서, 바이로솜은 외인 지질을 첨가하는 것을 포함하는 프로토콜을 통하여 생성하였고, 바이로솜의 조성물은 천연 바이러스 외피의 그것과는 다른 표면 구조로 이루어진 것을 발견하였다. 해당 기술 분야에서 숙련된 자라면, 이 렇게 다른 표면 구조는 생성된 바이로솜의 막 융합 성질과 이에 따라 그들의 면역원성에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다.
상기 백신의 비강 내(鼻腔內) 적용을 허용하여 면역 반응을 증강하기 위하여, 대장균 (열민감독소)으로부터 항원보강제 단백질을 지질 보충 바이로솜 인플루엔자 백신과 혼합하였다 (EP 0538437). 임상 시험은 독소의 첨가가 주입된 백신과 동등한 혈청 항체 역가를 유도하기 위하여 절대적으로 필요하다는 것을 나타내었다 (Gliick et al. 1994). 비록 독소의 첨가가 상기 백신의 면역원성을 증강한다 하더라도, 이는 또한 안면 근육을 일시적으로 마비시키는 벨안면신경마비(bell's palsy)라 알려진 심각한 부작용을 일으킨다. 독소의 항원보강 효과가 항원 전달 세포의 인지에 의한 것이기 때문에, 이러한 경우에 독소 및 바이러스 단백질이 동일한 세포를 접촉한다는 확신이 없으므로, 항원이 활성화된 세포에 의하여 인지될 가능성을 증가시키기 위하여 상대적으로 고농도인 독소가 모든 세포를 활성화시키기 위하여 필요할 것이다. 따라서, 지질이 첨가된 이러한 유형의 바이로솜 제제는 상당수의 약점들을 가진다.
또한 바이로솜은 순수 인플루엔자 항원으로부터 제조되고, 무라밀디펩티드의 유도체와 혼합된다 (EP 0 205098 및 EP 0 487 909). 이러한 경우에, 무라밀디펩티드 유도체는 막을 형성한다. 비록 무라밀디펩티드가 항원보강제이고 그 제형이 인플루엔자 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 것이 알려져 있다 하더라도, 무라밀 디펩티드는 발열성이고 (Kotani et al. , 1976; Dinarello et al. ,1978), 주입 후에 인체로부터 빠르게 제거되며, 육아종(肉芽腫) 및 염증을 유발하는 국소성 독소 를 가진다 (Ribi et al. , 1979; Kohashi et al. , 1980). 게다가 중성 pH에서 제한된 저장 수명을 가지며 (Powell et al.,1988), 그들의 구조적 통합성을 유지하기 위한 최적 pH가 너무 낮아서, 백신 중에서 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 같은 수용체 매개 엔도시토시스에 의거 세포로 진입하는 바이러스의 융합 단백질과 함께 배합할 수 없다. 게다가 상기 합성막은 천연 바이러스막과 꼭 닮은 것이 아니며, 그리하여 상기 합성막에 대한 면역 반응은 바이러스에 대하여 발생하는 면역 반응과 다르게 된다.
바꾸어, 해당 기술 분야의 연구자들은 '면역자극 복합체' (ISCOMs, Morein et al. 1984)와 같은 재구성된 바이러스막과는 다르고, 대부분 퀼라야 소파나리아 몰리나 (Quillaia sopanaria Molina)의 나무껍질로부터 분리된 Quil A (EP0231039B1 ; EP 0109942A1 ; EP0180564A1)와 같은 사포닌 등의 항원보강제와 복합된 바이러스 단백질을 함유하는 복합 항원을 제조하였다. 항원, 콜레스테롤과 같은 지질과 혼합하여, 이러한 항원보강제들은 30 - 40nm 사이의 우리(cage)와 같은 구조를 형성하고, 항원 보강제로서 작용하는 동시에 항원 미립자를 만들었다. 비록 ISCOMs가 수많은 가축(veterinary) 백신 중에서 사용되고 바이러스막단백질의 면역원성을 증강한다 하더라도, 그들의 독소와 혼합물의 복잡성에 대하 우려 때문에 인간을 위한 상기 백신의 개발이 저지되었었다 (Cox et al. 1998).
더욱 최근에는, 수막구균(meningococci)과 같은 박테리아의 순수 외막 단백질의 비공유 복합체로 구성되고, 인플루엔자 헤마글루티닌과 같은 항원 단백질 또는 인체 면역결핍 외피 당단백질과 혼합된 프로테오솜 인플루엔자 백신이 개발되었 다 (미국 출원 제20010053368호). 이러한 복합 박테리아 단백질이 항원보강제로서 작용할 수 있는 반면에, 복합 단백질로 이루어진 상기 혼합물의 복합적인 성질은 조절 문제(regulatory issue)를 야기할 것이다. 게다가 상기 면역 반응은 용액 중에 존재하는 모든 단백질과 기타 항원에 대하여 나타나고, 그 바이러스 단백질에 대해서는 덜 특이적으로 나타난다.
생벡터 치료법 (Biovector Therapeutics)에 의하여 개발된 또 다른 미립자 제형은 항원을 함유하는 지질 외피에 의하여 둘러싸인 탄수화물의 안쪽 중심으로 구성된다.항원으로서 인플루엔자 헤마글루티닌을 사용하여 어느 정도의 면역 반응이 증강되었지만, 더 이상의 개발을 정당화할 만큼 충분히 현저하지는 않다.
호흡기도(呼吸氣道)의 복제가 최소화 된 인플루엔자 바이러스의 저온 적응 균주와 같은 호흡 바이러스의 생(生) 약독화 버전(live attenuated versions)이 비강 투여형 백신으로 개발된 바 있다. 이러한 백신은 야생형 바이러스에 감염됨으로써 유도되는 천연 면역에 가까운 면역 반응을 일으킨다는 뚜렷한 장점을 가진다. 인플루엔자의 경우, 그 백신은 1980년대 이래로 알려져 있으나 현재에 이르러서야 시판이 임박한 것으로 보인다. 이러한 시판화의 지연은 많은 바이러스들이 공유하고는 급속한 변이 능력으로 인해, 약독화 바이러스가 부분적으로 또는 전적으로 야생형 바이러스로 복귀함으로 해서, 예방하고자 하는 병을 유발하는데 그 원인이 있었다.
상기와 같은 이유 때문에, 비록 ISCOM 및 프로테오솜과 같은 조성물이 개발된다 하더라고, 특별히 스스로는 강한 면역 반응을 일으키지 못하는 병원균을 위한 그리고 비강 내와 다른 점막층에 적용을 위한 면역 반응을 유도하기 위하여, 강한 면역 반응을 일으키고 생(生)바이러스를 함유하며 독소가 낮은 잘 특성화된 백신 조성물이 여전히 필요하다는 것은 당해 기술 분야에서 잘 인정되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 전술한 수많은 문제점과 어려움을 해결하는 새로운 수단과 방법을 제공한다. 본 발명은 양친매성 항원보강제 및 항원을 포함하는 재구성된 바이러스막을 제공하는데, 이 중 상기 항원보강제 및 항원은 서로 소수성 상호작용하고, 둘 다 재구성된 바이러스막의 지질 이중층막에 존재하며, 재구성된 바이러스막은 EP 0 538 437에 따라 제조된 바이로솜 보다 더 우수한 막 융합능을 가진다. 상기 재구성된 바이러스막은 재구성된 바이러스막을 유도한 바이러스 외피의 조성물, 표면 구조 및 기능적 성질과 더욱 밀접하게 닮았다. 또한 본 발명은 다음 단계의 일부 또는 전부를 포함하는, 상기 재구성된 바이러스막을 생산하는 방법을 제공한다: i)적절한 세제로 바이러스를 용해하고 ii) 바이러스 유전 물질 및 중심(core) 단백질을 제거하며 iii) 세제를 포함하는 용액 중에서 1 이상의 항원보강 활성을 갖는 양친매성 분자 및 항원을 접촉시키고; iv) 막을 재형성하는 환경 하에서 세제를 제거한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 재구성된 바이러스막, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 제제를 제공하고, 본 발명에 따른 상기의 재구성된 바이러스막 또는 약학적 제제의 비강 내, 경구 또는 비경구 전달에 의한 치료 또는 예방의 용도를 제공한다.
발명에 대한 설명
첫 번째 측면에서, 본 발명은 재구성된 바이러스막을 보유한다. 상기 재구성된 바이러스막은 좋게는 (a) 지질 이중층; (b) 바이러스의 융합 단백질; (c) 양친매성 항원보강제; 및 (d) 선택적으로 여분의 항원을 포함한다. 상기 재구성된 바이러스막에서, 지질 이중층은 상기 바이러스의 융합 단백질에 의하여 유발되는, 상기 바이러스막과 상기 바이러스의 천연 숙주의 숙주 세포와의 융합과 양립 가능한(compatible) 지질 조성을 갖는 것이 좋다. 지질 조성물은 융합의 최적 pH에서 융합하는 것이 좋다. 상기 융합 단백질, 양친매성 항원보강제 및 좋게는 또한 임의의 다른 항원이 지질 이중층의 소수성 내부와 상호 작용하는데, 다시 말하면 이중층의 지질과 및/또는 서로가 소수성 상호작용을 통하여 바이러스막의 이중층과 결합하고, 바이러스막의 이중층에 통합하며 및/또는 바이러스막의 이중층 중에 함몰되는 것이 좋다. 융합 단백질 및 양친매성 항원보강제는 공유 결합 되어 있지 않은 것이 더욱 좋다. 양친매성 항원보강제와 추가적인 항원 또한 공유 결합하지 않은 것아 좋다. 본 발명의 바이러스막은 지질, 좋게는 바이러스의 천연 지질, 양친매성 항원보강제, 바이러스 융합 단백질 및 1 이상의 항원을 포함하는 기능적으로 재구성된 바이러스막이 좋고, 이중 양친매성 항원보강제, 지질 바이러스 융합 단백질 및 항원은 주로 소수성 상호작용을 통하여 작용하며, 이중 양친매성 항원보강제의 소수성 부분은 좋게는 지질 이중층막의 구성 부분이고, 이중층은 또한 융합 단백질, 항원(들) 및 지질을 함유한다. 기능적으로 재구성됨에 의하여, 재구성막은 막 융합능을 가진다. 바람직한 재구성된 바이러스막은 소수포(小水疱)의 형태이다.
본 명세서에서 바이러스의 바이러스 융합 단백질은 바이러스의 내재성 막단백질, 보통 적절한 포유동물 (또는 조류) 세포의 표면상에서 발현된다면 적절한 pH에서 바이러스의 천연 숙주 세포와 세포 융합을 유도할 수 있는 껍질보유 바이러스의 내재성 막단백질을 의미한다 (예를 들면 Hernandez et al.,1996 참조). 재구성된 바이러스막에 합일화되는 바이러스 융합 단백질의 예에는 셈리키 삼림 바이러스 El 단백질, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 단백질, HIV gpl20/gp41 단백질, 파라믹소바이러스류의 F 단백질이 있다. 융합을 유도하는 바이러스 융합 단백질은 두 가지 유형으로 구별할 수 있다. 예를 들면 HIV gpl20/gp41 단백질에 의하여 유도되는 것과 같은 첫 번째 유형의 융합은, 중성 pH에서 표적 숙주 세포의 표면에서 일어난다. 예를 들면 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 단백질에 의하여 유도되는 것과 같은 두 번째 유형의 융합은, 낮은 pH (5.0 - 6.5)에서 숙주 세포의 엔도솜 구획 내로부터 내재화한다. 두 가지의 융합 유형 모두 본 발명에 명확하게 포함된다.
따라서 숙주 세포와 융합하기 위한 본 발명의 재구성된 바이러스막의 능력은 적절한 바이러스 융합 단백질의 존재에 의존한다. 그러나 합성 지질로 구성된 바이로솜 및 바이러스 융합 단백질이 당해 기술 분야에서 융합할 수 없는 것으로 기술된 것과 같이, 이 능력은 재구성된 바이러스막의 이중층의 지질 조성물에 더 의존한다. 따라서 재구성된 바이러스막의 지질 조성물은 적절한 pH에서 막이 적절한 숙주 세포와 융합할 수 있도록 선택되는 것이 좋다. 재구성된 바이러스막의 융합 능력은 예를 들면 본 명세서의 실시예 3에 기재된 것과 같은 적혈구 빈껍질(erythrocyte ghost) 융합 분석법으로 분석할 수 있다. 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하는 재구성된 바이러스막에서, 문제의 헤마글루티닌에 최적인 pH에서 1μM 바이로솜을 50 μM 적혈구 빈껍질 막 인지질과 혼합한다면, 상기 분석에서 바람직한 융합능은 1분 후에 적혈구 빈껍질과 적어도 30 %의 재구성된 바이러스막 소수포의 융합을 유도한다.
상기의 분석에 의하여 시험할 수 없는 다른 재구성된 바이러스막의 바람직한 융합 작용은, 그들의 융합 단백질을 유도한 바이러스에 의하여 감염될 수 있는 세포에 재구성된 바이러스막을 첨가하여 융합하는 것이다. 상기 재구성막들은 그들의 융합 단백질의 기원이 되는 바이러스에 의하여 융합될 세포들의 적어도 10%를 융합해야 한다.
융합능을 가지는 재구성된 바이러스막을 제공하는 하나의 바람직한 지질 조성물에는, 바이러스의 천연 지질을 포함하는 지질 조성물이 있다. 본 명세서에서 "바이러스의 천연 지질"라는 용어는 세포, 좋게는 포유동물에서, 또는 발육란에서 성장하는 바이러스의 막중에 존재하는 지질을 의미한다. 따라서 바이러스의 천연 지질은 합성 지질과는 반대로, 그렇게 성장한 바이러스 입자로부터 분리하거나 얻는 것이 좋다. 그러나 본 발명의 기능적으로 재구성된 바이러스막은 천연 지질 외에, 예를 들면 합성 지질과 같은 다른 근원으로부터 정제된 지질을 포함할 수 있다. 따라서 융합능을 가지는 재구성된 바이러스막을 제공하기 위한 지질 조성물은 천연 바이러스막으로부터 얻거나 얻을 수 있는 조성물이 좋다. 따라서 본 발명에서 사용되는 지질 조성물은 오로지 바이러스의 천연 지질로만 구성된 조성물, 다른 근원으로부터의 지질이 추가된 바이러스의 천연 지질로 구성된 조성물, 천연 바이러스막의 지질 조성물과 비슷한 다른 근원들로부터의 지질로 구성된 조성물을 포함한다.
본 명세서에서 항원보강제는 인간 또는 동물을 면역시키기 위하여 항원과 조합하여 사용되었을 때, 항원보강제 그 자체에 대한 특이 면역 반응을 일으키지 않으면서 면역계를 자극함으로써, 항원에 대한 면역 반응을 일깨우고 증강시키고 용이하게 하는 모든 물질 또는 화합물을 포함하는 것이 좋다. 항원보강제가 없다는 것을 제외하고는 동일한 조건 하에서 항원에 대하여 일어나는 면역 반응과 비교할 때, 바람직한 항원보강제는 일정 항원에 대하여 적어도 1.5, 2, 2.5, 5, 10 또는 20의 배수만큼 면역 반응을 증강한다. 대응하는 대조군에 비하여, 동물 또는 인간군에서 항원보강제에 의하여 발생하는 일정 항원에 대한 면역 반응의 통계적 평균 증강량을 측정하기 위한 실험이 당해 기술 분야에서 이용될 수 있다. 항원보강제는 적어도 두 가지의 다른 항원에 대하여 면역 반응을 증강할 수 있는 것이 좋다. 본 발명의 항원보강제는 예를 들면 인터류킨, 인터폐론 및 다른 호르몬과 같은 포유동물에 내재적인 면역자극 화합물을 제외하고, 보통 포유동물에게 이질적인 화합물일 것이다. 본 발명의 기능적으로 재구성된 바이러스막 중에 혼입된 항원보강제는 양친매성 항원보강제인 것이 좋다.
"양친매성 항원보강제"란 용어는 좋게는 물 중에서 그 자체로 소수포 또는 마이셀의 지질 이중층과 결합하거나 더 좋게는 소수포 또는 마이셀의 지질 이중층에 통합되고, 극성 (머리 군;head group) 모이어티 지향 환경과 함몰된 소수성 막을 가지는, 지질펩티드 및 당지질과 같은 화합물을 함유하는, 모든 항원보강제를 포함하는 것을 의미한다. 또한 상기 용어는 이중층막의 내부인 소수성 부위와 접촉하는 소수성 모이어티와, 막의 극성 표면인 외부를 향하는 극성 머리 군 모이어티를 가지고 지질 이중층 (바이러스의 천연 지질을 포함)에 안정하게 혼입되는 모든 양친매성 항원보강제를 포함한다. 그러나 엄밀히 말하면 양친매성이 덜 뚜렷하여 극성 머리 군 모이어티가 없거나 희박한, 그러나 지질 이중층 소수포에 결합하거나 통합될 수 있는 더 소수성인 항원보강제들이 본 발명에서 제외되는 것은 아니다. 따라서 본 명세서에서 항원 보강 작용을 갖는 "양친매성 항원보강제"는 재구성된 바이러스막을 형성할 수 있는 조건 하에서, 수분 환경 중에서 1 이상의 관심 항원 및 바이러스의 천연 지질과 함께 재구성된 바이러스막을 형성할 수 있는 천연적 또는 (부분적으로) 합성된 항원보강제를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 재구성된 바이러스막에 존재하는 양친매성 항원보강제는 예를 들면 당해 기술 분야에서 일정하게 조절된 조건하에서 시험한 항원보강 활성을 가지는 양친매성 물질인 QuilA 또는 다른 사포닌과 달리, 인간에게 사용하는 것이 약학적으로 허용 가능하다. 본 발명의 양친매성 항원보강제는 항원에 공유 결합하지 않지만 재구성막의 지질 이중층 중에서 함께 존재하는 것이 좋다. 항원 및 항원보강제가 공유 결합하지 않음으로 해서 항원의 프로세싱과 면역계에 대한 항원의 에피토프의 제시가 천연 단백질 단독인 상황과 본질적으로 동일해지고, 이로 인하여 천연 병원균에 존재하는 단백질을 잘 인지할 수 있게 한다. 다른 한편으로, 지질 이중층에 대한 항원 및 항원보강제의 소수성 상호작용(그리고 서로에 대한 소수성 상호작용)은 제제 중에서 재구성된 바이러스막에 항원보강제 및 항원이 분산되도록 하고, 이로 인하여 제제 중에서 대부분의 막 소수포들은 단일 소수포 내에 항원 및 항원보강제를 둘 다 함유하며, 더 좋게는 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 95%의 소수포가 항원 및 항원보강제를 둘 다 함유한다. 단일막 또는 단일 소수포 중에서 항원 및 항원보강제의 조합은 항원보강제에 의하여 활성화되는 항원 전달 세포에 항원을 전달하게 하고, 그로 인하여 재구성된 바이러스막의 치료 및/또는 예방 효과를 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 항원보강제는 항원 전달 세포상에 존재하는 톨형 수용체 (Toll-like receptor; TLR)에 의하여 인지된다. TLR에 의하여 인지되는 다양한 화합물이 당해 기술 분야에 알려져 있고, 이는 예컨대 지질펩티드, 지질다당질, 펩티도글리칸, 지질타이코산, 지질단백 (미코플라스마, 미코박테리아 또는 스피로카이타류로부터의), 두 가닥 RNA (poly I: C), 메틸화되지 않은 DNA, 지질아라비노만난(lipoarabinomannan), 플라젤린, CpG 함유 DNA 및 이미다조퀴놀린류가 있다. 모든 TLR 인식 화합물이 항원보강제로서 적합한 것은 아니다. 예컨대 야생형 그람 음성 박테리아 지질다당질의 독소는 항원보강제로 사용되기에는 너무 높아서, 인간에게 사용하기에는 약학적으로 허용 가능하지 않다. 그러나 다른 TLR 인식 화합물을 항원보강제로서 사용할 수 있다. 그러한 TLR 인식 항원보강제는 그 자체로 양친매성 항원보강제일 수 있고, 또는 예를 들면 극성 TLR 리간드에 소수성 화합물이 결합함으로써 (아래 참조) 양친매성 항원보강제로 변형될 수 있다. 다른 방법으로 양친매성 항원보강제는 다른 수용체를 표적으로 삼을 수 있다. 바람직한 양친매성 항원보강제는 합성적으로 또는 반합성적으로 생산할 수 있는 지질펩티드이다. 양친매성 항원보강제로서 사용되기 위한 바람직한 지질펩티드는 항원보강 작용을 하며, 인간에게 사용하는 것이 약학적으로 허용 가능하다. 본 발명의 지질펩티드는 보통 1 이상의 (올리고) 펩티드와 공유 결합한 지방산류, 지질, 세라마이드, 플라스마로전, 알킬 또는 알켄 사슬 또는 스테롤로부터 선택되는 1 이상의 소수성 화합물로 구성되는 분자이다. 일반적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 지질펩티드는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 아미노산을 포함하는 것이 좋고, 상기 펩티드는 좋게는 양전기로 하전 된 아미노산, 좋게는 리신 및 아르기닌을 40-70% 포함하며, 상기 펩티드는 좋게는 1 이상의 세린 및/또는 시스테인을 포함한다. 특히 좋은 지질펩티드는 표 1에 열거되어 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 양친매성 항원보강제는 당지질이다. 양친매성 항원보강제로서 사용되는 바람직한 당지질은 항원보강 활성을 가지고 인간에게 사용하는 경우 약학적으로 허용 가능하다. 당지질은 1 이상의 당류에 공유적으로 결합 된 지질(또는 다른 소수성 화합물)이다. 매우 바람직한 구체예에서 본 발명은 당지질이 α-갈락토실세라마이드 또는 포스파티딜 이노시톨 만노시드인, 본 발명에 따른 재구성된 바이러스막을 제공한다.
"α-갈락토실세라마이드" 및 "포스파티딜 이노시톨 만노시드"라는 용어는 이들의 모든 유도체를 포함하는 의미다. 항원보강 활성을 가지고 본 발명에서 유용한 상기 분자의 유도체는 예를 들면 US 5,936,076 및 US 4,542,212에 각각 기재되어 있다. 본 발명에 사용되는 다른 적절한 당지질 항원보강제에는 예를 들면 LPS의 지질 A 부분의 독성이 감소 된 그람 음성 박테리아의 내독소 지질다당질류 (LPS)의 변질형 형태가 있고, 이는 유전적으로 변질형 그람 음성 병원균으로부터 얻을 수 있으며 W0 02/09746에 기재되어 있다.
본 발명에서 양친매성 항원보강제로서 사용되는 변질 LPS는 독성이 감소 된 변질형 지질 A 모이어티를 가지는 것이 좋다. 변질 LPS의 독성은 좋게는 대응하는 야생형 LPS의 독성보다 낮고, 더욱 좋게는 변질 LPS의 독성은 야생형 LPS의 독성보다 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 또는 0.2% 더 낮다. 야생형의 독성과 다양하게 변질되어 독성이 감소 된 LPS의 독성은 당해 기술 분야에 알려진 모든 적합한 분석법에 의하여 측정될 수 있다. 독성을 측정하는, 즉 변질 LPS의 생물학적 활성을 측정하는 바람직한 분석법에는, MM6 큰포식세포 세포주 중에서 TNF 알파 유도를 위한 WEHI 시험이 있다 (Espevik and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95: 99-105; Ziegler-Heitbrock et al. , 1988, Int. J. Cancer 41: 456-461). 다른 한편으로, 독성이 감소 된 변질 LPS는 여전히 충분한 면역자극 활성, 즉 항원보강 활성을 가진다. 독성이 감소 된 변질 LPS는 좋게는 대응하는 야생형 LPS의 면역자극 활성의 적어도 10, 20, 40, 80, 90 또는 100%를 가진다. 면역자극 활성은 상기에 기재된 바와 같이 또는 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 실험실 동물의 생체 내에서 측정할 수 있거나, 또는 생체 외에서, 예를 들면 피험 LPS와 함께 배양함으로 해서 자극된 가지 세포의 성숙도를, LPS 자극형 가지 세포에 의한 적어도 1 종의 시토킨(예컨대 IL 12, IL 10, TNF-알파, IL 6 및IL-1-베타 중 하나)의 생산량을 측정하거나, 또는 LPS 자극형 가지세포 상에서 적어도 한 개의 공자극(costimulatory) 분자 (예를 들면 CD40 또는 CD86)의 발현량을 측정함으로써 시험할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 바이로솜에 존재하는 양친매성 항원보강제는 펩티드, 좋게는 양친매성 펩티드이다. 양친매성 항원보강제로서 사용되기 위한 바람직한 펩티드는 항원보강 활성을 가지며 인간에게 사용하는 것이 약학적으로 허용 가능하다. 항원보강 활성을 갖는 펩티드, 특히 극성 펩티드는 적절한 소수성 화합물을 (공유적으로) 연결시킴으로서 양친매성 항원보강제로 만들 수 있다 (아래 참조). 또한, 양친매성 펩티드는 아래에 기재한 것처럼 막횡단 서열과 같은 아미노산의 소수성 뻗침(stretch)을 포함할 수 있다. 바람직한 펩티드는 노치 리간드 재그드-1 (Notch ligand jagged-1)으로부터의 서열 (Weijzen et al. , 2002; Genbank accession no. AAC 52020 참조) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A로부터의 서열을 포함할 수 있다. 재그드-1 또는 단백질 A 유래의 서열을 갖는 펩티드는 좋게는 적절한 소수성 화합물 (위에 참조)과 공유적으로 결합하고 또는 결합하거나, 막횡단 서열 (아래 참조)을 포함한다. 지질 이중층으로부터 튀어나온 펩티드로부터 유래된 재그드-1 또는 단백질 A의 (극성) 부분은 좋게는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 이하의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 재구성된 바이러스막은 좋게는 비경구 투여 및 점막 (예를 들면 비강 내 또는 경구) 투여 양쪽에 모두 적절하다. 그러나 본 발명의 중요한 측면은, 본 발명의 재구성된 바이러스막은, 일반적으로는 항원을 포함하는 병원균에 의한 후속적인 감염을 막기 위하여 처리하는 물질을 비강 내 전달하여 충분한 면역 반응을 일으키지 못하는 항원을 비강 내에 전달할 수 있다는 것이다.
본 발명의 재구성된 바이러스막은 바이러스 융합 단백질 및 선택적으로 추가적인 항원을 포함한다. 따라서 바이러스 융합 단백질만을 포함하고 추가적인 항원이 없는 재구성된 바이러스막은, 바이러스 융합 단백질이 융합 단백질로서 기능할 뿐만 아니라 또한 항원으로서 작용하는 경우에는, 본 발명의 일부로 보아야 할 것이다. 따라서 다른 한편으로는, 상기 재구성된 바이러스막은 바이러스 융합 단백질 외에 1 이상의 추가적인 항원을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재구성된 바이러스막의 일부분인 항원은 재구성된 바이러스막 소수포의 지질 이중층막 내에 삽입될 수 있는 소수성 부분을 가지는 것이 좋다. 바이러스, 박테리아, 효모 및 기생충과 같은 많은 병원균은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 그들의 캡시드, 세포벽 또는 세포막, 단백질을 가지고 간다. 예를 들면 막횡단 구역과 같은 소수성 요소를 가지는 본 발명에 따른 재구성된 바이러스막의 일부분에 적합한 항원의 예는, 병원균의 막 (또한 바이러스의 경우 외피라 칭함) 중에서 존재하는 단백질이다. 그러므로, 좋게는, 본 발명의 재구성된 바이러스막에 존재하는 항원은 내재성 막단백질이다. 본 발명의 재구성된 바이러스막에 존재하는 항원 단백질은 바이러스막 또는 세포막상에서 나타내는 것과 동일한 방식이지만, 그러나 막 지질 이중층에 존재할 때 보통 부분적으로 또는 적어도 일시적으로 숨은 에피토프가 존재할 수 있다. 이러한 항원 전달 재구성된 바이러스막에 의한 면역계의 자극은 면역게 세표에 의한 그들의 특이적 인식, 그들의 특성, 단백질의 존재 및 숨은 에피토프가 드러내지는 것의 조합 때문일 수 있다. 좋게는, 본 발명의 재구성된 바이러스막 중에서 사용되는 항원 단백질은 1 이상의 보호 에피토프, 즉 포유동물 중에서 항원을 유도하는 병원균에 의한 감염에 대하여 보호하는 또는 항원을 발현하는 종양에 대하여 보호하는 면역 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 항원은 바이러스, 기생충, 곰팡이 또는 박테리아로부터 유래된다. 특히 상기 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유도되는 재구성된 바이러스막이 좋다. 본 발명의 재구성된 바이러스막 중에서 사용될 수 있는 인플루엔자 바이러스로부터의 단백질은 헤마글루티닌 (HA) 단백질, 뉴라미니다아제 (NA) 단백질 및/또는 M2 단백질을 단독으로 또는 조합하는 것이 좋다.
본 발명에 따라 재구성된 바이러스막의 형성에 사용하고 적용할 수 있는 항원은 모든 종류의 바이러스로부터 유도될 수 있고, 비제한적인 예로 다음의 바이러스가 있다: 인체 면역결핍 바이러스 (HIV)와 같은 레트로바이러스과; 풍진바이러스; 파라인플루엔자 바이러스와 같은 파라믹소바이러스과, 홍역, 볼거리, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 폐렴바이러스; 황열병 바이러스와 같은 플라비바이러스과, 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스 (HCV), 일본 뇌염 바이러스 (JEV), 진드기매개뇌염, 세인트루이스 뇌염바이러스 또는 서부 나일강 열바이러스; 단순헤르폐스 바이러스와 같은 헤르폐스바이러스과, 거대세포바이러스, 엡스타인바 바이러스; 분야바이러스과; 아레나바이러스과; 한탄과 같은 한타바이러스과; 코로나바이러스과; 인체 유두종바이러스와 같은 파포바바이러스과; 광견병바이러스와 같은 랍도바이러스과. 인간 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스과; 알파바이러스과, 아터리바이러스과, 에볼라바이러스와 같은 필로바이러스과, 아레나바이러스과, 두창 바이러스와 같은 폭스바이러스과 및 아프리카 돼지열바이러스. 상기 항원과 마찬가지로 병원균 박테리아, 곰팡이류 (효모 포함) 또는 기생충으로부터 유도할 수 있다. 그러한 항원에는 예를 들면 헬리코박터 필로리(H. pylori)와 같은 헬리코박터(Helicobacter), N. 멘기티디스(mengitidis)와 같은 나이세리아(Neisseria), H. 인플루엔자(influenza)와 같은 헤모필루스(Hemophilus), B. 백일해(pertussis)와 같은 보르데텔라(Bordetella), 클라미디아(Chlamydia), 스트렙토코커스 sp. 혈청형 A와 같은 스트렙토코커스(Streptococcus), V. 콜레라(cholera)와 같은 비브리오(Vibrio) 및 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter), 에스체리아(Escherichia)를 포함하는 그람 음성 창자 병원균의 박테리아 항원과, 탄저병, 나병, 결핵, 디프테리아, 라임 질환, 매독, 장티푸스 및 임질을 유발하는 박테리아로부터의 항원이 있다. 기생충으로부터의 항원은 예를 들면 바제오시스 보비스(Babeosis bovis)와 같은 원생동물, 열원충(Plasmodium), 리슈만편모충(Leishmania) spp. 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 및 크루스파동편모충(T. cruzi)과 같은 파동편모충(Trypanosoma)이 있다. 곰팡이 항원은 아스폐르길루스(Aspergillus) sp., 칸디다알비칸스(Candida albicans), 예를 들면 크립토코커스네오포르만스(C.neoformans)와 같은 크립토코커스(Cryptococcus) 및 히스토플리스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)와 같은 곰팡이로부터의 항원이 있다.
비록 백신 접종은 병원균에 대한 예방 보호를 위하여 또는 그 뒤의 병원균 감염을 치료하기 위하여 일반적으로 적용된다 하더라도, 당해 기술 분야에서 숙련된 자라면 종양 치료용 백신으로 적용할 수 있다. 게다가 인간 또는 인간화 항체에 의하여 표적으로 삼을 수 있는 적당한 개체로서 종양 특이 단백질의 수가 증가하는 것으로 알려진다. 또한 그러한 종양 특이 단백질은 본 발명의 범위 내이다. 많은 종양 특이 항원이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 그러므로 하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 종양 특이 항원을 포함하는 재구성된 바이러스막을 제공한다. 적절한 종양 항원에는 예를 들면 암배아 항원, 전립선 특이 막 항원, 전립선 특이 항원, 단백질 MZ2-E, 다형의 상피성 무친 (PEM), 엽산결합단백질 LK26, 끝이 잘린(truncated) 표피성장인자수용체(EGRF), 톰센 프리덴라이크(Thomsen-Friedenreich; T) 항원, GM-2 및 GD-2 강글리오시드, Ep-CAM, 무친-1, 상피(epithialial) 당단백질-2 및 콜론 특이적 항원이 있다.
이러한 병원균으로부터의 바람직한 항원은 내재성 막단백질이다. 그러나 보호 에피토프를 함유하는 비막단백질 항원 또는 이의 부분은 또한 본 발명에서 사용되기 위하여 막횡단 서열과 융합하여 변질될 수 있다. 막횡단 서열 또는 막 고정 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 포유동물 막횡단 분자의 유전 기하학에 기초한다. 막횡단 서열은 보통 약 10-30, 대개 20 아미노산 가량의 뻗친 구조(stretch)로 구성되어 있고, 대부분은 소수성 곁사슬을 가진다. 막횡단 서열은 많은 다양한 단백질이 알려져 있고 이들 모두 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 막 고정 서열의 예에는 예를 들면 CD8, ICAM-2, IL-8R, CD4 및 LFA-1로부터 유래된 것을 포함한다. 좋게는 막횡단 서열은 천연적으로 바이러스막에 존재하는 바이러스 내재성 막단백질로부터 유래된다. 그 예에는 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 당단백질 G의 막횡단 부위 (예를 들면 아미노산 38 내지 63) 또는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제의 막횡단 부위 (예를 들면 아미노산 7 내지 27)가 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계의 전부 또는 일부를 포함하는 재구성된 바이러스막의 제조 방법을 제공한다: (a) 세제를 포함하는 용액 중에서 양친매성 항원보강제, 바이러스 융합 단백질, 임의의 추가적인 항원 및 지질을 혼합하고; (b) 양친매성 항원보강제 및 바이러스 융합 단백질이 지질 이중층의 소수성 내부와 상호작용하고, 좋게는 양친매성 항원보강제 및 바이러스 융합 단백질은 공유 결합하지 않으며, 또한 좋게는 양친매성 항원보강제 및 임의의 추가적인 항원은 공유 결합하지 않는 지질 이중층을 포함하는 바이러스막을 재구성하고, 이로 인한 재구성된 바이러스막은 융합능을 가지도록 하는 조건 하에서 세제의 농도를 낮추며; (c) 선택적으로, 재구성된 바이러스막을 정제하고; 및 (d) 선택적으로, 재구성된 바이러스막을 약학적 조성물로 제형화한다. 바이러스 지질을 준비하기 위하여, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함할 수 있다: i) 옥타에틸렌글리콜모노-N-도데실에테르와 같은 적절한 세제로 바이러스를 용해하고 ii) 예를 들면 차동(differential) 초원심분리에 의하여 바이러스 유전 물질 및 중심 단백질을 제거한다. 세제를 적절한 비율로 제거하고 투석, 투석 여과 또는 소수성(및/또는 크기 배제) 비드에 흡착에 의하여 세제의 농도를 낮추어서 막이 재형성되도록 하며, 이중 좋게는 상기 재구성된 바이러스막에 존재하는 양친매성 항원보강제와 바이러스 융합 단백질 및 또한 좋게는 추가적인 항원이 이중층막의 내부인 소수성 부위와 및/또는 서로 소수성 상호작용하는 것이 좋다. 바이러스는 대부분의 껍질보유 바이러스와 같은 막 함유 바이러스가 좋다. 천연 바이러스 지질의 근원으로서 사용되기에 바람직한 바이러스에는 인플루엔자 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 오르파라믹소바이러스가 있다.
좋게는, 본 발명에 의하여 개시된 재구성된 바이러스막의 제조 방법은 상기 재구성된 바이러스막을 정제하는 단계를 포함한다. 재구성된 바이러스막의 정제 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있고, 예를 들면 차동 및 밀도 기울기 원심분리 및/또는 크로마토그래피 (크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피)가 있다. 세제는 표면 활성이 있는 양친매성 분자이다. 적절한 세제는 효과적으로 바이러스막을 용해하나, 융합 단백질, 바이러스 캡시드 및/또는 중심 단백질을 변성시키지 않는 세제로서, 예를 들면 옥타에틸렌글리콜 모노-N-도데실에테르와 같은 양성 이온 세제이다.
소수성 상호작용은 수분 환경 중에서 존재하는 소수성 물질 사이의 비공유, 비정전기적 인력에 기인한다. 또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 재구성된 바이러스막을 활성 성분으로서 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 또한 약학적으로 허용 가능한 안정화제, 삼투성 완화제, 완충제, 분산제 등은 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 적용 방법에 따라 다르다. 약학적 담체는 재구성된 바이러스막을 환자에게 전달하기에 적절하게 호환되고 비독성인 모든 물질일 수 있다. 비강 내 전달을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체의 예에는 물, 완충 식염수 용액, 글리세린, 폴리소르베이트 20, 크레모포(cremophor) EL 및 카프릴산/카프르산 글리세라이드의 수분 혼합물이 있고, 중성 pH 환경을 제공하도록 완화할 수 있다. 비경구 전달을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체의 예에는 무균의 완충된 0.9% NaCI 또는 선택적으로 20% 알부민이 보충된 5% 글루코오스가 있다. 비경구 투여용 제제는 살균해야 한다. 폴리펩티드 또는 항체를 투여하기 위한 비경구 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥 내, 복막 내, 근육 내, 동맥 내 또는 병변 내 경로에 의한 주사 또는 주입에 따른다. 재구성된 바이러스막은 일시 주사에 의하여 투여하는 것이 좋다. 근육 내 주사를 위한 통상적인 약학적 조성물은 예를 들면, 1-10 ml의 인산염 완충 식염수와 본 발명의 재구성된 바이러스막의 1 내지 100μg, 좋게는 15-45μg (항원 단백질)을 함유하도록 조성된다. 경구 투여에서, 활성 성분은 엘릭시르(elixir), 시럽 및 현탁액과 같은 액제(liquid dosage) 형태로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 액제 형태는 환자의 수용성을 높이기 위하여 색상이나 향을 함유할 수 있다. 비경구적으로, 경구적으로 또는 비강 내로 투여하는 조성물을 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science (15th ed. , Mack Publishing, Easton, PA,1980)를 포함하여 다양한 원천에 더욱 상세히 기재되어 있다 (그 내용 전부가 본 발명에 참고로 통합된다). 또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 또는 예방에 효과적인 양의 본 발명의 재구성된 바이러스막을(약학적 조성물에 포함) 예방 또는 치료에 필요한 만큼 환자에게 투여함으로써, 감염병 또는 종양에 대한 백신 접종 방법, 또는 감염병 또는 종양을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 재구성된 바이러스막을 약제, 좋게는 감염병 또는 종양의 백신 접종 또는 예방 또는 치료용 약제로서 사용하는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명은 감염병 또는 종양의 백신 접종 또는 예방 또는 치료용 약제의 제조하는데 본 발명의 재구성된 바이러스막을 사용하는 것에 관한 것이다.
도 1: 항원보강제 함유 재구성된 바이러스막의 지질펩티드, 단백질 및 지질 사이의 물리적 연합을 분석하기 위하여 사용된 자당 기울기(sucrose gredient)의 개략도.
도 2: 도 1에서 약술된 기울기 상의 10/40% 자당 경계로부터 검출된 지질 및 지질펩티드의 2차원 박층 크로마토그램. 패널 A: 대조군인 지질펩티드를 함유하지 않은 재구성된 바이러스막으로서 닌히드린 반응 천연 바이러스 지질을 나타낸다. 패널 B: 지질펩티드를 함유하는 재구성된 바이러스막으로서 닌히드린과 반응한 천연 바이러스 지질과, 추가로 닌히드린 반응 지질펩티드를 나타낸다. 크로마토그램은 2차원으로 개발되었다: 시스템 1 CHC13/메탄올/H2O 65/25/4, 시스템 2 N-부탄올/아세트산/물 2/1/1. 그리고 닌히드린 염색으로 유도체화함으로써 염색한다. 시료가 부가된 부위는 "점"으로 표시하였다.
도 3: 본 발명에 다른 지질펩티드를 함유하는 재구성된 바이러스막의 전자 현미경 사진; 인몰리브덴산암모늄을 이용한 음성 염색. 막은 직경 약 100-200 nm이다.
도 4: 코 및 폐 중에서 14일 간격으로 두 번 A/파나마/2007/99로 비강 내 백신 접종한 후의 IgA 역가(力價); 역가는 마지막 백신 접종 3주 후 측정하였다. 이전의 면역(pre-immumne) 역가는 감산하였다. 백신은 표준 상업 소단위 백신, EP 0538437에 따라 제조된 바이로솜 또는 본 발명에 따른 지질펩티드를 함유하는 재구성된 바이러스막을 사용하였다. 군의 크기는 10마리의 마우스이다.
도 5 : 14일 간격으로 두 번 비강 내 백신 접종한 후의 IgG 역가(力價); 역가는 마지막 백신 접종 3주 후 측정하였다. 이전의 면역(pre-immumne) 역가는 감산하였다. 백신은 EP 0538437에 따라 제조된 바이로솜 또는 본 발명에 따른 지질펩티드를 함유하는 재구성된 바이러스막을 사용하였다. 표시된 바와 같이 각각 한 가지의 바이러스 균주를 함유하는 4 가지의 다른 백신 제제를 10마리의 마우스로 구성된 4개의 군에 백신 접종하기 위해 사용하였다.
도 6: 본 발명에 따른 재구성된 바이러스막의 융합능. 피렌-인지질을 함유하는 재구성된 바이러스막을 적혈구 빈껍질과 혼합하고, 본문에 따라 융합을 측정하였다.
도 7: 단일 근육 내에 백신을 접종한 후에 혈액 중에서의 IgG 역가; 역가는 마지막 백신 접종 3주 후 측정하였다. 이전의 면역(pre-immumne) 역가는 감산하였다. 백신은 EP 0538437에 따라 제조된 바이로솜 또는 본 발명에 따른 지질펩티드를 함유하는 재구성된 바이러스막을 사용하였다. 군의 크기는 10마리의 마우스이다.
도 8: 평형 밀도 자당 기울기로 바이러스의 A/와이오밍 균주로부터의 재구성된 바이러스막을 분석하고 재구성 물질의 단일 밀도 피크를 나타내었다; 지질펩티 드는 구역 4,5 및 6에서 회수하였다.
도 9: 10마리의 마우스로 이루어진 군에 0일 및 14째에 비강 내 백신을 접종한 후에 혈액 중의 IgG 역가. 항원은 바이러스의 A/파나마/2007/99 균주로부터 얻었고, 막은 N-팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(프롤릴)3-프롤린을 함유한다.
도 10 : 10마리의 마우스로 이루어진 군 중에서 지질펩티드 N-팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(프롤릴)3-프롤린을 함유하는 A/파나마/2007/99 균주의 재구성막을 14일 간격으로 비강 내 두 번 백신 접종한 후의 코 및 폐 중에서의 IgA 역가; 역가는 마지막 백신 접종 3주 후 측정하였다. 이전의 면역(pre-immumne) 역가는 감산하였다.
실시예 1: 지질펩티드 N 파니토일(pahnitoyl)-S-2, 3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, 인플루엔자 바이러스의 천연 지질 및 인플루엔자 막단백질을 함유하는 재구성된 바이러스막의 제조.
인플루엔자 바이러스는 세계 인플루엔자 센터(World Influenza Center) 또는 미국 유형 조직 배양 수집 (American Type Tissue Culture Collection; ATCC)로부터 입수한 바이러스를, 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 알려진 방법, 예컨대 발육란 또는 배양 세포에서 바이러스를 키우는 방법을 이용하여 배양함으로써 얻었다. 그 다음 바이러스를, 좋게는 차동 또는 밀도 기울기 초원심분리 또는 이들을 조합함으로써 정제하였고, 후속적으로 확립된 표준 공정에 따라 베타-프로피오락톤 또는 포름알데히드로 비활성화시킬 수 있다.
정제하고 농축된 인플루엔자 A/파나마/2007/9 바이러스 (1500 nmol 인지질)을 100 mM의 농도에서 (상기 세제의 농도는 임계 마이셀 농도가 필요하다) 10분 동안, 4℃에서, 145 mM NaCI, 2.5 mM HEPES, 1 mm EDTA, pH 7.4 (완충액 A)의 중성 pH의 등장성 완충액 중에서, 1 ml의 세제 옥타 (틸렌 글리콜)-n-도데실 모노에테르 (C12E8) (Boehringer,Mannheim, Germany)와 배양하였다. 그 다음 30분 동안 4℃에서 100,000 x g에서 원심분리하여 바이러스 뉴클레오캡시드 및 기질 단백질을 제거하였다. 침전물을 버리고, 상청액을 바이러스 지질 750 nmol 당 지질펩티드 0.5 mg의 비율로 건조 지질펩티드와 혼합하고, 지질펩티드가 용해될 때까지 혼합하였다. 그 다음 128 mg의 바이오비드(BioBead) SM-2 (바이오 래드; Bio-Rad)를 각 350 마이크로리터의 혼합물에 첨가하였고, 세제는 혼합물 및 비드를 1 시간 동안 격렬히 교반함으로써 제거하였다. 그 다음 상기 용액을 또 다른 64 mg의 이러한 비드에 옮기고 계속하여 10분 동안 교반하였다. 생성된 혼탁 상청액은 재구성된 바이러스막을 함유하고, 정제하거나 정제하지 않고 백신 접종에 사용할 수 있다.
지질, 지질펩티드 및 바이러스 단백질 사이의 물리적 결합을 분석하기 위하여, 완충액 A 중에서 40% 자당 (w/v)의 1 mL의 쿠션(cushion)과 완충액 A 중에서 10% 자당 (w/v)의 4 mL의 꼭대기 층을 포함하는, 비연속적인 자당 기울기의 꼭대기에 재구성된 바이러스막을 함유하는 혼탁 혼합물을 로딩하였다. 상기 기울기는 100.000gmax에서 90분 동안 원심 분리하였고, 40% 쿠션, 40% 쿠션과 10% 꼭대기 층 사이의 경계면, 그리고 꼭대기로부터 시료를 수집하였다. 이러한 기울기 중에서, 혼합되지 않은 바이러스 단백질은 원심분리하는 동안 쿠션으로 이동하였고, 재구성된 바이러스막에 존재하지 않는 지질 및 지질펩티드는 기울기의 꼭대기로 이동하였으며, 재구성된 바이러스막은 경계면에서 발견할 수 있었다 (도 1). 바이러스 지질의 15%와 지질펩티드 6%는 기울기의 꼭대기 근처에서 발견되었다. 85%의 바이러스 지질, 94%의 지질펩티드 및 기울기에 로딩된 바이러스막단백질 60%는 재구성된 바이러스막 밴드(band)와 결합 된 상태로 발견되었다.
밴드의 지질 조성물을 분석하기 위하여, 상기 프로토콜에 따라 제조하거나 지질펩티드를 첨가하지 않고 제조한, 두 가지의 재구성된 바이러스막 시료를 전술한 자당 기울기의 40/10% 경계면으로부터 회수하고, Folch et al. (1957)에 따라 CHCL3/MeoH로 추출하였다. 추출된 지질 및 지질펩티드를 첫 번째 용리액으로서 CHC13/메탄올/H20 65/25/4을 사용하는 2차원 박층 크로마토그래피로 분석하고, 이어서 N 부탄올/아세트산/물 2/1/1에 의하여 분석하며, 닌히드린 염색으로 유도체화함으로써 염색하였다 (플레이트에 N-부탄올 중의 2% 닌히드린으로 분무하였고, 80에서 10분 동안 배양하였다). 그 결과는 도 2에 나타내었고, 바이러스의 천연 지질과 지질펩티드가 물리적으로 결합하였음을 명백히 증명하였다.
기울기의 밴드로부터 수집된 바이로솜의 전자 현미경 사진을 도 3에 나타내었고, 이는 인플루엔자 바이러스의 특징인 바이러스 항원 돌기를 표시하는 바이러 스의 입자 크기를 명확히 보여준다.
실시예 2: 지질펩티드 N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시-)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, 인플루엔자 바이러스의 천연 지질 및 인플루엔자 막단백질을 함유하는 재구성된 바이러스막을 이용한 비강 내 면역화 실험
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 및 N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신을 함유하는 재구성된 바이러스막의 비강 내 적용하는 것에 의한 백신 접종을, 표준 소단위 백신 또는 EP 0538437에 따라 제조된 바이로솜 백신을 비강 내 적용하는 것과 비교하였다. Balb/C 마우스에 0 및 14일째에 5μg의 인플루엔자 단백질을 함유하는 항원 10 마이크로리터를 비강 내 방울 주입함으로써 면역시켰다. 0일, 14일 및 35일째에 혈액 시료를 채취하고, 35일째에는 코 및 폐 세척물(washes)을 수집하였다. 인플루엔자 바이러스의 여러 다른 균주들을 비교하였다; 마우스는 각각 한 종류의 균주로 면역시켰다. 폐 세척물은 기관에 연결된 주사기를 통하여 폐에 1.5 ml의 PBS를 주입하고, 이어서 1 mL의 체액을 흡인함으로써 이루어졌다. 코 세척물은 기관을 통하여 코인두에 역방향으로 0.5 ml의 PBS를 주입함으로써 이루어지고, 콧구멍에서 세척액을 수집하였다. 조직파편 및 세포 성분을 즉시 원심분리에 의하여 세척액으로부터 제거하고, 단백분해효소 억제제 혼합물 (건조 DMSO 중에서 1000 x 농축 원액으로부터 최종 농도 1 μg/ml의 케마스틴(chemstatin), 아안티폐인(antipain), 레우펩틴(leupeptine), 펩스 타틴(pepstatin))을 첨가하였고, 그 후 시료를 액체 질소에서 냉동시키고 분석시까지 -20℃에서 저장하였다. 시료는 코 및 폐 중에서 IgA에 의하여, 그리고 인플루엔자 단백질에 대한 IgG ELISA에 의하여 분석하였다. 그 결과는 도 4 및 도 5에 각각 나타내었다.
실시예 3: 지질펩티드N-팔미토일-S-2, 3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, 인플루엔자 바이러스의 천연 지질, 피렌 표지 포스파티딜콜린 및 인플루엔자 막단백질을 함유하는 재구성된 바이러스막의 막 융합능.
정제 및 농축된 인플루엔자 A/파나마/2007/9 바이러스(1500 nmol 인지질) 을 10분 동안 4℃에서, 145 mMNaCl, 2.5 mM HEPES, 1 mm EDTA, pH 7.4 (완충액 A)의 중성 pH의 등장성 완충액 중에서 100 mM의 농도인 옥타 (에틸렌 글리콜)-n-도데실 모노에테르 (C12E8) 1 ml와 배양하였다. 그 다음 30분 동안 4℃에서, 100,000 x g의 원심 분리에 의하여 바이러스 뉴클레오캡시드 및 기질 단백질을 제거하였다. 침전물을 버렸다. 바이러스 지질 750 nmol 당 0.5 mg의 지질펩티드와 150 nmol의 1-헥사데카노일-2- (1-피렌데카노일)-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린의 비율로 건조 지질펩티드 및 피렌 표지 인지질을 혼합하고, 지질펩티드 및 피렌 표지 인지질가 용해될 때까지 혼합하였다. 그 다음 128 mg의 바이오비드 SM-2 (바이오 래드)을 각 350 마이크로리터의 혼합물에 첨가하였고, 혼합물 및 비드를 1 시간 동안 격렬히 교반함으로써 세제를 제거하였다. 그 다음 추가로 상기 비드 64 mg에 수액을 옮기 고, 10 분 동안 교반을 계속하였다.
막 융합의 측정을 위하여, 적혈구 빈껍질 표적 막은 오래된 적혈구 농축물 (혈액형 B, 레서스 인자 음성)으로부터, pH 5.1에서 140 mM NaCI, 15 mM 구연산 나트륨을 함유하는 완충액 중에서 0.06 M 농도의 빈(ghost)인지질 및 1 μM의 바이로솜 인지질에서 측정하는 Steck and Kant (1974) 융합 방법에 의하여 제조하였다. 지질 혼합은 pyrPC의 희석에 의하여 모니터하였다. 이러한 목적으로, 피렌 엑시머 형광을 방출 빔에서 475 nm 차단 필터의 존재하에 각각 345 nm (주파수폭 2 nm) 및 490 nm (주파수폭 16 nm)의 여기(excitation) 및 방출 파장에서 측정하였다. 배경 형광은 0.2 M C12E8 35μl을 첨가함으로써 얻어지는 프로브의 무한 희석시 평가하였다. 형광 중에서 변화는 f = 100x(Eo-E)/ (Eo-Fy)로 계산함으로써 융합의 정도(f)를 변환시켰는데, E는 항상 엑시머 형광을 나타내고, Eo와 Fy는 각각 0 및 C12E8를 첨가한 후의 시간에서 490 nm에서의 강도를 나타내며, 둘 다 희석 효과를 감안하여 보정하였다. 도 6에서 보인 결과는 재구성막의 강한 융합능을 명백히 나타낸다.
실시예 4: EP 0538437에 따라 제조된 바이로솜으로 면역화한 것과 비교하여, 지질펩티드 N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필- 시스테이닐-세릴-(리실)3 -리신. 인플루엔자 바이러스의 천연 지질 및 인플루엔자 막단백질을 함유하는 재구성된 바이러스막을 이용한 근육 내 면역화 실험.
25 μl의 인플루엔자 항원 (5μg의 단백질)을 0일째에 Balb/C 마우스의 한쪽 후각(後脚) 근육에 주입하였다. 혈액 시료를 0일 및 14일째에 채취하였다. 바이러스의 A/파나마/2007/99 균주는 백신 제제용으로 사용하였다. 시료는 인플루엔자 헤마글루티닌에 대한 IgG ELISA에 의하여 분석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 5: 평형 밀도 기울기 원심분리에 의한 A/와이오밍 막단백질을 함유하는 기능적으로 재구성된 바이러스막의 물리적 특성화
지질펩티드 N 팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신을 함유하는 재구성된 바이러스막은 실시예 1에 기재된 바와 같이, 10-60% w/v 자당 기울기 꼭대기에 로딩하고, 16시간 동안 베크만 SW55 로터(Beckman SW55 rotor)에서 50 000 rpm으로 원심 분리하여 제조하였다. 이러한 종류의 기울기에서는, 지질 및 지질펩티드는 꼭대기에 남고, 단백질은 맨 아래 부분으로 이동한다. 기울기로부터의 시료를 굴절측정, 단백질 및 인지질 측정에 의하여 분석하였다. 도 8에 도시된 결과는 본질적으로 모든 바이러스 단백 및 대부분의 바이러스 지질이 단일 피크에서 함께 정제된 것을 나타낸다. 또한 지질펩티드는 오직 분획 4,5 및 6에서만 회수되었다. 이러한 데이터는 재구성막이 약 1.12 g/ml의 밀도를 가진 입자라는 것을 가리킨다.
실시예 6: 지질펩티드 N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(프로필)3-프롤린, 인플루엔자 바이러스의 천연 지질 및 인플루엔자 막단 백질을 함유하는 재구성된 바이러스막을 이용한 비강 내 면역화 실험.
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 A/파나마/2007/99로부터 막을 제조하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 마우스를 면역시키는데 사용하였다. 혈청 중에서 ELISA IgG가 및 코 및 폐 중에서 IgA가를 도 9 및 도 10에서 각각 나타내었다. 이러한 데이터는 N-팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-의 프롤린 유도체 및 리신이 대략 동등한 면역 반응의 증강을 보인 것으로 나타났다.
[표 1] 본 발명에 따른 재구성된 바이러스막을 제조하는데 특히 적절한 지질펩티드
N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-세린
S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-세린
N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
N-팔미토일-S-2,3 (비스올레오일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리신)
N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
N-팔미토일-S-3 (팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
N-팔미토일-S-2,3 히드록시-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신
N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(프롤릴)3-프롤린
N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(글루타미닐)3-글루타민산
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Claims (15)

  1. 다음의 특징을 가지며, 그의 지질 이중층은 바이러스의 융합 단백질, 양친매성 항원보강제 및 선택적으로 추가적인 항원을 포함하는 것인, 재구성된 바이러스막:
    (a) 상기 지질 이중층은 상기 융합 단백질의 기원이 되는 바이러스와 융합할 수 있는 세포막과 상기 바이러스막과의, 융합 단백질에 의하여 유발되는 융합과 양립 가능한(compatible) 지질 조성을 가지고;
    (b) 상기 융합 단백질 및 양친매성 항원보강제는 지질 이중층의 소수성 내부와 상호작용하며;
    (c) 상기 융합 단백질, 상기 양친매성 항원보강제 및 임의의 추가적인 항원은 공유적으로 결합하지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지질 이중층은 바이러스막의 천연 지질을 포함하는 것인 재구성된 바이러스막.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양친매성 항원보강제는 지질펩티드, 당지질 또는 펩티드인 것인 재구성된 바이러스막.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 양친매성 항원보강제는 포유동물의 톨형(Toll-like) 수용체에 대한 리간드인 것인 재구성된 바이러스막.
  5. 제3항에 있어서, 상기 지질펩티드는 N 팔미토일-S-2, 3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-세린, S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-세린, N 팔미토일-S-2,3(비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, N-팔미토일-S- 2,3(비스올레오일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, S-2,3 (비스올레오일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-세린-(리실)3-리신, N-팔미토일-S-2,3 (비스미리스토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, S-2,3(비스미리스토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, N-팔미토일-S-3 (팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신 및 N-팔미토일-S-2,3 히드록시-프로필-시스테이닐-세릴-(리실)3-리신, N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(프롤릴)3-프롤린, N-팔미토일-S-2,3 (비스팔미토일옥시)-프로필-시스테이닐-세릴-(글루타미닐)3-글루타민산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 재구성된 바이러스막.
  6. 제3항에 있어서, 상기 당지질은 포스파티딜 이노시톨 만노시드, 알파-갈락토실세라마이드 또는 독성이 감소 된 변질형 지질다당질인 것인 재구성된 바이러스 막.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항원은 내재성 막단백질인 것인 재구성된 바이러스막.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 항원인 것인 재구성된 바이러스막.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것인 재구성된 바이러스막.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항원은 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다아제 (NA) 또는 M2 단백질인 재구성된 바이러스막.
  11. 제8항에 있어서, 상기 항원은 레트로바이러스과, 풍진바이러스, 파라믹소바이러스과, 플라비바이러스과, 헤르폐스바이러스과, 분야바이러스과, 아레나바이러스과, 한타바이러스과, 코로나바이러스과, 파포바바이러스과, 랍도바이러스과, 코로나바이러스과, 알파바이러스과, 아터리바이러스과, 필로바이러스과, 아레나바이러스과, 폭스바이러스과 및 아프리카 돼지열바이러스로 구성된 군에서 선택되는 바이러스로부터 유도되는 것인 재구성된 바이러스막.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항원은 기생충, 박테리아, 곰팡이, 효모로부터 유도되고, 또는 상기 항원은 종양 특이 항원인 재구성된 바이러스막.
  13. (a) 세제를 포함하는 용액 중에서 양친매성 항원보강제, 바이러스 융합 단백질, 임의의 추가적인 항원 및 지질을 혼합하고;
    (b) 양친매성 항원보강제 및 바이러스 융합 단백질이 지질 이중층의 소수성 내부와 상호작용함으로 인하여, 양친매성 항원보강제와 바이러스 융합 단백질이 공유 결합하지 않고, 양친매성 항원보강제와 임의의 추가적인 항원이 공유 결합하지 않으며, 이에 따라 재구성된 바이러스막은 융합능을 가지도록 하는 지질 이중층을 포함하는 바이러스막을 재구성할 수 있는 조건으로 세제의 농도를 낮추며;
    (c) 선택적으로, 재구성된 바이러스막을 정제하고;
    (d) 선택적으로, 재구성된 바이러스막을 약학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함하는 재구성된 바이러스막의 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의하여 정의된 재구성된 바이러스막과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 비강 내, 경구 또는 비경구 투여용으로 적 절한 것인 약학적 조성물.
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