CN1805754A - 含有佐剂的功能性重建病毒膜 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疫苗，其针对抗原如病原体或肿瘤细胞的膜蛋白。本发明还涉及形成具有膜融合活性的重建病毒膜的方法，所述病毒膜是脂双层，优选地含有一种病毒的天然脂质、一种病毒融合蛋白、一种或更多种任选的其它抗原以及两亲性佐剂。含有此类重建病毒膜的药物组合物也是本发明的一部分。
Description
技术领域
本发明涉及针对如来自病原体或肿瘤细胞的膜蛋白这样的抗原的疫苗。本发明进一步涉及产生具有膜融合活性的重建病毒膜的方法和包含该重建病毒膜的药物组合物，所述重建病毒膜是含有病毒的天然脂质、两亲性抗原以及两亲性佐剂的脂双层。
背景技术
典型地，抗有包膜病毒的疫苗含有灭活病毒或减毒活病毒，或者含有上述病毒组分的制剂(例如，裂解病毒或亚单位制剂)。对于接种疫苗而言，这些制剂通常被注射。注射后，存在于所述疫苗中的病毒或蛋白被免疫系统的抗原呈递细胞例如树突细胞或巨噬细胞摄取，随后将所述疫苗的抗原部分呈递给免疫系统的效应细胞。由于皮肤下的抗原呈递细胞最为丰富，因此疫苗在注射时是有效的。然而，目前已经清楚类似的细胞也存在于例如鼻粘膜中(Ogra等，2001)。为了诱导存在于粘膜中的这些吞噬细胞产生免疫应答，需要比皮肤下存在的那些细胞所需刺激更强的刺激(Janeway等，2001)。
虽然注射某些含于疫苗中的病毒或蛋白例如流感或麻疹病毒诱发了足以抵御由同一病毒导致的后期感染的保护性免疫应答，然而对于很多其它病毒例如呼吸道合胞病毒则不是这样。已经对通过物理或化学的方式来加强免疫应答进行了大量的尝试。从这种试验中所呈现出的最重要的原则是：(1)对于物理刺激，多拷贝的病毒蛋白需要组合成颗粒。这些颗粒可以是完整的病毒、重建病毒膜或微粒载体上的蛋白。颗粒对免疫系统的刺激优于单个亚单位(Ogra等，2001；Janeway等，2001)。(2)另一方面，化学刺激需要免疫系统的吞噬细胞或效应细胞通过存在于抗原呈递细胞表面的受体，例如通过这些受体所识别的佐剂、化合物的使用接受某些信号。
由于病毒蛋白具有足够的附加理化刺激，即使在应用于粘膜例如用于鼻粘膜时它也可诱发强烈的免疫应答(Ogra等，2001)。目前通过这样的方式(通过化学和/或物理的方式)用于刺激免疫应答的绝大多数方法和组合物均存在显著的缺点，这将被概述于下。
现有技术中开发出的一种特殊种类的疫苗组合物被称为“病毒体”，其为含有病毒糖蛋白的脂双层。病毒体可含有重建病毒膜，其通常通过用去污剂从有包膜病毒提取膜蛋白和脂质，然后添加脂质，并除去从所提取的病毒膜蛋白和脂质中除去所述去污剂而制备，从而形成具有从其突出的蛋白的特征性脂双层(Stegmann等，1987)。病毒体也可包括由纯化的病毒蛋白和合成脂质或天然脂质，或其它可能形成双层的物质所形成的膜。病毒体的特征是其精确地模拟了天然病毒包膜的组成、表面构造和功能活性。所述病毒体的一个尤其重要的特征涉及天然病毒包膜的受体结合和膜融合活性的保留，这使得病毒体能够进入病毒可进入的相同细胞，并可通过这些相同的细胞呈递给免疫系统。受体结合和膜融合活性的保留对于所述病毒体的全部免疫原性特征的表达是必需的(Arkema 2000；Bungener 2002)。
对于某些病毒抗原而言，即使当例如鼻内输送疫苗时，病毒体仍诱发保护性免疫应答，该免疫应答可以是强烈的免疫应答(如WO 88/08718和WO 92/19267中所述)。然而，与灭活病毒或亚单位制剂相比，其它病毒体制剂仅展现出略微增强的免疫原性(如在Glück等1994中所述)。在这一所引用的实例中，病毒体通过包括添加外源脂质的方法产生，申请人已经发现这导致了与天然病毒包膜不同的病毒体组成和表面构造。本领域技术人员已知这样的不同的表面构造可能影响所制备的病毒体的膜融合特性并从而影响其免疫原性。
为了增强免疫应答，允许经鼻内施用该疫苗，将来自大肠杆菌(Escherichia coli)的佐剂蛋白(热不稳定毒素)与添加了脂质的病毒体流感疫苗(EP0538437)混合。临床试验显示添加毒素是诱导与被注射的疫苗等效的血清抗体效价绝对必需的(Gliick等1994)。虽然添加毒素确实由此增强了该疫苗的免疫原性，但其也诱发了一系列的副作用，通称贝耳氏麻痹，一种面肌的暂时性麻痹。由于毒素的辅助效应归因于抗原呈递细胞对毒素的识别，在这种情况下毒素和病毒蛋白并非将必然接触相同的细胞，因此为了确保激活每个细胞，增加抗原被激活细胞识别的机会将需要相对高浓度的毒素。因此，添加了脂质的该类病毒体制剂有相当多的缺点。
病毒体也已通过与胞壁酰二肽衍生物混合的纯化的流感抗原进行制备(EP 0205098和EP 0487909)。在该情况下，胞壁酰二肽衍生物形成膜。尽管胞壁酰二肽是一种佐剂，且该制剂被发现确实增强了对流感抗原的免疫应答，胞壁酰二肽是热原性的(Kotani等，1976；Dinarello等，1978)，在注射后被迅速地清除出体内，且其具有局部毒性，可导致肉芽肿和炎症(Ribi等，1979；Kohashi等，1980)。而且，它们在中性pH值时的储存寿命有限(Powell等，1988)，维持其结构完整性的最佳pH值太低以至于不能使其与通过受体介导的胞吞作用进入细胞的病毒的融合蛋白例如流感病毒的血凝素一起配制疫苗。而且，这样的合成膜不能很好地模拟天然病毒膜，因此对它们的免疫应答将与抗该病毒所产生的免疫应答不同。
或者，本领域技术人员也已制备了与重建病毒膜不同的复合抗原，例如“免疫刺激复合物”(ISCOM，Morein等，1984)，其含有与佐剂例如皂苷象Quil A相复合的病毒蛋白(EP0231039B1；EP0109942A1；EP0180564A1)，其中绝大多数分离自Quillaia sopanaria Molina的茎皮。通过与抗原和脂质例如胆固醇混合，这些佐剂形成30-40nm的笼状结构使得抗原颗粒化，且同时起佐剂的作用。尽管ISCOM已用于众多兽医疫苗中，且增强了病毒膜蛋白的免疫原性，其毒性和混合物的复杂性仍限制了开发用于人的这类疫苗(Cox等，1998)。
最近，开发出了蛋白体流感疫苗(美国专利申请20010053368)，其由抗原蛋白例如流感血凝素或人免疫缺陷包膜糖蛋白与纯化的细菌外膜蛋白例如脑膜炎球菌素混合而成的非共价复合物所组成。尽管这些多种细菌蛋白可以用作佐剂，这种由多种蛋白质组成的混合物的复合特性将提出一个关于调节的问题。而且，免疫应答针对溶液中存在所有蛋白和其它抗原，而对病毒蛋白的特异性较低。
由Biovector Therapeutics开发的另一种微粒制剂由碳水化合物内核组成，该内核被含有抗原的脂质包膜环绕。以流感血凝素作为抗原时，免疫应答观察到免疫应答有少许增强，但并不显著到足以确保进一步的显色。
呼吸道病毒的减毒活病毒形式，例如呼吸道中最小复制的流感病毒的冷适应毒株已被开发成为鼻内疫苗。这些疫苗在诱导免疫应答与野生型病毒感染诱导的自然免疫相接近的免疫应答方面具有明显的优势。对于流感而言，这种疫苗自20世纪80年代以来已为公众所知，现已接近商业化。导致这一延迟的原因在于许多病毒共享的快速突变的能力致使减毒病毒部分或全部逆转为野生型病毒，由此实际上导致了其本来想要预防的疾病。
由于上述原因，在本领域中已充分意识到，尤其是对于诱导针对其自身不诱导强烈的免疫应答的病原体的免疫应答，和对于鼻内和其它粘膜应用，尽管已开发出了组合物例如ISCOM和蛋白体，但仍非常需要可诱发强烈的免疫应答，不含有活病毒，且具有低毒性的特性良好的疫苗组合物。
发明概述
本发明提供了解决上述多种问题和难题的新的手段和方法。本发明提供了一种重建病毒膜，其包含与重建病毒膜的脂双层膜共存的两亲性佐剂和抗原，其中所述佐剂和所述抗原通过疏水作用而互相作用，其中重建病毒膜具有膜融合活性且其优于根据EP0538437制备的病毒体的膜融合活性。重建病毒膜进一步高度模拟重建病毒膜所来源的病毒包膜的组成、表面结构和功能特性。本发明进一步提供了一种用于生产所述重建病毒膜的方法，该方法包括下述步骤中的某些步骤或所有步骤：i)在合适的去污剂中溶解病毒；ii)除去该病毒的遗传物质和核心蛋白；iii)在含有去污剂的溶液中，将具有佐剂活性的一种或多种两亲性分子与抗原接触；和iv)在允许膜重新形成的条件下除去去污剂。
此外，本发明提供了一种药物制剂，其包含根据本发明的重建病毒膜和一种药学上可接受的载体；以及所述重建病毒膜或根据本发明的药物制剂经鼻内、口服或肠胃外输送在治疗或预防中的用途。
发明内容
第一方面，本发明涉及一种重建病毒膜。该重建病毒膜优选含有：(a)脂双层；(b)病毒的融合蛋白；(c)两亲性佐剂；和(d)任选地，一种其它抗原。在所述重建病毒膜中，优选地，所述脂双层具有的脂质组成适合于在病毒膜与病毒的天然宿主的宿主细胞之间发生融合，如由所述融合蛋白诱导的融合。优选地，脂质组成适合于在最佳融合pH值时的融合。优选地，所述融合蛋白、两亲性佐剂以及优选地还有任选的其它抗原与脂双层的疏水性内部相互作用，即通过与所述脂双层的脂质和/或彼此间的疏水作用而与病毒膜的脂双层相结合、掺入和/或包埋于病毒膜的脂双层中。进一步优选所述融合蛋白与两亲性佐剂不发生共价连接。优选地，所述两亲性佐剂和所述其它抗原也不发生共价连接。本发明的病毒膜优选是功能性重建病毒膜，其含有脂质优选病毒的天然脂质、两亲性佐剂、病毒融合蛋白和一种或多种抗原，其中所述两亲性佐剂、脂质病毒融合蛋白和抗原主要通过疏水作用发生相互作用，其中所述两亲性佐剂的疏水部分优选地形成脂双层膜的膜内在部分，所述双层进一步包含所述融合蛋白、抗原和脂质。功能性重建意指重建病毒膜具有膜融合活性。优选的重建病毒膜以小泡的形式存在。
病毒的融合蛋白在本申请中被理解为病毒的膜内在蛋白，通常是有包膜病毒的膜内在蛋白，其如果在适合的哺乳动物或鸟类细胞表面上被表达，则可在合适的pH值下诱导细胞与该病毒的天然宿主细胞发生融合(例如参见Hernandez等，1996)。适于掺入重建病毒膜中的病毒融合蛋白的实例包括塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)E1蛋白、流感病毒血凝素(HA)蛋白、HIV gp120/gp41蛋白、副粘病毒的F蛋白。能区分出两种类型的病毒融合蛋白诱导的融合。第一种类型的融合，例如由HIV gp120/gp41蛋白所诱导的融合，在中性pH值下发生于目标宿主细胞的表面上。第二种类型的融合，例如由流感病毒血凝素(HA)蛋白诱导的融合，紧随内在化在较低的pH值(5.0-6.5)下从宿主细胞的内体区室中发生。两种类型的融合均被特别包含于本发明中。
因此本发明的重建病毒膜与宿主细胞相融合的能力依赖于是否存在合适的病毒融合蛋白。但是，由于现有技术中已描述了由合成脂质和病毒融合蛋白组成的病毒体不能融合，故这一能力还进一步依赖于重建病毒膜的脂双层的脂质组成。因此对重建病毒膜的脂质组成进行了优选，以使得所述膜能在合适的pH值下与合适的宿主细胞融合。重建病毒膜的融合能力可以在如本申请实施例3中所描述的红细胞血影融合分析(erythrocyte ghost fusion assay)中进行检测。对于含有流感血凝素的重建病毒膜，若将1μM病毒体与50μM红细胞血影膜磷脂在所述血凝素的最适pH值下相混合，在该测定中的优选融合活性在一分钟后诱导了至少30％的重建病毒膜小泡与红细胞血影的融合。
不能通过上述分析进行检测的其它重建病毒膜的优选融合活性是能在向细胞中添加所述重建病毒膜后即发生融合，其中所述细胞能被其融合蛋白所来源的病毒感染。重建病毒膜应与至少10％的细胞融合，所述细胞将被其融合蛋白所来源的病毒融合。
提供具有融合活性的重建病毒膜的一种优选的脂质组成是含有病毒的天然脂质的脂质组成。术语“病毒的天然脂质”在本申请中意指理解为是生长在细胞优选哺乳动物细胞上或生长在含胎卵上的病毒的膜中存在的那些脂质。与合成脂质不同，病毒的天然脂质因此优选地获自或分离自以这种方式生长的病毒颗粒。然而，除天然脂质外，本发明的功能性重建病毒膜可以含有来自其它来源的纯化脂质，例如合成脂质。因而，提供具有融合活性的重建病毒膜的脂质组成优选地是获自或可获自天然病毒膜的组成。因而，用于本发明的脂质组成包括只由病毒的天然脂质构成的脂质组成、由添加了其它来源的脂质的病毒天然脂质构成的脂质组成以及由多种来源的脂质构成的组成，它们可模拟天然病毒膜的脂质组成。
佐剂在本申请中意指在包括任何当其与抗原联合使用对人或动物进行免疫时刺激免疫系统，并由此激发、增强或促进抗所述抗原的免疫应答的物质或化合物，优选不产生针对该佐剂自身的特异性免疫应答。在除了不含佐剂的相同条件下针对所述抗原所产生的免疫应答相比，优选的佐剂增强了抗给定抗原的免疫应答至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。测定在一组动物或人中测定相对于相应对照组由佐剂产生的抗给定抗原的免疫应答的统计学平均增强的实验是本领域中已知的。所述佐剂优选地能增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。本发明的佐剂通常为哺乳动物外源性化合物，从而将哺乳动物内源性免疫刺激化合物例如白介素、干扰素和其它激素排除在外。待掺入至本发明的功能性重建病毒膜中的佐剂优选为两亲性佐剂。
术语“两亲性佐剂”意指包括任何佐剂，其包括化合物如脂肽和糖脂，具有疏水膜包埋和环境导向的极性部分(头部基团)，且其优选地通过自身，可连接，或更优选地可整合至于水中的脂双层小泡和胶束中。该术语也包括任何被稳定地掺入到脂双层(含有病毒的天然脂质)中的两亲性佐剂，其疏水部分与内区(脂双层的疏水区)接触，其极性头部基团部分朝向外部(该膜的极性表面)。然而，更多的具有较低的显著两亲性的疏水佐剂，即不具有或具有微弱极性的头部基团部分，但其可连接，或掺入到脂双层小泡中，这样的两亲性佐剂特别地包含在本发明中。本申请种使用具有佐剂活性的“两亲性佐剂”因此包括天然产生的或(部分)合成的佐剂，其能与一种或多种感兴趣的抗原和病毒的天然脂质一起在能够形成重建病毒膜的条件下于水环境中形成重建病毒膜。
在一个优选的实施方式中，存在于重建病毒膜中的两亲性佐剂对于用于人类是药学上可接受的，与例如Quil ATM或其它皂苷不同，其是在本领域特定试验中已测定的具有佐剂活性的两亲物。本发明的两亲性佐剂优选不与抗原共价连接而是共存于所述重建膜的脂双层中。抗原和佐剂不发生共价连接的事实确保抗原的处理和将其表位呈递给免疫系统的情形与单独的天然蛋白基本一致，这保证了对天然病原体上存在的蛋白质的良好识别。另一方面，所述抗原和所述佐剂与所述脂双层间(及互相间)的疏水作用使佐剂和抗原分散到制剂中重建病毒膜上，由此制剂中大多数膜小泡在单个小泡中同时包含抗原和佐剂，更优选至少60、70、80、90、95或95％的小泡同时包含抗原和佐剂。抗原和佐剂在单个膜或小泡中的联合使得抗原输送给由佐剂激活的抗原呈递细胞，由此增强了所述重建病毒膜的治疗和/或预防作用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述两亲性佐剂被存在于抗原呈递细胞上的Toll-样受体(TLR)识别。被TLR所识别的各种化合物是本领域中已知的，包括例如脂肽、脂多糖、肽聚糖、脂胞壁酸、脂蛋白(来自支原体、分枝杆菌、螺旋菌)、双链RNA(聚I:C)、未甲基化的DNA、脂阿拉伯甘露聚糖、鞭毛蛋白、含CpG的DNA和咪唑喹啉。并非所有TLR识别的化合物都适于做佐剂，例如野生型革兰氏阴性菌脂多糖的毒性对于将其用作佐剂来说就太高了，即其用于人在药学上是不可接受的。然而其它TLR识别的化合物可用作佐剂。这种TLR识别的佐剂自身可以是两亲性佐剂，或任选地可被修饰成两亲性佐剂例如通过将疏水化合物(参见如下)连接至极性TLR配体上。或者，所述两亲性佐剂可以靶向其它受体。优选的两亲性佐剂是脂肽，其可通过合成或半合成进行制备。优选的用作两亲性佐剂的脂肽具有佐剂活性且用于人类在是药学上可接受的。本发明的脂肽是将通常包含与一个或多个疏水化合物共价连接的一个或多个(寡)肽所组成的分子，所述疏水化合物选自脂肪酸、脂质、神经酰胺、缩醛磷脂、烷基或烯烃链或甾酮。一般而言，用于本发明的脂肽优选含有3、4、5、6、7或8个氨基酸，更优选该肽含有70-80％带正电荷的氨基酸其中优选赖氨酸和精氨酸，优选地该肽含有一个或多个丝氨酸和/或半胱氨酸。尤其优选的脂肽列于表1中。
在本发明的另一个实施方式中所述两亲性佐剂是糖脂。用作两亲性佐剂的优选的糖脂具有佐剂活性且用于人体是药学上可接受的。糖脂是共价连接于一个或多个糖的脂质(或其它疏水化合物)。在本发明的一个高度优选的实施方式中提供了根据本发明的重建病毒膜，其中糖脂是α-半乳糖苷神经酰胺或磷脂酰肌醇甘露糖苷。术语“α-半乳糖苷神经酰胺”和“磷脂酰肌醇甘露糖苷”是指包括其中任一种的任何衍生物。例如US5,936,076和US4,542,212中分别描述了具有佐剂活性且可用于本发明上下文中的这些分子的衍生物。其它适用于本发明的糖脂佐剂包括例如具有LPS的脂质A部分降低的毒性但保留了(部分)佐剂活性的革兰氏阴性菌的内毒素脂多糖(LPS)的修饰形式，可获自遗传修饰的革兰氏阴性病原体和参见WO02/09746。
本发明中的用作两亲性佐剂的修饰的LPS优选具有毒性降低的修饰的脂质A部分。优选修饰的LPS的毒性低于相应的野生型LPS的毒性，更优选修饰的LPS的毒性低于相应的野生型LPS毒性的90％、80％、60％、40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.2％。野生型的毒性和各种毒性降低的修饰的LPS的毒性可在本领域种已知的任何适宜的分析方法中进行测定。优选用于测定该毒性即修饰的LPS的生物学活性的分析是用于在检测MM6巨噬细胞系中的TNF-α诱导的WEHI检测(Espevik和Niessen，1986，J.Immunol.Methods 95：99-105；Ziegler-Heitbrock等，1988，Int.J.Cancer 41：456-461)。另一方面，毒性降低的修饰的LPS仍具有足够的免疫刺激活性，即佐剂活性。毒性降低的修饰的LPS优选具有相应的野生型LPS的免疫刺激活性的至少10％、20％、40％、80％、90％或100％。可如上述或本申请实施例中所述，在实验动物中对免疫刺激活性进行体内测定；或例如通过测量LPS刺激的树突细胞产生的至少一种细胞因子(例如IL12、IL10、TNF-α、IL-6和IL-1-β之一)的产量，或通过测量LPS刺激的树突细胞上至少一种共刺激分子(例如CD40或CD86)的表达体外测定由待检测的LPS温育所刺激的树突细胞的成熟度。
本发明的另一方面，存在于本发明的病毒体中的两亲性佐剂是一种肽，优选为一种两亲性肽。用作两亲性佐剂的优选的肽具有佐剂活性且用于人是药学上可接受的。具有佐剂活性的肽，特别是极性肽，可通过将其(共价)连接到一种合适的疏水化合物上是使其为两亲性佐剂(见上述)。或者，两亲肽可包括氨基酸的疏水分支例如下述的跨膜序列。一种优选的肽包含来源于Notch配体Jagged-1的序列(见Weijzen等，2002；Genbank登录号为AAC52020)或来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A的序列。优选具有来源于Jagged-1或蛋白A的序列的肽被共价连接于一种合适的疏水化合物(见上述)和/或包含跨膜序列(参见如下)。从所述脂双层突出的Jagged-1或蛋白A衍生肽的(极性)部分优选包含不超过3、4、5、6、7或8个氨基酸。
本发明的重建病毒膜优选地适于肠胃外和粘膜(例如鼻内或口服)施用。然而，本发明的一个重要方面是本发明的重建病毒膜可用于抗原的鼻内输送，所述抗原在正常情况下经鼻内递送不能在治疗个体中诱发足够的保护性免疫应答以抵御含有抗原的致病性生物体的后继感染。
本发明的重建病毒膜含有病毒融合蛋白和，任选地其它抗原。因而，只含有病毒融合蛋白而不含其它抗原的重建病毒膜应被理解为是本发明的一部分，其中病毒融合蛋白除作为融合蛋白的功能外还具有作为抗原的功能。另一方面，重建病毒膜除病毒融合蛋白以外还可包含一种或多种其它抗原。
作为根据本发明的重建病毒膜一部分的抗原优选具有能够插入该重建病毒膜小泡的脂双层中的疏水部分。许多病原体例如病毒、细菌、酵母和寄生虫在其衣壳、细胞壁或膜上携带有可诱发宿主免疫应答的蛋白。具有疏水元件如跨膜部分且适于作为本发明的重建病毒膜一部分的抗原的实例是存在于病原体膜(在病毒中也被称为包膜)上的蛋白。因而，优选地，存在于本发明的重建病毒膜上的抗原是膜内在蛋白。本发明的重建病毒膜中的抗原蛋白的朝向与其在病毒或细胞膜上呈现的一致，但当其存于膜脂双层中时可以呈递通常部分或至少暂时隐藏的表位。这些抗原呈递重建病毒膜对免疫系统的刺激可归因于免疫系统的细胞对它们的特异性识别、它们的特定特征、蛋白质的呈递和暴露出所隐藏的表位相结合。优选地，用于本发明的重建病毒膜的抗原蛋白包含一种或多种保护性表位，即能在哺乳动物中诱发免疫应答从而提供对所述抗原所来源的病原体的感染的保护或提供对表达该抗原的肿瘤的保护。
在优选的实施方式中，所述抗原来自病毒、寄生虫、真菌或细菌。特别优选的重建病毒膜，其中所述抗原来自流感病毒。优选可用于本发明的重建病毒膜中的来自流感病毒的蛋白是血凝素(HA)蛋白、神经氨酸酶(NA)蛋白和/或M2蛋白(单独或其组合)。
可适用和用于根据本发明的重建病毒膜的形成的抗原可源自所有类别的病毒，所述病毒的非限制性实例是：逆转录病毒科(Retroviridae)例如人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)；风疹病毒(rubellavirus)；副粘病毒科(paramyxoviridae)例如副流感病毒(parainfluenza viruses)、麻疹(measles)、流行性腮腺炎(mumps)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、人梅塔肺病毒(humanmetapneumovirus)；黄病毒科(flaviviridae)如黄热病毒(yellow fevervirus)、登革热病毒(dengue virus)、C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)、日本脑炎病毒(JEV)、森林脑炎(tick-borne encephalitis)、圣路易斯脑炎(St.Louis encephalitis)或西尼罗脑炎病毒(West Nile virus)；疱疹病毒科如单纯疱疹病毒(Herpes Simplex virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、EB病毒(Epstein-Barr virus)；本扬病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)；汉坦病毒科(Hantaviridae)如汗坦病毒(Hantaan)；冠状病毒科(Coronaviridae)；乳多空病毒科(Papovaviridae)如人乳头状瘤病毒(humanPapillomavirus)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)如狂犬病病毒(rabies virus)；冠状病毒科(Coronaviridae)如人冠状病毒(human coronavirus)；甲病毒科(Alphaviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、纤状病毒科(filoviridae)如埃博拉病毒(Ebolavirus)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、痘病毒科(poxviridae)如天花病毒(smallpox virus)和非洲猪热病毒(African swine fever virus)。同样所述抗原可来自致病性细菌、真菌(包括酵母)或寄生虫。所述抗原包括细菌抗原例如卷旋杆菌属(Helicobacter)如幽门螺旋杆菌(H.Pylori)、奈瑟氏菌属(Neisseria)如脑膜炎奈瑟氏球菌(N.mengitidis)、嗜血杆菌(Haemophilus)如流感嗜血杆菌(H.Influenza)、博德特氏杆菌属(Bordetella)如百日咳博德特氏杆菌(B.Pertussis)、衣原体(Chlamydia)、链球菌(Streptococcus)如链球菌亚种血清型A(Streptococcus sp.SerotypeA)、弧菌属(Vibrio)如霍乱弧菌(V.Cholera)、革兰氏阴性肠道病原体包括例如沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和埃希氏杆菌属(Escherichia)和来自导致炭疽、麻风病、结核病、白喉、莱姆病、梅毒、伤寒和淋病的细菌的抗原。来自寄生虫的抗原例如包括来自原生动物如巴贝虫(Babeosis bovis)、疟原虫(Plasmodium)、利什曼原虫(Leishmania spp.)、鼠弓形体(Toxoplasmagondii)和锥虫属(Trypanosoma)如克氏锥虫(T.Cruzi)的抗原。真菌抗原可包括来自真菌如曲霉属(Aspergillus sp.)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、隐球酵母属(Cryptococcus)如新型隐球酵母(C.Neoformans)和夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的抗原。
虽然接种疫苗通常用于针对病原体的预防性保护或用于治疗病原体感染后的疾病，本领域技术人员知晓疫苗在肿瘤治疗中的应用。此外发现数量渐增的肿瘤特异性蛋白是能被人或人源化抗体靶定的适宜的存在物。这种肿瘤特异性蛋白也包括在本发明的范围内。在本领域中已知多种肿瘤特异性抗原。因此，在一个优选的实施方式中，本发明提供了含有肿瘤特异性抗原的重建病毒膜。合适的肿瘤抗原包括例如癌胚抗原、前列腺-特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、蛋白MZ2-E、多形上皮粘蛋白(PEM)、叶酸结合蛋白LK26、截短的上皮生长因子受体(EGRF)、Thomsen-Friedenreich(T)抗原、GM-2和GD-2神经节苷酯、Ep-CAM、粘蛋白-1、上皮糖蛋白-2(Epithialial glycoprotein-2)和结肠特异性抗原。
优选来自这些病原体的抗原是膜内在蛋白。然而，包含保护性表位的非膜蛋白抗原或其部分也可被修饰而用于本发明中将其与跨膜序列相融合。跨膜序列或膜锚定序列是本领域中众所周知的，它们是基于哺乳动物跨膜分子的遗传几何学。跨膜序列通常由约10-30个，通常约20个氨基酸的序列组成，其中绝大多数具有疏水支链。已知多种蛋白的跨膜序列，其中任何一种均可使用。用于本发明的膜锚定序列的实例包括例如来自CD8、ICAM-2、IL-8R、CD4和LFA-1的那些序列。优选地，跨膜序列来自病毒膜中天然存在的病毒膜内在蛋白。其实例包括人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G的跨膜区(例如第38-63位氨基酸)或流感病毒神经氨酸酶的跨膜区(例如第7-27位氨基酸)。
另一方面，本发明提供了一种制备重建病毒膜的方法，包含以下步骤中的一些或全部：(a)于一种含有去污剂的溶液中将一种两亲性佐剂、一种病毒融合蛋白、一种任选的其它抗原和脂质相混合；(b)在使得病毒膜重建的条件下降低去污剂的浓度，所述病毒膜包含一种脂双层，该脂双层中的所述两亲性佐剂和病毒融合蛋白与所述脂双层疏水性内部相互作用，其中优选所述两亲性佐剂和所述病毒融合蛋白不发生共价连接，其中还优选所述两亲性佐剂和所述任选的其它抗原不发生共价连接，以及所述重建病毒膜具有膜融合活性；(c)任选地，纯化所述重建病毒膜；和，(d)任选地，将所述重建病毒膜配制成药物组合物。为提供病毒脂质，所述方法可进一步包括：(i)将所述病毒溶于一种合适的去污剂如辛乙二醇单-正十二烷基醚中；(ii)例如通过差异超速离心除去病毒遗传物质和核蛋白。优选通过透析、渗滤或吸附到疏水(和/或吸附进大小排阻)珠上，以合适的速率除去去污剂从而使形成膜以降低去污剂的浓度，其中优选所述两亲性佐剂和所述病毒融合蛋白以及还优选所述其它抗原存在于所述重建病毒膜上，通过疏水作用与内区(所述脂双层的疏水区)和/或相互之间相互作用。病毒优选是含有膜的病毒例如绝大多数有包膜病毒。优选用作天然病毒脂质来源的病毒是流感病毒、塞姆利基森林病毒或副粘液病毒。
优选地，本发明公开的用于制备重建病毒膜的方法包括纯化所述重建病毒膜的步骤。用于纯化重建病毒膜的方法是本领域公知的，包括例如差异和密度梯度离心和/或层析(大小排阻层析、离子交换层析和/或亲合层析)。去污剂是具有表面活性的两亲性分子。合适的去污剂是能有效溶解病毒膜组分但不会使融合蛋白、病毒衣壳和/或核蛋白变性的去污剂，例如两性离子去污剂如辛乙二醇单-正十二烷基醚。
疏水作用由水环境中存在的疏水物质之间的非共价、非静电引力所产生。在本发明的另一方面中提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的根据本发明的重建病毒膜和一种药学上可接受的载体。药学上可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等也可被掺入该药物组合物中。优选形式取决于所需给药方式和治疗用途。药学载体可以是任何适于将重建病毒膜输送给患者的相容性、无毒物质。用于鼻内输送的药学上可接受的载体的实例是水、缓冲盐溶液、甘油、聚山梨醇酯20、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和辛酸/癸酸甘油酯的水混合物，并可加入缓冲液以提供中性pH环境。用于肠胃外输送的药学上可接受的载体的实例是无菌缓冲的0.9％NaCl或5％葡萄糖，任选地添加了20％的白蛋白。用于亲本施用的制剂必须是无菌的。用于多肽或抗体施用的亲本途径可以依据已知的方法例如通过静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或损伤内途径进行注射或灌注。优选通过药丸注射施用重建病毒膜。一种用于肌内注射的典型的药物组合物可被制备成包含例如1-10ml磷酸盐缓冲液和1-100μg优选15-45μg本发明的重建病毒膜(的抗原蛋白)。对于口服施用，活性组分给予的方式可以是液体剂型，例如酏剂、糖浆和悬浮液。用于口服施用的液体剂型可包含色素和调味剂以增强病人的接受度。制备肠胃外、口服或鼻内施用的组合物的方法是本领域中众所周知的，并在多种来源有更多详细描述包括例如Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(在此通过应用将其整体完整地引入本发明)。另一方面，本发明涉及通过对需要预防或治疗的患者施用治疗或预防有效量的本发明的重建病毒膜(包含其的药物组合物)以用于抗感染性疾病或肿瘤的接种或用于预防和治疗感染疾病或肿瘤。本发明还涉及本发明的重建病毒膜用作药物，优选用作用于抗感染性疾病或肿瘤的接种或用于预防和治疗感染疾病或肿瘤的药物的用途。本发明还进一步涉及本发明重建病毒膜在制备用于抗感染性疾病或肿瘤的接种或用于预防和治疗感染疾病或肿瘤的药物中的用途。
附图说明
图1：用于分析包含佐剂的重建病毒膜的脂肽、蛋白和脂质间的物理结合的蔗糖梯度的示意图。
图2：从如图1中所示梯度上的10/40％的蔗糖界面中回收的脂质和脂肽的双向薄层层析。板A：对照，无脂肽的重建病毒膜，显示了水合茚三酮反应性天然病毒脂质。板B：包含脂肽的重建病毒膜，显示了与水合茚三酮反应的天然病毒脂质以及水合茚三酮反应性脂肽。进行双向层析：系统1 CHC13/甲醇/H2O 65/25/4，系统2正丁醇/乙酸/水2/1/1，并以水合茚三酮染料通过衍生化作用染色。加样位置标记为“斑点”。
图3：根据本发明的包含脂肽的重建病毒膜的电子显微照片；用磷钼酸铵负染色。膜直径大约为100-200nm。
图4：间隔14天进行鼻内接种A/巴拿马/2007/99两次后鼻和肺中的IgA效价；最后一次接种后3周测定效价。减去免疫前的效价。所用疫苗是标准商业亚单位疫苗、根据EP 0538437制备的病毒体或根据本发明的包含脂肽的重建病毒膜。每组10只小鼠。
图5：间隔14天进行鼻内接种两次后血液中的IgG效价；最后一次接种后3周测定效价。减去免疫前的效价。所用疫苗是根据EP 0538437制备的病毒体或根据本发明的包含脂肽的重建病毒膜。用各包含来自所示病毒中一株毒株的抗原的四种不同的疫苗制剂接种4组小鼠，每组10只。
图6：根据本发明的重建病毒膜的融合活性。将包含芘磷脂的重建病毒膜与红细胞血影混合，根据本申请对融合进行测定。
图7：单次肌内接种后血液中的IgG效价；接种后3周测定效价。减去免疫前的效价。所用疫苗是根据EP 0538437制备的病毒体或根据本发明的包含脂肽的重建病毒膜。每组10只小鼠。
图8：来自A/怀俄明病毒株的重建病毒膜的平衡密度蔗糖梯度分析，显示重建物质的单密度峰；脂肽回收自级分4、5和6。
图9：在10只小鼠的1个组中，在0和14日鼻内接种后血液中的IgG效价。抗原来自A/巴拿马/2007/99病毒株，膜含有N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸。
图10：在10只小鼠组的1个中，间隔14天两次鼻内接种A/巴拿马/2007/99病毒株的重建病毒膜后在鼻和肺中的IgA效价，所述膜含有脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸；最后一次接种后3周测定效价。减去免疫前的效价。
实施例
实施例1：含有脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、流感病毒的天然脂质和流感病毒膜蛋白的重建病毒膜的制备。
采用本领域技术人员所公知的方法，通过培养获自世界流感中心(World Influenza Center)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)的病毒来制备流感病毒，例如通过在含胎卵或培养细胞上培养病毒。然后将病毒纯化，优选通过差异和/或密度梯度超速离心，随后可以根据所建立的标准程序用β丙内酯或甲醛灭活。
在中性pH的等渗缓冲液：145mM NaCl，2.5mM HEPES，1mm EDTA，pH 7.4(缓冲液A)中，将被纯化和浓缩的流感A/巴拿马/2007/9病毒(1500nmol磷脂)用1ml去污剂辛(乙二醇)-正十二烷基单醚(C12E8)(Boehringer，Mannheim，Germany)在100mM的浓度(浓度需要大于去污剂的临界胶束浓度)于4℃温育10分钟。然后在4℃以100,000×g离心30分钟除去病毒核衣壳和基质蛋白。弃去沉淀，将上清液与干燥的脂肽以0.5mg脂肽/750nmol病毒脂质的比率混合，混合至脂肽被溶解。在每350微升的混合液中加入128mg BioBeads SM-2(Bio-Rad)，并剧烈振荡混合物和珠1小时以除去去污剂。然后，将液体转移到另一64mg的这种珠子中，继续振荡10分钟。所得浑浊上清液包含所述重建病毒膜，经或不经进一步的纯化即可将其用于接种疫苗。
为了分析脂质、脂肽和病毒蛋白之间的物理结合，将含有重建病毒膜的浑浊混合物加样到含有于缓冲液A中的40％蔗糖(w/v)的1mL垫层和于缓冲液A中的10％蔗糖(w/v)的4mL顶层(如图1中所示)不连续蔗糖梯度上。将所述梯度于100.000gmax离心90分钟，从所述40％垫层，所述40％垫层和10％顶层之间的界面，和顶层取样。在这些梯度中，未掺入的病毒蛋白在离心过程中移至垫层中，重建病毒膜中不存在的脂质和脂肽移至梯度顶层，可以在界面上得到重建病毒膜(图1)。在梯度顶层附近得到15％的病毒脂质和6％的脂肽。加载于梯度上的85％的病毒脂质，94％的脂肽和60％的病毒膜蛋白被发现与重建病毒膜条带相结合。
为了分析条带的脂质组成，根据Folch等(1957)所述，从上述蔗糖梯度的40/10％界面回收根据上述步骤制备的，或没有添加脂肽的重建病毒膜的两个样品，然后用CHCl3/MeoH抽提。以CHCl3/甲醇/H2O 65/25/4作为第一洗脱液，随后用正丁醇/乙酸/水2/1/1，通过双向薄层层析分析抽提出来的脂质和脂肽，并用水合茚三酮染料通过衍生化作用染色(平板喷以于正丁醇中的2％的水合茚三酮，于80℃温育10分钟)。结果示于图2中，其中清楚地证明了病毒的天然脂质与脂肽间的物理结合。
从该梯度的条带收集的病毒体的电子显微照片示于图3中，其中清楚地表明了颗粒病毒大小，显示了流感病毒特征性的病毒抗原波峰。
实施例2：采用包含脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、流感病毒的天然脂质和流感膜蛋白的重建病毒膜进行的鼻内免疫实验。
将通过鼻内施用包含流感病毒血凝素和N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸的重建病毒膜的接种疫苗与鼻内施用标准亚单位疫苗、或根据EP0538437制备的病毒体疫苗进行比较。在第0和14日，通过鼻内滴入10微升含有5μg流感蛋白的抗原对Balb/C小鼠。在第0、14和35日采取血样，在第35日收集鼻和肺冲洗液。比较流感病毒的几种不同的毒株；每只小鼠用一种类型的毒株进行免疫。通过与气管连接的注射器向肺中注射1.5ml PBS，随后吸入1ml流体对肺进行冲洗。通过逆向注射0.5ml PBS，通过气管，进入鼻咽，在鼻孔收集灌洗液来收集鼻内冲洗液。通过离心立即除去灌洗液中的碎片和细胞成分，加入蛋白酶抑制剂混合物(化学抑制素、抗蛋白酶、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂，终浓度1μg/ml，来自于干燥的DMSO中的1000×浓缩母液)，其后在液氮中冷冻该样品并储存于-20℃直至分析。通过抗流感蛋白的鼻和肺中的IgA及IgG ELISA对样品进行分析。结果分别示于图4和图5中。
实施例3：包含脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、流感病毒的天然脂质、芘标记的磷脂酰胆碱和流感膜蛋白的重建病毒膜的膜融合活性。
在中性pH的等渗缓冲液：145mM NaCl，2.5mM HEPES，1mm EDTA，pH 7.4(缓冲A)中，以100mM的浓度将经纯化和浓缩的流感A/巴拿马/2007/9病毒(1500nmol磷脂)与1ml辛(乙二醇)-正十二烷基单醚(C12E8)(Boehringer，Mannheim，Germany)于4℃温育10分钟。然后，于4℃以100,000×g离心30分钟除去病毒核衣壳和基质蛋白。弃去沉淀物。将上清液与干燥的脂肽和芘标记的磷脂以0.5mg脂肽和150nmol 1-十六烷酰-2-(1-芘癸酰)-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱/750nmol病毒脂质的比率混合，混合直至脂肽和芘标记的磷脂被溶解。然后，向每350微升的混合液中加入128mg BioBeads SM-2(Bio-Rad)，剧烈振荡混合物和该珠一小时除去去污剂。然后将液体转移到另一64mg的这种珠子中，继续振荡10分钟。
为了测量膜融合，通过Steck和Kant(1974)的方法从过期的红细胞浓缩液(B血型，Rh因子阴性)制备红细胞血影靶膜。在0.06M血影磷脂和1μM病毒体磷脂的浓度下，在含有140mM NaCl，15mM柠檬酸钠的pH 5.1的缓冲液中检测融合。通过稀释pyrPC监测脂质混合。为此目的，对芘受激子荧光进行测定，在发射光束中存在475nm截断值的滤波器的情况下，刺激和发射波长分别为345nm(带通2nm)和490nm(带通16nm)。在探针无限稀释的情况下通过加入35μl的0.2M C12E8对背景荧光进行评定。通过计算f＝100×(E0-E)/(E0-Ey)，将荧光的变化转换为融合程度(f)，其中E代表任何时候的受激子荧光，E0和Ey分别代表时间零和添加C12E8后于490nm处的光强，均针对稀释效应进行了矫正。结果，如图6所示，清楚地显示了该重建病毒膜的强融合活性。
实施例4：用包含脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、流感病毒的天然脂质和流感膜蛋白的重建病毒膜的肌内免疫与根据EP 0538437制备的病毒体的免疫的比较实验。
在第0日将25μl流感抗原(5μg蛋白)注射至Balb/C小鼠的一侧后肢肌肉内。在第0和14日采取血样。用A/巴拿马/2007/99株病毒制备疫苗。通过抗流感血凝素的IgG ELISA对样品进行分析。结果示于图7中。
实施例5：通过平衡密度梯度离心对包含A/怀俄明膜蛋白的功能性重建病毒膜进行物理表征。
如实施例1中所述制备包含脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸的重建病毒膜，加载于10-60％w/v蔗糖梯度上，在Beckman SW55转子中以50,000rpm离心16小时。在该类梯度中，脂质和脂肽保留在顶部，而蛋白移向最底层的级分。通过折光仪器、蛋白和磷脂测定对获自梯度的样品进行分析。结果，如图8中所示，表示基本上所有的病毒蛋白和绝大多数病毒脂质共纯化于一个单峰中。同样，脂质也仅回收自级分4、5和6。这些数据表明该重建病毒膜是密度约1.12g/ml的颗粒。
实施例6：采用重建病毒膜的鼻内免疫实验，所述膜包含脂肽N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸、流感病毒的天然脂质和流感膜蛋白。
如上述实施例1中所述，从A/巴拿马/2007/99制备膜，并将其用于免疫如实施例2中所述的小鼠。血清中的ELISA IgG效价和鼻与肺中的IgA效价分别示于图9和10中。这些数据表明N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-的赖氨酸和脯氨酸衍生物导致大约相当的免疫应答的增强。
表1：特别适于制备本发明的重建病毒膜的脂质
| N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸 |
| S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸 |
| N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| N-棕榈酰-S-2，3(双油酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| S-2，3(双油酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| N-棕榈酰-S-2，3(双肉豆蔻酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| S-2，3(双肉豆蔻酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| N-棕榈酰-S-3(棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| N-棕榈酰-S-2，3羟基-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸 |
| N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸 |
| N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(谷氨酰胺酰)3-谷氨酸 |
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Claims (15)
1.一种重建病毒膜，其脂双层包含病毒融合蛋白、两亲性佐剂和任选地其它抗原，其中：
(a)所述脂双层具有的脂质组成适合于在所述病毒膜和一种细胞的膜之间发生由所述融合蛋白所诱导的融合，所述细胞可与所述融合蛋白所来源的病毒相融合；
(b)所述融合蛋白和所述两亲性佐剂与所述脂双层的疏水性内部相互作用；和
(c)所述融合蛋白、所述两亲性佐剂和任选的所述其它抗原不是共价连接的。
2.根据权利要求1的重建病毒膜，其中所述脂双层包含病毒膜的天然脂质。
3.根据权利要求1或2的重建病毒膜，其中所述两亲性佐剂是脂肽、糖脂或肽。
4.根据权利要求1-3中任一项的重建病毒膜，其中所述两亲性佐剂是哺乳动物Toll-样受体的配体。
5.根据权利要求3的重建病毒膜，其中所述脂肽选自：N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸、S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸、N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、N-棕榈酰-S-2，3(双油酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、S-2，3(双油酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸-(赖氨酰)3-赖氨酸、N-棕榈酰-S-2，3(双肉豆蔻酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、S-2，3(双肉豆蔻酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、N-棕榈酰-S-3(棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸和N-棕榈酰-S-2，3-羟基-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸、N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(脯氨酰)3-脯氨酸、N-棕榈酰-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(谷氨酰胺酰)3-谷氨酸。
6.根据权利要求3的重建病毒膜，其中所述糖脂是磷脂酰肌醇甘露糖苷、α-半乳糖苷神经酰胺或经修饰的毒性降低的脂多糖。
7.根据权利要求1-6中任一项的重建病毒膜，其中所述抗原是膜内在蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项的重建病毒膜，其中所述抗原是病毒抗原。
9.根据权利要求8的重建病毒膜，其中所述抗原来自流感病毒。
10.根据权利要求9的重建病毒膜，其中所述抗原是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2蛋白。
11.根据权利要求8的重建病毒膜，其中所述抗原来自一种病毒，所述病毒选自：逆转录病毒科、风疹病毒、副粘病毒科、黄病毒科、疱疹病毒科、本扬病毒科、沙粒病毒科、汉坦病毒科、冠状病毒科、乳多空病毒科、弹状病毒科、冠状病毒科、甲病毒科、动脉炎病毒科、纤状病毒科、沙粒病毒科、痘病毒科和非洲猪热病毒。
12.根据权利要求1-7中任一项的重建病毒膜，其中所述抗原来自寄生虫、细菌、真菌、酵母，或其中所述抗原是肿瘤特异性抗原。
13.一种制备重建病毒膜的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将两亲性佐剂、病毒融合蛋白、任选的其它抗原和脂质在含有去污剂的溶液中相混合；
(b)在使得病毒膜重建的条件下降低去污剂的浓度，所述病毒膜包含一种脂双层，其中所述两亲性佐剂和所述病毒融合蛋白与所述脂双层疏水性内部相互作用，其中所述两亲性佐剂和所述病毒融合蛋白不发生共价连接，其中所述两亲性佐剂和所述任选的其它抗原不发生共价连接，以及其中所述重建病毒膜具有膜融合活性；
(c)任选地，纯化所述重建病毒膜；和
(d)任选地，将所述重建病毒膜配制成药物组合物。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1-12中任一项所定义的重建病毒膜和一种药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14的药物组合物，其中所述组合物适于经鼻内、口服或肠胃外施用。
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