JP2011506306A - 抗原に対する免疫応答を増強する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全体を参照により本明細書に組み込んだ2007年12月5日出願の米国特許仮出願第60/992460号の優先権を主張する。
[(式Iの化合物を含有する組成物で処理した後の対象の免疫応答を表す値)-(対照の免疫応答を表す値)/(式Iの化合物を含有する組成物で処理した後の対象の免疫応答を表す値)]×100
を使用して算出することができる。
マウスモデルは、静脈内投与したとき、抗原と組み合わせた被験アジュバント化合物によって惹起される特異的細胞傷害性T細胞応答(CD8+)をインビボにおいて試験するために使用した。マウス3匹ずつの8群を0日目に、PBSで総量100μlとした、アジュバントを含む、または含まない抗原(卵白アルブミン、Ova、等級VII、Sigma、St. Louis、MO)、アジュバント単独、あるいは担体単独(対照)で静脈内で免疫した(側尾静脈)。被験アジュバント化合物は、卵白アルブミン(OVA)抗原50μgを含む、または含まない1μgのPBS-96、1μgのPBS-14、1μgのPBS-11であった。
抗原と組合せ投与したとき、特異的細胞傷害性T細胞応答(CD8+)をインビボにおいて誘導する被験アジュバント化合物の能力を測定するために、被験アジュバント化合物をさらに実施例1で記載した方法を使用して測定した。0日目に静脈内(IV)(群1〜9で、群当たりマウス3匹)または筋肉内(IM)(群10〜18で、群当たりマウス6匹)のいずれかで免疫した18群のマウスは以下の通りである。
- 群1:PBS 100μlにOva 400μgでIVによる
- 群2:PBS 100μlにαGalCer 1μgでIVによる
- 群3:PBS 100μlにPBS-57 1μgでIVによる
- 群4:PBS 100μlにPBS-14 1μgでIVによる
- 群5:PBS 100μlにPBS-96 1μgでIVによる
- 群6:PBS 100μlにOva 400μg+αGalCer 1μgでIVによる
- 群7:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-57 1μgでIVによる
- 群8:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-14 1μgでIVによる
- 群9:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-96 1μgでIVによる
- 群10:PBS 50μlにOva 400μgでIMによる
- 群11:PBS 50μlにαGalCer 1μgでIMによる
- 群12:PBS 50μlにPBS-57 1μgでIMによる
- 群13:PBS 50μlにPBS-14 1μgでIMによる
- 群14:PBS 50μlにPBS-96 1μgでIMによる
- 群15:PBS 50μlにOva 400μg+αGalCer 1μgでIMによる
- 群16:PBS 50μlにOva 400μg+PBS-57 1μgでIMによる
- 群17:PBS 50μlにOva 400μg+PBS-14 1μgでIMによる
- 群18:PBS 50μlにOva 400μg+PBS-96 1μgでIMによる
アジュバント被験化合物がインビボにおいてサイトカイン放出を誘発する能力を試験するために、C57BL/6マウスに化合物を様々な濃度で静脈内投与し、血清中のIFNγの産生をELISAによって24時間後に測定した。マウス3匹の群に0日目に以下のように静脈内接種(尾静脈)した。
- 群1:PBS100μlのみ
- 群2:PBS 100μlにαGalCer 1μg
- 群3:PBS 100μlにαGalCer 100ng
- 群4:PBS 100μlにαGalCer 1ng
- 群5:PBS 100μlにαGalCer 0.1ng
- 群6:PBS 100μlにαGalCer 100ngおよびOva 400μg
- 群7:PBS 100μlにPBS-57 1μg
- 群8:PBS 100μlにPBS-57 100ng
- 群9:PBS 100μlにPBS-57 1ng
- 群10:PBS 100μlにPBS-57 0.1ng
- 群11:PBS 100μlにPBS-57 100ngおよびOva 400μg
- 群12:PBS 100μlにPBS-14 1μg
- 群13:PBS 100μlにPBS-14 100ng
- 群14:PBS 100μlにPBS-14 1ng
- 群15:PBS 100μlにPBS-14 0.1ng
- 群16:PBS 100μlにPBS-14 100ngおよびOva 400μg
- 群17:PBS 100μlにPBS-96 1μg
- 群18:PBS 100μlにPBS-96 100ng
- 群19:PBS 100μlにPBS-96 1ng
- 群20:PBS 100μlにPBS-96 0.1ng
- 群21:PBS 100μlにPBS-96 100ngおよびOva 400μg
接種後24時間して、血液試料をマウスから採取し、IFNγレベルをELISAキットによって検出した。2種類のELISAキットを使用し、QuantikineマウスIFNγ(RD systems)は、全試料を試験するために使用し、ELISA mIFNγ(Diaclone)は群1、2、3、6、7、8、11、12、13、16、17、18および21を試験するために使用した。全血清は、ELISAで使用する前に以下のように希釈した。
- 群1:1/1 群2:1/50 群3:1/50
- 群4:1/20 群5:1/10 群6:1/50
- 群7:1/50 群8:1/50 群9:1/20
- 群10:1/10 群11:1/50 群12:1/50
- 群13:1/50 群14:1/20 群15:1/10
- 群16:1/50 群17:1/50 群18:1/50
- 群19:1/20 群20:1/10 群21:1/50
抗原と併用した被験アジュバント化合物の、インビボにおいて特異的細胞傷害性T細胞応答(CD8+)を誘導する能力を測定するために、該被験化合物を実施例1で記載した方法によって試験した。0日目に静脈内(IV)で免疫したマウス9群は以下の通りである。
- 群1:PBS 100μlにOva 400μg
- 群2:PBS 100μlにPBS-11 1μg
- 群3:PBS 100μlにPBS-57新規製剤 1μg
- 群4:PBS 100μlにPBS-14 1μg
- 群5:PBS 100μlにPBS-96 1μg
- 群6:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-11 1μg
- 群7:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-57新規製剤 1μg
- 群8:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-14 1μg
- 群9:PBS 100μlにOva 400μg+PBS-96 1μg
標的細胞は、低濃度のCFSE添加細胞と高濃度のCFSE添加細胞を最終比50/50で混合し(各濃度について細胞1×107個、100μl当たり細胞は全部で2×107個)、免疫したマウスそれぞれに10日目に静脈内注射した。11日目にマウスを殺処分し、血液試料を眼窩から採取した。Ova特異的標的細胞の特異的細胞溶解物を末梢血細胞のフローサイトメトリーによってモニターした。特異的な細胞溶解は、前述のように測定した。結果は図6に示す。Ova特異的細胞溶解の平均は、Ova単独で処置したマウスでは11.8±14.4%で、OvaおよびPBS-11で処置したマウスでは32.3±2.5%で、OvaおよびPBs-57で処置したマウスでは88.1±6.2%で、OvaおよびPBS-14で処置したマウスでは83.3±6.1%で、OvaおよびPBS-96で処置したマウスでは89.2±10.3%であった。これらの結果は、PBS-14およびPBS-96は、抗原と組み合わせて静脈投与した後のインビボにおける細胞傷害性応答の誘導ではPBS-57と同様に有効であることを示している。
被験アジュバント化合物が免疫応答を増強する相対能力を測定するために、実施例2で記載したのと類似の実験を実施した。この実験では、マウスには0日目に以下のようにOVA抗原50μgと組み合わせて少量のアジュバント(それぞれ、100ngおよび10ng)を静脈内注射した。
実験A
群1:PBS 100μlにOva 50μg
群2:αGalCer 100ng
群3:PBS-11 100ng
群4:PBS-14 100ng
群5:PBS-57 100ng
群6:PBS-96 100ng
群7:αGalCer 100ngと共にOva 50μg
群8:PBS-11 100ngと共にOva 50μg
群9:PBS-14 100ngと共にOva 50μg
群10:PBS-57 100ngと共にOva 50μg
群11:PBS-96 100ngと共にOva 50μg
実験B:
群1:PBS 100μlにOva 50μg
群2:αGalCer 10ng
群3:PBS-11 10ng
群4:PBS-14 10ng
群5:PBS-57 10ng
群6:PBS-96 10ng
群7:αGalCer 10ngと共にOva 50μg
群8:PBS-11 10ngと共にOva 50μg
群9:PBS-14 10ngと共にOva 50μg
群10:PBS-57 10ngと共にOva 50μg
群11:PBS-96 10ngと共にOva 50μg
標的細胞は、実験10日目に投与し、血液は11日目に採取した。各アジュバント100ngを使用した実験Aの結果は図7に示し、実験Bの結果は図8に示す。図7および8は、PBS-14およびPBS-96は、筋肉内に投与したとき、予期せぬことに低用量でその他のアジュバントよりも抗原に対するCD8+T細胞応答を増強することを示している。実際に、OVAおよびわずか10ngの量のPBS-14もしくはPBS-96を筋肉内に投与した後、CD8+T細胞による標的細胞の特異的溶解のパーセンテージはまだ60%を上回っており、一方、OVAおよび同量のPBS-57、PBS-11またはαGalCerを投与した後では、標的細胞の特異的溶解のパーセンテージは対照と区別がつかなかった。
前記の実施例で記載したインビボにおける細胞傷害性アッセイを使用して得られた結果を確かめるため、類似の実験を実施し、CD8+T細胞活性化を、ペンタマーアッセイを使用してOVA特異的CD8+T細胞のパーセンテージを測定することによって測定した。簡単に説明すると、以下のように、マウスに指示した量のOVAおよびマウス当たり1μgまたは100ngのいずれかの被験アジュバント化合物をそれぞれ0日目に筋肉内注射した。
実験A:
群1:PBS 100μl
群2:PBS 100μlにOva 50μg
群3:αGalCer 1μgと共にOva 50μg
群4:PBS-11 1μgと共にOva 50μg
群5:PBS-14 1μgと共にOva 50μg
群6:PBS-57 1μgと共にOva 50μg
群7:PBS-96 1μgと共にOva 50μg
実験B:
群1:PBS 100μl
群2:PBS 100μlにOva 50μg
群3:αGalCer 100ngと共にOva 50μg
群4:PBS-11 100ngと共にOva 50μg
群5:PBS-14 100ngと共にOva 50μg
群6:PBS-57 100ngと共にOva 50μg
群7:PBS-96 100ngと共にOva 50μg
二回目の注射は、14日目にマウスに投与し、血液は21日目にマウスから採取した。リンパ球を採取し、OVAに応答するCD8+T細胞を検出するためのH-2KbSIINFEKLペンタマーおよびCD8抗体を使用したFACS分析によって分析した。実験Aの結果は図9に示し、実施例Bの結果は図10に示す。図9は、PBS-14、PBS-96およびPBS-57 1μgを投与すると、ワクチン摂取後、OVA特異的CD8+T細胞のパーセンテージを高め、一方、PBS-11およびαGalCerは効果的ではなかったことを示している。図10は、PBS-14およびPBS-96 100ngの低用量では、PBS-57、PBS-11およびαGalCerと比較して、抗原に対するCD8+T細胞応答を驚くほど強く増強することを示している。
体液性およびCD4+Tヘルパー細胞免疫応答も被験アジュバントと抗原との投与によって増強されるかどうかを評価するために、IgG1およびIgG2a抗体応答を、被験アジュバントと一緒にした、または一緒にしていないOVAでワクチン接種したマウスで測定した。マウス(群当たり6匹)の筋肉内にOVA50μgを単独か、または指示したアジュバント(フロイントアジュバントを陽性対照として使用した)100ngと組み合わせて、以下の通りに筋肉内注射した。
群1:CFA/IFA(陽性対照)と共にOva 500μg
群2:Ova 50μg
群3:Ova 50μgαおよびαGalCer 100ng
群4:Ova 50μgおよびPBS-11 100ng
群5:Ova 50μgおよびPBS-14 100ng
群6:Ova 50μgおよびPBS-57 100ng
群7:Ova 50μgおよびPBS-96 100ng
注射後14日目に、血液試料を採取し、OVAアイソタイプIgG1またはIgG2aに特異的なマウスモノクローナル抗体を使用してIgG1およびIgG2aのELISAを実施した。結果は、末梢血中の抗体の力価としてng/mlで示す。IgG1の結果は図11に示し、IgG2aの結果は図12に示す。図11に示したように、PBS-14、PBS-96、PBS-57は全て着実なIgG1力価を惹起することができ、OVA単独またはPBS-11もしくはαGalCerと組み合わせたOVAによるワクチン接種と比較してOVA特異的IgG1力価を増強させた。驚くべきことに、PBS-14およびPBS-96はOVA特異的IgG2a力価をフロイントアジュバントとほぼ同程度に、かつPBS-57よりもずっと強く増強させた。
Claims (25)
- xが23である、請求項1に記載の組成物。
- xが21である、請求項1に記載の組成物。
- nが13である、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 抗原をさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物および抗原を含む医薬組成物。
- 抗原に対する対象の免疫応答を増強する方法であって、前記抗原および請求項1に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、前記抗原に対する前記対象の免疫応答が前記抗原に対する対照の免疫応答と比較して増強されている方法。
- 抗原に対する対象の免疫応答を増強する方法であって、前記抗原および請求項1に記載の組成物を前記対象に筋肉内投与することを含み、前記抗原に対する前記対象の免疫応答が前記抗原に対する対照の免疫応答と比較して増強されている方法。
- 前記対象の免疫応答が前記対照と比較して少なくとも50%増強されている、請求項7または8に記載の方法。
- 前記対象の免疫応答が前記対照と比較して少なくとも100%増強されている、請求項7または8に記載の方法。
- 前記対象の免疫応答が前記対照と比較して少なくとも1000%増強されている、請求項7または8に記載の方法。
- 前記抗原および請求項1に記載の組成物を同時投与する、請求項7または8に記載の方法。
- 前記組成物を静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内および吸入からなる群から選択された経路から投与する、請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 抗原に対する対象の体液性免疫応答を増強する方法であって、前記抗原および請求項1に記載の組成物を対象に投与することを含み、前記抗原に対する前記対象の体液性免疫応答が前記抗原に対する対照の免疫応答と比較して増強されている方法。
- 前記体液性免疫応答がIgG抗体の産生を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記体液性免疫応答がIgA抗体の産生を含む、請求項14に記載の方法。
- 抗原に対する対象のCD4+T細胞応答を増強する方法であって、前記抗原および請求項1の組成物を対象に投与することを含み、前記抗原に対する前記対象の免疫応答が前記抗原に対する対照のCD4+T細胞応答と比較して増強されている方法。
- 増強されたCD4+T細胞応答がCD4+Tリンパ球の活性化を含む、請求項17に記載の方法。
- CD4+T細胞リンパ球の活性化がTh1免疫応答の増加を含む、請求項18に記載の方法。
- CD4+T細胞リンパ球の活性化がTh2免疫応答の増加を含む、請求項18に記載の方法。
- CD4+T細胞リンパ球の活性化がTh1およびTh2免疫応答の両方の増加を含む、請求項18に記載の方法。
- 抗原に対する対象のCD8+T細胞応答を増強する方法であって、前記抗原および請求項1に記載の組成物を対象に投与することを含み、前記抗原に対する前記対象の免疫応答が前記抗原に対する対照のCD8+T細胞応答と比較して増強されている方法。
- 増強されたCD8+T細胞応答がCD8+Tリンパ球の活性化を含む、請求項22に記載の方法。
- CD8+T細胞リンパ球の活性化が細胞傷害性応答の増加を含む、請求項23に記載の方法。
- 抗原に対する対象の抗原提示細胞の活性化を増強する方法であって、前記抗原および請求項1に記載の組成物を対象に投与することを含み、前記抗原に対する前記対象の免疫応答が前記抗原に対する対照の抗原提示細胞の活性化と比較して増強されている方法。
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