KR20100080549A - 과일 쥬스의 향미 특성 및 신선도 지표의 조절 - Google Patents

과일 쥬스의 향미 특성 및 신선도 지표의 조절 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과일 쥬스, 특히 감귤류 과일 쥬스, 특히 오렌지 쥬스의 향미 특성 및 신선한 맛의 조절에 관한 것이다.

Description

과일 쥬스의 향미 특성 및 신선도 지표의 조절 {Control of flavor characteristics of and indicator of freshness in fruit juice}
본 출원은 본원에 전문이 참조로 인용된 미국 가특허원 제60/978,515호(출원일: 2007년 10월 9일, 발명의 명칭: Control of Flavor Characteristics of and Indicator of Freshness in Fruit Juice)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 과일 쥬스의 향미 특성 및 신선한 맛의 조절에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 감귤류 과일 쥬스, 특히 오렌지 쥬스의 향미 특성 및 신선한 맛의 조절에 관한 것이다.
감귤류 과일은 오랫동안 중요한 영양소의 유용한 공급원으로서 인식되어 왔다. 보다 최근에는, 섭취시 유리하고 유익한 것으로서의 감귤류 공급원의 건강 이점 및 질병 저지 또는 치료 이점이 보다 완전히 인식되게 되었다. 따라서, 감귤류 유래 식품의 섭취가 사람 건강의 전체적인 계획에서 유익하고 중요한 목표인 것으로 일반적으로 여겨진다. 감귤류 과일은 또한 단순히 향기롭다는 이유로 많은 소비자들이 즐기고 있다.
감귤류 제품을 섭취하는 한가지 편리한 방법은 쥬스 형태이다. 쥬스는 쉽게 만들 수 있으며 편리하게 운반하고 소비될 수 있다. 신선한 쥬스 또는 '비농축과즙(not-from-concentrate)' 쥬스는 이의 향미 및 품질이 높이 평가된다. 쥬스는 또한 농축된 후 소비자의 편의에 따라 재구성될 수 있다. 농축 쥬스는 또한 효율적이고 비용 효과적인 방식으로 공급원으로부터 소비자에게 공급된다. 또한, 쥬스는 고형 음식을 먹기가 곤란한 사람들이 과일보다 쉽게 소비할 수 있다.
그러나, 일부 소비자들은 쓴맛, 신맛, 불쾌한 향미(off-flavor notes), 떫은맛, 갈변 및 진한 농도와 같은 감귤류 쥬스의 특정 특성을 싫어한다. 그레이프프루츠, 오렌지, 탄제린(tangerine), 라임 및 레몬을 포함한 모든 감귤류 과일은 이들 특성을 나타낼 수 있다. 일부 소비자들은 단맛이 약한 쥬스를 좋아하는 반면, 다른 소비자들은 단맛이 강한 제품을 좋아한다. 또한, 대개 향미 특성을, 예를 들면, 시즌 초기부터 말기까지 일정하게 유지하기는 어렵다.
쓴맛은 종종 소비자들의 주요 관심사이다. 낮은 수준의 쓴맛은 많은 소비자를 위한 쥬스의 감각수용(organoleptic) 특성 및 특징에 바람직하게 기여할 수 있다. 이러한 소비자는 쓴맛이 약한 톡 쏘는 향미를 즐긴다. 그러나, 대부분의 소비자들은 또한 과도한 쓴맛이 쥬스의 감각수용 특성에 악영향을 미쳐 소비자를 불쾌하게 한다는 데 동의한다. 소비자들은 쓴맛을 종종 신선도 부족, 농축 쥬스 및/또는 저품질 쥬스와 연관시키기도 한다.
쓴 향료는 각 종류의 감귤류 과일에서 다양한 양으로 발견된다. 동일한 과일의 품종간에 그리고 시즌 초기부터 말기까지 동일 품종의 과일 사이에도 이러한 향료의 농도 차가 존재한다. 따라서, 과일 공급원, 시즌 중 시기 및 기타 변수가 과일의 쓴 향료 농도에 영향을 미친다.
떫은맛은 소비자들이 종종 불쾌하게 여기는 쥬스, 특히 감귤류 쥬스의 특성이다. 특히, 감귤류 쥬스의 떫은맛은 순한 맛으로 입을 코팅하는 느낌을 특징으로 한다. 이러한 입맛은 많은 소비자가 불쾌하게 생각한다.
소비자들은 또한 과일 쥬스의 신맛을 염려한다. 감귤류 쥬스는 종종 소비자들에 의해 신 것으로 생각된다. 소비자들은 종종 신맛을 불쾌한 자극성 맛 뿐만 아니라 위가 상하거나 불편한 느낌 및 트림과 관련시킨다.
지금까지, 통상적으로 선택된 화합물을 제거함으로써 쓴맛, 신맛 및 기타 불쾌한 감각수용 특성 및 특징을 감소시키기 위한 제한된 노력이 있어 왔다. 리모닌이 이러한 하나의 화합물이다. 다른 방법들은 과일의 씨 및 껍질과 같은 부분을 쥬스 공급원으로부터 제거하여 쓴 향료의 농도를 최소화한다.
또한, 신선도는 소비자들이 요망하는 특성이다. 종종, 농축물로부터의 쥬스는 신선한 쥬스보다 품질이 낮은 것으로 생각된다. 냉동 쥬스 및 쥬스 농축물을 처리하는 다양한 방법이 알려져 있다. 그러나, 지금까지 농축물로부터의 쥬스는 향미가 떨어지고, 신선하든 냉동이든 완전히 만족스런 쥬스는 구입하기 쉽지 않았다.
따라서, 소비자들이 일반적으로 유쾌하게 느끼고 지나치게 쓰지 않은 한도 내로 쓴 향미가 조절되는 쥬스가 필요하다. 또한, 신선한 맛의 쥬스가 여전히 요구된다.
발명의 요지
본 발명의 제1 양태는 과일 쥬스, 특히 감귤류 쥬스의 쓴맛을 조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 제2 양태는 핵심적인 쓴 향료의 농도를 조절함으로써 감귤류 쥬스의 쓴맛과 신선도를 조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 과일 쥬스, 특히 오렌지 쥬스의 떫은맛을 조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 제4 양태는 과일 쥬스, 특히 오렌지 쥬스의 신맛을 조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는 과일 쥬스, 특히 오렌지 쥬스의 단맛을 조절하는 것에 관한 것이다.
도 1은 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1)를 효소분해하여 리모노에이트 A-환 락톤(2)을 거쳐 쓴맛을 내는 리모닌(3)을 수득하는 반응식을 도시한다.
도 2는 20℃에서 저장된 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1) 수용액 중의 리모닌(3)의 시간-의존성 형성에 대한 pH 값의 영향을 나타낸다.
도 3은 pH 3.0에서 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1) 수용액 중의 리모닌(3)의 시간-의존성 형성에 대한 온도의 영향을 보여준다.
도 4는 30℃에서 10주 동안 항온처리된 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1) 수용액(pH 3.0)으로부터 수득된 RP-HPLC-MS/MS 크로마토그램이고, 리모닌(3) 및 알려지지 않은 가수분해 생성물(4)의 피크를 나타낸다.
도 5는 정제된 C17-에피리모닌(4)의 1H NMR 스펙트럼(400MHz)이다.
도 6은 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1)를 가수분해하여 중요한 중간체로서 푸르푸릴리덴 카보-양이온을 거쳐 리모닌(3) 및 C17-에피리모닌(4)을 수득하는 반응 순서를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 20℃에서 오렌지 쥬스 저장시 리모닌(A) 및 C17-에피리모닌(B)의 생성을 시간의 함수로서 나타낸다.
도 8a 및 8b는 오렌지 쥬스의 열처리시 시간의 경과에 따른 리모닌 및 C17-에피리모닌(A)의 생성 및 C17-에피리모닌/리모닌 비(B)를 나타낸다.
본 발명은 과일 쥬스의 향미 특성의 조절에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 양태들은 핵심적인 쓴 향료의 농도를 조절함으로써 감귤류 쥬스의 쓴맛을 조절하고, 핵심적인 떫은맛 특성의 원인을 조절함으로써 떫은맛을 조절하고, 산의 농도 및 상대적인 비율을 조절함으로써 신맛을 조절하고, 당의 농도 및 상대적인 비율을 조절함으로써 단맛을 조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 쥬스에 신선한 맛을 부여하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 양태들은 과일 쥬스 중의 하나의 성분을 조절함으로써 신선한 맛의 쥬스를 제조하는 것에 관한 것이다
당업자는 식품 중의 향료 성분의 농도가, 역치(threshold)를 초과하여 소비자가 향료 성분을 감지할 수 있어야 함을 인지한다. 떫은맛 및 쓴맛과 같은 상이한 향미 특성의 감지에 대한 역치는 상이하다. 따라서, 지금까지 향미 특성에 기여하는 화합물의 확인 작업은 관련 맛 역치를 초과하는 농도로 존재하는 화합물들에 대한 것이었다.
본 발명의 발명자들은 감귤류 쥬스, 특히 오렌지 쥬스의 쓴맛이, 적어도 일부는 3개의 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 상호작용에 의해 발생하고 쥬스 중의 당의 농도에 의해 영향을 받음을 발견하였다. 이들 3개의 쓴맛을 내는 물질 그룹들과 당 사이의 상승작용의 발견은 감귤류 쥬스의 쓴맛을 조절하는 능력에 대한 기초를 형성한다. 지금까지, 당업자에게는 3개의 쓴맛을 내는 물질 그룹들과 당이 오렌지 쥬스의 쓴맛의 감지를 조절하는 것은 알려져 있지 않았다.
오렌지 쥬스의 쓴맛을 발생시키는 것으로 당업자에게 알려진 물질인 리모닌은 독립적으로 오렌지 쥬스의 쓴맛 전체를 설명하지 못한다. 오히려 오렌지 쥬스의 쓴맛은 다음 3개의 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 상호작용에 의해 발생한다:
(1) 리모닌, 이소리모닌 및, 적은 정도의 노밀린;
(2) 폴리메톡시화 플라본(flavone)(PMF's); 및
(3) 리모노이드 β-D-글루코피라노시드.
따라서, 쥬스 중의 당 농도를 조절하면서 이들 성분들의 상대적인 농도를 조절함으로써 쥬스의 쓴맛의 감지를 조절할 수 있다.
이들 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 성분 농도들은 품종, 성장 시기 및 수확 시기(즉 시즌 초기, 중기 또는 말기인지) 및 가공 조건에 따라 달라진다. 예를 들면, 리모넨은 말기에 수확된 오렌지들로부터 수득된 쥬스보다 초기 및 중기에 수확된 오렌지로부터 수득된 쥬스에서 더 많이 증가한 것으로 밝혀졌다. 3개의 쓴맛을 내는 물질 그룹과 당과의 관계를 이해함으로써, 이들 성분들을 포함하는 오렌지 쥬스 및 감귤류 쥬스의 쓴맛을 조절할 수 있다.
이들 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 성분의 맛 역치를 다음 표에 기재한다.
Figure pct00001

이들 화합물들의 구조식으로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 성분은 공통적인 구조적 특징을 갖는다.
본 발명의 발명자들은 PMF 및 적은 정도의 노밀린의 역치 미만(subthreshold) 농도가 쥬스와 같은 오렌지 제품의 리모닌-유발된 쓴맛을 증가시킴을 발견하였다. 이러한 효과는 당업자가 맛 역치 미만으로 존재하는 화합물이 쓴맛에 기여할거라고는 예상하지 못하였기 때문에 놀라운 것이다.
노밀린은 햄린(Hamlin) 오렌지 쥬스에서 역치 농도에 가깝고, 시즌 초기에 역치에 도달할 수 있다. 리모노이드 β-D-글루코피라노시드는 햄린 및 발렌시아(Vanlencia) 오렌지 쥬스 둘 다에서 역치보다 높다.
이들 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 성분은 매우 쓰다. 특히, 이들은 탄산음료 및 차에서 전형적으로 발견되는 화합물들보다 상당히 더 쓰다. 예를 들면, 리모닌은 카페인보다 거의 200배 더 쓰고 카테킨보다 150배 더 쓰다. 노밀린은 카페인보다 거의 150배 더 쓰고 카테킨보다 45배 더 쓰다.
쓴맛을 내는 물질 그룹들의 각각의 성분이 맛 역치를 갖지만, 쓴맛은 농도에 선형 비례하지 않는다. 예를 들면, 상기 성분들의 농도를 배가시켜도 쓴맛은 두배가 되지 않는다. 또한, 본 발명의 발명자들은 쓴맛에 기여하기 위해서 화합물의 농도가 화합물에 대한 맛 역치에 도달할 필요가 없음을 발견하였다. 오히려, 상기 성분들은 상승적으로 작용하여 개별 성분의 합이 제공할 것으로 예상되는 것보다 강한 쓴맛을 제공한다.
당은 브릭스(Brix)로 측정된다. 본 발명의 발명자들은 감지된 쓴맛이 브릭스가 증가할수록, 특히 브릭스/산 비가 증가할수록 감소하는 것을 밝혀냈다.
따라서, 본원에 제공된 지시에 따라, 당업자는 브릭스, 특히 브릭스/산 비 및 쥬스 제품 중의 이들 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 성분의 농도를 조절함으로써 감귤류 쥬스의 쓴맛을 조절할 수 있다. 예를 들면, 이들 화합물들의 농도는 적합한 가공, 예를 들면, 이온교환법, 증류법 또는 역삼투법을 사용하여 감소시킬 수 있다. 유사하게는, 각각의 화합물의 다양한 농도를 갖는 상이한 쥬스를 블렌딩하여, 이들 화합물의 농도가 쓴맛을 야기하는 농도보다 낮은 쥬스를 수득할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 리모닌이 다양한 경로로 형성됨을 밝혀냈다. 리모닌은 통상적으로 전체 과일에서 맛 역치를 초과하는 농도로 발견되지 않는다. 그러나, 리모닌은 효소에 의해 촉진된 락톤화에 의해 형성된다.
도 1은 이러한 경로를 나타낸다. 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1)는 17-β-D-글루코피라노실 글루코시다제의 작용에 의해 전환되어 리모네이트 A-환 락토스(2)를 형성한다. 당해 락톤은 리모닌-D-환 락톤 하이드롤라제의 존재하에 산 조건(pH<6.5) 하에 환원되어 리모닌(3)을 형성한다. 과일이 익어감에 따라 A-환 락톤이 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드로 전환되기 때문에 글루코시드의 농도는 약 200wppm으로 증가하다.
또한, 리모닌은 쥬스 속에서 산 가수분해를 통해 생성될 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 산 가수분해는 pH 감소 및 온도와 시간의 증가에 의해 촉진된다. 따라서, 쥬스 중의 리모닌을 조절하는 다른 방법들은 가열을 피하고 쥬스를 제한된 시간 동안 낮은 온도에서 저장하고/하거나 쥬스의 pH를 증가시키는 것이다.
쓴맛을 내는 물질 그룹들의 각각의 성분의 농도는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 액체 크로마토그래피/질량 분광(LCMS) 분석 또는 LCMS/MS 분석이 보다 명확한 측정을 제공할 것이다. 당업자는 쓴맛을 내는 물질 그룹들의 성분의 농도를 측정하는 이러한 방법들 및 다른 방법들을 이해한다.
본 발명의 발명자들은, 쓴맛과 마찬가지로, 떫은맛 역치 미만으로 오렌지 쥬스에 존재하는 복수의 화합물들이 쥬스의 떫은맛 입 감각에 기여하는 것을 밝혀냈다. 이러한 떫은맛을 내는 화합물들에 대한 맛 역치를 다음 표에 기재한다.
Figure pct00002

따라서, 본원에 제공된 지시에 따라, 당업자는 쥬스 제품 속의 이들 떫은맛을 내는 화합물들의 농도를 조절함으로써 감귤류 쥬스의 떫은맛을 조절할 수 있다. 예를 들면, 이들 화합물들의 농도는 적합한 가공, 예를 들면, 이온교환법, 증류법 또는 역삼투법을 사용하여 감소시킬 수 있다. 유사하게는, 각각의 화합물들의 다양한 농도를 갖는 상이한 쥬스들을 블렌딩하여 이들 화합물들의 농도가 떫은맛을 야기하는 농도보다 낮은 쥬스를 수득할 수 있다.
신맛 또한 소비자들에게 중요하다. 신맛을 내는 제품은 불쾌하고 자극적인 맛을 갖는다. 또한, 신맛은 종종 위를 불편하게 하고 위에 위와 식도를 손상시키고 트림을 일으킨다.
본 발명의 발명자들은 감지되는 신맛은 적어도 말산 및 시트르산의 상대적인 농도와 관련됨을 발견하였다. 이들 화합물들의 농도와 상대적인 비율은 신맛의 감지에 영향을 미친다.
말산 및 시트르산에 대한 신맛 역치는 당해분야에 알려져 있다. 이들 산들의 상대적인 비율이 상이한 품종의 쥬스 간에 다르고 시즌 중 시기에 따라서 다르지만, 산은 통상적으로 신맛 역치를 초과하고, 따라서 신맛 감각에 기여한다.
따라서, 본원에 제공된 지시에 따라, 당업자는 쥬스 제품 속의 이들 산들의 농도를 조절함으로써 감귤류 쥬스의 신맛을 조절할 수 있다. 예를 들면, 이들 산들의 농도는 적합한 가공, 예를 들면, 이온교환법, 증류법 또는 역삼투법을 사용하여 감소시킬 수 있다. 유사하게는, 각각의 산의 다양한 농도를 갖는 상이한 쥬스를 블렌딩하여 이들 산의 농도가 신맛을 야기하는 농도보다 낮은 쥬스를 수득할 수 있다.
단맛 또한 소비자들에게 중요하다. 일부 소비자들은 단맛을 좋아하지만, 다른 소비자들은 그렇지 않다. 따라서, 단맛을 조절하는 능력은 소비자 만족도를 증가시키는 기회를 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 감지되는 단맛이 적어도 당 글루코스, 프럭토스 및 수크로스의 상대적인 농도와 관련되는 것을 발견하였다. 이들 당의 농도와 상대적인 비율은 단맛의 감지에 영향을 미친다.
글루코스, 프럭토스 및 수크로스에 대한 단맛 역치는 당해분야에 알려져 있다. 이들 당들의 상대적인 비율은 상이한 품종의 쥬스 간에 다르고 시즌 중 시기에 따라 다르다. 그러나, 본원에 제공된 지시에 따라, 당업자는 쥬스 제품 속의 이들 당들의 농도를 조절함으로써 감귤류 쥬스의 단맛을 조절할 수 있다. 예를 들면, 이들 당들의 농도는 적합한 가공, 예를 들면, 이온교환법, 증류법 또는 역삼투법을 사용하여 감소시킬 수 있다. 유사하게는, 각각의 화합물의 다양한 농도를 갖는 상이한 쥬스들을 블렌딩하여 이들 화합물들의 농도가 신맛을 야기하는 농도보다 낮은 쥬스를 수득할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 또한 리모노이드 β-D-글루코피라노시드 중의 하나로부터 형성된 화합물인 이소리모닌의 존재가 신선도의 지표임을 밝혀냈다. 이소리모닌은 또한 C17-에피리모닌으로 알려져 있다. 이소리모닌은 저온살균 후 리모닌을 산 가수분해하여 형성된다. 이소리모닌은 또한 리모닌 17-β-D-글루코피라노시드로부터 비효소적으로 형성된다. 냉동 오렌지 쥬스 농축액 중의 이소리모닌의 농도는 신선한 오렌지 쥬스의 이소리모닌의 농도의 약 2배이며, 이는 쥬스에 "스트레스를 가하는 것(stressing)" 또한 이소리모닌 형성에 기여함을 나타낸다. 따라서, 이소리모닌이 신선한 제품보다 높은 농도로 존재한다는 것은 당해 제품이 신선하지 않을 수 있거나(이소리모닌이 시간이 경과함에 따라 형성되기 때문에) 냉동되었음을 나타낸다.
실시예
다음 실시예들은 본 발명에 관한 다양한 양상들을 예시한다. 실시예 1은 오렌지 씨로부터 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드의 분리에 대한 것이다. 실시예 2는 리모닌이 용액 속에서 증가하는 속도를 측정하기 위한 다양한 온도 및 pH 값에서의 조사를 요약한다. HPLC 및 LC-MS 및 NMR에 의한 리모닌 및 이소리모닌의 확인을 실시예 3에 기재한다.
실시예 4는 오렌지 쥬스 중의 리모닌 및 이소리모닌의 정량화에 대한 것이다. 실시예 5는 관능 분석(sensory analysis)에 관한 것이다.
이들 실시예를 위해서, 다음 화합물들을 상업적으로 입수하였다: 리모닌(Sigma, 독일 슈타인하임); 포름산, 메탄올 및 아세토니트릴(Merck, 독일 다름슈타트); 중수소화 용매(Aldrich, 독일 토프키르헨); 크로마토그래피용으로 사용된 탈이온수는 Milli-Q Gradient A10 시스템(Millipore, 미국 빌레리카)을 통해 정제하였다. 오렌지 씨와 2006년 3월에 미국 플로리다에서 수확한 오렌지(발렌시아 말기)로부터 제조한 오렌지 쥬스 뿐만 아니라 동일한 과일 뱃치로부터 제조한 냉동 농축된 오렌지 쥬스를 오렌지 쥬스 업계(미국)로부터 입수하였다. 신선한 오렌지 과일(발렌시아 말기)을 지역 상인으로부터 구입하였다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
HPLC 장치는 2개의 펌프(Sykam, S 1122), 구배 혼합기(Sunchrom, 동적/정적 구배 혼합기), 레오다인 인젝터(Rheodyne injector)(250㎕ 루프), 오토샘플러(Spark, Midas 380), 200 내지 600nm의 파장 범위에서 유출물을 모니터링하는 다이오드 어레이 검출기(Sunchrom, SpectraFlow 600 DAD), 분배 모듈(Upchurch, P-470 눈금 마이크로스플리터) 및 네뷸라이저(S.E.D.E.R.E., HPLC 네뷸라이저 200㎕/min-2.5mL/min)가 장착된 증기화 광산란 검출기(ELSD)(S.E.D.E.R.E., Sedex 85 LT-ELSD, p = 2.6bar, T = 40℃)로 이루어져 있다.
액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS)
LC-MS/MS 분석은 네거티브(ESI-) 또는 포지티브(ESI+) 전기분무 이온화 방식으로 작동되는 API 4000 LC-MS/MS에 연결된 Agilent 1100 HPLC-시스템(Applied Biosystems, 독일 다름슈타트)을 사용하여 수행하였다. 분무 전압은 -4500V로 설정했고, 질소가 커튼 가스(curtain gas)(20psi)로서 작용했고, 디클러스터링 전위(declustering potential)는 -65V로 설정하였다. 다중 반응 모니터링(MRM) 방식을 통해 화합물 2 및 3을 위에서 설명한 질량 전이를 사용하여 분석하였다.
핵자기 공명 분광학(NMR)
1H, COSY, HMQC 및 HMBC 분광학적 실험은 브루커(Bruker)(독일 라인슈테텐)로부터 입수한 DPX 400 MHz NMR에서 수행하였다. 샘플을 측정 전에 내부 표준물로서 테트라메틸실란과 함께 DMSO-d 6 또는 MeOD-d 4에 용해시키고 NMR 튜브(Schott Professional 178 x 5mm)에 넣었다. 데이타 처리는 NMR 소프트웨어 Mestre-C를 사용하여 수행하였다.
실시예 1 -오렌지 씨로부터 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드의 분리
오렌지 씨(100g)를 물로 철저히 세척하고, 아세톤으로 세척한 후, 액체 질소 중에서 냉동시키고, 분쇄 밀에서 분쇄한 다음, 메탄올(300mL)로 4시간 동안 60℃에서 2회 추출하였다. 여과시킨 후, 추출물로부터 용매를 진공 중에서 제거하여 메탄올 추출물을 무정형 분말(28g)로서 수득하였다.
조악한 분리물의 분취물(2g)을 물로 컨디셔닝된 Amberlite XAD-2 물질(BDH Chemicals Ltd, 영국 풀)의 슬러리로 충전된 수냉 유리 칼럼(300mm x 35mm)의 상부에 적용된 물(10mL)에 용해시켰다. 5mL/min의 유량으로 작동시키고, 크로마토그래피를 물(200mL; 분획 I)로 시작하여 메탄올 20% 함유 메탄올/물 혼합물(200mL; 분획 II), 메탄올 40% 함유 메탄올/물 혼합물(200mL; 분획 III), 메탄올 60% 함유 메탄올/물 혼합물(200mL; 분획 IV), 메탄올 80% 함유 메탄올/물 혼합물(200mL, 분획 V) 및 메탄올(200mL; 분획 VI)을 사용하여 수행하였다. 개별 분획을 따로 수거하고, 진공중에서 30℃에서 용매를 제거한 후, 동결-건조시켜 분획 I 내지 VI을 무정형 분말로서 수득하였다.
분획 II 내지 IV를 합하고, 메탄올과 0.1% 수성 포름산의 혼합물(20/80, v/v)에 용해시키고, 막 여과한 후, 분취액(250㎕)을 Microsorb-MV, RP-18, 250 x 10mm 내경, 5㎛ 칼럼(Varian, 독일) 상에서 반-제조용(semi-preparative) HPLC로 분별화하였다. 220nm에서의 UV 검출기 및 증기화 광산란 검출기(ELSD), 크로마토그래피를 통한 유출물 모니터링을, 유량 3.5mL/min으로 아세토니트릴과 0.1% 수성 포름산의 혼합물(10/90, v/v)로부터 출발하여 15분 이내에 아세토니트릴 함량을 20%로 증가시키고, 5분 동안 유지시키고, 마지막으로 5분 이내에 아세토니트릴 함량을 100%로 증가시켜 수행하였다. 17분에 검출된 피크의 유출물을 빙냉 플라스크에 수거하고, 유기 용매를 진공중에서 제거한 후, 수성 층을 물로 컨디셔닝된 Strata C 18-E SPE 카트릿지(10g, 55㎛; Giga Tubes, Phenomenex)의 상부에 가하였다. 카트릿지를 물(150mL)로 플러싱한 후, 이를 통해 질소 스트림을 흡인하여 건조시키고, 마지막으로 메탄올(100mL)로 용출시켰다. SPE 카트릿지는 미량의 포름산을 제거하여 아글리콘의 양성자 촉매된 유리를 방지한다. 유기 유출물로부터 용매를 진공 중에서 제거하고, 잔류물을 물(5mL)에 현탁시키고, 동결-건조시켜 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드를 순도 99% 이상의 백색 무정형 분말로서 수득하였다.
Figure pct00003

실시예 2 - 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드로부터 리모닌의 생성
오렌지 쥬스를 저장하는 동안 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드로부터 리모닌의 추정되는 비효소적 방출을 조사하기 위해서, 금방 짜 낸 오렌지 쥬스(pH 3.5)의 pH 값 또는 오렌지 쥬스 농축물에서 밝혀진 pH 값의 범위(pH 2.0 내지 3.0)로 조정된 글리코피라노시드 수용액을 암실에서 14주 이하 동안 20℃에서 유지시켰다. 일정한 시간 간격으로, 분취액을 모델 용액으로부터 회수하여 MRM 방식으로 작동하는 HPLC-MS/MS를 통해 글루코피라노시드로부터 방출된 리모닌의 양을 분석하였다. 모델 용액의 pH 값과 독립적으로, 도 2에 도시된 바와 같이 저장 시간이 증가함에 따라 리모닌은 생성되지만, pH 값의 감소가 쓴맛을 내는 화합물의 생성에 유리하다. 예를 들면, pH 2.0에서 유지되는 경우에 리모닌 0.85mol%가 글루코피라노시드로부터 방출되는 반면, pH 3.5에서는 쓴맛을 내는 화합물 0.25%만이 생성되었다.
리모닌 생성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해서, pH 3.0으로 조정된 글루코피라노시드 수용액을 암실에서 14주 이하 동안 4, 20 및 30℃에서 유지시켰다. 일정한 시간 간격으로, 리모닌의 양을 MRM 방식으로 작동하는 HPLC-MS/MS를 통해 측정하였다. 도 3에 도시된 결과는 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드로부터의 리모닌의 방출이 4℃ 및 20℃에서 각각 유지시킨 모델 용액에 비해 30℃에서 촉짐됨을 명확히 입증하였다. 예를 들면, 리모닌은 30℃에서 항온처리되는 경우, 거의 4.0% 수율로 이의 전구체로부터 방출되는 반면, 전구체 용액을 4℃에서 14주 동안 저장한 후에 쓴맛을 내는 화합물 단지 0.2%만이 검출 가능했다.
특히, 미량의 염산(1mol/L)을 가함으로써 pH 값 2.0, 3.0 및 3.5로 각각 조정된 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(0.35mg/L) 수용액을 암실에서 밀폐된 유리병 속에서 14주 이하 동안 상이한 온도(4, 20, 30℃)에서 유지시켰다. 일정한 시간 간격으로, 샘플(5㎕)을 시린지로 회수하여 Synergi Fusion, 150 x 2 mm 내경, 4㎛ 칼럼(Phenomenex) 상에서 LC-MS/MS를 통해 리모닌의 생성을 분석하였다. 이를 달성하기 위해, 0.1% 수성 포름산과 아세토니트릴의 혼합물(80/20, v/v)로부터 출발하여 아세토니트릴 함량을 10분 이내에 40%로 증가시키고, 5분 이내에 80%로 증가시키고, 5분 동안 유지시킨 후, 마지막으로 5분 이내에 100%로 증가시켜 유량 250㎕/min으로 크로마토그래피를 수행하였다. 네가티브 전기분무 이온화를 사용하여 리모닌을 다중 반응 모니터링(MRM) 방식으로 질량 전이 m/z 469→229를 사용하여 분석하였다. 정량화 분석은 질량 트레이스(mass trace)에 대해 수득된 피크 면적을 메탄올 중의 리모닌의 정의된 표준 용액의 피크 면적과 비교함으로써 수행하였다.
도 4는 LC-MS/MS 크로마토그램이 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1) 및 리모닌(3)을 나타내지 않음을 보여주지만, 놀랍게도 제3 피크(4)가 16.59분에 용출되고 리모닌에 대해 밝혀진 바와 같은 동일한 질량 전이 m/z 469→229를 보여주며, 이는 리모닌 입체이성체의 존재를 의미한다. 상기 화합물의 화학 구조가 NMR 분광학 실험에 의해 아직 명확하게 확인되지 않았기 때문에, 추가의 실험들은 분광학 실험을 수행하기 위해 화합물 4를 적합한 양으로 제조하는 것을 목적으로 한다.
실시예 3 - 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드로부터 방출된 리모닌 및 이소리모닌(화합물 4 )의 확인
실시예 2에서 확인되고 도 4에 도시된 화합물 4의 화학 구조를 결정하기 위해서, pH 1.5로 조정된 리모닌-17-β-D-글루피라노시드의 수용액을 60℃에서 4시간 동안 항온처리하고, 화합물 4를 분리하고, 반-제조용 HPLC를 통해 정제시킨 후, 이의 화학 구조를 LC-MS/MS 및 1D/2D-NMR 실험을 통해 결정하였다. 도 5에 도시된 1H NMR 스펙트럼에서, 21개의 신호가 관찰되었고, 이들 중 δ 1.44, 1.72, 2.00, 2.25, 2.66, 2.66, 2.73, 2.75, 2.91, 및 4.14ppm의 화학적 이동을 나타내는 10개의 신호는 리모닌의 알킬 양성자 H-C(12a), H-C(11), H-C(12b), H-C(6a), H-C(2a), H-C(5), H-C(2b), H-C(9), H-C(6b) 및 H-C(1)의 공명과 다소 일치하였다. 이들 신호의 할당은 호모- (COSY) 및 타핵종 상호관계 실험(HMQC, HMBC)을 통해 명확하게 확인되었다. 4.51 및 4.78ppm에서 공명하는 디아스테레오트로픽(diastereotropic) 양성자는 메틸렌 양성자 H-C(19)와 일치하였고, 이는 리모닌에 존재하는 온전한 A-환을 나타낸다. 또한, 푸란 양성자 H-C(21), H-C(22) 및 H-C(23)에 대해 6.62, 7.60 및 7.70ppm에서 관찰되는 공명 신호는 리모닌과 구조적 유사성을 입증하였다. 그러나, 화합물 4는 양성자 H-C(15), H-C(17) 및 H-C(18)의 화학적 이동에서 리모닌과 현저한 차이를 나타내었다. 양성자 H-C(17)는 5.48ppm(3)으로부터 5.05ppm(4)로의 하이-필드(high-field) 이동을 나타내는 반면, 양성자 H-C(15) 및 H-C(18)는 각각 4.21 및 1.11ppm(3)로부터 4.50 및 1.48ppm(4)로의 로우-필드(low-field) 이동을 나타내었다. 또한, 2D-NMR 실험은 리모닌(3)에 대해 77.9/20.0ppm에서 공명하고 화합물 4에 대해 85.1/27.1ppm에서 공명하여 C(17)/C(18)의 화학적 이동에 차이를 나타내는 것으로 확인되었고, 이는 화합물 4의 구조에서 위치 C(17)에서의 리모닌의 에피머화를 나타낸다. 모든 분광학적 데이타를 고려해 볼때, 화합물 4는 C(17)에서 리모닌의 α-배향이 아닌 β-배향의 푸란 환을 나타내는 리모닌의 C17-에피머로서 처음으로 명확하게 확인되었다. C17-에피리모닌 또는 이소리모닌으로 명명된 화합물 4가 이미 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드의 사람 혈장 대사물질로서 추정되고 있지만, 이는 리모닌 에피머의 글루코피라노시드로부터 가수분해적 방출을 입증하는 분광학적 데이타에 근거한 리모닌 에피머 구조의 최초 확인이다.
특히, 물(20mL) 속의 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(35mg)의 용액을 미량의 염산(1mol/L)을 사용하여 pH 1.5로 조정하고, 60℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 냉각시킨 후, 상기 용액을 수-컨디셔닝된 Strata C 18-E SPE 카트릿지(10g, 55㎛, Giga Tubes, Phenomenex)의 상부에 가하고, 물(150mL)로 플러싱한 다음, 물/메탄올 혼합물(50/50, v/v; 100mL) 및 메탄올(150mL)로 플러싱하였다. 메탄올 분획으로부터 진공 중에서 용매를 제거하고, 메탄올과 1% 수성 포름산의 혼합물에 용해시킨 후, 분취액(100㎕)을 Microsorb-MV, RP-18, 250 x 10mm 내경, 5㎛ 칼럼(Varian, 독일) 상에서 반분취용 HPLC를 통해 분리시켰다. 220nm에서 UV-검출기 뿐만 아니라 ELSD에 의해 유출물을 모니터링하면서, 유량 3.5mL/min으로 작동하는 용매 구배로 아세토니트릴과 0.1% 수성 포름산의 혼합물(30/70, v/v)로 출발하여 15분 이내에 아세토니트릴 함량을 40%로 증가시키고, 10분 이내에 80%로 증가시키고, 마지막으로 10분 이내에 100%로 증가시켜 크로마토그래피를 수행하였다. 2개의 피크가 검출 가능하였고; 각각의 피크의 유출액은 빙냉 플라스크에 개별적으로 수거하고, 진공 중에서 용매를 제거한 후, 동결-건조시켰다. 분리된 화합물을 리모닌 및 이의 아직 보고되지 않은 입체이성체 C17-에피리모닌(이는 이소리모닌으로도 알려져 있다)으로서 LC-MS 및 NMR 실험을 통해 확인하였다.
Figure pct00004

Figure pct00005

본 발명의 발명자들은 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 도 6은 리모닌-β-D-글루코피라노시드로부터 리모닌(3) 및 이소리모닌, 또는 C17-에피리모닌(4)의 형성을 보여주는 반응 경로를 도시한다. 글루코스는 우수한 이탈 그룹이기 때문에, 헥소스는 산성 조건하에 1의 푸르푸릴리덴 그룹의 α-위치로부터 분리되어 일시적인 주요 중간체로서 비편재된 푸르푸릴리덴 양이온을 방출시킨다. 이어서, 카복시 작용기의 친핵성 공격에 의해 유도된 분자내 폐환으로 α-배향의 푸란환을 갖는 리모닌(3) 뿐만 아니라 C(17)에서 β-배향의 푸란환을 나타내는 이소리모닌/C17-에피리모닌을 생성시킨다.
또한, pH 3의 수용액 속에서 리모닌을 항온처리하여도 상당량의 이소리모닌을 생성시키지 못하고, 따라서 이소리모닌은 리모닌의 직접적인 에피머화에 의해 형성되지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4 - 오렌지 쥬스 중의 리모닌과 이소리모닌의 정량화
오렌지 쥬스의 저장 동안 리모닌 및 이소리모닌/C17-에피리모닌의 생성을 조사하기 위해서, 금방 짜 낸 오렌지 쥬스(pH 3.5)를 4주 이하 동안 20℃에서 저장한 후, 리모닌 및 이소리모닌/C17-에피리모닌을 MRM 방식을 사용하여 HPLC-MS/MS를 통해 정량적으로 측정하였다. 도 7A에 도시하는 바와 같이, 오렌지 쥬스 중의 리모닌의 농도는 저장 동안 금방 짜 낸 쥬스에서의 70.0㎍/100g으로부터 2주 동안 4 및 20℃에서 각각 유지시키는 경우에 80 및 85㎍/100g으로 약간 증가하였다. 오렌지 쥬스의 저장은 또한 C17-에피리모닌의 농도도 증가시키는데, 예를 들면, 4 내지 20℃에서 각각 4주 동안 유지된 샘플 속에서 C17-에피리모닌의 양이 1.5배 또는 2배 증가하는 것이 관찰되었다(도 7B). 저장으로 인한 리모닌 양의 증가와 저장으로 인한 이소리모닌의 양의 증가를 비교해보면, 오렌지 쥬스의 저장시 리모닌의 형성이 이의 C17-에피머의 형성보다 촉진되고, 이는 저장 동안 쥬스 중에 존재하는 리모노에이트 A-환이 산 촉매작용시 서서히 리모닌으로 전환된다는 문헌의 기재내용을 지지한다.
두번째 실험 세트에서, 리모닌 및 이소리모닌/C17-에피리모닌의 생성에 대한 열처리의 영향을 조사하였다. 이를 달성하기 위해서, 금방 짜 낸 오렌지 쥬스를 70℃에서 10분 동안 열처리하고, 이들 화합물의 최대 방출 속도에 대해서 일부 정보를 얻기 위해서 95℃에서 240분 이하 동안 열처리하였다. HPLC-MS/MS (MRM) 분석으로 금방 제조되고 열처리되지 않은 쥬스 중의 리모닌 및 이소리모닌의 농도가 각각 70.0 및 1.3㎍/100g임을 밝혀냈다(도 8A). 열처리시, 테르페노이드 둘 다의 농도가 상당히 증가하는데, 예를 들면, 70℃에서 10분 동안 가열함으로써 이소리모닌의 양이 5배까지 증가하여 농도 6.1㎍/100g에 도달하는 반면, 리모닌의 농도는 100㎍/100g에 도달하였다.
95℃에서 오렌지 쥬스를 가열하는 것은 리모닌 및 이소리모닌의 양에 훨씬 더 영향을 미친다. 오렌지 쥬스를 95℃에서 10분 동안 가열한 후, 이미 C17-에피리모닌의 양은 10배까지 증가하였다(도 8A). 각각 30분 및 60분 동안 가열한 후, C17-에피리모닌 20 및 30㎍/100g이 생성되었다. 60분 동안 가열시, 리모닌의 농도는 70㎍/100g으로부터 115㎍/100g으로 증가하였고 4시간 후에 최대값 140㎍/100g에 도달하였다. 가열된 오렌지 쥬스 샘플 중의 리모노이드 둘 사이의 비를 계산함으로써 C17-에피리모닌/리모닌 비가 가열 시간이 증가함에 따라 극적으로 변화하고, 240분 후에 최대 0.50에 도달하는 것으로 밝혀졌다(도 8B).
이들 측정을 위해서, 오렌지를 2등분해서 부엌용 감귤류 쥬서기(Citromatic MPZ 22, 독일 브라운)를 사용하여 손으로 주의해서 압착하였다. 오렌지 쥬스 중의 리모닌 및 이소리모닌의 농도에 대한 저온 저장의 영향을 조사하기 위해서, 금방 짜 낸 오렌지 쥬스의 분취액(300mL)을 암실에서 4 및 20℃에서 4주 동안 유지시켰다. 승온에서의 리모닌 및 이소리모닌의 형성을 조사하기 위해서, 금방 짜 낸 오렌지 쥬스의 분취액(300mL)을 70℃에서 10분 동안 또는 95℃에서 240분 이하 동안 열처리하였다.
정량 분석을 위해서, 신선한 오렌지 쥬스와 처리된 오렌지 쥬스의 분취액(8g)을 각각 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하고, 불용성 물질을 현탁시키고, 물(8mL)과 친밀하게 혼합한 후, 다시 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 합하고, 수-컨디셔닝된 C 18-E SPE-카트릿지(1g, 5㎛, Phenomenex)의 상부에 위치시켰다. 물(20mL)로 플러싱한 후, 카트릿지를, 이를 통해 질소 스트림을 흡인함으로써 건조시킨 다음, 메탄올(20mL)을 사용하여 용출시켰다. 메탄올성 유출물로부터 진공 중에서 용매를 제거하고, 메탄올 3.0mL를 보충하였다. 분취액(5㎕)을 Synergi Fusion, 150 x 2 mm 내경, 4㎛ 칼럼(Phenomenex) 상에서 LC-MS/MS를 통해 리모닌 및 이소리모닌/C17-에피리모닌에 대해서 분석하였다. 이를 달성하기 위해서, 0.1% 수성 포름산과 아세토니트릴의 혼합물(80/20, v/v)로부터 출발하여 아세토니트릴 함량을 10분 이내에 40%로 증가시키고, 5분 이내에 80%로 증가시키고, 5분 동안 유지시킨 후, 마지막으로 5분 이내에 100%로 증가시켜 유량 250㎕/min으로 크로마토그래피하였다. 네거티브 전기분무 이온화를 사용하여, 리모닌 및 이소리모닌/C17-에피리모닌을 질량 전이 m/z 469→229를 사용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 방식으로 분석하였다. 질량 트레이스에 대해 수득된 피크 면적과 메탄올 중의 리모닌 및 C17-에피리모닌의 정의된 표준 용액의 피크 면적을 비교함으로써 정량 분석을 수행하였다.
최종 실험은 3 및 4의 양에 대한 오렌지 쥬스 농축 공정의 영향에 집중하였다. 이를 달성하기 위해서, C17-에피리모닌의 농도를 신선한 오렌지 쥬스 및 6.6배 농축된 동일한 오렌지 쥬스 뱃치로부터 제조된 냉동 오렌지 쥬스에서 정량적으로 분석하였다. 오렌지 쥬스는 이소리모닌/C17-에피리모닌을 1.6㎍/100g의 양으로 함유하는 한편, 약 21.0㎍/100g의 이소리모닌이 상응하는 냉동 농축된 쥬스에서 발견되었다. 당해 농축액은 오렌지 쥬스의 6.6배 농축에 의해 제조되었음을 고려하면, 에피머 10.6㎍/100g이 농축 쥬스 속에서 발견될 것으로 예상되었다. 그러나, 2배 많은 21.0㎍/100g의 양이 냉동 농축액에 존재하였고, 이는 C17-에피리모닌이 냉동 농축 오렌지 쥬스를 제조하는 동안 상당량 형성됨을 처음으로 명백히 입증한다.
실시예 5 - 관능 분석
이들 리모노이드의 관능 활성에 대한 C(17)의 키랄성의 영향을 조사하기 위해서, 쓴맛 역치 농도를 리모닌 및 C17-에피리모닌에 대해 측정하였다. 이러한 관능 조사에 의해 C17-에피리모닌에 대한 쓴맛 역치 농도 10.0㎍/L(물)은 리모닌에 대해 얻어진 쓴맛 역치 농도(4.0㎛ol/L)에 다소 근접하는 것으로 드러났고, 이는 트리테르펜 락톤 화합물 둘 모두의 유사한 관능 활성을 입증한다.
이러한 평가를 수행하기 위해서, 2년 이상 동안 매주 훈련에 참가한 11명의 평가인(여성 4명 및 남성 7명, 연령: 23 내지 39세)이 문헌[참조: Stark, T.; Barenther, S.; Hofmann, T. (2005) J. Agric. Food Chem. 53:5407-5418]에 이미 보고되어 있는 과정에 따라서 3개의 선택적 강제 선택법을 통해 자극 농도를 증가시키면서 병 속의 물(pH 5.1) 속에서의 맛 인지 역치 농도를 측정하였다.
실시예는 리모노에이트 A-환 락톤(2)의 폐환만이 리모닌을 형성시킬 수 있지만(도 1), 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드(1)가 가수분해되어 푸르푸릴리덴 양이온을 거쳐 리모닌(3) 및 C17-에피리모닌(4)을 생성시킴을 나타낸다(도 6). 미량의 이소리모닌만이 오렌지 쥬스의 저온-저장시 생성되는 것으로 밝혀졌지만, 상당히 많은 양이 승온시 이의 전구체 리모닌-17-β-D-글루코피라노시드로부터 방출되므로, C17-에피리모닌/리모닌 비는 오렌지 쥬스 가공 동안 인가된 열 투입량을 분석적으로 측정할 수 있는 적합한 표지일 수 있다.
도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 이소리모닌/리모닌 비는 약 20분 이내에 0으로부터 약 0.25로 증가하였고, 100℃에서 약 60분 이내에 약 0.40 내지 0.45로 증가하였다. 따라서, 이소리모닌/리모닌 비(C17-에피리모닌/리모닌 비라고도 한다)는 가열의 강도를 나타내는 경향이 있다.
본 발명은 본 발명을 수행하는 바람직한 방식을 포함하여 특정 실시예에 대해 기재되었지만, 당업자는 상기된 시스템 및 기술의 다수의 변형 및 변경이 있음을 이해할 것이며, 이러한 변형 및 변경은 청구범위에 기재된 본 발명의 취지 및 범위 내에 있다

Claims (21)

  1. 리모닌, 이소리모닌, 노밀린 및 이들의 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물의 과일 쥬스 속에서의 농도를 이들의 역치 맛 수준(threshold taste level) 미만의 수준으로 조절함을 포함하여, 과일 쥬스의 향미를 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 쥬스 속의 브릭스(Brix)/산 비를 조절함을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 폴리메톡시화 플라본(flavone)의 농도를 이의 역치 맛 수준 미만의 수준으로 조절함을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 쥬스 속의 브릭스/산 비를 조절함을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 쥬스 속의 리모노이드 β-D-글루코피라노시드의 농도를 조절함을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 쥬스 속의 리모노이드 β-D-글루코피라노시드의 농도를 이의 역치 맛 수준 미만의 수준으로 조절함을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이소리모닌/리모닌 비가 약 0.25 미만인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 이소리모닌/리모닌 비가 약 0.25 미만인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 농도가 역삼투법, 이온교환법, 증류법 또는 이들의 조합법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술에 의해 조절되는 방법.
  10. 처리되지 않은 과일 쥬스보다 쓴맛이 약한 과일 쥬스로서,
    당해 과일 쥬스 속에서의 리모닌, 이소리모닌, 노밀린 및 이들의 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물의 농도가, 상기 화합물의 역치 맛 농도 미만인, 과일 쥬스.
  11. 제10항에 있어서, 폴리메톡시화 플라본을 추가로 포함하는 과일 쥬스.
  12. 제10항에 있어서, 리모노이드 β-D-글루코피라노시드를 추가로 포함하는 과일 쥬스.
  13. 제7항에 있어서, 상기 이소리모닌/리모닌 비가 약 0.25 미만인 과일 쥬스.
  14. 처리되지 않은 과일 쥬스보다 쓴맛이 약한 처리된 과일 쥬스로서,
    상기 처리된 과일 쥬스의, 리모닌, 이소리모닌, 노밀린 및 이들의 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물의 농도가, 상기 처리되지 않은 과일 쥬스 속의 상기 화합물의 농도보다 낮은, 처리된 과일 쥬스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이소리모닌/리모닌 비가 약 0.25 미만인, 처리된 쥬스.
  16. 제14항에 있어서, 추가로, 말산, 시트르산 및 이들의 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산의 수준이, 상기 처리되지 않은 쥬스 속의 상기 산의 농도보다 낮은, 처리된 쥬스.
  17. 제14항에 있어서, 상기 화합물의 농도가 이의 역치 맛 수준보다 낮은, 처리된 쥬스.
  18. 제16항에 있어서, 상기 화합물의 농도가 이의 역치 맛 수준보다 낮은, 처리된 쥬스.
  19. 제2항에 있어서, 상기 브릭스/산 비가 말산, 시트르산 및 이들의 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산의 농도를 감소시킴으로써 조절되는 방법.
  20. 제4항에 있어서, 상기 브릭스/산 비가 말산, 시트르산 및 이들의 블렌드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산의 농도를 감소시킴으로써 조절되는, 방법.
  21. 이소리모닌 대 리모닌의 비를 측정함을 포함하여, 과일 쥬스에 부과된 열 스트레스(heat stress)의 양을 측정하는 방법.

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