CN105029631B - 控制果汁的风味特性以及果汁中新鲜度的指标 - Google Patents

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Abstract

控制果汁、特别是柑橘属果汁且尤其是橙汁的风味特性和其中的鲜味，包含将其中选自由柠檬苦素、异柠檬苦素、诺米林及其混合物组成的组的化合物的浓度控制到低于其阈味道水平的水平。

Description

控制果汁的风味特性以及果汁中新鲜度的指标
本申请是申请日为2008年10月9日、申请号为200880110658.0、发明名称为“控制果汁的风味特性以及果汁中新鲜度的指标”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求享有2007年10月9日提交的美国临时申请系列No.60/978,515的优先权，所述美国临时申请的名称为“Control of Flavor Characteristics of andIndicator of freshness in Fruit Juice”,并且该美国临时申请以参照的方式全文并入本文。
发明领域
本发明涉及控制果汁的风味特性和果汁中的鲜味。特别是，本发明涉及控制柑橘类果汁、特别是橙汁的风味特性以及其中的鲜味。
发明背景
长期以来，柑橘类水果被认为是重要营养物的有价值的来源。更近期一些，柑橘属来源的健康益处和防病或治病益处已经被更充分地认为在被摄入时是有利的和有益的。因此，一般认为，在人类健康的总体方案中，增加起源于柑橘属的食物的摄入是一个有益而重要的目标。而且，柑橘类水果受到很多消费者的喜爱，只是因为它们别有风味。
摄入柑橘属产品的一种便利途径是果汁的形式。果汁能容易地制备，而且能便利地被运输和消费。新鲜的或者“不是从浓缩物得到的”果汁因其风味和品质而得到好评。也可以将果汁浓缩，然后由消费者就便冲调。浓缩果汁同样以一种高效且节约成本的方式从其来源配给到消费者。而且，与果实相比，果汁可以更容易地被在进食固体食品方面有困难的人们所食用。
然而，一些消费者不喜欢柑橘类果汁的某些特性，例如苦味、酸味、异味成分、涩味、褐变和稠度。包括葡萄柚、橙子、红桔、酸橙和柠檬在内的所有柑橘类水果都会表现出这些问题。一些消费者偏爱有低水平甜味的果汁，而其他消费者偏爱非常甜的产品。此外，往往难以达到所述风味特性中的一致性，例如，从采摘季节的早期到采摘季节的晚期。
苦味往往是消费者关心的首要问题。对于很多消费者来说，低水平的苦味可以对果汁的感官性质和特性做出所需的贡献。这类消费者喜爱低水平苦味的开胃风味成分。然而，大多数消费者也承认，过度的苦味会不利地影响果汁的感官性质和特性，使它令消费者不舒服。消费者往往还把苦味与缺少新鲜度相联系，与浓缩果汁相联系，和/或与低品质果汁相联系。
苦香味以不同的程度见于每个种类的柑橘类水果。在相同水果的各栽培品种之间、在相同栽培品种的各果实之间、从采摘季节的早期到采摘季节的晚期，这些风味的浓度都存在着差异。因此，水果的来源、采摘季节的时间以及其它变量都影响着水果中苦香味的浓度。
涩味是果汁、特别是柑橘类果汁的一个特性，消费者往往认为这个特性令人不快。特别是，柑橘类果汁中的涩味往往以柔软的、糊嘴(mouth-coating)感觉为特征。很多消费者认为这种口感令人不快。
消费者还关心果汁的酸味。消费者往往认为柑橘类果汁是酸性的。消费者通常将酸味不仅与令人不快的辛辣味相联系，而且与倒胃或胃中不适以及打嗝的感觉相联系。
到此为止，为降低苦味、酸味和其它令人不快的感官性质和特性而做出的努力很有限，主要是通过脱除选定的化合物。柠檬苦素是一种这样的化合物。其它方法是从果汁来源中排除果实的某些部分，例如籽和皮，以使苦香味的浓度最小化。
此外，新鲜度是消费者所需要的特性。与新鲜果汁相比，从浓缩物得到的果汁往往被认为是低质量的。用于处理冷冻果汁和果汁浓缩物的各种方法是已知的。然而，到此为止，从浓缩物得到的果汁对风味有有害的影响，而且还没有市售的完全令人满意的果汁，不管是新鲜的还是冷冻的果汁。
因此，需要这样一种果汁，其中的苦香味被控制到令消费者普遍感到愉悦而且不太苦的限度之内。同样需要一种品尝起来有新鲜感觉的果汁。
发明概述
本发明的第一个实施方案涉及控制果汁、特别是柑橘类果汁中的苦味。
本发明的第二个实施方案涉及通过控制关键苦香味的浓度来控制柑橘类果汁中的苦味和新鲜度。
本发明的第三个实施方案涉及控制果汁、特别是橙汁中的涩味。
本发明的第四个实施方案涉及控制果汁、特别是橙汁中的酸味。
本发明的第五个实施方案涉及控制果汁、特别是橙汁中的甜味。
附图简述
图1描绘了一张反应图解，显示出柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)的酶促降解，经由柠檬苦素酸A-环内酯(2)，得到苦味的柠檬苦素(3)。
图2图解了在20℃下贮藏的柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)水溶液中，pH值对时间依赖型形成柠檬苦素(3)的影响。
图3图解了在pH 3.0下的柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)水溶液中，温度对依赖型形成柠檬苦素(3)的影响。
图4是RP－HPLC－MS/MS色谱，得自在30℃下保温十周的柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)的水溶液(pH 3.0)，并且显示了柠檬苦素(3)和一种未知水解产物(4)的峰。
图5是纯化的C17-表柠檬苦素(4)的1H NMR谱图(400MHz)。
图6图解了一个反应顺序，显示了柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)的水解降解，经由作为关键中间体的亚糠基碳阳离子，得到柠檬苦素(3)和C17-表柠檬苦素(4)。
图7图解了在20℃下贮藏橙汁时，随着时间的推移，柠檬苦素(A)和C17-表柠檬苦素(B)的生成。
图8图解了热处理橙汁时，随着时间的推移，柠檬苦素和C17-表柠檬苦素(A)的生成以及C17-表柠檬苦素/柠檬苦素比(B)。
发明详述
本发明旨在控制果汁的风味特性。特别是，本发明的实施方案旨在通过控制关键苦香味的浓度来控制柑橘类果汁中的苦味，通过控制关键涩味特点的原因来控制涩味，通过控制各种酸的浓度和相对比例来控制酸味，以及通过控制糖类的浓度和相对比例来控制甜味。
本发明还旨在把鲜味赋予果汁。特别是，本发明的实施方案旨在控制果汁中的组分从而使所述果汁品尝起来有新鲜的感觉。
本领域技术人员公认的是，风味组分在食品中的浓度必须超过一个阈，然后消费者才能感觉到所述风味组分。感觉不同的风味特性(例如涩味和苦味)的阈是不同的。因此，至今关于鉴定对风味特性有贡献的化合物的工作针对以超过相应味道阈的浓度存在的那些化合物。
本发明人已经发现，柑橘类果汁、特别是橙汁的苦味至少部分地是由三个苦味物质组的相互作用所导致的而且受到果汁中糖的浓度的影响。在这三组苦味物质组与糖之间的协同作用的发现构成了控制柑橘类果汁中苦味的能力的基础。到此为止，本领域技术人员还不知道三个苦味物质组和糖控制着橙汁中苦味的感觉。
柠檬苦素是一种本领域人员已知的能导致橙汁中的苦味的物质，该物质并不单独地是橙汁的全部苦味的原因。相反，橙汁中的苦味是由下列三个苦味物质组的相互作用引起的：
(1)柠檬苦素，异柠檬苦素，和，在较小的程度上，诺米林；
(2)多甲氧基化黄酮类(PMF’s)；和
(3)柠檬苦素类化合物β-D-吡喃葡糖苷。
于是，控制果汁中这些组分的相对浓度连同控制果汁中的糖浓度就能控制果汁中苦味的感觉。
这些苦味物质组中各个成员的浓度随着栽培品种、生长和收获季节的时间(即，早季、中季或晚季)和加工条件的不同而变化。例如，与从晚期收获的橙子获得果汁的情况相比，发现在从早期和中期收获的橙子获得的果汁中在更大程度上形成柠檬苦素。理解了所述三个苦味物质组与糖之间的关系，就能控制橙汁以及包含这些组分的柑橘类果汁的苦味。
下表中列出了这些苦味物质组中的各个成员的味道阈：
在这些化合物的结构式中可以看出，这些苦味物质组中的成员具有共同的结构特征。
本发明人已经发现，PMF’s以及，在较小的程度上，诺米林的阈下浓度增强橙子产品例如橙汁中柠檬苦素导致的苦味。这个效应出乎预料，因为本领域技术人员不会预期到，低于味道阈存在的化合物会对苦味有贡献。
在哈姆林橙汁中，诺米林接近阈浓度而且在采摘季节的早期可能达到阈值。在哈姆林橙汁和伏令夏橙汁中，柠檬苦素类化合物β-D-吡喃葡糖苷都高于阈值。
这些苦味物质组中的这些成员非常苦。特别是，它们比碳酸软饮料和茶中常见的化合物要苦得多。例如，柠檬苦素的苦味是咖啡因的几乎200倍，是儿茶素的150倍。诺米林的苦味是咖啡因的几乎150倍，是儿茶素的45倍。
虽然苦味物质组中的每一个成员都具有味道阈，但是苦味并不是与浓度线性相关的。例如，使组分的浓度加倍并不能使苦味加倍。此外，本发明人已经发现，化合物的浓度不必达到对于该化合物的味道阈就能对苦味做出贡献。相反，所述组分协同作用而产生一种大于各个部分之和能预期到的苦味。
糖是用白利糖度来量度的。本发明人已经发现，随着白利糖度的升高、特别是随着的白利糖度/酸度比的升高，感觉到的苦味下降。
于是，有了本文提供的指导，本领域技术人员就能通过控制果汁产品中的白利糖度、特别是白利糖度/酸度比以及这些苦味物质组的这些成员的浓度来控制柑橘类果汁的苦味。例如，可以采用适当的处理(例如离子交换、蒸馏或反渗透)降低这些化合物的浓度。类似地，可以将具有各种浓度的每种化合物的不同果汁掺合成这样一种果汁，该果汁中这些化合物的浓度低于导致苦味的浓度。
本发明人已经发现，柠檬苦素是通过各种途径形成的。通常，柠檬苦素不以高于味道阈的浓度存在于完整水果中。然而，通过由酶加速的内酯化作用形成了柠檬苦素。
图1图解了这条途径。柠檬苦素-17-β-D吡喃葡糖苷1在17-β-D-吡喃葡糖基葡糖苷酶的作用下被转化而形成柠檬苦素酸A-环内酯2。在酸性条件下(pH<6.5)、在柠檬苦素-D-环内酯水解酶的存在下，这种内酯被还原而形成柠檬苦素3。因为随着水果的成熟，所述A-环内酯被转化成柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷，所以葡糖苷的浓度积累到约200wppm。
此外据信，通过酸水解可以在果汁中产生柠檬苦素。采用降低的pH和增加的温度和时间可以加速这种酸水解。于是，用于控制果汁中柠檬苦素的其它方法是避免加热，在低温下有限的时间内贮藏果汁，和/或升高果汁的pH。
可以用高压液相色谱法(HPLC)测定所述苦味物质组中每个成员的浓度。然而，液相色谱/质谱(LCMS)分析或LCMS/MS分析能提供更确定的测量结果。本领域技术人员了解测定所述苦味物质组中每个成员的浓度的这些和其它方法。
本发明人已经发现，如同苦味一样，低于涩味阈存在于橙汁中的多种化合物对果汁的涩味口感做出贡献。下表中列出了这些涩味化合物各自的味道阈：
于是，有了本文中提供的指导，本领域技术人员就能通过控制果汁产品中这些涩味化合物的浓度来控制柑橘类果汁的涩味。例如，可以采用适当的处理(例如离子交换、蒸馏或反渗透)降低这些化合物的浓度。类似地，可以将具有各种浓度的每种化合物的不同果汁掺合成这样一种果汁，该果汁中这些化合物的浓度低于导致涩味的浓度。
酸味也是消费者所关心的。酸味产品是令人不快的而且具有辛辣味。此外，酸味往往引起倒胃和对胃和食道的损伤，并且引起打嗝。
本发明人已经发现，感觉到的酸味与至少苹果酸和柠檬酸的相对浓度有关。这些化合物的浓度和相对比例影响酸味的感觉。
关于苹果酸和关于柠檬酸的酸味阈是本领域已知的。虽然这些酸的相对比例在不同栽培品种的果汁之间并且随着采摘季节中的时间的不同而变化，但是这些酸一般都高于酸味阈，因此对酸味感觉做出贡献。
于是，有了本文中提供的指导，本领域技术人员就能通过控制果汁产品中这些酸的浓度来控制柑橘类果汁的酸味。例如，可以采用适当的处理(例如离子交换、蒸馏或反渗透)降低这些酸的浓度。类似地，可以将具有各种浓度的每种酸的不同果汁掺合成这样一种果汁，该果汁中这些酸的浓度低于导致酸味的浓度。
甜味也是消费者所关心的。尽管一些消费者偏爱甜味，但是其他消费者并非如此。所以，控制甜味的能力显示出提高消费者满意度的机会。
本发明人已经发现，感觉到的甜味与至少葡萄糖、果糖和蔗糖这些糖类的相对浓度有关。这些糖类的浓度和相对比例影响甜味的感觉。
关于葡萄糖、果糖和蔗糖的甜味阈是本领域中已知的。这些糖类的相对比例在不同栽培品种的果汁之间并且随着采摘季节中的时间的不同而变化。然而，有了本文中提供的指导，本领域技术人员就能通过控制果汁产品中这些糖类的浓度来控制柑橘类果汁的甜味。例如，可以采用适当的处理(例如离子交换、蒸馏或反渗透)降低这些糖类的浓度。类似地，可以将具有各种浓度的每种化合物的不同果汁掺合成这样一种果汁，该果汁中这些化合物的浓度低于导致酸味的浓度。
本发明人还已经发现，异柠檬苦素(它是从这些柠檬苦素类化合物β-D-吡喃葡糖苷之一得到的一种化合物)是新鲜度的指标。异柠檬苦素也被称为C17-表柠檬苦素。异柠檬苦素是通过巴氏灭菌之后柠檬苦素的酸水解而形成的。异柠檬苦素还通过非酶促方法由柠檬苦素17-β-D-吡喃葡糖苷形成。冷冻橙汁浓缩物中异柠檬苦素的浓度大约是新鲜橙汁的两倍，这表明给果汁“施加应力”也促使异柠檬苦素形成。所以，浓度高于新鲜产品中的浓度的异柠檬苦素的存在表明该产品可能不是新鲜的(因为异柠檬苦素随着时间而形成)或者已经冷冻过了。
实施例
如下实施例阐释了与本发明有关的各个方面。实施例1旨在从橙籽中分离柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷。实施例2总结了在各种温度和pH值下的研究，目的是测定柠檬苦素在溶液中的形成速率。实施例3中讲述了用HPLC和LC-MS和NMR鉴定柠檬苦素和异柠檬苦素。
实施例4旨在橙汁中柠檬苦素和异柠檬苦素的定量。实施例5旨在感官分析。
对于这些实施例，从商业途径获得了下列化合物：柠檬苦素(Sigma,Steinheim,Germany)；甲酸、甲醇和乙腈(Merck,Darmstadt,Germany)；氘代溶剂(Aldrich,Taufkirchen,Germany)；用于色谱法的去离子水是借助Milli-Q Gradient AlO系统(Millipore,Billerica,USA)提纯的。从橙汁工业(USA)获得了由2006年3月佛罗里达州(USA)收获的橙子(Valencia late)制备的橙籽和橙汁以及由同一批水果制备的冷冻浓缩橙汁。新鲜橙子果实(Valencia late)是从当地的卖家购买的。
高效液相色谱法(HPLC)
HPLC装置的组成如下：两个泵(Sykam,S 1122)、一个梯度混合器(Sunchrom,动态/统计梯度混合器)、一个Rheodyne注射器(250μL loop)、一个自动进样器(Spark,Midas380)、一个监测在200与600nm之间波长范围内的流出物的二极管阵列检测器(Sunchrom,SpectraFlow 600DAD)、一个分流组件(Upchurch,P-470刻度微型分流器)以及一个装有雾化器(S.E.D.E.R.E.，HPLC雾化器200μL/min－2.5mL/min)的蒸发光散射检测器(ELSD)(S.E.D.E.R.E.,Sedex85LT-ELSD,p＝2,6bar,T＝40℃)。
液相色谱/质谱(LC/MS)
进行LC-MS/MS分析，采用与API 4000LC-MS/MS(Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)连接的Agilent 1100HPLC-系统，以负(ESL-)或正电喷雾电离(ESI+)方式运行。喷雾电压被设定在－4500V，氮气充当气帘(20psi)且去束电势(declustering potential)被设定在－65V。借助多反应检测(MRM)方式，采用上述的质量跃迁(mass transitions)分析了化合物2和3。
核磁共振谱法(NMR)
在来自Bruker(Rheinstetten,Germany)的DPX 400MHz NMR上进行了1H,COSY,HMQC,和HMBC光谱实验。将样品溶于DMSO-d6或MeOD-d4，以四甲基硅烷作为内标物，在测量之间放入NMR管(Schott Professional 178x 5mm)。用NMR软件Mestre-C进行数据处理。
实施例1-从橙籽中分离柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷
用水，然后用丙酮彻底地洗涤橙籽(100g)，并在液氮中冷冻，在研磨机中磨碎，然后在60℃下用甲醇(300mL)萃取两次，进行4h。过滤后，在真空中脱除萃取物中的溶剂，得到无定形粉末形式的可以用甲醇萃取的物质(28g)。
将粗分离物的等分试样(2g)溶解在上到水冷却的玻璃柱(300mm x 35mm)顶部的水(10mL)中，所述柱充满着用水调节的Amberlite XAD-2材料(BDH Chemicals Ltd,Poole,England)的浆液。在5mL/min的流量下操作，进行色谱法，开始用水(200mL；级分I)，接着是含20％(200mL；级分II)、40％(200mL；级分III)、60％(200mL；级分IV)、80％(200mL,级分V)不同的甲醇/水混合物和甲醇(200mL；级分VI)。分别收集各级分，在30℃下真空中脱除溶剂，然后冷冻干燥后得到各级分I-VI，为无定形粉末。
将级分II-IV合并，溶于甲醇与0.1％甲酸水溶液的混合物(20/80,v/v)，在膜过滤之后，通过在Microsorb-MV,RP-18,25O x 10mm i.d.,5μm柱(Varian,Germany)上的半制备HPLC将等分试样(250μL)分级分离。借助UV检测器在220nm下并且借助蒸发光散射检测器(ELSD)监测流出物，在3.5mL/min的流量下进行色谱法，开始时是用乙腈与0.1％甲酸水溶液的混合物(10/90,v/v)，在15min内增加乙腈含量至20％，保持5min，最后在5min内提高乙腈含量至100％。在冰冷却的烧瓶中收集在17min时检测到的峰的流出物，在真空中脱除有机溶剂，将水层加到用水调节的Strata C 18-E SPE筒体(10g,55μm；Giga Tubes,Phenomenex)的顶部。用水(150mL)冲洗所述筒体，然后通过抽吸氮气流经过筒体而进行干燥，最后，用甲醇(100mL)洗脱。所述SPE筒体脱除了甲酸痕量物以防质子催化的糖苷配基的释放。在真空中脱除有机流出物中的溶剂，将残余物悬浮于水(5mL)中并且冷冻干燥而得到柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷，为白色的无定形粉末，纯度高于99％。
柠檬苦素-l7-β-D-吡喃葡糖苷,图1中的1：UV/VIS(乙腈/水；pH 2.5)：λmax＝220nm；LC/MS(ESI+)：m/z 649([M-H]-)；LC/MS(ESI-)：m/z 668([M+NH4]+),673([M+Na]+),689([M+K]+)；1H NMR(400MHz,MeOD-d4,COSY)：δ0.66[s,3H,H-C(24)],0.98[s,3H,H-C(25b)],1.21[s,3H,H-C(25a)],1.40[s,3H,H-C(18)],1.66[m,1H,H-C(12)],1.78[m,2H,H-C(11)],1.99[m,1H,H-C(12)],2.43[dd,1H,J＝7.4,22.1Hz,H-C(6)],2.55[dd,1H,J＝5.6,19.0Hz,H-C(6)],2.68[d,1H,J＝4.3Hz,H-C(9)],2.71[d,2H,J＝4.1Hz,H-C(2)],2.79[dd,1H,J＝5.6,14.7Hz,H-C(5)],2.94[s,1H,H-C(15)],3.11[m,2H,H-C(2'),H-C(5')],3.20[m,1H,H-C(4')],3.27[m,1H,H-C(3')],3.48[m,1H,H-C(6')],4.20[s,1H,H-C(1)],4.29[d,1H,J＝7.6Hz,H-C(1')],4.40[d,2H,J＝8.1Hz,H-C(19)],5.42[s,1H,H-C(17)],6.53[d,1H,J＝1.3Hz,H-C(21)],7.24[s,1H,H-C(23)],7.63[s,1H,H-C(22)]；13C NMR(100MHz,MeOD-d4,HMQC,HMBC)：δ17.1[C,C(11)],18.4[C,C(24)],20.8[C,C(25b)],24.7[C,C(18)],26.8[C,C(12)],29.2[C,C(25a)],35.2[C,C(2)],36.4[C,C(6)],44.8[C,C(13)],45.1[C,C(9)],45.2[C,C(10)],50.7[C,C(8)],54.8[C,C(5)],59.8[C,C(15)],61.7[C,C(6')],63.8[C,C(19)],69.1[C,C(14)],70.4[C,C(4')],75.4[C,C(2')],76.0[C,C(5')],76.9[C,C(3')],78.1[C,C(17)],78.4[C,C(1)],80.8[C,C(4)],104.3[C,C(1')],112.3[C,C(21)],125.4[C,C(20)],140.3[C,C(22)],142.3[C,C(23)],173.0[C,C(3),C(16)],209.6[C,C(7)]。
实施例2-从柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷生成柠檬苦素
为了研究橙汁贮藏过程中柠檬苦素从柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷中推定的、非酶促释放，把被调节到新榨橙汁的pH值(pH 3.5)或调节到见于橙汁浓缩物的pH值范围(pH2.0和3.0)的吡喃葡糖苷水溶液在20℃下在暗处保持14周之久。以一定的时间间隔，从模型溶液取出等分试样，并借助按MRM方式操作的HPLC-MS/MS分析了从吡喃葡糖苷释放的柠檬苦素的量。如图2中所示，与模型溶液的pH值无关，柠檬苦素随着增加的贮藏时间而生成，但是降低pH值有助于苦味化合物的产生。例如，在pH 2.0下保持时，从吡喃葡糖苷释放出0.85％mol的柠檬苦素，而在pH 3.5下保持时，仅仅生成0.25％的苦味化合物。
为了研究温度对柠檬苦素生成的影响，把调节到pH 3.0的吡喃葡糖苷水溶液在4、20和30℃下在暗处保持14周之久。以一定的时间间隔，借助按MRM方式操作的HPLC-MS/MS测定了柠檬苦素的量。图3中所示的结果清楚地证明了，与分别在4和20℃下保持的模型溶液相比，在30℃下加速了从柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷释放柠檬苦素。例如，在30℃下保温时，柠檬苦素以接近4.0％的产率从其前体释放，而在4℃下贮藏前体溶液14周之后，仅仅可以检测到0.2％的苦味化合物。
特别是，将通过添加痕量的盐酸(1mol/L)而分别调节到2.0、3.0和3.5的pH值的柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷水溶液(0.35mg/L)在不同的温度(4、20、30℃)下在暗处在密闭的小瓶中保持14周之久。以一定的时间间隔，用注射器取出样品(5μL)，借助在SynergiFusion,150x 2mm i.d.,4μm柱(Phenomenex)的LC-MS/MS分析了柠檬苦素的生成。为此，以250μL/min的流量进行色谱法，开始时用0.1％甲酸水溶液与乙腈的混合物(80/20,v/v)，在10min内升高乙腈含量至40％，然后在5min内升高至80％，保持5min，最后，在5min内升高至100％。采用负电喷雾电离，按多反应监测(MRM)方式，用质量跃迁m/z 469→229，分析了柠檬苦素。通过比较为质量痕量物(mass trace)获得的峰面积与柠檬苦素在甲醇中的规定标准溶液的峰面积，进行了定量分析。
图4表明，LC-MS/MS色谱不只是显示柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)和柠檬苦素(3)，而是意外地显示出第三个峰(4)，该峰在16.59min处洗脱并且显示与柠檬苦素中发现的相同的质量跃迁m/z 469→229，于是暗示着柠檬苦素立体异构体的存在。由于到目前为止该化合物的化学结构还没有通过NMR光谱实验被明确地确认，所以附加实验旨在为了进行光谱实验而产生合适量的化合物4。
实施例3-柠檬苦素和异柠檬苦素(化合物4)的鉴定从柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖 苷释放
为了确定在实施例2中鉴定且在图4中图解的化合物4的化学结构，将调节到pH1.5的柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷水溶液在60℃下保温4h，借助半制备HPLC分离和提纯了化合物4，其化学结构借助LC-MS/MS和1D/2D-NMR实验来确定。在图5中所示的1H NMR谱图中，观察到21个信号，其中显示出化学位移δ1.44、1.72、2.00、2.25、2.66、2.66、2.73、2.75、2.91和4.14ppm的十个信号与柠檬苦素的烷基质子H-C(12a)、H-C(11)、H-C(12b)、H-C(6a)、H-C(2a)、H-C(5)、H-C(2b)、H-C(9)、H-C(6b)和H-C(1)的共振非常一致。借助同核(COSY)和异核相关实验(HMQC,HMBC)明确地确认了这些信号的分配。在4.51和4.78ppm处共振的非对映异构的质子与亚甲基质子H-C(19)非常一致，于是表明完整的A-环存在于柠檬苦素中。在6.62、7.60和7.70ppm处观察到的关于呋喃质子H-C(21)、H-C(22)和H-C(23)的共振信号同样证明了与柠檬苦素的结构类似性。然而，化合物4在质子H-C(15)、H-C(17)和H-C(18)的化学位移方面显示出与柠檬苦素的明显差异。质子H-C(17)显示出从5.48ppm(3)到5.05ppm(4)的高场位移，而质子H-C(15)和H-C(18)显示出分别从4.21和1.11ppm(3)到4.50和1.48ppm(4)的低场位移。此外，2D-NMR实验鉴定出对于柠檬苦素(3)在77.9/20.0ppm处和对于化合物4在85.1/27.1ppm处共振的C(17)/C(18)的化学位移的差异，于是指出了在化合物4的结构中的位置C(17)处柠檬苦素的差向异构化。把所有光谱数据都考虑进去，首次将化合物4明确地鉴定为柠檬苦素的C17-差向异构体，该异构体显示出在C(17)处β-取向的呋喃环而不是柠檬苦素的α-取向。虽然被称为C17-表柠檬苦素或异柠檬苦素的化合物4已经被推测为柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷的人血浆代谢物，但是第一次基于光谱数据确认该柠檬苦素差向异构体的结构，并且证明了它由吡喃葡糖苷水解释放。
特别是，用痕量的盐酸(1mol/L)将柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(35mg)在水(20mL)中的溶液调节到pH 1.5，并且在60℃下保温4h。冷却后，把溶液加到用水调节的Strata C 18-E SPE筒体(10g,55μm,Giga Tubes,Phenomenex)的顶部，然后用水(150mL)冲洗，接着是水/甲醇混合物(50/50,v/v；100mL)，和甲醇(150mL)。在真空中给甲醇级分脱除溶剂，溶于甲醇与1％甲酸水溶液的混合物，借助在Microsorb-MV,RP-18,250x 10mm i.d.,5μm柱(Varian,Germany)上的半制备HPLC对等分试样(100μL)进行分离。借助UV-检测器在220nm处并且借助ELSD监测流出物，通过在3.5mL/min的流量下操作的溶剂梯度进行色谱法，开始时采用乙腈与0.1％甲酸水溶液的混合物(30/70,v/v)，在15min内将乙腈含量提到高40％，然后在l0min内提高到80％，最后在10min内提高到100％。两个峰是可检测的；将每个峰的流出物分别收集在冰冷却的烧瓶中，在真空中脱除溶剂，然后冷冻干燥。借助LC-MS和NMR实验，将分离的化合物鉴定为柠檬苦素以及它的以前没有报道过的立体异构体C17-表柠檬苦素，也被称为异柠檬苦素。
柠檬苦素,3：UV/VIS(乙腈/水；pH 2.5)λmax＝220nm；LC/MS(ESI+)m/z 509([M+K]+),493([M+Na]+),488([M+NH4]+)；LC/MS(ESI-)：m/z 469([M-H]-)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,COSY)：δ1.00[s,3H,H-C(24)],1.02[s,3H,H-C(25b)],1.11[s,3H,H-C(18)],1.19[s,3H,H-C(25a)],1.23[m,1H,H-C(12)],1.73[m,2H,H-C(11)],1.83[m,1H,H-C(12)],2.27[dd,1H,J＝3.0,14.7Hz,H-C(6)],2.46[dd,1H,J＝3.0,15.7Hz,H-C(5)],2.55[m,1H,H-C(9)],2.62[m,1H,H-C(2)],2.77[d,1H,J＝16.4Hz,H-C(2)],3.10[t,1H,J＝15.5Hz,H-C(6)],4.11[m,1H,H-C(1)],4.12[s,1H,H-C(15)],4.48[d,1H,J＝12.9Hz,H-C(19)],4.92[d,1H,J＝12.9Hz,H-C(19)],5.48[s,1H,H-C(17)],6.51[s,1H,H-C(22)],7.66[s,1H,H-C(21)],7.72[s,1H,H-C(23)]；13C NMR(100MHz,MeOD-d6,HMQC,HMBC)：δ17.4[C,C(24)],18.1[C,C(11)],20.0[C,C(18)],20.4[C,C(12)],22.3[C,C(25b)],30.1[C,C(25a)],35.9[C,C(2)],36.5[C,C(6)],37.5[C,C(13)],45.7[C,C(10)],46.9[C,C(9)],50.5[C,C(8)],54.3[C,C(15)],58.2[C,C(5)],65.3[C,C(19)],67.4[C,C(14)],77.9[C,C(17)],78.9[C,C(1)],80.4[C,C(4)],110.9[C,C(22)],120.6[C,C(20)],141.9[C,C(23)],143.9[C,C(21)],168.7[C,C(16)],170.9[C,C(3)],208.5[C,C(7)]。
C17-表柠檬苦素，或异柠檬苦素4：UV/VIS(乙腈/水；pH 2.5)λmax＝220nm；LC/MS(ESI+)m/z 509([M+K]+),493([M+Na]+),488([M+NH4]+)；LC/MS(ESI-)：m/z 469([M-H]-)；1HNMR(400MHz,DMSO-d6,COSY)：δ0.99[s,3H,H-C(24)],0.99[s,3H,H-C(25b)],1.19[s,3H,H-C(25a)],1.44[m,1H,H-C(12)],1.72[m,2H,H-C(11)],2.00[m,1H,H-C(12)],2.25[dd,1H,J＝3.7,16.2Hz,H-C(6)],2.66[m,1H,H-C(2)],2.66[m,1H,H-C(5)],2.73[m,1H,H-C(2)],2.75[m,1H,H-C(9)],2.91[t,1H,J＝15.8Hz,H-C(6)],4.14[d,1H,J＝3.68Hz,H-C(1)],4.50[s,1H,H-C(15)],4.51[d,1H,J＝13.2Hz,H-C(19)],4.78[d,1H,J＝13.2Hz,H-C(19)],5.05[s,1H,H-C(17)],6.62[s,1H,H-C(22)],7.60[s,1H,H-C(21)],7.70[s,1H,H-C(23)]；13C NMR(100MHz,MeOD-d4HMQC,HMBC)：δ18.3[C,C(11)],19.3[C,C(24)],22.1[C,C(12)],22.1[C,C(25b)],27.1[C,C(18)],30.6[C,C(25a)],36.6[C,C(2)],36.9[C,C(6)],40.3[C,C(13)],45.0[C,C(9)],45.1[C,C(10)],47.6[C,C(8)],56.3[C,C(5)],56.6[C,C(15)],65.4[C,C(19)],70.4[C,C(14)],79.1[C,C(1)],79.9[C,C(4)],85.1[C,C(17)],112.9[C,C(22)],122.4[C,C(20)],143.8[C,C(21)],144.2[C,C(23)],168.8[C,C(16)],170.5[C,C(3)],208.3[C,C(7)]。
尽管本发明人不想受理论的束缚，但是图6图解了一条反应途径，该途径显示了从柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷形成柠檬苦素(3)和异柠檬苦素或C17-表柠檬苦素(4)。因为葡萄糖是良好的离去基团，所以在酸性条件下己糖从1的亚糠基的α位散落下来，于是导致作为主要的瞬变中间体的离域亚糠基阳离子的释放。然后，由羧基官能的亲核攻击诱导的分子内环化产生了带有α-取向的呋喃环的柠檬苦素(3)以及在C(17)处显示出β-取向的呋喃环的异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素。
此外，还已经证明，在pH为3的水溶液中保温柠檬苦素并不产生大量的异柠檬苦素，所以异柠檬苦素不是通过柠檬苦素的直接差向异构化来形成的。
实施例4－橙汁中的柠檬苦素和异柠檬苦素的定量
为了研究橙汁贮藏过程中柠檬苦素和异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素的生成，将新榨橙汁(pH 3.5)在4和20℃下贮藏达四周之久，然后，借助采用MRM方式的HPLC-MS/MS定量地确定了柠檬苦素和异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素。如图7A中所示，分别在4和20℃下保持2周时，在贮藏过程中,橙汁中柠檬苦素的浓度从新榨果汁中的70.0μg/100g稍稍增加到80和85μg/100g。橙汁的贮藏还引起C17-表柠檬苦素浓度的升高，例如，分别在4和20℃下保持四周的样品中，观察到C17-表柠檬苦素的量(图7B)增加到1.5倍或2倍。对比贮藏引起的柠檬苦素量的增加与异柠檬苦素量的增加清楚地证明了，贮藏橙汁时，与柠檬苦素的C17-差向异构体的形成相比，对柠檬苦素的形成更有利，于是支持了文献中的发现，即，在贮藏过程中，在酸催化下，果汁中存在的柠檬苦素酸A-环内酯被缓慢地转化成柠檬苦素。
在第二组实验中，研究了热处理对柠檬苦素和异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素的生成的影响。为此，将新榨橙汁在70℃下热处理10min，而且，为了对这些化合物的最大释放速率有些了解，在95℃下处理240min之久。HPLC-MS/MS(MRM)分析显示，在新制备的、未加热过的果汁中，柠檬苦素和异柠檬苦素的浓度分别为70.0和1.3μg/100g图8A)。热处理后，两种萜类化合物的浓度都显著升高，例如，在70℃下加热10min导致异柠檬苦素的量提高到五倍而达到6.1μg/100g的浓度，而柠檬苦素的浓度达到100μg/100g的浓度。
在95℃下加热所述橙汁对柠檬苦素和异柠檬苦素的量的影响更大。在95℃下加热所述果汁10min已经将C17-表柠檬苦素的量提高到十倍(图8A)。分别加热30和60min后，生成了20和30μg/100g的C17-表柠檬苦素。在加热60min后，柠檬苦素的浓度从70升高到115μg/100g，并且在4h之后达到最大值140μg/100g。计算加热后的橙汁样品中两种柠檬苦素类化合物之间的比值显示出，C17-表柠檬苦素/柠檬苦素比随着加热时间的延长而显著地变化并且在240min之后达到最大值0.50(图8B)。
为了做出这些确认，把橙子切成两半，借助厨用柑橘类榨汁机(Citromatic MPZ22,Braun,Germany)仔细地手工压榨橙子。为了研究冷藏对橙汁中柠檬苦素和异柠檬苦素的浓度的影响，将新榨橙汁的等分试样(300mL)在4和20℃下在暗处保持4周。为了研究在升高的温度下柠檬苦素和异柠檬苦素的形成，将新榨橙汁的等分试样(300mL)在70℃下热处理10min或者在95℃下热处理长达240min。
为进行定量分析，分别将新鲜橙汁和处理过的橙汁的等分试样(8g)在3000rpm下离心10min，将不溶性物质悬浮并与水(8mL)密切地混合，再次在3000rpm下离心10min。将上清液合并，放入用水调节过的C 18-E SPE-筒体(1g,5μm,Phenomenex)的顶部。用水(20mL)冲洗后，通过抽吸氮气流通过所述筒体而进行干燥，然后用甲醇(20mL)洗脱。在真空中脱除含甲醇流出物中的溶剂，用甲醇补充至3.0mL。借助LC-MS/MS在Synergi Fusion,150x 2mmi.d.,4μm柱(Phenomenex)上分析等分试样(5μL)中的柠檬苦素和异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素。为此，采用250μL/min的流量进行色谱法，开始时用0.1％甲酸水溶液与乙腈的混合物(80/20,v/v)，在10min内增加乙腈含量至40％，然后在5min内增加至80％，保持5min，最后，在5min内增加到100％。采用负电喷雾电离，按多反应监测(MRM)方式分析了柠檬苦素和异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素，采用了质量跃迁m/z 469→229。通过比较为质量痕量物获得的峰面积与柠檬苦素和C17-表柠檬苦素在甲醇中的规定标准溶液的峰面积，进行了定量分析。
最后的实验集中在橙汁浓缩过程对3和4的量的影响。为此，定量分析了新鲜橙汁和冷冻橙汁浓缩物中C17-表柠檬苦素的浓度，所述冷冻橙汁浓缩物是由同一批橙汁浓缩6.6倍而产生的。虽然所述橙汁含有数量为1.6μg/100g的异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素，但是在相应的冷冻浓缩橙汁中发现约21.0μg/100g的异柠檬苦素。要记住的是，所述浓缩物是通过将所述橙汁浓缩6.6倍而产生的，所以预计会在浓缩橙汁中发现10.6μg/100g的所述差向异构体。但是，在所述冷冻浓缩物中发现的却是两倍的量，即21.0μg/100g，于是首次清楚地证明了，在冷冻浓缩橙汁的生产中形成了大量的C17-表柠檬苦素。
实施例5－感官分析
为了研究C(17)的手性对这些柠檬苦素类化合物的感观活性的影响，确定了柠檬苦素和C17-表柠檬苦素的苦阈浓度。这些感观研究显示出，C17-表柠檬苦素的苦阈浓度为10.0μg/L(水)，这个浓度相当接近于为柠檬苦素获得的苦阈浓度(4.0μmol/L)，于是证明了两种三萜内酯化合物的相似感观活性。
为了进行这些评估，十一名评估者(四名妇女和七名男人，年龄23－39岁)借助三选项强迫选择法，采用浓度渐增的刺激物确定了瓶装水(pH 5.1)中的味道识别阈浓度，所述评估者参与过至少两年的每周训练期，评估过程遵循了以前报道的程序：Stark,T.；Barenther,S.；Hofmann,T.(2005)J.Agric.Food Chem.53：5407-5418。
这些实例指出，虽然柠檬苦素酸A-环内酯(2)的闭环仅仅允许柠檬苦素的形成(图1)，但是柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷(1)的水解降解经由亚糠基阳离子产生了柠檬苦素(3)和C17-表柠檬苦素(4)(图6)。因为发现冷藏橙汁时只有痕量的异柠檬苦素生成而在升高的温度下有数量高得多的异柠檬苦素由其前体柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷释放，所以C17-表柠檬苦素/柠檬苦素比可以是一个合适的指标，其能实现橙汁加工过程中使用的热输入的分析测定。
如图8可见，在100℃下，异柠檬苦素/柠檬苦素比在约20分钟内从0增加到约0.25，在约60分钟内增加到约0.40－0.45。因此，异柠檬苦素/柠檬苦素比(也表示为C17-表柠檬苦素/柠檬苦素比)往往能指示加热的剧烈程度。
优选的实施方式：
1.控制果汁的风味的方法，该方法包含：
将所述果汁中的选自由柠檬苦素、异柠檬苦素、诺米林及其混合物组成的组的化合物的浓度控制到低于其阈味道水平的水平。
2.项目1的方法，进一步包含控制所述果汁中的白利糖度/酸度比。
3.项目1的方法，进一步包含将多甲氧基化黄酮类的浓度控制到低于其阈味道水平的水平。
4.项目3的方法，进一步包含控制所述果汁中的白利糖度/酸度比。
5.项目1的方法，进一步包含控制所述果汁中的柠檬苦素类化合物β-D-吡喃葡糖苷的浓度。
6.项目3的方法，进一步包含将其中的柠檬苦素类化合物β-D-吡喃葡糖苷的浓度控制到低于其阈味道水平的水平。
7.项目1的方法，其中所述异柠檬苦素/柠檬苦素比低于约0.25。
8.项目2的方法，其中所述异柠檬苦素/柠檬苦素比低于约0.25。
9.项目1的方法，其中用选自由反渗透、离子交换、蒸馏或其组合组成的组的技术来控制所述浓度。
10.比未处理过的果汁的苦味小的果汁，该果汁中选自由柠檬苦素、异柠檬苦素、诺米林及其混合物组成的组的化合物的浓度低于所述化合物的阈味道浓度。
11.项目10的果汁，进一步包含多甲氧基化黄酮类。
12.项目10的果汁，进一步包含柠檬苦素类化合物β-D-吡喃葡糖苷。
13.项目7的果汁，其中所述异柠檬苦素/柠檬苦素比低于约0.25。
14.处理过的果汁，它比未处理过的果汁的苦味小，该处理过的果汁的选自由柠檬苦素、异柠檬苦素、诺米林及其混合物组成的组的化合物的浓度低于未处理过的果汁中该化合物的浓度。
15.项目14的处理过的果汁，其中所述异柠檬苦素/柠檬苦素比低于约0.25。
16.项目14的处理过的果汁，更进一步的是，该果汁的选自由苹果酸、柠檬酸及其混合物组成的组的酸的水平低于未处理过的果汁中酸的浓度。
17.项目14的处理过的果汁，其中所述化合物的浓度低于其阈味道水平。
18.项目16的处理过的果汁，其中所述化合物的浓度低于其阈味道水平。
19.项目2的方法，其中通过降低选自由苹果酸、柠檬酸及其混合物组成的组的酸的浓度来控制所述白利糖度/酸度比。
20.项目4的方法，其中通过降低选自由苹果酸、柠檬酸及其混合物组成的组的酸的浓度来控制所述白利糖度/酸度比。
21.测定已经给予果汁的热应力的量的方法，该方法包含测定异柠檬苦素与柠檬苦素之比。
虽然已经就包括目前优选的本发明实施方式在内的具体实施例描述了本发明，但是本领域技术人员能领会的是，存在着落入后附权利要求书中所述本发明的实质和范围的上述系统和技术的各种变化和置换形式。

Claims (6)

1.测定已经给予果汁的热应力的量的方法，该方法包含测定异柠檬苦素与柠檬苦素之比，其中异柠檬苦素/柠檬苦素之比指示加热的剧烈程度。
2.权利要求1的方法，其中所述异柠檬苦素是柠檬苦素的C17-差向异构体，该异构体显示出在C(17)处β-取向的呋喃环，并如下式：
3.权利要求1－2中任一项的方法，其中所述异柠檬苦素由其前体柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷释放。
4.权利要求3的方法，其中所述异柠檬苦素通过柠檬苦素-17-β-D-吡喃葡糖苷经由亚糠基阳离子的水解降解而释放。
5.异柠檬苦素在测定已经给予果汁的热应力的量中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述异柠檬苦素是柠檬苦素的C17-差向异构体，该异构体显示出在C(17)处β-取向的呋喃环，并如下式：
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