KR20100060196A - 조류메타뉴모바이러스 재조합 뉴클레오캡시드 단백질, 상기단백질에 반응하는 단클론항체를 생산하는 융합세포주 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곤충세포에서 발현하여 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 조류메타뉴모바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질, 상기 단백질에 결합하는 단클론항체, 및 이를 이용한 조류뉴모바이러스 항체진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 진단항원으로서 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 조류메타뉴모바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 항원을 제공하고, 진단항체로서 상기 뉴클레오캡시드 단백질의 주 에피톱에 결합하는 단클론항체를 제공하며, 이를 이용하여 조류메타뉴모바이러스 항체를 검출하는 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 조류메타뉴모바이러스 감염증 항체 진단방법은 닭, 칠면조 등 축종에 관계없이 혈청 진단에 사용할 수 있으며, 일반실험실에서 수 시간 내 혈청시료 대량검사가 가능하므로 질병진단 및 양계농장 질병모니터링 등에 적합하다.

조류메타뉴모바이러스 * 단클론항체 * ELISA * 항체 검출법

Description

조류메타뉴모바이러스 재조합 뉴클레오캡시드 단백질, 상기 단백질에 반응하는 단클론항체를 생산하는 융합세포주 및 그의 용도{Recombinant avian metapneumovirus nucleocapsid, monoclonal antibody binding to the protein and the use thereof}

본 발명은 곤충세포에서 발현하여 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 조류메타뉴모바이러스(avian metapneumovirus, 이하 “aMPV”이라 함) 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein, 이하 “N 단백질”이라 함), 상기 단백질에 결합하는 단클론항체, 및 이를 이용한 aMPV 항체진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 진단항원으로서 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 aMPV의 재조합 N 단백질 항원을 제공하고, 진단항체로서 상기 N 단백질의 주 에피톱에 결합하는 단클론항체를 제공하며, 이를 이용하여 aMPV 항체를 검출하는 진단방법에 관한 것이다.

aMPV는 닭의 두부종창증(SHS: swollen head syndrome) 및 칠면조의 전염성비기관염(TRT: turkey rhinotracheitis)을 유발하는 주요 병원체로서, 최근 사람 호 흡기 환자에서 분리 보고된 사람 메타뉴모바이러스와 함께, 파라믹소비리디과(family Paramyxoviridae)의 메타뉴모바이러스속(genus Metapneumovirus)에 속하는 바이러스이다. aMPV는 혈청형이 하나만 존재하지만, 4개의 유전형(genotypes A-D)이 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 현재 유전형 A형 및 B 형은 유럽과 아시아에서, 유전형 C형은 미국에서, 유전형 D형은 프랑스에서 분리 보고된 바가 있다. 닭에서 주로 문제되는 유전형은 A형과 B형이다.

aMPV는 칠면조, 닭, 뿔닭(guinea fowls), 꿩, 오리, 거위 및 타조에 감염이 될 수 있다고 보고되고 있다. 그러나, 이들 조류종들 중 aMPV에 의한 피해는 대부분 칠면조와 닭에서 발생하고 있다. 칠면조의 경우 감염 시 기침, 비류, 기관염, 결막염 및 부비동염 등의 임상증상을 나타낸다. 닭의 경우 호흡기 증상, 5% 내지 30% 정도의 산란저하와 난각품질 저하 및 신경증상 등을 나타낼 수 있으며, 대장균 등 세균성 질병과의 복합감염 시 두부 종창증을 보인다.

aMPV 감염증은 1980년 남아프리카에서 사육중인 칠면조에서 처음 관찰되었으며, 이후 유럽, 아시아 및 북미 대륙 등 전 세계 칠면조 및 닭을 사육하는 대부분의 지역에서 그 발생이 보고되었다. 국내의 경우 80년대부터 닭에서 두부종창증 사례가 보고되어 있으며, 현재 닭에서 호흡기 증상, 산란하는 닭의 경우 산란피해와 품질저하란(탈색란 등) 및 두부종창증에 의한 피해가 속출하고 있는 실정이다.

aMPV에 의한 피해의 예방 조치를 취하기 위해서는 의심되는 피해와 임상증상이 발견될 경우 aMPV 감염여부를 조기에 신속하게 진단하는 것이 매우 중요하다. aMPV 감염증의 실험실 진단은 바이러스 분리검사, 항원검사 및 항체검사 등을 이용 하여 이루어진다. 바이러스 분리검사는 실험실 진단의 표준 진단방법이지만 감염 숙주내 바이러스 증식량이 낮고, 감염 숙주의 호흡기내 바이러스 존재 기간이 감염 초기 수 일 정도이며 바이러스의 분리방법 또한 까다로워 대부분의 실험실에서 의심계군으로부터 바이러스 분리하는 것이 쉽지 않은 실정이다. 그러므로, 실험실 진단은 역전사 중합효소연쇄반응(Reverase Transcription Polymerase Chain Reaction, 이하 “RT-PCR”이라 함)법 등을 이용한 항원검사와 혈중 항체검사 등에 주로 의존하고 있는 실정이다.

항체검사법은 대단위 사육하는 양계산업의 특성에 적합하게 채혈한 시료를 이용하며, 바이러스 중화시험법이 표준 진단법이다. 그러나, 이 방법은 감염력 있는 병원체를 직접 취급하여야 하며, 고가의 장비와 숙련된 세포 배양기술, 그리고 일주일 이상의 장기간이 요구되기 때문에 대량검사나 질병 모니터링 목적으로 사용하기가 힘들다. 최근에는 대량검사와 질병 모니터링에 적합한 효소결합면역측정법(이하 “ELISA”라 함)이 많이 이용되고 있다. 상기 목적으로 사용 중인 종래의 ELISA 검사키트의 경우 불활화시킨 바이러스 입자를 항원으로 사용하고 있다.

이에, 본 발명자들은 일반 실험실에서 aMPV 항체를 신속하게 검사할 수 있는 방법으로서 일반실험실에서도 항원을 쉽게 제조할 수 있고, 축종과 관계없이 검사할 수 있으며, 대량검사에 적합한 ELISA를 개발하는 것이 가장 효과적임을 깨닫고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 aMPV의 재조합 N 단백질을 인공적으로 생산하고, 상기 N 단백질에 결합하는 단클론항체를 분비하는 융합세포주를 작성하여, 이를 이용한 ELISA를 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 대량검사와 질병 모니터링에 적합한 aMPV 재조합 N 단백질, 상기 단백질에 결합하는 단클론항체, 및 이를 이용한 aMPV 항체진단방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 재조합 N 단백질을 항원으로 하고, 기탁번호 KCLRF-BP-00195의 하이브리도마 세포주에서 생산된 항체를 사용하는 효소결합면역측정법(ELISA)을 통해 검사 시료로부터 aMPV 항체를 검출하여 aMPV 감염증을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 경합적 ELISA법은 종래의 ELISA 키트와 비교하였을 때 aMPV 감염증을 진단함에 있어서 특이도와 민감도가 우수하였다. 본 발명의 경합적 ELISA의 민감도가 우수한 것은 본 발명의 단클론항체 5H7이 감염숙주동물에서 강한 면역원성을 보이는 N 단백질 에피톱에 반응하기 때문이다. 종래의 경우 ELISA 검사키트를 제작함에 있어서 감염성이 있는 aMPV를 증식하여 항원을 제조하는 반면 본 발명의 경우 사용된 재조합 N 단백질 항원은 인공적으로 합성된 단백질 항원이기 때문에 ELISA 항원 제조과정상 병원체 오염 등의 문제점이 없이 안전하게 생산할 수 있었다.

또한, 본 발명에 의한 경합적 ELISA 진단방법은 검사시간이 5시간 이내로 짧고, 검사방법이 단순하여 진단 검사를 수행하기가 용이하기 때문에 대단위 혈청시료를 신속히 검사하는데 적합하며, 국내 양계농장에서 질병 진단 또는 주기적 모니터링 등의 목적으로 활용하기에 적합하다. 또한, 단클론 항체를 사용하여 검사혈청과 경합반응을 통하여 항체를 검출하는 방식이기 때문에 닭 이외에 칠면조 등 다른 조류종에서도 활용이 가능하다.

본 발명의 aMPV 재조합 N 단백질(이하, "rAPV-N"라 함)은 서열번호 3의 1,176개의 핵산 염기서열에 의해 암호화되어 있으며, 서열번호 4의 391개 아미노산으로 구성된 약 44kDa의 단백질로서 재조합 베큘로바이러스에 의해 곤충세포에서 발현되어, 본 발명의 진단방법에 사용되는 진단항원을 생산함을 특징으로 한다.

본 발명의 rAPVN는 재조합 베큘로바이러스에 의해 곤충세포에서 발현되어, 본 발명의 진단방법에 사용되는 진단항원을 생산함을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 베큘로바이러스(이하 “rBacAMPVN”이라 함)는 발현벡터 pBacPAK/APVN과 베큘로바이러스 선형 DNA간 유전자 재조합에 의해 유전자 게놈 내에 APV N 유전자가 삽입된 형태로, 감염된 곤충세포에서 rAPV-N을 생산함을 특징으로 한다.

본 발명의 aMPV N 유전자는 국내사육 닭에서 유행하는 aMPV의 N 전체 유전자(서열번호 3)를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 융합세포주(한국세포주은행 기탁번호 KCLRF-BP-00195)는 aMPV의 N 단백질 항원으로 면역시킨 발브시 마우스(Balb/c mouse)로부터 채취한 B 림프구와 SP2/0 골수종유래 세포간의 세포융합에 의하여 작성된 것으로 단클론항체 5H7을 분비함을 특징으로 한다.

본 발명의 단클론 항체 5H7은 aMPV N 단백질 상에 존재하는 면역원성이 강한 에피톱(epitope)에 결합하는 항체로서, aMPV 감염조류의 혈청 또는 난황내 항체와 본 발명의 N 단백질에 대한 경합적 반응을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 닭뉴모바이러스 항체검출 방법은 rAPV-N 항원과 단클론항체 5H7을 사용하여 경합적 ELISA 원리를 의하여 검사 혈청 또는 난황시료 내 aMPV 항체를 검출함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 ELISA 진단방법은,

(1) aMPV 재조합 N 단백질 rAPV-N을 ELISA 플레이트에 코팅하는 단계;

(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항원들을 세척하여 제거하는 단계;

(3) 상기 플레이트에 검사혈청 시료 및 단클론항체 5H7를 첨가하는 단계;

(4) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체성분을 세척하여 제거하는 단계;

(5) 호스레디쉬 페록시다제를 결합시킨 항-마우스 2차 항체를 반응시키는 단계;

(6) 상기 플레이트에 부착되지 않은 2차 항체들을 세척하여 제거하는 단계; 및

(7) 효소반응을 위한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정함으로서 검사 혈청중의 aMPV 항체를 측정하는 단계;

를 포함하여 구성되는 단계를 수행함을 특징으로 하는 aMPV 항체 검출방법이며, 상기 과정은 도 1에서 도식화하였다.

이러한 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당 업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.

상기 방법의 ELISA는 면역원성이 매우 강한 N 단백질 에피톱에 반응하는 단클론항체를 사용하기 때문에 그 민감도 및 특이도가 매우 뛰어나며, 혈중 존재하는 aMPV 항체를 신속히 검출할 수 있다는 이점이 있다. 여기서, aMPV 항원은 당 업계에 공지된 것으로서 단클론항체 5H7에 반응하는 단백질 항원 예를 들면 aMPV 입자항원 등을 사용할 수 있다. 또한 사용한 단클론항체 5H7을 호스페록시다제를 결합 시켜 경합적 ELISA 검사방법에 사용할 수 있다.

단클론항체 5H7은 일반적으로 aMPV 항원이나 재조합 N 단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포 융합에 의해서 생산될 수 있으며, 이러한 융합세포주는 당 업계에 통상적인 방법에 의해서 제조될 수 있고, 예를 들어 HAT 선택법 등을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 항체를 생산하는 융합세포주, 즉 하이브리도마 세포주는 대한민국 서울시에 위치한 한국세포주은행(Korean Cell Line Research)에 2008년 11월 18일자로 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00195를 부여받았다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당 업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 닭뉴모바이러스 RNA 추출

2008년 국내 산란계 농장에서 aMPV에 감염된 닭의 기관 스왑(treacheal swb) 시료로부터 RNeasy RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 aMPV 전체 게놈 유전자 RNA를 추출하였다.

[실시예 2] aMPV N 단백질 유전자 cDNA 합성, 증폭 및 클로닝

aMPV N 단백질 유전자의 cDNA 합성은 상기 실시예 1에서 추출한 전체 RNA와 하기 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)를 cDNA 합성을 위한 RT 프리믹스 키트(RT primix kit; Bioneer)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 위한 PCR 프리믹스 키트(premix kit; Bioneer)의 튜브에 첨가하여 95℃에서 10분간 열처리한 후 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 PCR 증폭기(PE 9600; Perkin Elmer)에서 30회 반복하여 PCR 증폭을 실시하였고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA 합성을 실시하였다.

상기의 PCR을 위하여 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 L39878호로 등록된 aMPV N 유전자 서열을 이용하여 N 단백질 전체를 암호화하는 1,176개 핵산이 증폭되도록 하기의 PCR용 프라이머들을 제작하였다.

정방향 프라이머: 5'- GGATCC ATGTCTCTTGAAAGTATTAGG-3' (서열번호 1)

역방향 프라이머: 5'- GGTACC GAAAGACATTGTTACTTGTCC-3' (서열번호 2)

상기 프라이머 서열들은 이후의 베큘로바이러스 발현벡터를 작성하기 위하여 의도적으로 제한효소 작용부위가 삽입되었는데, 구체적으로 서열번호 1의 프라이머는 5'-말단의 ATG 상류에 BamH1 제한효소 작용부위를, 서열번호 2의 프라이머는 5'-말단에 종료코돈 상류에 Kpn1 제한효소 작용부위를 삽입되었다. 상기에서 증폭된 N 유전자 cDNA 단편은 제한효소처리 없이, 바로 pGEM-Teasy 벡터(Promega사, USA)에 삽입하여 클로닝하여 "pGEM/APVN"을 작성하고, 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 삽입된 유전자의 염기서열을 서열번호 3(신규한 본 발명의 aMPV 재조합 N 단백질을 암호화하는 N 유전자의 핵산 염기서열)의 오리지널 염기서열과 비교 분석함으로써 N 유전자 cDNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다.

[실시예 3] 재조합 베큘로바이러스 발현벡터 작성

상기 실시예 2의 pGEM/APVN 벡터를 BamH1 및 Kpn1으로 처리하여 1,176 bp의 DNA 단편을 추출하였다. 그 다음, 베큘로바이러스 폴리헤드린프로모터(P_PH)를 가진pBacPAK8 전이벡터의 멀티클로닝 부위(multicloning site) 내 aMPV N 유전자를 삽입하여 재조합 베큘로바이러스 발현벡터(이하 "pBacPAK/aMPVN"이라 함)를 제작하였다. 제작한 발현벡터 pBacPAK/aMPVN 및 그 제작과정은 도 2에 도시하였다.

[실시예 4] 재조합 베큘로바이러스 작성

재조합 베큘로바이러스 발현벡터 pBacPAK/aMPVN는 베큘로바이러스 발현시스템[인비트로젠사(Invitrogen), USA]을 이용하여 작성하였다. 상기 실시예 3에서 작성한 pBacPAK/aMPVN 벡터를 DH10Bac 대장균에 형질도입하여 rBac/aMPVN DNA를 작성하였다. rBac/aMPVN DNA 5 ㎍을 100 ㎕ 무혈청 그레이스 배지에 첨가한 용액과, 마찬가지로 6 ㎕ 셀펙틴(Cellfectin; 인비트로젠사)을 100 ㎕ 무혈청 그레이스 배지에 첨가한 용액을 혼합하여 실온에서 30분간 방치하였다. 그 다음, 직경 35 mm 세포배양용 페트리디쉬 웰에 미리 배양된 S-f9(Spodoptera frugiperda) 세포주(GibcoBRL, 2 x 10⁶ 세포)를 무혈청 그레이스배지로 간단하게 세척한 후 상기 제조된 혼합물을 첨가하여 27℃에서 5시간 배양함으로써 공동형질감염시켰다. 그런 다음, 공동형질감염시킨 혼합물을 제거하고, 10% 우태아혈청이 함유된 새 그레이스 배지를 2 ㎖ 가하여 27℃에서 4일 내지 6일간 배양하면서 세포변성효과(CPE: Cytopathic effect) 출현여부를 관찰하였다. 형질감염시킨 세포의 배양상층액을 수확하여 재조합 베큘로바이러스를 순수 분리하기 위하여 플라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하였다. 즉, 2×10⁶ 개의 S-f9 세포를 직경 35 mm 세포배양용 페트리디쉬 웰에 단층으로 도포한 후 상기의 수확한 배양상층액 100 ㎕를 접종하였으며, 27℃에서 1시간동안 감작한 다음 1.5% 저융점 아가로스가 포함된 그레이스(Grace's) 배지를 그 위에 층을 이루도록 도포(Overlay)하여 3일내지 4일간 27℃에서 배양하여 나타난 단일 플라크들을 취하였다. 그런 다음, 취한 플라크 산물들을 새로운 S-f9 곤충세포에 감염시켜 3일내지 4일간 배양하여 CPE 출현 여부를 관찰하였다. 상기 CPE를 나타내는 감염 세포들을 취하여 aMPV N 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 간접 형광항체법 및 웨스턴블랏법(Western blot)으로 N 단백질을 발현여부를 확인한 후, 배양상층액을 취하여 재조합 베큘로바이러스 rBacAPVN를 선발하였다. 도 3은 재조합 베큘로바이러스 감염세포에서의 서열번호 4의 재조합 N 단백질의 발현여부를 소디움도데실 폴리아크릴라마이드겔 전기영동(Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis, 이하 “SDS-PAGE”라 함) 및 aMPV 면역혈청을 이용한 웨스턴 블랏으로 확인한 결과로서, 본 발명에 의한 서열번호 4의 재조합 N 단백질이 44 kDa의 분자량으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

[실시예 5] 재조합 N 단백질 항원 제조

상기 실시예 4의 재조합 베큘로바이러스 rBacAPVN에 의한 곤충세포에서의 재조합 N 단백질의 발현 및 N 단백질 항원의 제조는 다음과 같이 실시하였다. 즉, 미리 S-f9 곤충세포를 단층 배양시킨 175-㎠ 세포배양용 플라스크에 0.1 MOI 농도의 재조합 베큘로바이러스를 첨가하여 27℃에서 90분간 곤충세포에 감염시킨 후 27℃에서 4일에서 5일간 배양하였다. 그 다음, 상기의 감염세포들을 수확하여 500×g에서 20분간 원심하여, 상층액은 제거한 후 감염세포 펠렛(Pellet)만을 수확하였다. 그 다음, 0.05% 트윈 20, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail ; Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 함유하는 0.01 M 인산 완충 식염수 용액(이하 “용균 완충액(lysis buffer)”이라 함)을 곤충세포배양 원액의 1/20 양이 되도록 상기의 감염세포 펠렛에 가하여 실온에 5분간 방치한 후 초음파처리기로 세포를 파쇄하여 서열번호 4의 재조합 N 단백질이 추출되도록 하였다. 마지막으로, 500×g에서 20분간 원심하여 상층액만을 수확하여 서열번호 4의 재조합 N 단백질 항원을 제조하였다. 제조된 단백질 항원은 효소결합면역측정법 항원으로 사용하였다.

도 4는 하기 실시예 6의 단클론항체 5H7을 이용한 간접 ELISA 방법에 의하여상기 제조항원의 항원량을 측정한 결과이다. 도 4의 결과에서 보여지는 바와 같이, 제조한 N 단백질 항원을 6,400배 이상 희석한 경우에도 N 단백질이 검출될 정도로 고농도의 항원이 생산되었음을 알 수 있었다. 본 발명의 경합적 ELISA에 적용할 적정 항원 농도는 제조항원을 완충용액으로 1:1600배 희석한 단백질 항원이었다.

[실시예 6] aMPV N 단백질에 대한 단클론항체 생산 및 선발

단클론항체를 작성하기 위하여 상기 실시예 5의 aMPV N 단백질 항원을 마우스 면역에 사용하였다. 상기 제조한 재조합 N 단백질 항원 원액을 불완전 프로인트어쥬반트(Incomplete Freund Adjuvant)와 동량으로 균질하게 혼합한 다음, 혼합액 0.05 ㎖를 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥(Foot-pad)에 접종하였다. 면역 후, 10∼15일 사이에 슬와 임파절(Popliteal lymph node)을 채취하여 세포융합에 사용하였다.

세포융합은 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지(Serum Free Mdeium; SFM)로 세척한 후 마우스 골수종양세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 내지 10:1 비율로 혼합한 다음 PEG1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) 증식배지(10% 우태아혈청을 첨가한 D-MEM)에 적당히 희석한 후 미리 마우스복강세포를 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기내에서 배양하였다.

N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 하이브리도마세포가 증식한 웰의 세포배양 상층액을 수거하여 간접 ELISA로 검사하였을 때, 상기 실시예 5의 재조합 N 단백질 항원에 양성반응을 보이는 웰의 하이브리도마 세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.5개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일 클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. N 단백질에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰의 하이브리도마를 선발하였다. 본 실험에서 선발된 aMPV N 단백질에 대한 단클론항체 생산하는 하이브리도마 세포주 및 단클론 항체의 특성은 하기 표 1에 표시하였다. 표 1에서 보는 바와 같이 선발된 단클론 항체 모두 aMPV 유전형 A 및 B에 반응하는 단클론 항체였다. 상기 선발된 하이브리도마 세포는 10⁶/ml의 세포 농도로 세포보관용액(세포배양액:소태아혈청:DMSO=7:2:1)에 부유하여 액체질소통에 보관하였다.

실시예 6의 aMPV N 단백질에 대한 단클론항체의 특성

단클론항체 (하이브리도마)	면역원	Isotype	간접 형광항체법			비 고
			raMPVN	aMPV (A형)	aMPV (B형)
5H7	raMPV-N	IgG2a, κ	양성	양성	양성
5D7	raMPV-N	IgG2b, κ	양성	양성	양성
4G5	raMPV-N	IgM, κ	양성	양성	양성
1G11	raMPV-N	IgM, κ	양성	양성	양성
6A7	raMPV-N	IgM, κ	양성	양성	양성

[실시예 7] 경합적 ELISA 방법

상기 실시예 5의 재조합 N 단백질 항원 및 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용하여 경합적 효소결합면역측정법을 다음과 같이 실시하였다. 상기 실시예 5의 재조합 N 단백질 항원을 0.01M PBS로 1:1,500배 희석하여 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc사)의 웰에 50 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로서 재조합 N 단백질 항원을 ELISA 플레이트에 코팅시켰다. 그 다음, ELISA 플레이트에 부착하지 않은 산물들은 0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 0.002 M PBS(PBST) 세척용액으로 3회 세척하여 제거하였다. 그 후, 블로킹 완충용액(0.01 M PBS에 0.05% 트윈20 및 3% 스킴밀크를 첨가한 용액)으로 단클론항체(상기 실시예 6의 하이브리도마 세포배양액)와 5배 희석한 검사혈청(또는 난황추출시료)을 동량 혼합하여 각 혈청당 두 웰씩 반복하여 웰당 50 ㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간동안 반응하게 하였다. 이때 표준 양성혈청과 표준음성혈청을 모든 플레이트마다 첨가하여 반응의 평가기준으로 삼았다. 상기 반응이 끝난 후, PBST로 3회 세척하고 항-마우스 면역글로불린 페록시다제 컨쥬게이트(anti-mouse IgG+IgA+IgM Peroxidase conjugate; KPL사)를 불로킹 완충용액으로 2,000배가 되도록 희석하여 각 웰에 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응하게 하였다. 상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 OPD(O-Phenylenediamine) 용액(Sigma사)을 각 웰에 50 ㎕씩 분주한 후, 실온에서 10분간 발색시켰다. 그 후 1.25 M 황산용액을 웰당 100 ㎕씩 분주함으로서 발색반응을 중지시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검사의 결과는 혈청없이 단클론항체만 첨가한 웰(단클론항체 대조웰)의 흡광도 대비 검사웰의 흡광도 억제율 (Percent inhibition, PI)로 환산하여 분석하였다. 검사 웰의 PI는 하기 수학식 1에 의거하여 산정하였다.

[PI치=100-(검사웰 흡광도)/(단클론항체 대조웰)*100]

본 발명의 경합적 ELISA 결과판정은 혈청 시료의 경우 PI치가 50% 이상, 난황 시료의 경우 25% 이상일 경우 항체 양성으로 판정하였다.

[실시예 8] 본 발명의 경합적 경합적 ELISA에 적용할 단클론항체 선발

본 발명의 경합적 ELISA에 적용할 단클론 항체의 선발은 다양한 수준의 aMPV 항체양성 닭 야외혈청 10점으로 구성된 혈청 판넬을 사용하여 실시예 7의 방법으로 실시하였다. 본 발명의 경합적 ELISA 결과판정은 PI치가 50% 이상일 경우 양성, 50% 미만일 경우 음성으로 판정하였으며, 그 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5의 결과에서, 검사한 단클론 항체 5종 중 5H7이 혈청시료 내 aMPV 항체 검출능력이 가장 우수하였다. 따라서 단클론 항체 5H7을 본 발명의 경합적 ELISA에 적용할 단클론항체로 선발하였다. 단클론항체 5H7을 생산하는 하이브리도마 세포주에 대하여 대한민국 서울시에 위치한 한국세포주은행에 이 클론을 기탁하였으며, 이 기관으로부터 2008년 11월 18일자로 KCLRF-BP-00195의 기탁번호를 부여받았다.

[시험예 1] aMPV 항체음성 혈청을 이용한 경합적 ELISA의 특이도 평가

본 발명의 경합적 ELISA 검사결과 판정을 위한 음성/양성 판정 기준치 설정을 위하여 aMPV 항체 음성으로 판정된 닭 혈청 150점을 사용하였다. 본 발명의 경 합적 ELISA는 실시예 7에 따라 실시하였으며, 실시예 5의 aMPV 재조합 N 단백질과 실시예 6의 단클론항체 5H7을 사용하였다. 본 발명의 경합적 ELISA 결과 판정은 PI치가 50% 이상일 경우 양성, 50% 미만일 경우 음성으로 판정하였으며, 그 결과를 도 6에 도시하였다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의하여 상기 닭 혈청 검사시료를 조사한 도 6의 결과에서, 음성혈청 150점 중 150점이 모두 항체 음성으로 판정되어 특이도(specificity)가 100% 이었다. 따라서, 본 발명에 의한 경합적 ELISA가 조류의 혈청시료 검사 시 특이도가 매우 우수한 것임을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] aMPV 항체 양성시료를 이용한 본 발명의 경합적 ELISA의 aMPV 항체검출 민감도 평가

본 발명의 경합적 ELISA의 aMPV 항체검출 민감도를 측정하기 위하여 aMPV 항체 양성으로 판정된 야외 닭 혈청 118점을 검사하였다. 본 발명의 경합적 ELISA는 실시예 7에 따라 실시하였으며, 실시예 5의 aMPV 재조합 N 단백질과 실시예 6의 단클론항체 5H7을 사용하였다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의한 양성 판정기준치는 PI치 50% 이상으로 하였다. 본 발명의 경합적 ELISA의 민감도를 상대적으로 비교하기 위하여 종래의 ELISA 키트(IDEXX FlockCheck-ELISA kit)의 결과와 비교하였다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의한 검사 결과(도 7), 검사시료 118점 중 116점이 양성(PI 50이상)으로 판정되었다. 그러므로 본 발명의 경합적 ELISA의 특이도는 98.3%이었다. 이 결과는 본 발명의 경합적 ELISA가 닭에서 aMPV 항체를 검출할 수 있는 민감도가 우수함을 나타낸다.

[시험예 3] 계란 난황시료에서 본 발명의 경합적 ELISA에 의한 aMPV 항체 검출

본 발명의 경합적 ELISA가 산란하는 닭의 계란내 난황 추출시료로부터 aMPV 항체를 검출할 수 있는 지를 조사하기 위하여 난황추출시료 68점을 검사하였다.

본 발명의 경합적 ELISA는 실시예 7에 따라 실시하였으며, 실시예 5의 aMPV 재조합 N 단백질과 실시예 6의 단클론항체 5H7을 사용하였다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의한 양성 판정기준치는 혈청검사와 같이 PI치 25% 이상으로 하였다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과를 종래의 시판 ELISA 키트와 비교한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

계란 난황시료에 대한 본 발명의 경합적 ELISA와 종래의 ELISA 검사키트의 aMPV 항체검출 결과 비교

		종래의 ELISA 검사 키트(IDEXX-ELISA)
		양성	음성	소계
본 발명의 경합적 ELISA법	양성	35	2	37
	음성	3	28	31
	소계	38	30	68

* 단순일치율=(35+30)/68=0.93

* 우연일치율=(38/68)*(37/68)+(30/68)*(31/68)=0.51

* 비우연일치율=1-0.51=0.49

* 일치율(kappa value)=(단순일치율-우연일치율)/비우연일치율=(0.93-0.51)/0.49=0.85

본 발명의 경합적 ELISA와 종래의 ELISA 키트와의 비교 시험결과, 본 발명의 경합적 ELISA 양성판정 난황시료 37점 중 35점이, 음성판정 난황시료 31점 중 28점에서 기존 시판 ELISA 키트 결과와 일치하였다. 그 결과 두 검사 방법간 결과판정 일치율은 85%로 높은 일치율을 보였다. 그러므로 본 발명의 경합적 ELISA는 산란하는 닭의 계란을 이용하여 aMPV 항체의 검출여부를 통해 aMPV 감염증을 진단하는 데에도 적합하다.

[시험예 4] 본 발명의 경합적 ELISA를 이용한 닭 농장에서의 aMPV 감염증 모니터링

aMPV 감염이 있었던 국내사육 닭 농장을 대상으로 감염 전후 채취한 닭 혈액을 검사하여 본 발명의 경합적 ELISA가 aMPV 감염 진단에 유용한 지를 조사하였다. 실험대상 닭 농장은 2007년 10월에 aMPV가 검출되어 aMPV 감염증으로 판정된 농장이었다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의한 검사결과 판정은 PI치가 50 이상일 경우 항체양성으로 하였다. 본 발명의 경합적 ELISA에 의한 검사 결과는 종래의 검사키트(IDEXX Flockcheck ELISA kit)의 검사 결과와 비교분석하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

본 발명의 경합적 ELISA에 의한 국내사육 닭 농장 대상 aMPV 주기적 모니터링 결과

	채혈시기
	2007.7	2007.8	2007.9	2007.10
본 발명의 ELISA	0/10*	0/10	0/10	9/10(90%)
종래의 검사키트	0/10	0/10	0/10	5/10(50%)

* 양성수수/검사수수

상기 표 3은 본 발명의 경합적 ELISA를 사용하여 상기 야외농장 닭 혈청으로부터 aMPV 항체를 검출한 결과를 나타낸 것이다. 이 결과에 의하면 닭이 2007년 10월 이전에는 모든 닭에서 aMPV 항체가 검출되지 않았으나, 2007년 10월 채혈한 혈청시료에서는 90%(9/10수)에서 aMPV 항체가 검출되었다. 종래의 검사키트의 검사결과 닭이 2007년 10월 이전에는 모든 닭에서 aMPV 항체가 검출되지 않았으나, 2007년 10월 채혈한 혈청시료에서는 50%(5/10수)에서 aMPV 항체가 검출되었다. 2007년 10월 닭 농장에서 채혈당시 aMPV가 검출되었다는 사실을 감안할 때 2007년 10월 닭 혈청에서의 항체 양성은 aMPV 감염으로 인해 형성된 항체라고 판단할 수 있었다. 그러므로, 2007년 10월 채취한 닭 혈청에서 본 발명의 경합적 ELISA의 항체검출율(90%)이 종래의 검사키트(50%)에 비해 항체 검출율이 높았다는 점을 고려하면 본 발명의 경합적 ELISA는 종래의 검사키트에 비해 감염후 항체검출 시기가 빠르다. 그러므로 본 발명의 경합적 ELISA는 야외 닭 농장에서 주기적인 혈청 모니터링 검사를 통해 aMPV 감염 여부를 진단하는 데도 적합하다.

도 1은 aMPV 항체를 검출하기 위한 신규한 본 발명의 경합적 ELISA의 모식도이다.

도 2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 aMPV 재조합 N 단백질을 생산하기 위한 aMPV N 단백질을 인코딩하는 서열번호 3의 유전자가 포함된 발현벡터 pBAKPAK/aMPVN을 작성한 모식도이다.

도 3은 SDS-PAGE (A) 및 aMPV 면역혈청을 이용한 웨스턴 블롯법(B)을 이용하여 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 aMPV N 단백질을 확인한 결과를 보여준다.

레인 1 : 정상 곤충세포(Sf9 cells) 추출물

레인 2 : 본 발명의 aMPV 재조합 N 단백질(raMPV-N)

레인 M : 단백질분자량 크기 마커

도 4는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 aMPV 재조합 N 단백질을 aMPV 특이 단클론항체 5H7로 적정항원농도를 간접 ELISA법으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 신규한 본 발명의 단클론항체 5H7을 선발하기 위하여 실시한 간접 ELISA 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 신규한 본 발명의 경합적 ELISA에 의하여 aMPV 항체음성 닭 혈청시료를 검사한 결과를 보여준다.

도 7은 신규한 본 발명의 경합적 ELISA에 의하여 aMPV 항체양성 닭 혈청시료를 검사하고, 그 결과를 종래의 검사키트(IDEXX FlockCheck ELISA kit)와 비교한 결과를 보여준다. 종래의 검사키트(X축 결과, 0.22이상 양성)와 본 발명의 검사결과(Y축 결과, 50%이상 양성)를 개체별로 나타낸 것이다. 그래프상의 점선은 각 검사법의 컷 오프(cut-off)를 나타낸다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry of Agriculture and Forestry, National Verterinary Research) <120> Recombinant avian metapneumovirus nucleocapsid, monoclonal antibody binding to the protein and the use thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ggatccatgt ctcttgaaag tattagg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 ggtaccgaaa gacattgtta cttgtcc 27 <210> 3 <211> 1176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene for encoding the recombinant nucleocapsid protein of avian metapneumovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(1173) <400> 3 atg tct ctt gaa agt att agg ctc agt gac ttg gaa tac aaa cat gca 48 Met Ser Leu Glu Ser Ile Arg Leu Ser Asp Leu Glu Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 att ctt gaa gac tct cag tat aca att aga agg gat gtt ggt gct acc 96 Ile Leu Glu Asp Ser Gln Tyr Thr Ile Arg Arg Asp Val Gly Ala Thr 20 25 30 act gca atc aca cct tcc gaa ctg cag ccg caa gta tcc ata tta tgc 144 Thr Ala Ile Thr Pro Ser Glu Leu Gln Pro Gln Val Ser Ile Leu Cys 35 40 45 ggt atg gtg ttg ttt gca aaa cac acc gac tat gag cct gca gca gag 192 Gly Met Val Leu Phe Ala Lys His Thr Asp Tyr Glu Pro Ala Ala Glu 50 55 60 gta ggc atg cag tac att agt act gct cta gga gct gat aga act caa 240 Val Gly Met Gln Tyr Ile Ser Thr Ala Leu Gly Ala Asp Arg Thr Gln 65 70 75 80 caa ata ctg aaa aat tcc ggt agt gaa gta cag ggt gtt atg acc aag 288 Gln Ile Leu Lys Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Gly Val Met Thr Lys 85 90 95 att gta aca ctt ccg gca gag ggt tct gtc aga aag cga gag gtg cta 336 Ile Val Thr Leu Pro Ala Glu Gly Ser Val Arg Lys Arg Glu Val Leu 100 105 110 aac att cac gat gta ggt gtt ggg tgg gct gat gat gtc gaa agg act 384 Asn Ile His Asp Val Gly Val Gly Trp Ala Asp Asp Val Glu Arg Thr 115 120 125 aca aga gaa gca atg gga gca atg gtt agg gaa aaa gtg caa ctc aca 432 Thr Arg Glu Ala Met Gly Ala Met Val Arg Glu Lys Val Gln Leu Thr 130 135 140 aag aat caa aag ccg tct gcc ttg gat gct ccc gtt att cta tta tgc 480 Lys Asn Gln Lys Pro Ser Ala Leu Asp Ala Pro Val Ile Leu Leu Cys 145 150 155 160 att ggt gcc ctc att ttc acc aag ttg gcc tca act gtt gaa gta ggc 528 Ile Gly Ala Leu Ile Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr Val Glu Val Gly 165 170 175 ctt gaa act gct atc cga cgt gcc tca agg gta tta agc gat gcc ata 576 Leu Glu Thr Ala Ile Arg Arg Ala Ser Arg Val Leu Ser Asp Ala Ile 180 185 190 tca cgg tat ccc agg atg gat ata cca agg att gcc aaa tca ttc ttt 624 Ser Arg Tyr Pro Arg Met Asp Ile Pro Arg Ile Ala Lys Ser Phe Phe 195 200 205 gaa ttg ttt gag aag aag gtg tac tac aga aat cta ttt att gaa tac 672 Glu Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr Tyr Arg Asn Leu Phe Ile Glu Tyr 210 215 220 ggt aag gca ctc gga agt aca tcc acc gga agc agg atg gag agc ctg 720 Gly Lys Ala Leu Gly Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Met Glu Ser Leu 225 230 235 240 ttt gtg aat att ttt atg caa gct tat ggg gca ggg caa aca atg ctg 768 Phe Val Asn Ile Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Thr Met Leu 245 250 255 cgc tgg ggt gtg att 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gat gat gag agg gaa gca gca gca tcc tac cta ggg gga gat gat 1152 Thr Asp Asp Glu Arg Glu Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Gly Gly Asp Asp 370 375 380 gag aga tca tcc aag ttt gag taa 1176 Glu Arg Ser Ser Lys Phe Glu 385 390 <210> 4 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Ser Leu Glu Ser Ile Arg Leu Ser Asp Leu Glu Tyr Lys His Ala 1 5 10 15 Ile Leu Glu Asp Ser Gln Tyr Thr Ile Arg Arg Asp Val Gly Ala Thr 20 25 30 Thr Ala Ile Thr Pro Ser Glu Leu Gln Pro Gln Val Ser Ile Leu Cys 35 40 45 Gly Met Val Leu Phe Ala Lys His Thr Asp Tyr Glu Pro Ala Ala Glu 50 55 60 Val Gly Met Gln Tyr Ile Ser Thr Ala Leu Gly Ala Asp Arg Thr Gln 65 70 75 80 Gln Ile Leu Lys Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Gly Val Met Thr Lys 85 90 95 Ile Val Thr Leu Pro Ala Glu Gly Ser Val Arg Lys Arg Glu Val Leu 100 105 110 Asn Ile His Asp Val Gly Val Gly Trp Ala Asp Asp Val Glu Arg Thr 115 120 125 Thr Arg Glu Ala Met Gly Ala Met Val Arg Glu Lys Val Gln Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Lys Pro Ser Ala Leu Asp Ala Pro Val Ile Leu Leu Cys 145 150 155 160 Ile Gly Ala Leu Ile Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr Val Glu Val Gly 165 170 175 Leu Glu Thr Ala Ile Arg Arg Ala Ser Arg Val Leu Ser Asp Ala Ile 180 185 190 Ser Arg Tyr Pro Arg Met Asp Ile Pro Arg Ile Ala Lys Ser Phe Phe 195 200 205 Glu Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr Tyr Arg Asn Leu Phe Ile Glu Tyr 210 215 220 Gly Lys Ala Leu Gly Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Met Glu Ser Leu 225 230 235 240 Phe Val Asn Ile Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Thr Met Leu 245 250 255 Arg Trp Gly Val Ile Ala Arg Ser Ser Asn Asn Ile Met Leu Gly His 260 265 270 Val Ser Val Gln Ala Glu Leu Arg Gln Val Ser Glu Val Tyr Asp Leu 275 280 285 Val Arg Lys Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu Arg Gln Ser 290 295 300 Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Thr Asn Cys Pro Asn Phe Ala Ser 305 310 315 320 Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ile Gly Met Tyr Lys 325 330 335 Gly Arg Ala Pro Asn Leu Glu Leu Phe Ala Ala Ala Glu Ser Tyr Ala 340 345 350 Arg Thr Leu Arg Lys Asn Asn Lys Ile Asn Leu Ala Ala Leu Gly Leu 355 360 365 Thr Asp Asp Glu Arg Glu Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Gly Gly Asp Asp 370 375 380 Glu Arg Ser Ser Lys Phe Glu 385 390

Claims (3)

1. 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 재조합 N 단백질을 항원으로 하고, 기탁번호 KCLRF-BP-00195의 하이브리도마 세포주에서 생산된 항체를 사용하는 효소결합면역측정법(ELISA)을 통해 검사 시료로부터 조류메타뉴모바이러스 항체를 검출하여 조류메타뉴모바이러스 감염증을 진단하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 검사 시료는 닭 또는 칠면조의 혈청 또는 난황임을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 감염증을 진단하는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 방법은

   1) ELISA 플레이트에 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 항원을 코팅시키는 단계;

   2) 반응잔여물을 세척용 완충용액을 사용하여 제거하는 단계;

   3) 검사혈청과 단클론항체를 ELISA 플레이트에서 경합시키는 단계;

   4) 반응잔여물을 세척용 완충용액을 사용하여 제거하는 단계;

   5) 호스레디쉬 페록시다제가 결합된 항-마우스 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및

   6) 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하여, 검사시료 중의 조류메타뉴모바이러스 항체를 측정하는 단계;

   를 포함하는 경합적 ELISA에 의해 수행되는 것임을 특징으로 하는 조류메타뉴모바이러스 감염증을 진단하는 방법.

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