KR102302141B1 - 전염성 기관지염 바이러스 재조합 뉴클레오캡시드 및 이의 용도 - Google Patents

전염성 기관지염 바이러스 재조합 뉴클레오캡시드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드(nucleocapsid), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 뉴클레오캡시를 포함하는 전염성기관지염 바이러스 항체 탐지용 조성물 및 상기 재조합 뉴클레오캡시드를 시료를 이용한 전염성기관지염 바이러스 항체 탐지 방법에 관한 것으로, 이를 통해 최근 전세계적으로 유행하고 있는 신장형 IBV 혈청형 QX의 확산 방지를 위한 보다 신속한 초기 예방 조치 및 계군 항체 모니터링이 가능하다.

Description

전염성 기관지염 바이러스 재조합 뉴클레오캡시드 및 이의 용도{Recombinant nucleocapsid for detecting the antibodies against Infectious Bronchitis Virus and using the same}
본 발명은 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드(nucleocapsid), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 뉴클레오캡시를 포함하는 전염성기관지염 바이러스 항체 탐지용 조성물 및 상기 재조합 뉴클레오캡시드를 시료를 이용한 전염성기관지염 바이러스 항체 탐지 방법에 관한 것이다.
전염성기관지염(Infectious Bronchitis; 이하, IB)은 계군 내 전파력이 매우 빠른 질병으로써, 병아리에서는 심한 호흡기 증상을 유발하는 등 치사율이 약 40% 이상으로 매우 높다. 육계에서는 호흡기질환에 의한 증체율 저하뿐만 아니라, 대장균증 등을 동반한 폐사가 나타날 수 있으며, 산란중인 닭에서는 연각란, 무각란, 기형란, 산란저하 등의 산란이상 증상을 유발하는 것으로 알려져 있다.
이러한 IB의 원인체는 코로나 비리데(Coronaviridae) 코로나바이러스(coronavirus)에 속하는 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus; 이하, IBV)이며, 4종의 구조단백질(Spike, Envelope, Membrane, Nucleocapsid)로 이루어진 단일가닥(single-stranded) RNA 바이러스이다.
IBV는 그 혈청형에 따라 호흡기 증상을 주요증상으로 하는 호흡기형과 신장염과 폐사를 동반하는 신장형 등 크게 두 가지 형태의 전염성기관지염을 유발하는 것으로 알려져 있다.
IBV는 1936년 Beach & Schalm 에 의해 처음으로 보고 되었으며, 1960년대까지 매사추세츠(Massachusetts) 혈청형(serotype) 만 존재하는 것으로 알려져 있었으나 현재까지 새로운 혈청형의 IBV가 지속적으로 나타나고 있는 실정이다. 이는 야외바이러스간의 유전자 재조합 및 바이러스 유전자 내 자체 돌연변이 등 유전적 변이에 의한 현상으로서, 전세계적으로 수십 개의 혈청형이 존재하고 있는 것으로 추정된다.
국내의 경우, 1986년 산란계 농장에서 심한 호흡기 증상과 함께 산란율 저하를 유발하는 호흡기형 IB 발생이 확인된 바 있으며, 그 이후 1991년 어린 닭에서 신장염을 동반한 높은 폐사율 및 산란계에서의 산란저하를 유발하는 신장형 IB (KM91)가 처음으로 발생된 바 있다.
이러한 신장형 IB는 2000년대 중반까지 유행하였으며 그 이후에도 발생 사례가 일부 나타나는 것으로 확인 되었다. 또한, 2000년대 중반의 경우 중국 신장형 QX 형이 발생되어 양계농장에 문제를 일으키고 있으며, 현재까지도 지속적으로 유행하고 있다. 또한, 2000년대 후반에는 한국 신장형 IBV (KM91)과 중국 신장형 IBV (QX) 의 재조합형이 출현된 바 있고 최근 중국에서는 QX 유사 IBV 출현으로 인한 피해와 유전적 변이 분석관련 연구가 지속적으로 보고되고 있다.
IBV의 진단을 위한 바이러스 분리는 기관점막과 분변, 임파절 시료 등을 이용하여 20일령의 계태아의 Tracheal Organ Cultures(TOCs)법을 이용하여 확인하고 있으며, 바이러스 확진은 항혈청을 이용한 중화시험과 면역형광염색법, 전자현미경을 통해 실행하고 있다.
항체검사법의 경우, 국제수역사무국(OIE)의 표준매뉴얼에 의하면, 혈구응집저해(Hemagglutination Inhibition; 이하, HI), 바이러스 중화시험(Virus Neutralizing Test; 이하, VNT), 효소면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay; 이하, ELISA), 한천겔 면역확산(Agar Gel Immuno Diffusion; 이하, AGID)이 표준검사법으로 사용되고 있다.
HI와 ELISA는 바이러스 혈청형에 대한 특이적인 반응성의 차이가 있지만 가장 널리 사용되는 혈청검사방법이고, 특히 ELISA는 가장 민감하고 신속하며 재현성이 높고 다수의 검체를 동시에 검사할 수 있는 특징이 있어 백신항체 및 계군의 혈청변화를 측정하는 혈청학적 예찰 검사에 적용할 것을 권고하고 있다.
이러한 야외 IBV의 높은 변이율에 따라 발생되는 피해를 최소화하고자 다양한 혈청형 기반의 생독 또는 사독 백신이 개발되고 있으며, 이에 따라 백신접종 후 항체 역가 측정 및 야외 IBV의 감염에 의한 항체 측정이 가능한 진단키트가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 신장형 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 뉴클레오캡시드의 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 최근 우리나라 및 중국을 포함한 전세계적으로 유행하고 있는 신장형 IBV 혈청형 QX에 대한 항체 진단을 위하여, 신장형 IBV 혈청형 QX 유전자 기반 재조합 뉴클레오캡시드(Nucleoprotein, N)을 이용한 항체 진단용 효소면역측정법을 개발하였으며, 이를 이용하여 신장형 IBV 혈청형 QX에 대한 감염항체 검사뿐만 아니라 백신 접종 후 계군의 백신항체 수준을 정략적으로 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 신장형 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19 내지 24의 아미노산 서열 중 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드 또는 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다.
상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 동일하다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 벡터는 상술한 바와 동일하다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19 내지 24의 아미노산 서열 중 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드 또는 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 조성물은 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드;
서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드; 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드; 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드; 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드; 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재조합 뉴클레오캡시드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 효소면역측정법에 사용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 효소면역측정법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 각종 질병의 검사를 가능하게 하는 진단법으로서 특이항체와 효소가 결합되어있는 특이항체(conjugate)를 이용하여 다수의 검체로부터 검사하고자 하는 항원을 감지할 수 있는 면역검사법의 일종이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지 방법은 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 시료와 접촉시키는 접촉 단계.
본 발명에 있어서 상기 접촉 단계는 1종 이상의 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드를 시료와 동시에 접촉시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19 내지 24의 아미노산 서열 중 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드 또는 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 재조합 뉴클레오캡시드의 신장형 전염성기관지염 바이러스 혈청형 QX 항체 탐지 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19 내지 24의 아미노산 서열 중 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 재조합 뉴클레오캡시드는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드 또는 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드인 것일 수 있다.
본 발명은 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지를 위한 재조합 뉴클레오캡시드(nucleocapsid), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 뉴클레오캡시를 포함하는 전염성기관지염 바이러스 항체 탐지용 조성물 및 상기 재조합 뉴클레오캡시드를 시료를 이용한 전염성기관지염 바이러스 항체 탐지 방법에 관한 것으로, 이를 통해 최근 전세계적으로 유행하고 있는 신장형 IBV 혈청형 QX의 확산 방지를 위한 보다 신속한 초기 예방 조치 및 계군 항체 모니터링이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 유전자 기반 재조합 뉴클레오캡시드 항원 디자인 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 유전자로부터 뉴클레오캡시드 유전자(full sequence)를 증폭한 RT-PCR 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 유전자로부터 뉴클레오캡시드 유전자(partial sequence)를 증폭한 RT-PCR 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(full sequence)의 발현(BL21 codon plus (DE3) RIPL host)결과이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence A)의 발현(BL21 codon plus (DE3) RIPL host)결과이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence B)의 발현(BL21 codon plus (DE3) RIPL host)결과이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence C)의 발현(BL21 codon plus (DE3) RIPL host)결과이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence D)의 발현(BL21 codon plus (DE3) RIPL host)결과이다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence E)의 발현(BL21 codon plus (DE3) RIPL host)결과이다.
도 3g는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(full sequence)의 발현(BL21 (DE3)host)결과이다.
도 3h는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence A)의 발현(BL21 (DE3) host)결과이다.
도 3i는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence B)의 발현(BL21 (DE3) host)결과이다.
도 3j는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence C)의 발현(BL21 (DE3) host)결과이다.
도 3k는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence D)의 발현(BL21 (DE3) host)결과이다.
도 3l은 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(partial sequence E)의 발현(BL21 (DE3) host)결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(full sequence, BL21 (DE3) host)의 정제결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드(full sequence, BL21 codon plus (DE3) RIPL host)의 정제결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드 단편들(partial sequence, BL21 codon plus (DE3) RIPL host)의 정제결과이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 신장형 IBV 혈청형 QX 재조합 뉴클레오캡시드 단편들(partial sequence, BL21 (DE3)host) 의 정제결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 코팅 항원 및 공격접종 항혈청 별 반응성을 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 코팅 항원 및 야외 산란계 농장 백신접종 항혈청 별 반응성을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 뉴클레오캡시드 발현 및 정제
1-1. 신장형 IBV 혈청형 QX 의 뉴클레오캡시드 유전자 클로닝
신장형 IBV의 뉴클레오캡시드를 발현하기 위해서 혈청형 QX (K1277/03) 배양액으로부터 RNA(RNeasy mini kit, QIAGEN)를 추출하여 cDNA를 합성(power cDNA synthesis, INTRON)하였다. 뉴클레오캡시드의 증폭을 위한 PCR 반응은 Taq DNA Polymerase를 사용하여 40ul 반응액에서 이루어졌다. PCR 증폭은 한 사이클을 denaturation (94℃, 1분), annealing (55℃, 1분), 및 extension (72℃, 2분)으로 구성하여 총 30 사이클을 실행하였으며, 마지막 단계에서 72℃ 에서 10분 동안 유지하였고 PCR반응에 사용된 IBV QX 뉴클레오캡시드 재조합 항원 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 명명 서열목록(5'-3') 비고
1 IBV QX NP full Forward CGCGGATCCATGGCAAGCGGTAAGGTATC
2 IBV QX NP full Reverse CGCGAGCTCAAGTTCATTTTTACCAAGTG
3 IBV QX NP A Forward CGCGGATCCTCATCTGGAAATGCATCTTG
4 IBV QX NP A Reverse CGCGCGGCCGCCAGAGGAATGAAATCCC
5 IBV QX NP B Forward CGCGGATCCTCATCTGGAAATGCATCTTG
6 IBV QX NP B Reverse CGCGCGGCCGCCAGAGGAATGAAATCCC
7 IBV QX NP C Forward CGCGGATCCATGGCAAGCGGTAAGGTATC
8 IBV QX NP C Reverse CGCGCGGCCGCCAGAGGAATGAAATCCC
9 IBV QX NP D Forward CGCGGATCCATGGCAAGCGGTAAGGTATC
10 IBV QX NP D Reverse CGCGCGGCCGCCAGAGGAATGAAATCCC
11 IBV QX NP E Forward CGCGGATCCATGGCAAGCGGTAAGGTATC
12 IBV QX NP E Reverse CGCGCGGCCGCTTGCTTTGTAATACGCGTACC
이렇게 합성된 뉴클레오캡시드 단편을 pET32a(Novagen) 벡터의 MCS(multiple cloning site)에 존재하는 BamHI.SalI(Full), BamHI/NotI(Partial)의 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 형질전환은 Heat shock방법을 사용하여 DH5a 대장균에 삽입되었으며 플라스미드 DNA 추출하여 제한효소를 처리하여 도입유전자의 시퀀스를 확인하였다.
1-2. 신장형 IBV 혈청형 QX 의 뉴클레오캡시드 유전자 발현
도입유전자의 확인이 완료된 플라스미드는 BL21(DE3) 와 BL21 codon plus 발현 대장균에 형질전환되어 발현 확인을 진행하였다. 발현조건은 OD600 0.5일 때 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; 이하, IPTG)로 인덕션하여 37oC에서 4시간 동안 배양하였다. 배양액의 수확은 6000rpm, 15분, 4oC의 조건에서 원심분리 하였고 재조합 단백질의 발현여부를 분석하기 위해서 12% SDS-PAGE를 실시하였다.
1-3. 신장형 IBV 혈청형 QX 의 뉴클레오캡시드 정제
재조합 항원의 정제는 니켈(Ni) 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제 조건을 확립하였다. 크로마토그래피 정제는 AKTA Start (GE Healthcare)에서 수행하였고, 컬럼은 HiTrap Chelating HP 컬럼 (GE Healthcare)에 0.1M NiSO4 용액을 흘려 준 후 DW로 세척하여 준비하였다.
단백질 정제를 위해 대장균 침전물을 20mM 이미다졸이 포함된 50mM Na2HPO4 150mM NaCl pH 7.4 용액으로 현탁하였다. 현탁한 대장균 침전물을 초음파분쇄기(Sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 12,578xg에서 10분간 원심 분리하여 상등의 단백질 추출물을 수집하였다(A50S-8 No.7 Rotor, 한일).
추출한 단백질 추출액은 Millipore 0.45㎛ 실린지 필터로 여과하였고, 20mM 이미다졸이 포함된 50mM Na2HPO4 150mM NaCl pH 7.4 버퍼로 평형시킨 HiTrap Chelating HP 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩하였다.
Full 단백질은 비드에 결합된 단백질을 20mM, 40mM, 60mM, 80mM 이미다졸이 포함된 50mM Na2HPO4 150mM NaCl pH 7.4 세척버퍼로 순차적으로 세척한 후 500mM 이미다졸이 들어있는 버퍼로 용출을 실시하였다. 용출된 단백질은 14 kDa 컷-오프 투석 튜빙 (cut-off dialysis tubing; sigma)을 사용하여 10mM 사붕산나트륨(Sodium tetraborate) pH 9.2버퍼에 대해 하룻밤 동안 1번, 6시간 1번 투석하였다. 투석한 단백질을 회수하여 BCA 단백질 어세이 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 정량하고, 항원의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였다.
Partial 단백질은 비드에 결합된 단백질을 20mM, 150mM 이미다졸 세척버퍼로 세척 후, 500mM 이미다졸 버퍼로 용출을 실시하였다. 용출된 단백질은 14 kDa 컷-오프 투석 튜빙 (cut-off dialysis tubing; sigma)을 사용하여 10mM 사붕산나트륨 pH 9.2버퍼에 대해 하룻밤 동안 1번, 6시간 1번 투석하였다. 투석한 단백질을 회수하여 BCA 단백질 어세이 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 정량하고, 항원의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였다.
실시예 2. 항체진단키트제작
2-1. IBV 항혈청 구축
공격접종 계군의 항혈청의 경우, SPF(Specific Pathogen Free) 닭에 IBV 혈청형 QX와 혈청형 M41을 각각 그룹당 6~7 마리씩 근육 접종한 뒤 접종 4주차에 다시 동일한 방법으로 2차 접종하여 1차 접종 전, 1차 접종 후 4주차 및 8주차에 각각의 닭의 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 시험 시료로 사용하였다 (표 2).
또한, 백신접종 계군 항혈청의 경우, 백신 프로그램에 따라 접종하고 있는 야외 산란계 농장으로부터 그룹당 10마리씩 닭 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 시험 시료로 사용하였다 (표 3).
공격접종군 IBV 접종혈청형 접종차수 접종시 닭주령 채혈시기
G1(6수) M41 1차 6주령 접종전
2차 10주령 1차접종후 4주차
- - 1차접종후 8주차
G2(6수) QX(K1277-03) 1차 6주령 접종전
2차 10주령 1차접종후 4주차
- - 1차접종후 8주차
백신 일령 백신 종류 백신 혈청형 백신 경로 1일령에 백신접종 후 채혈 주차 채혈두수
1일령 생독 KM91 분무 1주 10수
20일령 생독 KM91 분무 3주 10수
30일령 생독 M41 분무 5주 10수
55일령 생독 KM91 분무 7주 10수
70일령 사독 KM91, QX 근육 10주 10수
100일령 생독 M41 분무 14주 10수
127일령 사독 KM91, QX 근육 18주 10수
140일령 생독 KM91 분무 22주 10수
- - - - 26주 10수
- - - - 36주 10수
- - - - 48주 10수
- - - - 54주 10수
- - - - 60주 10수
2-2. 신장형 IBV 혈청형 QX 의 뉴클레오캡시드 부동화
신장형 IBV 혈청형 QX기반 재조합 뉴클레오캡시드 (발현숙주세포 BL21 (DE3) & BL21(DE3)codon plus)을 각각 1ug/mL의 농도로 96웰 마이크로플레이트의 한 웰 당 100 ul(1 ug/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 3% BSA_PBS-T 블록킹 용액을 웰 당 200ul씩 분주한 후 37℃에서 1 시간 동안 반응 후 인산 완충용액-tween 20(0.05% tween-20 (v/v)이 포함되어있는 인산완충용액, pH 7.4; 이하, PBS-T)로 3회 세척하였다.
2-3. Goat anti-chicken IgG HRP 컨쥬게이트
상용화 goat anti-chicken IgG HRP 컨쥬게이트 (KPL, cat. no. 5220-0373)를 컨쥬게이트 희석버퍼 (인산완충용액-tween 20 0.05%, pH 7.4)에 50ng/ml로 희석하여 이용하였다.
2-4. 검체 희석버퍼 (specimen dilution buffer)
닭 혈청 검체를 희석하기 위한 검체 희석버퍼는 PBS-T를 사용하였다.
실시예 3. 항체진단키트 성능평가
3-1. 코팅 항원 및 공격접종 항혈청 별 반응성
제조된 키트에 신장형 IBV 혈청형 QX에 의한 항혈청 및 다양한 항혈청을 1:500으로 희석한 후 96웰 플레이트 각 웰에 100 ul씩 가하여 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, PBS-T 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 검체를 제거하였다. 여기에 goat anti-chicken IgG HRP conjugate를 0.05ug/ml 농도로 가하여 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, PBS-T로 3회 세척하였다. 세척한 후 퍼옥시다제의 기질용액(TMB)을 가하여 반응시키고, 황산 0.5 M를 플레이트 각 웰에 50 ul씩 분주한 뒤 Sunrise ELISA reader(Tecan)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 항원에 대한 반응성 측정하여, 그 결과를 도 6 및 표 4에 나타내었다.

공격접종
항혈청		 96well 플레이트 코팅 항원
IBV QX NP patial D IBV QX NP partial E IBV QX NP Full (DE3 & codon plus) IBV M41 NP Full IDEXX IBV AB ELISA
M41 (0 week) 0.01 0.05 0.08 0.25 -0.02
QX (0 week) 0.00 -0.01 0.09 0.29 -0.01
M41 (4 week) 2.60 2.10 1.45 1.54 0.44
QX (4 week) 5.57 3.81 3.35 2.36 0.58
M41 (8 week) 2.60 2.10 1.31 0.67 1.42
QX (8 week) 5.44 3.75 3.19 0.76 0.81
* S/P = (Sample O.D - NC O.D) / (PC O.D - NC O.D) PC: Positive control, NC: Negative control
도 6 및 표4에서 확인할 수 있듯이, IBV 혈청형 QX에 대한 항혈청을 반응시킨 결과, 신장형 IBV 혈청형 QX 기반 재조합 뉴클레오캡시드 항원을 코팅한 플레이트에서 타사 kit(IDEXX IBV AB ELISA) 보다 월등히 높은 반응성을 보였으며, 호흡기형 IBV 혈청형 M41 기반 재조합 뉴클레오캡시드 항원(IBV M41 NP Full) 코팅 플레이트 보다도 높은 반응성을 나타냈다.
3-2. 코팅 항원 및 야외 산란계 농장 백신접종 항혈청 별 반응성
백신프로그램(IBV 혈청형 QX 백신접종 포함됨(70일령, 127일령))에 따라 접종하고 있는 야외 산란계 농장의 항혈청 패널을 반응시킨 결과를 도 7 및 표 5에 나타내었다.
야외 산란계 농장
백신접종 항혈청		 96well 플레이트 코팅 항원
IBV QX NP partial D IBV QX NP partial E IBV QX NP Full (DE3 & codon plus) IBV M41 NP Full IDEXX IBV AB ELISA
1주차 -0.01 -0.01 1.21 1.06 1.70
3주차 0.00 -0.02 0.13 -0.01 0.08
5주차 -0.01 -0.01 0.11 0.01 0.02
7주차 -0.02 -0.04 0.10 -0.01 -0.01
10주차 -0.02 -0.03 0.12 0.06 0.02
14주차 2.05 2.01 2.95 1.13 0.56
18주차 0.27 0.13 1.07 4.40 0.91
22주차 3.13 3.47 5.24 4.05 0.97
26주차 1.67 1.67 2.88 3.27 1.25
36주차 1.44 1.40 3.60 2.94 1.65
48주차 1.37 1.37 3.20 2.71 1.65
54주차 1.32 1.53 3.28 4.63 2.07
60주차 1.55 1.99 4.00 4.20 1.84
도 7 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 신장형 IBV 혈청형 QX 기반 재조합 뉴클레오캡시드 항원을 코팅한 플레이트에서 IBV 혈청형 QX백신 접종 시 유발되는 특이 항체를 타사 kit(IDEXX IBV AB ELISA) 보다 잘 표현하였으며, 호흡기형 IBV 혈청형 M41 기반 재조합 뉴클레오캡시드 항원(IBV M41 NP Full) 코팅 플레이트 보다 도 잘 표현하였다.
<110> MEDIAN Diagnostics Inc. 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<220> <223> IBV QX NP C Forward <400> 7 cgcggatcca tggcaagcgg taaggtatc 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBV QX NP C Reverse <400> 8 cgcgcggccg ccagaggaat gaaatccc 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBV QX NP D Forward <400> 9 cgcggatcca tggcaagcgg taaggtatc 29 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBV QX NP D Reverse <400> 10 cgcgcggccg ccagaggaat gaaatccc 28 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBV QX NP E Forward <400> 11 cgcggatcca tggcaagcgg taaggtatc 29 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBV QX NP E Reverse <400> 12 cgcgcggccg cttgctttgt aatacgcgta cc 32 <210> 13 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP full 1227 nucleotide <400> 13 atggcaagcg gtaaggtatc tggaaagaca gactccccct cgccaatcat caaactagga 60 gggccaaaac cacctaaggt agggtcatct ggaaatgcat cttggttcca gtctctaaag 120 gccaagaaac taaattcacc tcctcctatg tttgaaggta gtggtgttcc tgataatgaa 180 aatctaaaat ctagccagca gcatggatac tggagacgcc aagccaggta taagcaaggc 240 aaaggcggaa gaaaaccagt ccctgatgca tggtacttct attatacagg aacaggacca 300 gccgctgacc tgaattgggg tgattctcaa gatggtatag tgtgggttgc tgccaagggt 360 gctgatgtaa aatctagatc caatcagggt acaagagatc ctgataagtt tgaccaattt 420 ccactacggt tttcagatgg aggacctgat ggtaatttcc gttgggattt cattcctctg 480 aatcgtggta ggagtgggag gtcgactgca gcttcatcag cagcatctag tagagtgccg 540 tctcgagaag gttcacgtgg tcgtaggagt ggagctgaag aagatctgat tgctcgtgcg 600 gcaaagatta ttcaggacca gcaaaggaag ggtacgcgta ttacaaagca aaaggcagat 660 gagatggctc accgtcgatt ctgtaagcgt accattccac caggttatag agtagatcaa 720 gtatttggcc ctcgtactaa aggtaaggag ggaaattttg gtgatgacaa gatgaatgag 780 gaaggtatta aggatgggcg tgttacagca atgctcaacc ttacacctag cccacatgct 840 tgtctttttg gaagtagagt gacgcccaag cttcaaccag atgggcttca ccttagattt 900 gaatttacta ctgtggtgcc tagagatgac ccgcagtttg ataattatgt aaagatttgt 960 gatgagtgtg ttgatggtgt aggcacacgc ccaaaagacg aagttgtaag accaaaatca 1020 cgctcaagtt caagacctgc tacaagagga aattctccag cgccaaaaca acagcgccaa 1080 aagaaggaga aaaagccaaa gaagcaggat gatgaagtgg ataaagcatt gacctcagat 1140 gaggagagga acaatgcaca gctggaattt gatgatgaac ccaaagtgat taattggggt 1200 gattcagcac ttggtaaaaa tgaactt 1227 <210> 14 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial A 396 nucleotide <400> 14 tcatctggaa atgcatcttg gttccagtct ctaaaggcca agaaactaaa ttcacctcct 60 cctatgtttg aaggtagtgg tgttcctgat aatgaaaatc taaaatctag ccagcagcat 120 ggatactgga gacgccaagc caggtataag caaggcaaag gcggaagaaa accagtccct 180 gatgcatggt acttctatta tacaggaaca ggaccagccg ctgacctgaa ttggggtgat 240 tctcaagatg gtatagtgtg ggttgctgcc aagggtgctg atgtaaaatc tagatccaat 300 cagggtacaa gagatcctga taagtttgac caatttccac tacggttttc agatggagga 360 cctgatggta atttccgttg ggatttcatt cctctg 396 <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial B 336 nucleotide <400> 15 aaggcagatg agatggctca ccgtcgattc tgtaagcgta ccattccacc 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taaattcacc tcctcctatg tttgaaggta gtggtgttcc tgataatgaa 180 aatctaaaat ctagccagca gcatggatac tggagacgcc aagccaggta taagcaaggc 240 aaaggcggaa gaaaaccagt ccctgatgca tggtacttct attatacagg aacaggacca 300 gccgctgacc tgaattgggg tgattctcaa gatggtatag tgtgggttgc tgccaagggt 360 gctgatgtaa aatctagatc caatcagggt acaagagatc ctgataagtt tgaccaattt 420 ccactacggt tttcagatgg aggacctgat ggtaatttcc gttgggattt cattcctctg 480 480 <210> 18 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial E 651 nucleotide <400> 18 atggcaagcg gtaaggtatc tggaaagaca gactccccct cgccaatcat caaactagga 60 gggccaaaac cacctaaggt agggtcatct ggaaatgcat cttggttcca gtctctaaag 120 gccaagaaac taaattcacc tcctcctatg tttgaaggta gtggtgttcc tgataatgaa 180 aatctaaaat ctagccagca gcatggatac tggagacgcc aagccaggta taagcaaggc 240 aaaggcggaa gaaaaccagt ccctgatgca tggtacttct attatacagg aacaggacca 300 gccgctgacc tgaattgggg tgattctcaa gatggtatag tgtgggttgc tgccaagggt 360 gctgatgtaa aatctagatc caatcagggt acaagagatc ctgataagtt tgaccaattt 420 ccactacggt tttcagatgg aggacctgat ggtaatttcc gttgggattt cattcctctg 480 aatcgtggta ggagtgggag gtcgactgca gcttcatcag cagcatctag tagagtgccg 540 tctcgagaag gttcacgtgg tcgtaggagt ggagctgaag aagatctgat tgctcgtgcg 600 gcaaagatta ttcaggacca gcaaaggaag ggtacgcgta ttacaaagca a 651 <210> 19 <211> 409 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP full 409 amino acid <400> 19 Met Ala Ser Gly Lys Val Ser Gly Lys Thr Asp Ser Pro Ser Pro Ile 1 5 10 15 Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn 20 25 30 Ala Ser Trp Phe Gln Ser Leu Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Pro 35 40 45 Pro Met Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Ser 50 55 60 Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Tyr Lys Gln Gly 65 70 75 80 Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr 85 90 95 Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly 100 105 110 Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn 115 120 125 Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Phe Pro Leu Arg Phe 130 135 140 Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Arg Val Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ala 180 185 190 Glu Glu Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln 195 200 205 Arg Lys Gly Thr Arg Ile Thr Lys Gln Lys Ala Asp Glu Met Ala His 210 215 220 Arg Arg Phe Cys Lys Arg Thr Ile Pro Pro Gly Tyr Arg Val Asp Gln 225 230 235 240 Val Phe Gly Pro Arg Thr Lys Gly Lys Glu Gly Asn Phe Gly Asp Asp 245 250 255 Lys Met Asn Glu Glu Gly Ile Lys Asp Gly Arg Val Thr Ala Met Leu 260 265 270 Asn Leu Thr Pro Ser Pro His Ala Cys Leu Phe Gly Ser Arg Val Thr 275 280 285 Pro Lys Leu Gln Pro Asp Gly Leu His Leu Arg Phe Glu Phe Thr Thr 290 295 300 Val Val Pro Arg Asp Asp Pro Gln Phe Asp Asn Tyr Val Lys Ile Cys 305 310 315 320 Asp Glu Cys Val Asp Gly Val Gly Thr Arg Pro Lys Asp Glu Val Val 325 330 335 Arg Pro Lys Ser Arg Ser Ser Ser Arg Pro Ala Thr Arg Gly Asn Ser 340 345 350 Pro Ala Pro Lys Gln Gln Arg Gln Lys Lys Glu Lys Lys Pro Lys Lys 355 360 365 Gln Asp Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Thr Ser Asp Glu Glu Arg Asn 370 375 380 Asn Ala Gln Leu Glu Phe Asp Asp Glu Pro Lys Val Ile Asn Trp Gly 385 390 395 400 Asp Ser Ala Leu Gly Lys Asn Glu Leu 405 <210> 20 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial A 132 amino acid <400> 20 Ser Ser Gly Asn Ala Ser Trp Phe Gln Ser Leu Lys Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Asn Ser Pro Pro Pro Met Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg 35 40 45 Tyr Lys Gln Gly Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr 50 55 60 Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp 65 70 75 80 Ser Gln Asp Gly Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys 85 90 95 Ser Arg Ser Asn Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Phe 100 105 110 Pro Leu Arg Phe Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp 115 120 125 Phe Ile Pro Leu 130 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial B 112 amino acid <400> 21 Lys Ala Asp Glu Met Ala His Arg Arg Phe Cys Lys Arg Thr Ile Pro 1 5 10 15 Pro Gly Tyr Arg Val Asp Gln Val Phe Gly Pro Arg Thr Lys Gly Lys 20 25 30 Glu Gly Asn Phe Gly Asp Asp Lys Met Asn Glu Glu Gly Ile Lys Asp 35 40 45 Gly Arg Val Thr Ala Met Leu Asn Leu Thr Pro Ser Pro His Ala Cys 50 55 60 Leu Phe Gly Ser Arg Val Thr Pro Lys Leu Gln Pro Asp Gly Leu His 65 70 75 80 Leu Arg Phe Glu Phe Thr Thr Val Val Pro Arg Asp Asp Pro Gln Phe 85 90 95 Asp Asn Tyr Val Lys Ile Cys Asp Glu Cys Val Asp Gly Val Gly Thr 100 105 110 <210> 22 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial C 84 amino acid <400> 22 Met Ala Ser Gly Lys Val Ser Gly Lys Thr Asp Ser Pro Ser Pro Ile 1 5 10 15 Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn 20 25 30 Ala Ser Trp Phe Gln Ser Leu Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Pro 35 40 45 Pro Met Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Ser 50 55 60 Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Tyr Lys Gln Gly 65 70 75 80 Lys Gly Gly Arg <210> 23 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial D 160 amino acid <400> 23 Met Ala Ser Gly Lys Val Ser Gly Lys Thr Asp Ser Pro Ser Pro Ile 1 5 10 15 Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn 20 25 30 Ala Ser Trp Phe Gln Ser Leu Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Pro 35 40 45 Pro Met Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Ser 50 55 60 Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Tyr Lys Gln Gly 65 70 75 80 Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr 85 90 95 Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly 100 105 110 Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn 115 120 125 Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Phe Pro Leu Arg Phe 130 135 140 Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu 145 150 155 160 <210> 24 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP partial E 217amino acid <400> 24 Met Ala Ser Gly Lys Val Ser Gly Lys Thr Asp Ser Pro Ser Pro Ile 1 5 10 15 Ile Lys Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Lys Val Gly Ser Ser Gly Asn 20 25 30 Ala Ser Trp Phe Gln Ser Leu Lys Ala Lys Lys Leu Asn Ser Pro Pro 35 40 45 Pro Met Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro Asp Asn Glu Asn Leu Lys Ser 50 55 60 Ser Gln Gln His Gly Tyr Trp Arg Arg Gln Ala Arg Tyr Lys Gln Gly 65 70 75 80 Lys Gly Gly Arg Lys Pro Val Pro Asp Ala Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr 85 90 95 Gly Thr Gly Pro Ala Ala Asp Leu Asn Trp Gly Asp Ser Gln Asp Gly 100 105 110 Ile Val Trp Val Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Lys Ser Arg Ser Asn 115 120 125 Gln Gly Thr Arg Asp Pro Asp Lys Phe Asp Gln Phe Pro Leu Arg Phe 130 135 140 Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Arg Val Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Ala 180 185 190 Glu Glu Asp Leu Ile Ala Arg Ala Ala Lys Ile Ile Gln Asp Gln Gln 195 200 205 Arg Lys Gly Thr Arg Ile Thr Lys Gln 210 215

Claims (9)

  1. 서열번호 23 및 24의 아미노산 서열 중 선택된 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드.
  2. 제1항의 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 및 18의 염기서열 중 선택된 염기서열로 이루어진 것인, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항의 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 및 18의 염기서열 중 선택된 염기서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
  6. 제1항의 재조합 뉴클레오캡시드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 및 18의 염기서열 중 선택된 염기서열로 이루어진 것인, 숙주세포.
  8. 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드; 및
    서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드;
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재조합 뉴클레오캡시드를 포함하는 신장형 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지용 조성물.
  9. 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드; 및
    서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 뉴클레오캡시드;
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재조합 뉴클레오캡시드를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 신장형 전염성기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus) 혈청형 QX 항체 탐지 방법.
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