KR20100052938A - 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 세포 배양 시스템에서 각 외사 자극에 따른 세포 변화를 측정하는 방법으로, 배양하는 피부 세포에 육음 외사의 적절한 자극원으로 자극을 주어 세포 변화 정도를 세포생화학적 방법으로 측정함으로써 기존에 제시된 개념적 육음 외사의 영향을 과학적이고 정량적으로 표현할 수 있도록 한 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
육음 외사, 바람, 추위, 더위, 습기, 건조, 열기, 항노화, 색소 침착, 피부 건조, 피부 트러블

Description

육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법{Method for assaying the degree of skin aging by the environmental elements and for screening materials of improving skin care by using the assay}
본 발명은 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 세포 배양 시스템에서 각 외사 자극에 따른 세포 변화를 측정하는 방법으로, 배양하는 피부 세포에 육음 외사의 적절한 자극원으로 자극을 주어 세포 변화 정도를 세포생화학적 방법으로 측정함으로써 기존에 제시된 개념적 육음 외사의 영향을 과학적이고 정량적으로 표현할 수 있도록 한 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
육음 외사는 한의학에서 인체에 나쁜 영향을 주는 외부요소들, 즉 병의 원인으로 변별하고 있으며 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건 조) 및 화사(열기)와 같은 외감 병사의 통칭이다. 풍, 한, 서, 습, 조 및 화는 일반적으로 자연계의 6가지 다른 기후변화로 6기라 하는데 만물 생장의 조건으로 원래는 인체에 무해하다. 그러나 기후의 변화가 비정상적이고 6기의 발생이 넘치거나(태과) 혹은 부족하게(불급) 되면 발병인자가 되어서 인체에 침범하여 질병을 발생하게 되는데 이럴 때의 6기를 6음이라고 부르고 육사라고 하며 외감병으로 외사라고도 한다.
육음은 주로 얼굴 부위와 피부에 미용의 변화를 야기할 수 있다. 얼굴 부위는 외부에 항상 노출되어 있어서 바람, 추위 및 더위 등의 외부 조건의 변화를 견뎌내야 한다. 피부는 인체의 장벽으로서 육음이 사람을 손상시키는 데 있어서 제일 먼저 방어하는 부위가 된다. 육음이 일단 침범하게 되면 피부의 노화를 야기하는데 특히 혹독한 추위, 혹독한 더위, 건조 및 강한 태양 광선 등은 피부에 매우 좋지 않은 결과를 초래한다. 피부의 생리적 노화 현상은 필연적으로 우리가 사는 환경 중의 육음과 떨어질 수 없는 밀접한 관계를 갖고 있다. 육음은 피부 노화 현상의 외인으로 작용하여 직접적으로 각종 피부 질환과 오관 질환을 야기하거나 질병을 악화시키게 된다.
화장품 업계에서 한방 화장품이 많이 개발되고 있을 뿐만 아니라 화장품제조 시 다양한 한방 이론을 활용하고 있다. 그러나, 육음 개념을 개념적으로 이용하더라도 소재의 효능을 과학적이고 객관적으로 증명하지는 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 피부 세포 배양 시스템을 이용하여 육음에 해당되는 외부 자극과 그에 따른 피부 세포 변화를 세포 생화학적 기술로 시각화하고 정량화하여, 육음외사로 인한 피부 손상을 방어할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 육음 외사에 의한 피부 변화를 과학적으로 표현할 수 있는 피부 세포 배양시스템을 구축하고 이를 통해 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용하여 피부 개선 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는
(a) 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건조) 및 화사(열기)로 이루어진 육음 외사 중 적절한 피부 자극원을 선정하는 단계;
(b) 각 자극원에 따라 세포 변화를 측정할 수 있는 세포 생화학적 방법을 결정하는 단계;
(c) 상기 생화학적 방법으로 측정 대상 피부의 상태를 측정하는 단계;
(d) 각 자극원으로 피부를 자극한 후 자극 강도에 따른 세포 변화 정도를 정량하는 단계; 및
(e) 육음 외사를 방어하는 한약재를 피부에 적용한 다음 피부의 상태를 상기 생화학적 방법으로 측정하여 정량화를 검증하는 단계;
를 포함하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 피부 변화를 정량하는 방법을 이용하여 피부 개선 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법은 피부 세포 배양 시스템에서 육음 외사에 맞는 자극원을 가한 후에 세포 변화를 과학적, 정량적으로 표현할 수 있으며 이는 해당되는 한약재의 효능으로 재확인할 수 있었다.
따라서, 한방 화장품의 효능 소재 발굴 시 한방 효능을 과학적 결과를 통해 객관적으로 표현하여 제품의 효능을 증진시킬 수 있다. 또한 이 방법은 화장품 사용자의 피부 샘플을 얻어 사용자의 피부 상태 변화를 측정하는 방법으로 확대 적용할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은
(a) 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건조) 및 화사(열기)로 이루어진 육음 외사 중 적절한 피부 자극원을 선정하는 단계;
(b) 각 자극원에 따라 세포 변화를 측정할 수 있는 세포 생화학적 방법을 결정하는 단계;
(c) 상기 생화학적 방법으로 측정 대상 피부의 상태를 측정하는 단계;
(d) 각 자극원으로 피부를 자극한 후 자극 강도에 따른 세포 변화 정도를 정량하는 단계; 및
(e) 육음 외사를 방어하는 한약재를 피부에 적용한 다음 피부의 상태를 상기 생화학적 방법으로 측정하여 정량화를 검증하는 단계;
를 포함하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용하는 "육음외사"란 용어는 피부에 자극을 주어 피부 노화를 유발하는 여섯 가지 외부 요소, 즉 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건조) 및 화사(열기)를 의미한다.
또한 본 발명에서 사용하는 "육음외사에 의한 피부 변화"라는 용어는 육음외사에 노출되기 이전 상태의 피부를 기준으로 하여 육음외사에 노출된 시점부터 변화된 전반적인 피부의 변화를 포함하는 것이며, 바람직하게는 육음외사에 의한 피부 손상을 의미하는 것으로, 예를 들면 피부 노화, 색소 침착, 피부 건조 및 피부 트러블 등을 모두 포함할 수 있으나, 이에만 한정되지 않는다.
또한 본 발명에서 사용하는 "피부 개선 물질"이라는 육음외사에 의한 노화, 색소 침착, 피부 건조 또는 피브 트러블 등을 개선하는 효과를 가지는 물질을 의미한다.
이하, 본 발명에 의한 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법을 단계별로 구체적으로 설명한다.
먼저, 육음 외사의 적절한 자극원을 선정한다. 본 발명에서는 동의보감 등의 한의서 개념에 맞게 육음외사의 적절한 자극원으로서 풍사는 염증 유발 요인, 한사는 저온 자극, 서사는 고온 자극, 습사는 활성산소종(ROS: Reactive Oxygen Species) 자극, 화사는 자외선 자극 등으로 선정하였다. 이를 보다 구체적으로 살펴보면 하기와 같다:
1) 풍사: 풍사에 해당되는 자극원은 피부에 염증을 유발할 수 있는 인자들로 포름알데히드와 같은 대기 오염 물질, 진드기 및 꽃가루와 같은 알레르기 유발 물질, 황사, LPS(bacterial lipopolysaccharide), PMA(phorbol myristate acetate) 및 염증 유발 사이토카인 등이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 상기 염증 유발 인자들을 시험물질(또는 배양세포)에 대하여 0.0001∼10 중량%로 사용할 수 있다. 상기 염증 유발 인자들의 사용량이 0.0001 중량% 미만에서는 적절한 강도의 자극을 유발하지 못하는 문제가 발생하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 자극의 강도가 지나쳐 세포가 모두 죽게 되는 문제가 발생한다.
이와 같이 풍사를 자극원으로 하는 세포 반응을 통한 피부 변화의 정량 방법은 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법을 거쳐 TNF-α 및 PGE2의 생성량 변화 또는 이를 유발하는 COX-2 단백질의 생성량 및 활성 변화를 측정함으로써 피부 변화량을 측정할 수 있다. 또한 염증관련 또는 피부 효능 관련 생체지표들을 합리적으로 활용할 수도 있다.
2) 한사: 한사에 해당되는 자극원은 피부에 손상을 줄 수 있는 추위 자극이다. 추위 자극은 피부의 생체 온도보다 낮은 온도로 설정되며 35℃ 정도의 실온부터 -40℃의 저온까지 필요에 따라서 적용 가능하다. 설정 온도가 저온 -40℃ 보다 낮은 온도에서는 자극의 강도가 지나쳐 세포가 모두 죽게 되는 문제가 발생하고, 35℃ 보다 높은 온도에서는 정상 체온 범위 안에 들어서 한사 자극으로의 의미가 없다. 이와 같이 한사를 자극원으로 하는 세포 반응을 통한 피부 변화의 정량방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 세포 증식률 변화, 세포 대사 변화 및 기타 피부 관련 생체지표들을 합리적으로 활용하여 피부 변화량을 측정할 수 있다.
3) 서사: 서사에 해당되는 자극원은 피부에 손상을 줄 수 있는 더위 자극이다. 더위 자극은 피부의 생체 온도보다 높은 온도로 설정되며 39℃ 부터 50℃의 고온까지 필요에 따라서 적용 가능하다. 설정 온도가 39℃ 보다 낮은 온도에서는 정상 체온 범위 안에 들어서 서사 자극으로의 의미가 없고 50℃ 보다 높은 온도에서는 자극의 강도가 지나쳐 세포가 모두 죽게 되는 문제가 발생한다. 이와 같이 서사를 자극원으로 하는 세포 반응을 통한 피부 변화의 정량방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 세포 손상 변화, 세포 대사 변화 및 기타 피부 관련 생체지표들을 합리적으로 활용하여 피부 변화량을 측정할 수 있다.
4) 습사: 본 발명에서는 습사의 자극원을 선정하기 위하여 습사로 인한 피부 손상이 주로 장마철의 탁하고 더러운 것이 정체되어 발생하는 것과 연관 지어, 습사가 강해진 상황을 탁하고 더러운 것이 피부에 정체되어 에너지 대사 부산물로 생성되는 활성산소종의 양을 증가시키는 것과 관련이 있는 것으로 보고 습사에 해당되는 자극원으로서 활성 산소종 자극을 선정하였다. 활성 산소종 자극은 직접적으로 활성 산소종을 처리하는 것뿐만 아니라 활성 산소종을 생체에서 유발하는 물질이나 자극 처리까지 포함하며, 예를 들면 FeCl3 또는 FeCl2 등과 같이 펜톤 반응(fenton reaction)에 의해서 라디칼을 유도할 수 있는 물질을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 H2O2 자극을 사용하였으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
상기 H2O2 자극은 각 H2O2를 0.001∼10 mM 범위로 조사하는 것이 바람직하다. 상기 조사량이 0.001 mM 미만인 경우에는 자극의 강도가 미약하여 정상 상태와 비교하기 어려운 문제가 발생하고, 10 mM를 초과하는 경우에는 자극의 강도가 너무 강해 세포가 모두 죽어버리는 문제가 발생한다.
이와 같이 습사를 자극원으로 하는 세포 반응을 통한 피부 변화의 정량방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 세포 손상 변화, 세포 항산화 시스템 변화 및 기타 피부 관련 생체지표들을 합리적으로 활용하여 피부 변화량을 측정할 수 있다.
5) 조사: 조사에 해당되는 자극원은 피부에 손상을 줄 수 있는 건조 자극이다. 건조 자극은 직접적으로 건조 공기에 노출하여 처리하는 것뿐만 아니라 이와 유사한 반응을 생체에서 유발하는 물질이나 자극 처리까지 포함한다.
본 발명에서 사용하는 건조 공기는 수분함량 60% 미만인 공기를 의미하며, 수분 함량 35%인 건조 공기를 자극원으로 사용할 경우 노출 시간은 5분에서 20분 사이로 한정할 수 있다. 이 때, 노출 시간이 5분 미만인 경우에는 건조 자극이 미약하며, 20분을 초과하는 경우에는 자극의 강도가 지나쳐서 세포가 모두 죽는다. 그러나 구체적인 실험 조건(수분 함량 또는 노출 시간 등)은 실험 장소의 실내 습도 측정에 따라서 당업자가 용이하게 조절 가능하다.
이와 같이 조사를 자극원으로 하는 세포 반응을 통한 피부 변화의 정량방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 세포 손상 변화, 세포 증식률 변화, 생체 내 칼슘 신호 전달 시스템 변화 및 기타 피부 관련 생체지표들을 합리적으로 활용하여 피부 변화량을 측정할 수 있다.
6) 화사: 화사에 해당되는 자극원은 피부에 손상을 줄 수 있는 태양 광선 자극이 사용 가능하다. 태양 광선 자극은 자외선 B 뿐만 아니라 자외선 A, 가시광선 및 적외선 자극을 포함한다. 상기 태양 광선 자극은 각 태양광선을 5∼200 mJ/㎠ 범위로 조사하는 것이 바람직하다. 상기 조사량이 5 mJ/㎠ 미만인 경우에는 자극의 강도가 미약하여 정상 상태와 비교하기 어려운 문제가 발생하고, 200 mJ/㎠를 초과 하는 경우에는 자극의 강도가 너무 강해 세포가 모두 죽어버리는 문제가 발생한다.
이와 같이 조사를 자극원으로 하는 세포 반응을 통한 피부 변화의 정량방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 세포 손상 변화, 생체 방어 시스템 변화 및 기타 피부 관련 생체지표들을 합리적으로 활용하여 피부 변화량을 측정할 수 있다.
이는 외감(외부 자극으로의) 육사에 해당되는 것이며 내감(내부 현상으로의) 육사의 경우는 다른 기작과 다른 자극으로 적용 가능하다.
본 발명에 기재된 육음외사는 각기 혼자서도 인체에 침입이 가능하고 두 가지 이상의 외사가 동시에 침입할 수도 있으며 각기 다른 것으로 전환되는 바, 이를 적절한 생체 지표와 적절한 대표적 한약재를 이용하여 적용할 수 있다. 예를 들면, 풍사가 침입하여 열사로 변하거나("풍열"로 지칭됨), 한사가 습사로 자리잡거나("한습"으로 지칭됨) 할 수 있다.
다음으로, 각 자극원에 따라 자극원의 강도와 적절한 세포 생화학적 방법을 결정한다. 상기 단계에서 자극원의 종류에 따라서 특징적으로 활용될 수 있는 세포 생화학 방법을 응용하여 수행한다. 상기 세포 변화 반응이 상기 육음 외사, 즉, 풍사, 한사, 서사, 습사, 조사 및 화사에 의한 변화를 회복시키는 대표적인 한약재와 해당 한약 처방에 의해서 완화되거나 억제됨을 확인함으로써 그 유의적 차이를 통해 풍사에 의한 피부 노화를 정량할 수 있다.
본 발명에서 정량화를 위해 거치는 세포 생화학 방법은 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법들을 모두 포함할 수 있으며, 예를 들면, 풍사에 의한 피부 변화 정량 시에는 TNF-α ELISA, PGE2 ELISA 또는 인터류킨 발현 패턴 분석(Interukin expression pattern analysis) 등을; 한사에 의한 피부 변화 정량 시에는 세포 증식 분석(Cell proliferation assay) 또는 FAS 분석(FAS analysis) 등을; 서사에 의한 피부 변화 정량 시에는 RT-PCR 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry) 등을; 습사에 의한 피부 변화 정량 시에는 멜라닌 분석(melanin analysis), 카탈라아제 분석(catalase assay) 또는 DCFH-DA 분석(Dichlorofluorescin diacetate assay) 등을; 조사에 의한 피부 변화 정량 시에는 면역세포화학법을; 및 화사에 의한 피부 정량 시에는 DAPI 염색법(DAPI staining) 또는 β-Gal 염색법 등을 거칠 수 있으며, 이러한 분석 방법들은 사이토카인 분석, 항산화력 분석, 세포 독성 분석, 세포 증식 분석, 특정 단백질 및 유전자 변화 패턴 분석 등을 포함한다는 점에서 공통적 특징을 가진다. 또한 본 발명에서는 세포 변화를 측정할 수 있는 MTT 분석, LDH 분석, 유전자 혜성 분석(Comet assay) 및 특정항체를 이용한 웨스턴 블랏(western blot) 등을 응용하여 세포 생존율, 세포성장율, 세포막 손상, DNA 손상 및 특정 단백질 발현 변화 등을 측정하여 피부 변화를 정량화할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 세포로는 사람과 동물의 피부에서 일차 분리 배양할 수 있는 각질 형성 세포, 섬유아 세포 및 지방 세포 등을 포함하여 단일층 배양계와 3차 조직 배양계(3D tissue culture)를 이용할 수 있는 모든 피부 세포주를 활용할 수 있다. 또한 대식 세포주인 RAW 264.7 세포와 같이 피부내 면역을 담당할 수 있는 세포주도 사용 가능하고, 사람의 생검 조직을 활용할 수도 있다.
마지막으로, 육음외사를 방어하는 대표 한약재로 상위 단계에서 선정한 방법의 적합성을 확인한다.
이 단계에서는 육음 외사 각각의 자극원으로 선정되고 측정 지표로 선정된 것들이 한약재에 의한 효능을 확인해 줄 수 있는지를 측정함으로써 대조군과 실험군의 유의적 변화를 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 한약재는 일반적으로 통용되는 한약재의 약성과 특징을 가진 것뿐만 아니라 동의보감, 상한론 등 한의학 고전의 처방을 따르거나 한의사가 적절한 한방 진단에 따라서 처방한 것을 모두 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 예를 들면, 백지(白芷; Angelica dahurica), 건강(乾薑; Zingiberis officinale), 금은화(金銀花; Lonicera japonica), 황금(黃芩; Scutellaria baicalensis), 생지황(生地黃; Rehmannia glutinosa) 및 지모(知母; Anemarrhena asphodeloides) 등이 있으나, 이에만 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 육음 외사에 의한 피부 변화의 정량 방법을 구축하고 이를 이용하여 피부 개선 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 후보물질이 첨가된 세포를 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건조) 및 화사(열기)로 이루어진 육음 외사 중 1종 이상의 자극원으로 자극하는 단계;
2) 자극의 전후에 후보물질과 함께 양성대조군으로서 한약재를 각각 세포에 처리하는 단계;
3) 피부의 상태를 세포 생화학적 방법으로 측정하여 정량하는 단계; 및
4) 후보물질과 양성대조군인 한약재의 정량 수치를 비교하여 후보물질의 효능을 판단하는 단계.
상기에서 사용하는 배양 세포, 육음 외사의 자극원, 세포 생화학적 방법 및 양성대조군으로 사용된 한약재는 상술한 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법에서 사용한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
이와 같은 방법은 단일 세포 배양 시스템뿐만 아니라 인체 피부까지 확대 적용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당 업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함된다.
[참고예 1] 한약재 추출물의 제조
백지(Angelica dahurica), 건강(Zingiberis officinale), 금은화(Lonicera japonica), 황금(Scutellaria baicalensis), 생지황(Rehmannia glutinosa) 및 지 모(Anemarrhena asphodeloides) 각 1 kg을 70% 에탄올 5 ℓ로 각각 3시간 추출한 뒤 여과하고 남은 액을 감압 농축하여서 각 한약재들의 70% 에탄올 추출물을 얻었다. 이 시료를 이용하여 하기의 실험들을 진행하였다.
[실시예 1] 풍사에 의한 피부 변화의 정량방법
인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% FBS-DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 각각 세포주를 5×105세포/웰(well)로 6 웰 세포 배양판에 부착시키고 LPS 1 μg/ml의 농도가 되게 하여 풍사를 유발하였다. 풍사를 유발한 실험군에 한약재로 거풍해표(祛風解表), 거풍습(祛風濕)하는 약성을 가진 백지(白芷; Angelica dahurica) 추출물(참고예 1) 10 μg/ml를 동시에 처리하여 그 효과를 비교하였다. 상기 LPS와 백지 추출물을 처리하지 않고 배양한 세포주를 대조군으로 하고, 이 대조군을 기준으로 변화된 COX-2(cyclooxygenase-2) 단백질 발현량과 그 활성으로 측정하여 풍사에 의한 피부 변화를 정량하였다.
시험물질을 처리한 다음날 시료를 채취해서 세포 분쇄액을 10% SDS-겔 전기영동을 통해서 전개하고 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨서 5% 무지방 우유(Non-fat milk)로 반응을 차단(blocking)한 후에 COX-2 단일 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하여 염증 반응에 중요한 역할을 하는 COX-2 단백질의 발현을 농도계(densitometer)로 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
풍사 자극원으로 사용된 LPS에 의한 COX-2 발현 증가와 백지의 효과
LPS 처리 백지 추출물 처리 COX-2 발현 정도(AU) COX-2 발현 증가율(%)
- - 723 0.0
+ - 1571 117.3
+ + 1218 68.5
상기 표 1의 결과에서, 백지 추출물은 LPS에 의한 염증 유발을 40% 정도 억제하는 효과를 보였다. 따라서, LPS와 같은 염증 유발 인자를 풍사의 자극원으로 설정하고 COX-2와 같은 단백질을 세포 변화를 측정하는 지표로 활용 가능함을 알 수 있었다.
[실시예 2] 한사에 의한 피부 변화의 정량방법
인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% FBS-DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 각각 세포주를 2×105 세포/웰로 3.5 웰 세포 배양 접시에 부착시키고 -15℃에 두어서 한사를 유발하였다. 한사를 유발한 실험군에 한약재로 온중거한(溫中祛寒)하는 건강(乾薑; Zingiberis officinale) 추출물(참고예 1) 10 μg/ml를 동시에 처리하여 그 효과를 비교하였다. 저온처리없이 건강 추출물을 처리하지 않고 배양한 세포주를 대조군으로 하고, 이 대조군을 기준으로 변화된 세포 성장율을 MMT 분석으로 측정하여 한사에 의한 피부 변화를 정량하였다.
저온 처리 및 시험물질 처리 다음날 배양 중인 세포에 MTT 시약(3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드, Sigma)을 0.5 μg/ml의 농도로 2시간 처리한 후에 배양액을 제거하고 남아 있는 보라색 침전물을 DMSO를 이용하여 녹여낸 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
한사 자극원으로 저온 처리후 성장 감소와 건강의 효과
저온 처리 건강 추출물 처리 OD560(AU) 세포 성장율(%)
- - 0.9679 100.0
+ - 0.4825 49.9
+ + 0.7489 77.4
상기 표 2의 결과에서, 건강 추출물은 저온 처리에 의한 성장 감소를 효과적으로 되돌릴 수 있었다. 따라서, 저온 처리를 한사의 자극원으로 설정하고 세포 성장률을 세포 변화를 측정하는 지표로 활용 가능함을 알 수 있었다.
[실시예 3] 서사에 의한 피부 변화의 정량방법
인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% FBS-DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 각각 세포주를 2×105 세포/웰로 3.5 웰 세포 배양 접시에 부착시키고 44℃에 두어서 서사를 유발하였다. 서사를 유발한 실험군에 청열해독(淸熱解毒)하는 한약재인 금은화(金銀花; Lonicera japonica) 추출물(참고예 1) 10 μg/ml를 동시에 처리하여 그 효과를 비교하였다.
서사에 의한 피부 변화를 정량한 결과는 LDH 분석(Sigma Aldrich, Product Number TOX-7)을 활용하여 세포막 안정성 반응으로 측정하였다. 고온 처리와 물질 처리를 한 다음날 배양 중인 세포 배양액을 수거하여 세포 파편이 모두 가라앉도록 원심분리(12000 rpm, 3분)하여 상층액만 덜어내었다. 상층액 100 μl를 98 웰 실험판에 넣고 LDH 분석 혼합물(LDH Assay Substrate: Cofactor: Dye solution = 1: 1: 1)을 사용 직전에 만들어 200 μl씩 시료 상층액과 섞어 주었다. 빛을 차단하고 20분간 반응이 진행되게 놓아둔 후에 1N HCl 용액을 각각 25 μl씩 넣어서 반응을 종결시키고 490 및 690 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 490 nm 흡광도에서 690 nm 흡광도를 빼서 배경을 제거하여 측정 흡광도 값을 보정한 후 그 결과를 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 고온 처리없이 금은화 추출물을 처리한 대조군을 기준으로 하여 세포막 손상율을 산출하였다.
사사 자극원으로 고온 처리후 세포막 손상 증가와 금은화의 효과
고온 처리 금은화 추출물 처리 보정된OD490(AU) 세포막 손상율(%)
- - 0.1916 100.0
+ - 0.3577 186.7
+ + 0.3113 162.5
상기 표 3의 결과에서, 금은화 추출물은 고온 처리에 의한 세포막 손상을 효과적으로 줄일 수 있었다. 따라서, 고온 처리를 서사의 자극원으로 설정하고 세포막 손상율을 세포 변화를 측정하는 지표로 활용 가능함을 알 수 있었다.
[실시예 4] 습사에 의한 피부 변화의 정량방법
인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% FBS-DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 각각 세포주를 1×105 세포/웰로 98 웰 세포 배양판에 부착시키고 H2O2 1mM을 처리하여 습사를 유발하였다. 습사를 유발한 실험군에 청열조습(淸熱燥濕)으로 쓰이는 한약재인 황금(黃芩; Scutellaria baicalensis) 추출물(참고예 1) 10 μg/ml를 동시에 처리하여 그 효과를 비교하였다.
습사에 의한 피부 변화를 정량한 결과는 MTT 분석을 활용하여 세포 독성 정도로 측정하였다. H2O2 처리와 물질 처리를 한 다음날 배양 중인 세포에 MTT 시약(3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드, Sigma)을 0.5 μg/ml의 농도로 2시간 처리한 후에 배양액을 제거하고 남아 있는 보라색 침전물을 DMSO를 이용하여 녹여낸 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표4에 나타내었다. H2O2 및 황금 추출물을 처리하지 않은 대조군으로 기준으로 하여 세포 생존율을 산출하였다.
습사 자극원으로 H2O2 처리 후 세포 독성 증가와 황금의 효과
H2O2 처리 황금 추출물 처리 OD560(AU) 세포 생존율(%)
- - 1.7679 100.0
+ - 0.7789 44.1
+ + 1.426 80.7
상기 표 4의 결과에서, 황금 추출물은 H2O2 처리에 의한 독성 증가를 효과적으로 보호하였다. 따라서, H2O2 처리를 습사의 자극원으로 설정하고 세포 독성을 세포 변화를 측정하는 지표로 활용 가능함을 알 수 있었다.
[실시예 5] 조사에 의한 피부 변화의 정량방법
인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% FBS-DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 각각 세포주를 2×105 세포/웰로 48 웰 세포 배양판에 부착시키고 클린 벤치 안에 배양판 뚜껑을 열고 방치하여서 조사를 유발하였다. 조사를 유발하는 클린 벤치안 조건으로 온도 29℃, 습도 45%를 기준으로 하되 실험 조건에 따라서 변동을 줄 수 있다. 건조 조건에 노출시키면서 양음생진(養陰生津)하는 한약재인 생지황(生地黃; Rehmannia glutinosa) 추출물(참고예 1) 10 μg/ml를 동시에 처리하여 그 효과를 비교하였다.
조사에 의한 피부 변화를 정량한 결과는 MTT 분석을 활용하여 세포 독성 정도로 측정하였다. 건조 노출 처리와 물질 처리를 한 다음날 배양 중인 세포에 MTT 시약(3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드, Sigma)을 0.5 μg/ml의 농도로 2시간 처리한 후에 배양액을 제거하고 남아 있는 보라색 침전물을 DMSO를 이용하여 녹여낸 다음 560 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 조사 및 생지황 추출물을 처리하지 않은 대조군으로 기준으로 하여 상대적인 세포 생존율을 산출하였다.
조사 자극원으로 건조 노출 처리 후 세포 독성 증가와 생지황의 효과
건조 노출 처리 생지황 처리 OD560(AU) 세포 생존율 (%)
- - 1.463 100.0
+ - 0.6789 46.4
+ + 0.9127 62.4
상기 표 5의 결과에서, 생지황 추출물은 건조 노출 처리에 의한 독성 증가를 효과적으로 보호하였다. 따라서, 건조 노출 처리를 조사의 자극원으로 설정하고 세포 독성을 세포 변화를 측정하는 지표로 활용 가능함을 알 수 있었다.
[실시예 6] 화사에 의한 피부 변화의 정량방법
인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% FBS-DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 각각 세포주를 5×105 세포/웰로 6 웰 세포 배양판에 부착시키고 UVB를 조사하여서 화사를 유발하였다. 화사를 유발하는 UVB조건으로 40 mJ/㎠를 기준으로 하되 실험 조건에 따라서 변동을 줄 수 있다. 자외선 조사와 함께 청열사화(淸熱瀉火)하는 한약재인 지모(知母; Anemarrhena asphodeloides) 추출물(참고예 1) 10 μg/ml를 동시에 처리하여 그 효과를 비교하였다.
화사에 의한 피부 변화를 정량한 결과는 유전자 혜성 분석을 활용하여 DNA 손상 정도를 측정하였다. 자외선 조사 처리와 물질 처리를 한 다음날 배양 중인 세포를 수거하여 세포 20 μl를 녹인 LMagarose 200 μl에 섞어서 즉시 75 μl를 코멧 슬라이드로 옮겼다. 그 후 용균액(lysis solution)과 새로 만든 알칼리 용액(NaOH 0.6g/50 ml DIW)에 차례로 담가 처리하고 전기영동하였다. SYBR 그린 I 희석액 50 μl를 떨어뜨려서 DNA를 염색시킨 후 형광현미경으로 494 nm/512 nm 필터에서 관찰하고 사진을 찍어서 그 정도를 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 자외선 B 조사 및 지모 추출물을 처리하지 않은 대조군으로 기준으로 하여 상대적인 DNA 손상율을 산출하였다.
화사 자극원으로 자외선 조사 처리 후 세포 독성 증가와 지모의 효과
자외선 조사 처리 지모 추출물 처리 테일 길이(㎛) DNA 손상율(%)
- - 65.4 100.0
+ - 112.4 171.9
+ + 78.2 119.6
상기 표 6의 결과에서, 지모 추출물은 자외선 조사 처리에 의한 DNA 손상 증가를 효과적으로 보호하였다. 따라서, 자외선 조사 처리를 화사의 자극원으로 설정하고 DNA 손상을 세포 변화를 측정하는 지표로 활용 가능함을 알 수 있었다.
이들 실시예는 본 발명의 대표적인 일례만을 예시한 것으로, 당업자에 의해 어떠한 다른 형태로도 변형이 가능할 것이다. 예를 들면, 풍사의 경우에는 LPS가 아니라 집먼지 진드기 파쇄액으로 대신 자극을 줄 수도 있으며, 한사, 서사 및 조사의 경우에는 각 처리 온도가 고정된 것이 아니라 피부 온도보다 저온, 고온 및 건조 조건으로 폭넓게 활용이 가능할 것이며, 습사의 경우에도 단순 H2O2외 ROS 생성을 유발하는 물질 대용 사용이 가능하고, 화사의 경우에도 자외선A 또는 적외선 등이 자극원으로 가능하다.

Claims (19)

  1. (a) 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건조) 및 화사(열기)로 이루어진 육음 외사 중 적절한 피부 자극원을 선정하는 단계;
    (b) 각 자극원에 따라 세포 변화를 측정할 수 있는 세포 생화학적 방법을 결정하는 단계;
    (c) 상기 생화학적 방법으로 측정 대상 피부의 상태를 측정하는 단계;
    (d) 각 자극원으로 피부를 자극한 후 자극 강도에 따른 세포 변화 정도를 정량하는 단계; 및
    (e) 육음 외사를 방어하는 한약재를 피부에 적용한 다음 피부의 상태를 상기 생화학적 방법으로 측정하여 정량화를 검증하는 단계;
    를 포함하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 풍사의 자극원은 포름알데히드를 포함하는 대기 오염 물질, 진드기 및 꽃가루를 포함하는 알레르기 유발 물질, 황사, LPS(bacterial lipopolysaccharide), PMA(phorbol myristate acetate) 및 염증 유발 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 한사의 자극원은 실온 35℃ 내지 -40℃의 저온임을 특징으 로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 서사의 자극원은 39∼50℃의 고온임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 습사의 자극원은 활성 산소종임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 조사의 자극원은 수분함량 60% 미만의 건조 공기임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 화사의 자극원은 자외선 B, 자외선 A, 가시광선 및 적외선으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 세포 생화학적 방법은 TNF-α ELISA, PGE2 ELISA, 인터류킨 발현 패턴 분석(Interukin expression pattern analysis), 세포 증식 분석(Cell proliferation assay), FAS 분석(FAS analysis), RT-PCR, 면역세포화학법(immunocytochemistry), 멜라닌 분석(melanin analysis), 카탈라아제 분 석(catalase assay), DCFH-DA 분석(Dichlorofluorescin diacetate assay), DAPI 염색법(DAPI staining), β-Gal 염색법, MTT 분석, LDH 분석, 유전자 혜성 분석(Comet assay) 및 특정항체를 이용한 웨스턴 블랏(western blot)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 한약재는 백지(白芷; Angelica dahurica), 건강(乾薑; Zingiberis officinale), 금은화(金銀花; Lonicera japonica), 황금(黃芩; Scutellaria baicalensis), 생지황(生地黃; Rehmannia glutinosa) 및 지모(知母; Anemarrhena asphodeloides)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 육음 외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법.
  10. 1) 후보물질이 첨가된 세포를 풍사(바람), 한사(추위), 서사(더위), 습사(습기), 조사(건조) 및 화사(열기)로 이루어진 육음 외사 중 1종 이상의 자극원으로 자극하는 단계;
    2) 자극의 전후에 후보물질과 함께 양성대조군으로서 한약재를 각각 세포에 처리하는 단계;
    3) 피부의 상태를 세포 생화학적 방법으로 측정하여 정량하는 단계; 및
    4) 후보물질과 양성대조군인 한약재의 정량 수치를 비교하여 후보물질의 효능을 판단하는 단계;
    를 포함하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 풍사의 자극원은 포름알데히드를 포함하는 대기 오염 물질, 진드기 및 꽃가루를 포함하는 알레르기 유발 물질, 황사, LPS(bacterial lipopolysaccharide), PMA(phorbol myristate acetate) 및 염증 유발 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 한사의 자극원은 실온 35℃ 내지 -40℃의 저온임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 서사의 자극원은 39∼50℃의 고온임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 습사의 자극원은 활성 산소종임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 조사의 자극원은 수분함량 60% 미만의 건조 공기임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  16. 제 10항에 있어서, 화사의 자극원은 자외선 B, 자외선 A, 가시광선 및 적외선으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  17. 제 10항에 있어서, 상기 세포 생화학적 방법은 TNF-α ELISA, PGE2 ELISA, 인터류킨 발현 패턴 분석(Interukin expression pattern analysis), 세포 증식 분석(Cell proliferation assay), FAS 분석(FAS analysis), RT-PCR, 면역세포화학법(immunocytochemistry), 멜라닌 분석(melanin analysis), 카탈라아제 분석(catalase assay), DCFH-DA 분석(Dichlorofluorescin diacetate assay), DAPI 염색법(DAPI staining), β-Gal 염색법, MTT 분석, LDH 분석, 유전자 혜성 분석(Comet assay) 및 특정항체를 이용한 웨스턴 블랏(western blot)으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  18. 제 10항에 있어서, 상기 양성대조군으로 사용하는 한약재는 백지(白芷; Angelica dahurica), 건강(乾薑; Zingiberis officinale), 금은화(金銀花; Lonicera japonica), 황금(黃芩; Scutellaria baicalensis), 생지황(生地黃; Rehmannia glutinosa) 및 지모(知母; Anemarrhena asphodeloides)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
  19. 제 10항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 개선 물질은 육음외사에 의한 노화, 색소 침착, 피부 건조 또는 피브 트러블을 개선하는 효과를 가지는 물질임을 특징으로 하는 피부 개선 물질의 스크리닝 방법.
KR1020080111838A 2008-11-11 2008-11-11 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법 KR101645937B1 (ko)

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