CN102203279A - 定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法和使用该方法筛选改善皮肤状况的材料的方法 - Google Patents

定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法和使用该方法筛选改善皮肤状况的材料的方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了一种定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法和使用所述定量方法筛选改善皮肤状况的材料的方法。更具体地，本文公开了一种在皮肤细胞培养系统中测定由外部刺激所引起的细胞变化的方法，其中通过细胞生物化学方法测定细胞变化的程度，所述细胞变化是通过对待培养的皮肤细胞施用适当的六种外感病邪的刺激而得到的，使得能科学并定量地表达在现有技术中提出的六种外感病邪的概念性效果，而且本文还公开了一种使用所述测定方法筛选改善皮肤状况的材料的方法。

Description

定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法和使用该方法筛选改善皮肤状况的材料的方法
技术领域
本发明涉及一种定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法和使用所述定量方法筛选改善皮肤状况的材料的方法，更具体地，本发明涉及一种在皮肤细胞培养系统中测定由外感刺激所引起的细胞变化的方法，其中，通过细胞生物化学方法测定细胞变化的程度，所述细胞变化是通过对待培养的皮肤细胞施用适当的六种外感病邪刺激而得到的，使得能科学并定量地表达在现有技术中提出的六种外感病邪的概念性效果，并且本发明涉及一种使用所述测定方法筛选改善皮肤状况的材料的方法。
背景技术
在中国本草医学中，“六种外感病邪(six external evils)”指的是对人体有副作用的因素，即，疾病的起因，并且通常指的是外感致病因素，包括风、寒、暑、湿、燥和火。通常，风、寒、暑、湿、燥和火为自然界中六种不同的气候变化，并且被称为“六种大气影响”。这六种大气影响为万事万物生长的条件。这六种大气影响在正常状态下对人体无害。但是，如果气候变化异常并且这六种大气影响的产生过度或不足，则这六种大气影响变成引起疾病的因素并且侵袭人体以引起疾病。在这种情况下，这六种大气影响被称作“六种过度或六种病邪”。
六种过度主要可以引起面部和皮肤区域的状况变化。由于面部区域总是暴露于外部环境，面部区域必须承受外部条件的变化，包括风、寒和暑。皮肤用作第一防御屏障用于保护人体免受六种过度的侵袭。如果六种过度侵袭人体，它们将引起皮肤老化，具体地，严寒、酷暑、干燥和强日光将对皮肤引起非常严重的破坏。在人类生存环境中皮肤的生理学老化现象与六种过度紧密相关。六种过度用作皮肤老化现象的外部起因，以直接引起各种皮肤疾病和五种感觉器官疾病或者使疾病更严重。
在化妆品领域，已开发了多种草本化妆品产品，此外，各种草本理论已适用于制造化妆品产品。但是，即使这六种过度的概念用于制造草本化妆品产品，也不能科学和客观地证明草本化妆品产品的材料的效果。
发明内容
技术问题
因此，本发明人通过细胞生物化学技术，使用皮肤细胞培养系统，直观并定量了对应于六种过度的外感刺激和由外感刺激所引起的皮肤细胞变化，从而开发了一种筛选能防护皮肤免受六种外感病邪的材料的方法，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是构建一种能科学表达由六种外感病邪所引起的皮肤变化的皮肤细胞培养系统并且通过所构建的细胞培养系统提供一种定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法以及使用所述定量方法筛选改善皮肤状况的材料的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)选择适当的六种外感病邪的皮肤刺激，所述六种外感病邪包括风、寒、暑、湿、燥和火病邪；
(b)根据每一种刺激，确定能测定皮肤细胞变化的细胞生物化学方法；
(c)通过所述生物化学方法测定受试者的皮肤状况；
(d)使用每一种刺激来刺激皮肤，随后根据刺激的强度来定量细胞变化的程度；和
(e)向皮肤施用防御皮肤免受六种外感病邪的药草，随后通过生物化学方法测定和定量皮肤状况。
本发明还提供了一种使用用于定量皮肤变化的所述方法来筛选改善皮肤状况的材料的方法。
有益效果
用于定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的本发明的方法能科学和定量地表达在皮肤细胞培养系统中施用对应于六种外感病邪的刺激之后的皮肤变化。这种定量检测的结果能通过对应于所施用的刺激的药草的效果再次确认。
因此，在发现的可用于制造草本化妆品产品的材料中，材料的草本效果能通过科学结论客观地表达，由此提高化妆品产品的效果。另外，这种方法能广泛地适用于从化妆品产品的使用者得到皮肤样品并测定使用者的皮肤状况的变化的方法。
具体实施方式
本发明是针对一种定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)选择适当的六种外感病邪的皮肤刺激，所述六种外感病邪包括风、寒、暑、湿、燥和火病邪；
(b)根据每一种刺激，确定能测定皮肤细胞变化的细胞生物化学方法；
(c)通过所述生物化学方法测定受试者的皮肤状况；
(d)使用每一种刺激来刺激皮肤，随后根据刺激的强度来定量细胞变化的程度；和
(e)向皮肤施用防御皮肤免受六种外感病邪的药草，随后通过生物化学方法测定和定量皮肤状况。
本文使用的术语“六种外感病邪”指的是刺激皮肤以引起皮肤老化的六种外部因素，包括风、寒、暑、湿、燥和火病邪。
本文使用的短语“由六种外感病邪所引起的皮肤变化”意味着包括在暴露于六种外感病邪之前和之后期间的通常的皮肤变化。优选地，所述短语是指由六种外感病邪所引起的皮肤破坏，并且皮肤破坏的例子包括但不限于皮肤老化、色素沉着、皮肤干燥和皮肤困扰。
本文使用的术语“改善皮肤状况的材料”指的是具有改善由六种外感病邪所引起的皮肤老化、色素沉着、皮肤干燥或皮肤困扰的效果的材料。
下文中将进一步详细描述用于定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的本发明方法的各步骤。
首先，选择适当的六种外感病邪的刺激。在本发明中，基于中国医药书籍如《东医宝鉴》(Donguibogam)的观念，选择诱导炎症的因素作为风刺激，选择低温刺激用于寒病邪，选择高温刺激用于暑病邪，选择活性氧物类(ROS)用于湿病邪，选择紫外光刺激用于火病邪。现在将进一步详细描述所选的刺激。
1)风病邪：对应于风病邪的刺激为能在皮肤上引起炎症的因素。能用于本发明的诱导炎症的因素的例子包括大气污染物如甲醛、变应性材料如蜱和花粉、黄沙、细菌脂多糖(LPS)、乙酸豆蔻酸酯佛波醇(phorbol myristate acetate)(PMA)和诱导炎症的细胞因子。在本发明中，基于测试样品(或经培养的细胞)的重量，诱导炎症的因素的用量可以是0.0001-10重量％。如果诱导炎症的因素的用量小于0.0001重量％，则不能诱导具有适当强度的刺激，而如果超过10重量％，则刺激的强度太强而使得所有细胞被杀死。
通过本领域众所周知的任何常规方法，通过如上所述使用风病邪作为刺激的细胞反应来定量皮肤变化的方法能通过测定TNF-α和PGE2的产生的变化或诱导TNF-α和PGE2的COX-2蛋白质的产生或活性的变化来测定皮肤变化。此外，还可以适当使用与炎症相关的或与皮肤相关的生物学指数。
2)寒病邪：对应于寒病邪的刺激为能对皮肤引起破坏的寒刺激。寒刺激设定在低于皮肤温度的温度。所设定的温度可以从室温(约35℃)到低温(约-40℃)。如果设定温度低于-40℃，则刺激的强度太强而使得所有细胞被杀死，而如果高于35℃，由于在正常体温范围内，则作为寒刺激将没有意义。通过如上所述使用寒病邪作为刺激的细胞反应来定量皮肤变化的方法能通过适当利用细胞增殖率的变化、细胞代谢的变化以及本领域常规使用的其它与皮肤相关的生物学指数来测定皮肤变化。
3)暑病邪：对应于暑病邪的刺激为能对皮肤引起破坏的热刺激。热刺激设定在高于皮肤温度的温度。所设定的温度可以从39℃到50℃。如果设定温度低于39℃，由于在正常体温范围内，则作为热刺激将没有意义，而如果高于50℃，则刺激的强度太强而使得所有细胞被杀死。通过如上所述使用热作为刺激的细胞反应来定量皮肤变化的方法能通过适当利用细胞破坏的变化、细胞代谢的变化以及本领域常规使用的其它与皮肤相关的生物学指数来测定皮肤变化。
4)湿病邪：在本发明中，因为主要由于在雨季不纯的和脏的物质的累积而发生由湿病邪所引起的皮肤破坏，我们认为强潮湿的环境与不纯的和脏的物质在皮肤上累积以增加作为能量代谢的副产物而产生的反应性氧物类的量有关。出于这种原因，选择反应性氧物类刺激作为对应于湿病邪的刺激。反应性氧物类刺激不仅包括直接处理的反应性氧物类，而且还包括处理体内诱导反应性氧物类的材料或刺激。例如，反应性氧物类刺激可以包括能通过芬顿反应诱导反应性氧自由基的如FeCl3或FeCl2的材料。在本发明的一个实施例中，使用H2O2刺激，但是本发明的范围不局限于此。
H2O2刺激优选地通过以0.001-10mM的剂量施用H2O2来进行。如果剂量小于0.001mM，则刺激的强度低以至于难以与正常状态比较。另一方面，如果剂量超过10mM，则刺激的强度太强而使得所有细胞被杀死。
通过如上所述使用湿病邪作为刺激的细胞反应来定量皮肤变化的方法能通过适当利用细胞破坏的变化、细胞抗氧化剂系统的变化以及本领域常规使用的其它与皮肤相关的生物学指数来测定皮肤变化。
5)燥病邪：对应于燥病邪的刺激为能对皮肤引起破坏的干燥刺激。干燥刺激不仅包括将皮肤直接暴露于干燥空气，而且还包括处理体内诱导类似反应的材料或刺激。本文使用的术语“干燥空气”是指水分含量低于60％的空气。如果使用水分含量为35％的干燥空气作为刺激，则暴露时间可以限定在5分钟到20分钟之间。如果暴露时间小于5分钟，则干燥刺激的强度低，而如果超过20分钟，则刺激的强度太强而使得所有细胞被杀死。但是，根据实验场所室内湿度的测定，本领域技术人员可以容易地控制具体的实验条件(水分含量、暴露时间，等)。
通过如上所述使用燥病邪作为刺激的细胞反应来定量皮肤变化的方法能通过适当利用细胞破坏的变化、细胞增殖率的变化、体内钙信导系统的变化以及本领域常规使用的其它与皮肤相关的生物学指数来测定皮肤变化。
6)火病邪：对应于火病邪的刺激可以是能对皮肤引起破坏的日光刺激。日光刺激的例子包括UV-B刺激、UV-A刺激、可见光刺激和IR刺激。日光刺激优选地通过以5-200mJ/cm2的剂量照射日光来进行。如果剂量小于5mJ/cm2，则刺激的强度低以至于难以与正常状态比较，而如果超过200mJ/cm2，则刺激的强度太强而使得所有细胞被杀死。
通过如上所述使用火病邪作为刺激的细胞反应来定量皮肤变化的方法能通过适当利用细胞破坏的变化、身体防御系统的变化以及本领域常规使用的其它与皮肤相关的生物学指数来测定皮肤变化。
上述六种刺激对应于六种外感病邪，而在六种内感病邪的情况下，可以适用其它机理和刺激。
在本发明中所述的六种外感病邪能单独侵袭身体，并且两种或更多种外感病邪能同时侵袭身体并且可以转化为其它类型的病邪。由此，适当的生物学指数和适当的典型的药草可以适用于六种外感病邪。例如，风病邪可以侵袭身体并变化为暑病邪(称为“风-暑病邪”)，并且寒病邪可以变化为湿病邪(称为“寒-湿病邪”)。
接着，确定每一种刺激的强度和每一种刺激的适当的细胞生物化学方法。根据在选择步骤中所述的刺激的种类，使用能特性使用的细胞生物化学方法进行这种确定步骤。通过证实典型的药草和对应于此能恢复由六种外感病邪(即，风、寒、暑、湿、燥和火病邪)所引起的变化的草本药方减轻或抑制细胞反应，能通过变化的显著差异确定由风病邪所引起的皮肤老化。
用于定量所进行的细胞生物化学方法可以包括本领域众所周知的所有常规方法。例如，细胞生物化学方法包括：用于定量由风病邪所引起的皮肤变化的TNF-αELISA、PGE2 ELISA或白细胞介素表达分析；用于定量由寒病邪所引起的皮肤变化的细胞增殖检测或FAS分析；用于定量由暑病邪所引起的皮肤变化的RT-PCR或免疫细胞化学；用于定量由湿病邪所引起的皮肤变化的黑色素分析、过氧化氢酶检测或DCFH-DA(二氯氢化荧光素二乙酸酯检测)；用于定量由燥病邪所引起的皮肤变化的免疫细胞化学；和用于定量由火病邪所引起的皮肤变化的DAPI染色法或β-gal染色法。这种分析方法共同的特性在于包括细胞因子的分析、抗氧化剂活性的分析、细胞毒性的分析、细胞增殖的分析以及特定蛋白质和基因变化方式的分析。另外，在本发明中，使用MTT检测、LDH检测、彗星实验以及采用能测定细胞变化的特定抗体的蛋白质印迹分析，通过测定细胞存活率、细胞生长率、细胞膜破坏、DNA破坏和特定蛋白质表达的变化，能定量皮肤变化。
能用于本发明的细胞为能使用单层培养和3D组织培养的所有皮肤细胞，包括能主要从人和动物皮肤分离和培养的角质化细胞。此外，也可以使用归功于皮肤免疫力的巨噬细胞系如RAW 264.7细胞。此外，也可以使用人活体解剖组织。
最后，证实选作防御皮肤免受六种外感病邪的典型的药草的上述方法的适用性。
在这步中，通过确定选作为六种外感病邪的刺激和选作为度量指数的那些物质是否能使药草的效果被证实，能测定对照组与测试组之间的显著差异。
能用于本发明的药草不仅包括具有常规药草的性能和特性的那些，而且还包括基于中国传统医药书籍如《东医宝鉴》和《伤寒论》(Sanghanrhon)(伤寒理论)所做出的药方或者基于东方医生的东方医学诊断所做出的药方。药草的更具体的例子包括但不限于白芷(Angelica dahurica)、干姜(Zingiberis officinale)、金银花(Lonicera japonica)、贝加尔黄芩(Scutellaria baicalensis)、地黄(Rehmannia glutinosa)和知母(Anemarrhena asphodeloides)。
另外，本发明涉及一种使用用于定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的上述方法来筛选改善皮肤状况的材料的方法。
用于筛选改善皮肤状况的材料的本发明的方法包括以下步骤：
1)向细胞中加入候选物质，并且使用至少一种选自六种外感病邪的刺激来刺激已加入候选物质的细胞，所述六种外感病邪包括风、寒、暑、湿、燥和火病邪；
2)在步骤1)的刺激之前或之后，使用作为正对照组的药草与候选物质一起处理细胞；
3)通过细胞生物化学方法测定和定量皮肤状况；和
4)比较由候选物质所得到的定量值与由作为正对照组的药草所得到的定量值，以确定候选物质的效果。
用于上述筛选方法的经培养的细胞、六种外感病邪的刺激、细胞生物化学方法以及用作正对照组的药草可以与用于定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的上述方法的那些相同。
这种筛选方法不仅可以广泛适用于单细胞培养系统，而且还可以适用于人皮肤。
实施例
下文中，将参考实施例和测试实施例来进一步详细描述本发明。但是，本领域技术人员将理解，这些实施例不应解释成限制本发明的范围，并且在不偏离本发明的范围的情况下，可以进行各种修改、替代和添加。
参考实施例1：药草提取物的制备
将白芷、干姜、金银花、贝加尔黄芩、地黄和知母每种1kg分别用5L70％乙醇提取3小时，随后过滤。将剩余的滤出液减压浓缩，由此得到每一种药草的70％乙醇提取物。这些样品用于进行以下实验。
实施例1：用于定量由风病邪所引起的皮肤变化的方法
在37℃和5％CO2条件下，将人的角质化HaCaT细胞在10％FBS-DMEM中培养。以5×105细胞/孔的密度将细胞接种到6-孔细胞培养板中，并用1μg/ml LPS处理，以诱导风病邪。将经风病邪诱导的测试组用具有驱风、减轻外部综合症和驱风湿性能的10μg/ml的药草白芷提取物(参考实施例1)处理，检验用药草提取物处理的效果。未用LPS和白芷提取物处理的所培养的细胞用作对照组，相对于对照组，通过测定COX-2(环加氧酶-2)蛋白质的表达和活性的变化来定量由风病邪所引起的皮肤变化。
在用测试材料处理一天后，收集样品，已分裂的细胞溶液用10％SDS-凝胶电泳展开，并转移至硝化纤维素膜，随后硝化纤维素膜用5％无脂奶阻断。使用COX-2单克隆抗体，通过蛋白质印迹分析已阻断的硝化纤维素膜，通过光密度计测定在炎性反应中起到重要作用的COX-2蛋白质的表达。测定结果示于下表1。
表1
由用作风刺激的LPS所引起的COX-2表达的增加以及白芷提取物的效果
Figure BPA00001363043700101
由表1中的结果可见，白芷提取物显示将LPS-诱导的炎症抑制了约40％的效果。这表明，诱导炎症的因素如LPS能用作风刺激并且蛋白质如COX-2能用作测定细胞变化的指数。
实施例2：定量由寒病邪所引起的皮肤变化的方法
在37℃和5％CO2条件下，将人的角质化HaCaT细胞在10％FBS-DMEM中培养。以2×105细胞/孔的密度将细胞接种到3.5-孔细胞培养皿中，并在-15℃下温育，以诱导寒病邪。将经寒病邪-诱导的测试组用具有驱寒性能同时保持温度的10μg/ml药草干姜提取物(参考实施例1)处理，检验用药草处理的效果。未经低温处理但用干姜提取物处理的所培养的细胞用作对照组，使用MMT分析，相对于对照组，通过测定细胞生长率的变化来定量由寒病邪所引起的皮肤变化。
在低温处理和用测试材料处理一天后，将待培养的细胞用0.5μg/mlMMT试剂(溴化3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑，Sigma)处理2小时，将培养基移除。将剩余的紫色沉淀物溶解于DMSO中，随后在560nm下测定吸光度。测定结果示于下表2。
表2
用寒刺激低温处理之后细胞生长率的下降以及干姜提取物的效果
  低温处理   干姜提取物的处理   OD560(AU)   细胞生长率(％)
  -   -   0.9679   100.0
  +   -   0.4825   49.9
  +   +   0.7489   77.4
由表2中的结果可见，干姜提取物有效恢复了由低温处理所引起的细胞生长率的下降。这表明，低温处理能用作寒刺激并且细胞生长率能用作测定细胞变化的指数。
实施例3：用于定量由暑所引起的皮肤变化的方法
在37℃和5％CO2条件下，将人的角质化HaCaT细胞在10％FBS-DMEM中培养。以2×105细胞/孔的密度将细胞接种到3.5-孔细胞培养皿中，并在44℃下温育，以诱导暑病邪。将经暑病邪-诱导的测试组用具有清热解毒性能的10μg/ml药草金银花提取物(参考实施例1)处理，检验用药草提取物处理的效果。
使用LDH检测(Sigma Aldrich，产品型号TOX-7)，通过测定细胞膜稳定性得到由暑所引起的皮肤变化的定量结果。在高温和用药草提取物处理一天后，收集待培养的细胞，于12000rpm下离心分离3分钟，使得细胞碎片完全沉淀，仅收集上清液。将100μl上清液加入到98-孔板中，在使用前立即制备LDH检测混合物(LDH检测底物∶辅因子∶染料溶液＝1∶1∶1)，并以200μl的量与上清液混合。阻断光，让所得到的混合物反应20分钟，并向其中加入25μl的1N的HCl溶液以终止反应。接着，在490nm和690nm下测定反应材料的吸光度。从在490nm下的吸光度减去在690nm下的吸光度，以除去背景，由此校正测得的吸光度值，测定结果示于表3。基于未经高温处理而用金银花提取物处理的对照组来计算细胞膜破坏率。
表3
在用热刺激高温处理之后细胞膜破坏的增加以及金银花提取物的效果
Figure BPA00001363043700121
由表3中的结果可见，金银花提取物能有效降低由高温处理所引起的细胞膜破坏率。这表明，高温处理能用作热刺激并且细胞膜破坏率能用作测定细胞变化的指数。
实施例4：用于定量由湿病邪所引起的皮肤变化的方法
在37℃和5％CO2条件下，将人的角质化HaCaT细胞在10％FBS-DMEM中温育。以1×105细胞/孔的密度将细胞接种到98-孔细胞培养板上，用1mM H2O2处理以诱导湿病邪。将经湿病邪-诱导的测试组用具有清热和干燥潮湿性能的10μg/ml药草贝加尔黄芩提取物(参考实施例1)处理，检验用药草提取物处理的效果。
使用MTT检测，通过测定细胞毒性得到的由湿病邪所引起的皮肤变化的定量结果。在用H2O2和药草提取物处理一天后，将待培养的细胞用0.5μg/ml的MTT试剂(溴化3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑，Sigma)处理2小时，随后将培养基移除。将剩余的紫色沉淀物溶解于DMSO中，随后在560nm下测定吸光度。测定结果示于下表4。基于未经H2O2和贝加尔黄芩提取物处理的对照组计算细胞存活率。
表4
在用H2O2作为潮湿刺激之后细胞毒性的增加以及贝加尔黄芩提取物的效果
  H2O2处理   贝加尔黄芩提取物的处理   OD560(AU)   细胞存活率(％)
  -   -   1.7679   100.0
  +   -   0.7789   44.1
  +   +   1.426   80.7
由表4中的结果可见，贝加尔黄芩提取物有效抑制了由H2O2处理所引起的细胞毒性的增加。这表明，H2O2处理能用作潮湿刺激并且细胞毒性能用作测定细胞变化的指数。
实施例5：用于定量由燥病邪所引起的皮肤变化的方法
在37℃和5％CO2条件下，将人的角质化HaCaT细胞在10％FBS-DMEM中培养。以2×105细胞/孔的密度将细胞接种到48-孔细胞培养板上，在培养板的盖敞开的状态下在干净的工作台中温育，从而诱导燥病邪。将诱导湿病邪的干净的工作台的内部条件设定在温度为29℃并且湿度为45％，但是可以根据实验条件来改变这些条件。当将细胞暴露于潮湿条件时，将细胞用具有滋养阴(Yin)以产生体液性能的10μg/ml药草地黄提取物(参考实施例1)处理，检验用药草提取物处理的效果。
使用MTT检测，通过测定细胞毒性得到由燥所引起的皮肤变化的定量结果。在潮湿处理和用药草提取物处理一天后，将待培养的细胞用0.5μg/ml的MTT试剂(溴化3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑，Sigma)处理2小时，随后将培养基移除。将剩余的紫色沉淀物溶解于DMSO中，随后在560nm下测定吸光度。测定结果示于下表5。基于既未暴露于干燥也未用地黄提取物处理的对照组计算相对细胞存活率。
表5
在暴露于燥病邪之后细胞毒性的增加以及地黄提取物的效果
  干燥暴露处理   地黄提取物的处理   OD560(AU)   细胞存活率(％)
  -   -   1.463   100.0
  +   -   0.6789   46.4
  +   +   0.9127   62.4
由表5中的结果可见，地黄提取物有效抑制了由暴露于干燥所引起的细胞毒性的增加。这表明，暴露于干燥能用作干燥刺激并且细胞毒性能用作测定细胞变化的指数。
实施例6：用于定量由火病邪所引起的皮肤变化的方法
在37℃和5％CO2条件下，将人的角质化HaCaT细胞在10％FBS-DMEM中培养。以5×105细胞/孔的密度将细胞接种到5-孔细胞培养板中，并用UVB照射以诱导火病邪。诱导火病邪的UVB照射的剂量为40mJ/cm2，但是也可以根据实验条件而变化。当细胞用UVB照射时，将细胞用具有清热和泻火性能的10μg/ml药草知母提取物(参考实施例1)处理，检验药草提取物的效果。
使用彗星实验，通过测定DNA破坏的程度，得到由火病邪所引起的皮肤变化的定量结果。在UV照射和用药草提取物处理一天后，收集待培养的细胞，将20μl收集到的细胞加入到200μl熔融的LM琼脂糖中。接着，将75μl混合物立即转移至彗星载玻片。接着，将彗星载玻片依次浸没在溶解溶液和新制备的碱性溶液(0.6g NaOH/50ml DIW)和电泳液中。将50μl的SYBR green I稀释液滴在载玻片上以使DNA着色，接着，观察载玻片，并在494nm/512nm滤光片下用荧光显微镜照相，以比较对照组与测试组之间的DNA尾长。比较结果示于下表6。基于既未暴露于UVB也未用知母提取物处理的对照组计算相对DNA破坏率。
表6
在用UVB作为火病邪照射之后细胞毒性的增加以及知母提取物的效果
  UV光照射   知母提取物的处理   尾长(μm)  DNA破坏率(％)
  -   -   65.4  100.0
  +   -   112.4  171.9
  +   +   78.2  119.6
由表6中的结果可见，知母提取物有效抑制了由UV光照射所引起的DNA破坏率的增加。这表明，UV光照射能用作火刺激并且DNA破坏能用作测定细胞变化的指数。
上述实施例举例说明了本发明的典型的实施例并且可以以任何形式进行修改。例如，在风病邪的情况下，可以使用粉尘螨(Dermatophagoides farina)碎片来代替LPS作为风刺激。在寒、暑和燥病邪的情况下，温度和湿度条件不限定于在上述实施例中指定的条件，并且可以在宽范围的条件内进行选择，包括高于或低于皮肤温度的温度和宽范围的湿度条件。在湿病邪的情况下，可以使用诱导ROS产生的材料来代替H2O2作为干燥刺激，而在火病邪的情况下，也可以使用UVA或IR光作为火刺激。

Claims (19)

1.一种定量由六种外感病邪所引起的皮肤变化的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)选择适当的六种外感病邪的皮肤刺激，所述六种外感病邪包括风、寒、暑、湿、燥和火病邪；
(b)根据每一种所述刺激，确定能测定皮肤细胞变化的细胞生物化学方法；
(c)通过所述生物化学方法测定受试者的皮肤状况；
(d)用每一种所述刺激来刺激皮肤，随后根据所述刺激的强度来定量细胞变化的程度；和
(e)向皮肤施用防御皮肤免受所述六种外感病邪的药草，随后通过生物化学方法测定和定量皮肤状况。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对应于所述风病邪的刺激选自由大气污染物包括甲醛、变应性材料包括蜱和花粉、黄沙、细菌脂多糖(LPS)、乙酸豆蔻酸酯佛波醇(PMA)和诱导炎症的细胞因子组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，对应于所述寒病邪的刺激设定在从35℃的室温到-40℃的低温的温度范围内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，对应于所述暑病邪的刺激设定在从39℃到50℃的高温范围内。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，对应于所述湿病邪的刺激为反应性氧物类刺激。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，对应于所述燥病邪的刺激是通过水分含量低于60％的干燥空气的刺激。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，对应于所述火病邪的刺激选自由UV-B刺激、UV-A刺激、可见光刺激和IR刺激组成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞生物化学方法选自由TNF-αELISA、PGE2 ELISA、白细胞介素表达分析、细胞增殖检测、FAS分析、RT-PCR、免疫细胞化学、黑色素分析、过氧化氢酶检测、DCFH-DA(二氯氢化荧光素二乙酸酯检测)、DAPI染色法、β-gal染色法、MTT检测、LDH检测、彗星实验和采用特定抗体的蛋白质印迹分析组成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述药草选自由白芷(Angelica dahurica)、干姜(Zingiberis officinale)、金银花(Lonicera japonica)、贝加尔黄芩(Scutellaria baicalensis)、地黄(Rehmannia glutinosa)和知母(Anemarrhena asphodeloides)组成的组。
10.一种筛选改善皮肤状况的材料的方法，所述方法包括以下步骤：
1)向细胞中加入候选物质，并且使用至少一种选自六种外感病邪的刺激来刺激已加入候选物质的细胞，所述六种外感病邪包括风、寒、暑、湿、燥和火病邪；
2)在步骤1)的所述刺激之前或之后，使用作为正对照组的药草与候选物质一起处理细胞；
3)通过细胞生物化学方法测定和定量皮肤状况；和
4)比较由候选物质所得到的定量值与由作为正对照组的药草所得到的定量值，以确定候选物质的效果。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，对应于所述风病邪的所述刺激选自由大气污染物包括甲醛、变应性材料包括蜱和花粉、黄沙、细菌脂多糖(LPS)、乙酸豆蔻酸酯佛波醇(PMA)和诱导炎症的细胞因子组成的组。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，对应于所述寒病邪的刺激设定在从35℃的室温到-40℃的低温的温度范围内。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，对应于所述暑病邪的刺激设定在从39℃到50℃的高温范围内。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，对应于所述湿病邪的刺激为反应性氧物类刺激。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，对应于所述燥病邪的刺激是通过水分含量低于60％的干燥空气的刺激。
16.根据权利要求10所述的方法，其中，对应于所述火病邪的刺激选自由UV-B刺激、UV-A刺激、可见光刺激和IR刺激组成的组。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞生物化学方法选自由TNF-αELISA、PGE2 ELISA、白细胞介素表达分析、细胞增殖检测、FAS分析、RT-PCR、免疫细胞化学、黑色素分析、过氧化氢酶检测、DCFH-DA(二氯氢化荧光素二乙酸酯检测)、DAPI染色法、β-gal染色法、MTT检测、LDH检测、彗星实验和采用特定抗体的蛋白质印迹分析组成的组。
18.根据权利要求10所述的方法，其中，所述用作正对照组的药草选自由白芷、干姜、金银花、贝加尔黄芩、地黄和知母组成的组。
19.根据权利要求10-18中任意一项所述的方法，其中，所述改善皮肤状况的材料为具有改善由六种外感病邪所引起的皮肤老化、色素沉着、皮肤干燥或皮肤困扰的效果的材料。
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