KR20100042604A - 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증성 장 질환, 즉, 궤양성 대장염과 크론병의 치료 또는 예방에 유용한 조성물에 관한 것으로서, 나복자 추출물 또는 나복자 분말을 포함하는 것을 특징으로 한다.

염증성 장 질환, 나복자

Description

염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treating or preventing inflammatory bowel disease}

본 발명은 염증성 장 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 일반적으로 궤양성 대장염(Ulcerative colitis)과 크론병(Crohn's disease)을 일컬으며, 지난 수십 년간 전 세계적으로 많은 연구자들에 의해 연구되어 오고 있다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 이 질환의 병인과 병태생리 및 효과적인 치료제는 여전히 불분명한 상태이다. 특히 궤양성 대장염은 대장 점막에 염증성 궤양이 생기며, 증상은 다양하지만 설사, 장출혈, 복통 등이 주된 증상이고, 발열, 식욕부진, 체중감소 등도 흔히 올 수 있다. 또 궤양성 대장염 환자의 3% 내지 13%정도가 대장암으로 진행된다고 보고되고 있다. 이러한 염증성 잘 질환은 증상의 악화와 회복단계를 반복하는 특징을 지닌 만성 질환으로 장기간 치료를 요하는 반면, 만족할 만한 치료제는 없는 상태이다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 나복자 분말 또는 나복자 추출물을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 나복자의 염증성 장 질환 치료제로서의 가능성을 여러 가지 모델로 평가한 결과 나복자가 염증성 장 질환, 즉, 궤양성 대장염(Ulcerative colitis) 또는 크론병(Crohn's disease)의 치료 또는 예방에 유용하다는 놀라운 발견을 하였다.

나복자는 내복자라고도 하며 십자화과의 무(Raphanus sativus L.) 또는 동속식물의 씨를 말하며, 본 발명에 따른 조성물은 염증성 장 질환의 치료 성분으로 이러한 나복자를 포함한다. 본 발명에 따른 조성물은 제제화가 용이하도록 나복자 분말 또는 나복자 추출물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 나복자 추출물은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 추출, 분리 및 정제방법을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 통상적인 용매추출방법으로서 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 이들의 혼합물 등의 적당한 용매를 이용하여 추출하거나 초임계 추출법을 통해서도 얻을 수 있으며, 또한 추출물을 다시 정제함으로써 더욱 고순도의 나복자 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 조성물은 의약품 및 기능성 식품의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 의약품 및 기능성 식품은 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물을 포함하는 의약품 또는 기능성 식품은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 나복자 분말 또는 나복자 추출물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 나복자 추출물 또는 나복자 분말; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

염증성 장 질환의 개선이라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 나복자 분말 또는 나복자 추출물은 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 나복자 분말 또는 나복자 추출물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명은 염증성 장 질환, 보다 바람직하게는, 궤양성 대장염과 크론병의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 아세트산 유발 대장염 개선 평가

시험 샘플의 준비 및 실험동물

하기 표 1과 같은 시험 샘플을 준비하였다. 나복자 추출물의 경우 30% 에탄올 수용액을 이용하여 추출하고 감압농축한 후 건조하여 제조하였다.

시험 샘플	Dose(mg/kg)
Normal Control	투여 없음
Negative Control	투여 없음
Posive Control (Prednisolone)	1mg / kg
나복자	100mg / kg

6주령 Male Sprague-Dawley 쥐를 오리엔트사에서 구입하여 일반 동물실험실에서 사육하였다. 사육환경은 온도 23±2℃, 습도 55±15%, 조명시간 12시간의 조건을 유지하였으며, 동물은 케이지 당 한 마리씩 분리하여 수용하였다.

상기 쥐를 24시간 절식시킨 후, 길이 8㎝의 폴리에틸렌 튜브(직경0.76㎜)를 항문으로 밀어 넣은 후 아세트산 용액을 주입하여 대장염을 유발하였다. 아세트산은 7% 수성용액을 한 마리당 1ml의 용량으로 0.1 ml씩 천천히 점적 주사하여 주입하였다. 아세트산 주입 후 24시간 후부터 4일 동안 1일 1회씩 쥐용 경구존데를 이용하여 약물을 경구로 투여하였다.

체중 평가

7% 아세트산으로 대장염 유발을 하기 직전과 투여가 끝난 후 각 동물의 체중을 측정하여 각 동물의 체중감소량을 확인하였다. 체중감소량은 대장염 유발을 하기 직전의 체중에 대한 그 날의 체중의 감소(g)로 나타내었다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	Mean of body weight gain(g)(n=4)
Normal control	3.67±0.62
나복자	3.00±1.06
positive control	1.75±0.65
negative control	-2.25±0.82

상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 7% 아세트산 용액으로 대장염을 유발한 음성 대조군들은 유발 직후부터 체중이 감소되는 경향을 보였지만 프레드니솔론을 투여한 양성 대조군과 시험군인 나복자 추출물을 투여한 군에서는 약물의 투여 4일까지 꾸준한 체중증가를 보여주었다.

설사발생률 평가

7% 아세트산으로 대장염 유발한 후 24시간 후 매일 경구투여하기 직전 각 동물의 설사의 유무를 확인하였다. 각 군의 전체 동물 수에 대한 설사발생 수의 비율로 나타내었다.

나복자 투여군은 투여 후 심한 설사에서 회복되어 정상변에 가까워 졌으며, 양성 대조군의 경우에는 대장염 유발 후 설사 정도가 심한 대변을 보았다가 점차적으로 묽은 변의 형태를 보였다. 음성 대조군의 경우에는 설사의 정도가 매우 심하여 항문 주위에 염증이 발생하였으며 그중 1마리가 혈변증상을 나타내었다.

대장의 길이, 무게 및 형태 변화 평가

마지막 약물투여 24시간 후에 각 군의 동물들을 경추 탈골시킨 후 부검을 실시하고, 대장과 비장, 간을 적출하였으며 대장의 길이는 직장 쪽으로부터 3.5cm를 제외한 부분의 대장의 길이를 측정하고, 대장과, 비장, 간의 무게를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다.

(n=4)	Colon length	Colon weight
Normal control	15.67±0.40	10.98±0.22
나복자	13.18±0.58	9.90±0.47
positive control	11.98±0.50	7.18±0.57
negative control	11.20±1.09	5.36±0.37

상기 표 3 및 도 1에 나타나는 바와 같이, 정상 대조군과 비교했을 때 나복자 투여군의 경우가 대장(colon)의 길이, 무게에서 가장 정상 대조군과 가까운 수치를 나타냄을 알 수 있어 대장의 병변이 정상으로 완화됨을 알 수 있었다. 형태적인 면에서 볼 때 나복자 투여군은 궤양 및 염증이 없었고, 약간의 충혈만 있었다. 양성 대조군도 궤양이나 염증의 소견이 적었으나 음성 대조군은 염증과 궤양의 정도가 심했고 장벽은 두꺼웠다.

대장 병변 소견 및 조직학적 염색 소견

현미경 관찰을 위하여 실험동물을 마취한 후 복부를 정중 절개하고 소화관을 전체적으로 적출하였다. 적출한 내장 중 대장을 채취하여 실체 현미경으로 대장 병변 소견을 관찰하였다. 그 후 실온에서 10% 포르말린 용액에 고정하고 H&E 염색을 실시하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타나는 바와 같이, 대장을 적출하여 실체현미경으로 관찰한 결과 음성 대조군의 경우는 대장의 병변이 확인 가능하여 IBD가 유발됨을 확인할 수 있었으나, 시험군인 나복자 투여군의 경우는 병변의 정도가 완화되었음을 관찰할 수 있었다. 또한 도 3의 H&E 염색에서 관찰할 수 있는 것처럼 궤양성 대장염(IBD)가 유발된 음성 대조군은 점막하 조직상의 염증세포 침윤, 상피세포의 파괴, 점액세포의 파괴 등의 염증 소견이 관찰되었지만, 양성 대조군 및 실험대조군인 나복자 투여군에서 점액세포와 선와 등이 정상적인 형태를 보여 치료 효과를 나타내는 것으로 사료되었다

대장( colon )의 형태 평가

대장의 벽 두께 정도를 측정하고 대장을 절개하여 반으로 자른 후, 궤양 및 염증상태의 육안병변을 하기 표 4(Wallace의 기준)에 따라 점수화하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

Score	Appearance
0	Nomal
1	Localized hypermia, no ulcers
2	Linear ulceration without hyperemia or bowel wall thickening
3	Linear ulceration with inflammation at one site
4	Two or more sites of ulceration and inflammation
5	Two or more sites of ulceration and inflammation, or one major site of damage extending more than 1cm along the length of the colon
6~10	When an area of ulceration and inflammation extended more than 2cm along the length of the colon, the score was incresed by 1 for each additional cm of involvement

도 4에 나타나는 바와 같이, 나복자는 한, 두곳에서 염증성을 가진 궤양이 관찰되었고 장벽의 두께와 길이가 정상군의 대장과 거의 유사한 모양을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 양성 대조군의 경우에는 궤양의 범위가 상대적으로 넓었다. IBD가 유발된 군의 경우에는 장벽이 너무 얇아져서 장이 파열되어 변들이 흘러나올 정도였으며, 색깔 역시 변하여 누런 색으로 변해 있었다.

< 실시예 2> TNBS 유발 궤양성 대장염 개선 평가

실험동물은 실시예 1과 동일한 조건의 실험동물을 사용하였다. 아세트산 대신 실제 인간 대장염과 가장 가까운 모델인 트리니트로벤젠 설포닉 산(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS) 유발 대장염 모델을 사용하여 나복자 추출물의 대장염 개선 효과를 평가하였다. 접촉성 감작 알레르겐인 TNBS를 에탄올과 함께 대장에 관장 투여하면 대장염을 유발할 수 있다. 이때 에탄올은 점막장벽(mucosal barrier)을 깨서 TNBS를 장벽으로 들어가게 하는 역할을 한다. TNBS가 장에 저촉되게 되면 산화적 손상에 의해 급성 전층성 괴사를 일으키게 되며, 관장 후 수일 내에 급성 괴사와 염증이 생기고 그 후로는 단핵구 침윤 등과 함께 만성 염증 소견을 보인다. 이러한 TNBS 유발 대장염 모델은 반복성이 있으며, 전벽성 궤양을 얻을 수 있고, 면역 기전을 통한 병변이므로 만성염증까지 유발할 수 있어 사람의 염증성 장질환과 매우 유사하다.

TNBS 유도 궤양성 대장염 유발

유발 물질로는 TNBS 용액(5 w/v%, Sigma)을 사용하였다. 24시간 절식시킨 6주령의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(rat)에 폴리에틸렌 튜브(직경 0.76mm)를 항문으로 밀어 넣은 후 TNBS 용액을 주입하여 대장염을 유발하였다. TNBS 용액을 한 마리당 0.6 ml의 용량으로 0.1 ml씩 천천히 점적 주사하여 주입하였으며, 주입 후 24시간 후부터 7일 동안 1일 1회씩 같은 시간에 시험 약물을 경구 투여하였다. 시험 약물은 하기 표 5와 같으며, 추출물은 나복자 약 1 kg 당 추출용매 약 3 리터를 이용하여 제조하였다.

추출물명	투여량	용매
나복자 물 추출물	100 mg/kg	정제수
나복자 50% 주정 추출물	100 mg/kg	50% EtOH 수용액
양성 대조군(mesalazine)	25 mg/kg	정제수
음성 대조군	×	정제수
정상 대조군	×	정제수

체중 변화 평가

TNBS 5 w/v%로 대장염을 유발하기 직전과 매일 경구투여하기 직전 각 동물의 체중을 측정하여 각 동물의 체중감소량을 확인하였다. 체중감소량은 대장염 유발을 하기 직전의 체중에 대한 그날의 체중의 비율(퍼센트)로 나타내었다. 음성 대조군을 제외한 모든 군에서 투약 직후부터 체중은 꾸준히 증가하는 양상을 보였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

추출물명	투여 5일 후의 평균 체중 증가 백분율(%)
나복자 물 추출물	17%
나복자 50% 주정 추출물	8%
양성 대조군(mesalazine)	21%
음성 대조군	-3%
정상 대조군	22%

설사발생률 평가

TNBS 5 w/v%로 대장염을 유발하고 난 24시간 후 매일 경구투여하기 직전 각 동물의 설사의 유무를 확인하였다. 나복자 물 추출물 군은 투약 후 2일째부터 정상변보다 약간 무른 변을 보기 시작하였고, 5일 후부터 정상변을 보았으며, 나복자 50% 주정 추출물의 경우에도 5일 후부터 정상변을 보았다. 양성 대조군 투여 후 4일째까지 피가 섞인 설사를 조금 했지만, 5일째부터는 상태가 나아졌다. 정상 대조군의 경우에는 정상 변의 형태를 나타내었다.

대장( colon )의 형태 평가

대장의 벽두께를 측정하고 대장을 절개하여 궤양 및 염증상태의 육안 병변을 상기 표 4의 기준에 따라 점수화하였다. 정상군과 비교하여 보았을 때 대장의 형태는 나복자 추출물 투여 군에서 상대적으로 정상 형태를 띠고 있음을 관찰할 수 있었다. 양성 대조군은 대장의 형태가 정상군에 비하여 상대적으로 손상의 정도가 심하다는 것을 관찰할 수 있었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 또한 대장의 벽 두께 정도를 측정하고 대장을 절개하여 반으로 자른 후, 궤양 및 염증상태의 육안 병변을 상기 표 4에 따라 점수화한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타나는 바와 같이, 나복자 물 추출물의 효과가 가장 뛰어났으며, 나복자 50% 주정 추출물의 효과는 양성 대조군과 거의 유사하였다.

염색학적 소견 평가

대장을 적출하여 실체현미경으로 관찰한 결과 음성 대조군의 경우는 대장의 병변이 확인 가능하여 IBD가 유발됨을 확인할 수 있었으나, 시험군인 나복자 추출물 투여군의 경우는 병변의 정도가 완화되었음을 관찰할 수 있었다. 또한 H&E 염색 결과에서 관찰할 수 있는 것처럼 궤양성 대장염(IBD)이 유발된 음성 대조군은 점막하조직 상의 염증세포 침윤, 상피세포의 파괴, 점액세포의 파괴 등의 염증 소견이 관찰되었지만, 양성 대조군 및 나복자 추출물 투여군에서 점액세포, 선와 등이 정상적인 형태를 보여 치료 효과를 나타내는 것으로 사료되었다. 특히 나복자 물 추출물 투여군이 가장 우수한 효과를 나타내었으며, 양성 대조군인 메살라진 투여군의 경우에는 나복자 추출물 투여군에 비해 만족할 만한 결과를 보이지 못했는데, 이러한 결과는 메살라진의 용량 의존성에 기인한 것으로 생각된다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 1은 본 발명에 따른 비교평가실험에 있어 마지막 약물투여 24시간 후에 각 군의 동물들을 경추 탈골시킨 후 부검을 실시하여 적출한 대장의 사진 결과이다.

도 2는 본 발명에 따른 비교평가실험에 있어 적출한 대장의 병변을 관찰하기 위한 현미경 사진 결과이다.

도 3은 본 발명에 따른 비교평가실험에 있어 적출한 대장의 H&E 염색 결과 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 비교평가실험에 있어 궤양 및 염증 상태의 육안병변을 Wallace의 기준에 따라 점수화한 결과이다(n=4).

도 5는 시험 물질들을 투여한 TNBS 유발 대장염 모델 동물들로부터 적출한 대장의 사진 결과이다.

도 6은 시험 물질들을 투여한 TNBS 유발 대장염 모델 동물들로부터 적출한 대장의 궤양과 염증 상태의 육안 병변을 Wallace의 기준에 따라 점수화한 결과이다(n=4).

도 7은 시험 물질들을 투여한 TNBS 유발 대장염 모델 동물들로부터 적출한 대장의 H&E 염색 사진 결과이다.

Claims (2)

1. 나복자 분말 또는 나복자 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis) 또는 크론병(Crohn's disease)인 것을 특징으로 하는 조성물.

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